JP6920230B2 - アルファ−１アンチトリプシン融合ポリペプチド、それをコードする核酸構築体、及びそれらの組成物 - Google Patents

Description

本明細書の実施形態は、組換えアルファ−１アンチトリプシン（α−１アンチトリプシン、ＡＡＴ）の組成物、方法、及び使用に関する。ある実施形態では、本明細書に開示された組換えＡＡＴは、他の形態のＡＡＴよりも容易に単離することができる。他の実施形態では、組換えＡＡＴは、天然ＡＡＴ又はＡＡＴの他の市販製剤と比較して、抗炎症活性及び抗免疫活性の増強を示す。更に他の実施形態では、１０倍、１００倍、又は１０００倍も少ない組換えＡＡＴ（ｒＡＡＴ）又はＡＡＴ融合分子を、対象体の症状又は疾患を予防又は治療するためのあらゆる現行形態のＡＡＴの代わりに使用することができる。幾つかの実施形態では、ＡＡＴ融合分子は、感染症等の疾患又は他の健康状態を有する対象体を治療するために使用することできる。本明細書に報告されている更に他の実施形態は、心筋症状、糖尿病、炎症性腸疾患、移植片拒絶、又は他の公知のＡＡＴ応答性疾患を治療するための組成物及び方法に関する。

ＡＡＴ
アルファ−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）の正常な血漿中濃度は、１．３以上３．５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲である。ある条件下では、ＡＡＴは、組織空間へと容易に拡散し、標的プロテアーゼ、主に好中球エラスターゼと１：１の複合体を形成する。トリプシン、キモトリプシン、カテプシンＧ、プラスミン、トロンビン、組織カリクレイン、及び第Ｘａ因子等の他の酵素も基質となり得る。その後、酵素／阻害剤複合体は、セルピン−酵素複合体（ＳＥＣ）受容体と結合することにより循環から除去され、肝臓及び脾臓により分解される。

本明細書の実施形態には、市販のＡＡＴ組成物よりも優れた特性を有するアルファ−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）の組換え構築体の生成及び使用が報告されている。他の実施形態には、治療用に組換えＡＡＴ生産を精製及びスケールアップするための方法が報告されている。これらの実施形態によると、組換えＡＡＴは、例えば、抗炎症剤、免疫修飾剤、及び／又はセリンプロテアーゼ阻害剤として、任意のＡＡＴ関連活性を使用するために単離することできる。

ある実施形態では、本明細書に開示された組換えＡＡＴは、当技術分野で知られている任意の組換え技術により生成された全長分子又はそのカルボキシ末端ペプチド誘導体を含む。幾つかの実施形態は、例えば、ＡＡＴの迅速な精製や活性の保存に使用するための、又はＡＡＴ若しくはそのペプチドの活性を増加させるための、ＡＡＴと結合されている免疫学的要素を有するＡＡＴ又はそのカルボキシ末端誘導体を含む構築体に関する。他の実施形態は、各々が免疫学的要素（例えば、Ｆｃ断片）と結合され、ユニットとして共精製される、ＡＡＴ分子を有する複数の構築体の同時合成に関する。他の実施形態は、例えば、１つ又は複数の免疫分子と結合して、本明細書に開示された組成物、方法、及び使用のための構築体を形成する、この分子の最後の８０ＡＡの断片又はその亜断片（例えば、約４０、約３０、約２０、若しくは約１０ＡＡ、又は約５ＡＡ）を含む、ＡＡＴの１つ又は複数のカルボキシ末端誘導体又は断片の構築体を生成することに関する。

本明細書で企図されている構築体のＡＡＴ分子は、天然アルファ−１アンチトリプシン（例えば、ヒト）、又はＡＡＴの最も多く見られる形態、又はそれらの他の天然形態、又はそれらの断片若しくは誘導体、又は顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たない突然変異型のＡＡＴ、又はそれらの対立遺伝子（例えば、およそ１００個の天然ＡＡＴ変異体が存在し、これらの変異体はいずれも、本明細書に開示された構築体に使用することができる）、又はそれらの類似体、又はそれらの融合タンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧの断片）に関する。これらの実施形態によると、最終構築体は、各々が免疫学的断片（例えば、Ｆｃ断片）と結合された２つのＡＡＴ構築体を含んでいてもよく、ＡＡＴ−免疫断片構築体は、ジスルフィド結合で共に結合されており、１つ又は複数のジスルフィド結合で結合された２重ＡＡＴ−免疫断片構築体を形成する（例えば、図１及び図２を参照）。本明細書に開示されたある方法では、免疫分子に結合されたＡＡＴ又はＡＡＴペプチドの迅速精製は、ＡＡＴ活性の失活を顕著に低減し、精製時間を短縮した。迅速精製では、複数の精製ステップが省略され、構築体の重要な活性が保存される。例えば、このような迅速に精製された融合分子は、対照血漿由来ＡＴＴと比較して（例えば、天然ＡＡＴの典型的な精製、及び市販製剤の精製）、サイトカイン阻害機能を保持することができ、免疫分子及び炎症分子の産生を調節する。顕著に低減された濃度の融合分子を使用して、同じか又はより良い調節機能を達成することができる。更に、Ｆｃ−ＡＡＴのＦｃ領域が切断型ヒンジ又は欠失ヒンジ領域を有する、本明細書に開示された融合分子は、血漿由来ＡＡＴ、又は完全なＦｃを有するＦｃ−ＡＡＴの融合分子と比較して優れた活性を有する。

これらの実施形態によると、２つ以上のＡＡＴ−Ｆｃ（ヒンジ欠失／切断）構築体（又はカルボキシ末端ＡＡＴペプチド断片）を含むユニットは、本明細書に開示された組成物及び方法で精製及び使用することができる。Ｆｃ−ｈｕＡＡＴ（ヒンジ欠失）のこれらの実施形態の幾つかは、本明細書で企図された任意の方法又は組成物に使用することができる。他の実施形態には、ＡＡＴ分子の活性を保存するために迅速精製法により精製されたＡＡＴ分子に結合されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ断片（ヒンジは、切断又は欠失されている）を使用することが含まれていてもよい。

本明細書に開示されたある実施形態は、他の方法及び血漿ＡＡＴ精製に使用される複数ステップの有害効果を回避するために、Ｆｃ融合構築体の最小ステップ（例えば、一段階）精製にプロテインＡを使用することに関する。本明細書の幾つかの実施形態は、市販の製品（例えば、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（商標））及び／又は血漿中に見出される天然ＡＡＴに使用される標準的精製と比較して、融合分子中で８５％、９０％、又は９５％以上のＡＡＴ抗炎症活性を保存することに関する。幾つかの実施形態では、本出願の融合分子は、市販の製剤と比較して、炎症を低減するか又は疾患を治療する活性が１００〜１０００倍高いことを実証した。他の実施形態では、Ｆｃ部分の切断又は欠失ヒンジ領域を有するＡＡＴ−Ｆｃは、Ｆｃが完全であるＦｃ−ＡＡＴよりもｉｎ ｖｉｖｏでの活性が優れていることを実証した。

本明細書に開示されているのは、血漿由来ＡＡＴと同様の、ある実施形態ではそれより優れた活性を有する構築体を生成及び回収する方法である。ＡＡＴに関して興味の対象となっていることが知られている活性には、免疫調節活性又は炎症調節活性が含まれる。本明細書では、記載されている構築体を単離し、セリンプロテアーゼ阻害活性以外の活性について評価することが企図されている。幾つかの実施形態では、本明細書に開示された構築体は、市販の組成物と比較して、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト活性の増加、及びＩＬ−１β並びに他の炎症誘発性サイトカインの産生の低減を示す。

ある実施形態では、組成物（例えば、構築体組成物）及び方法は、対象体に対する放射線の有害効果を調節することに関する。幾つかの実施形態では、組成物及び方法は、例えば、癌を有するか又は悪性腫瘍の発症が疑われるか又は細胞増殖制御不能の対象体に投与される場合、放射線療法又は放射線を受けている対象体を治療することに関する。本明細書に開示された他の実施形態は、例えば、偶発的に又は意図的な行為により、放射線に被曝した対象体を治療することに関する。

幾つかの実施形態は、ＡＡＴ療法を必要とする対象体に、組換え法を使用して生成されたＡＡＴを投与することに関する。これらの実施形態によると、対象体は、ＡＡＴ欠乏、炎症若しくは免疫疾患、又は当技術分野で知られている他のＡＡＴ関連疾患を有する場合がある。本明細書のある実施形態には、少なくとも１つの構築体を有する組成物及び薬学的に許容される担体を、そのような治療を必要とする対象体に投与することが含まれる。ある実施形態では、対象体に投与される用量には、市販の製剤と比較して１０倍、１００倍、又は１，０００倍低減された対象体に対する用量（例えば、Ｆｃ−ＡＡＴ３構築体の）が含まれていてもよい。ある実施形態では、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）又はＰｒｏｌａｓｔｉｎ Ｃ（商標）等の、一般的に使用されている市販ＡＡＴの濃度）と比較して、対象体に対して約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである。

本発明の幾つかの実施形態は、虚血再灌流の有害効果を低減することに関する。これらの実施形態によると、本明細書の組成物は、心筋梗塞又は腎不全又は他の疾患の結果としての虚血再灌流損傷の影響を調節するために使用することができる。他の実施形態では、本明細書で報告されている融合構築体は、心臓組織リモデリング（例えば、心臓組織の拡張及び壊死）、例えば、左心室又は右心室（ＬＶ）リモデリングの発症又は進行を調節するために使用することができる。これらの実施形態によると、例えば、本明細書に開示された組成物の投与による介入は、心筋損傷に結び付く場合がある心臓事象の前に又は事象中に又は事象後に、発症、重症度（例えば、損傷）、又は進行を調節することができる。更に他の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、心臓疾患を有する対象体に投与して、急性期又は後期梗塞サイズを縮小することができる。これらの実施形態によると、急性期梗塞は、手術又は他の心臓事象の前（例えばベースライン）、事象中、又は事象の４８時間後に測定されたものであってもよい。他の実施形態では、後期梗塞は、手術又は他の心臓事象の４８時間後又は最大数日若しくは数週間後、例えば心臓事象の７日後に測定されたものであってもよい。更に他の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、心臓事象（例えば、心筋梗塞）を有する対象体を治療して、心臓事象の結果としての心臓の拡張及び機能不全を、これらの組成物で治療されなかった対象体と比較して、約５％、又は約１０％、又は約１５％、又は約２０％、又は約２５％、又は約３０％以上調節するために使用することができる。

ある実施形態は、心臓事象を有する対象体を治療するための組成物に関する。これらの実施形態によると、組成物は、ＡＡＴ−Ｆｃ（ヒンジ欠失又は切断）（例えば、ヒトＡＡＴ又はその断片）、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないその突然変異体、又はその対立遺伝子（例えば、およそ１００個の天然ＡＡＴ変異体が存在する）、又はその類似体、又はその融合タンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧの断片（Ｆｃ））を含むことができる。幾つかの実施形態は、ＬＶリモデリングを調節するために、心臓事象を有するか有していた対象体に天然ＡＡＴを投与することに関する。他の実施形態は、１つ又は複数のカルボキシ末端誘導体又は断片、例えば、３９４ＡＡの天然ＡＡＴの最後の８０ＡＡの断片（配列番号１及び３３）の組成物を投与することに関していてもよい。幾つかの実施形態は、心臓疾患を改善するために、本明細書に開示された組換え的に産生されたＡＡＴ融合ペプチドを用いて、心臓疾患を有する対象体を治療することに関する。

他の実施形態には、本明細書に開示された組成物を使用して、感染症（例えば、細菌性又はウイルス性感染症）を有する対象体を治療すること、又は対象体が感染症に罹患することを予防することが含まれる。ある実施形態では、ウイルス性感染症は、ＨＩＶによる感染症又はインフルエンザ（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ａ型又はＢ型インフルエンザ）であってもよい。他の実施形態では、細菌性感染症は、細菌性肺炎、マイコバクテリア感染、バチルス・アントラシス（ｂａｃｉｌｌｉｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）との接触、又は他の細菌性感染症を含んでいてもよい。

幾つかの実施形態は、移植片拒絶を低減又は予防するための、本明細書に開示された組成物に関する。他の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の発生頻度を低減又は予防するために使用することができる。ある実施形態では、本明細書に開示された組成物は、臓器、組織、又は細胞移植の前、移植中、又は移植後に、対象体を治療するために使用することができる。他の実施形態では、臓器、組織、又は細胞培養を、移植前に及び移植中に臓器、組織、又は細胞培養を保存するために、Ｆｃ−ＡＡＴ（ヒンジ欠失型又は切断型）融合分子を有する組成物と接触させることができる。

ある実施形態では、投与用の組成物は、１ｍｌ又は１ｍｇの製剤当たり約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇの範囲であってもよい。ＡＡＴ又はペプチドと同様の活性を有する治療上有効量のＡＡＴペプチド又は構築体は、モル濃度で測定することができ、約１ｎＭ〜約１０ｍＭの範囲であってもよい。また、薬学的又は美容的に許容される担体と組み合わせた製剤が企図される。正確な用量は、周知の日常的な臨床試験により過度の実験作業を行わずに確立することができる。１つの実施形態では、単一用量（対照と比較した構築体組成物の効力に応じて、例えば、ＩＶ注入により０．６ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇ）の活性薬剤（例えば、ＡＡＴ構築体又はそのＡＡＴペプチド誘導体）を用いて、対象体の疾患を治療することができる。この実施形態によると、対象体は、医療従事者により決定されるように、継続治療で治療することができる（例えば、単一又は複数用量後の５〜１０日間）。他の実施形態には、プラセボ（例えば、ヒト血清アルブミン投与又は他の同様のプラセボ）での対照集団を使用し、プラセボ効果を、本明細書に開示された組成物を受容した集団と比較することが含まれていてもよい。

他の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、対象体が放射線療法及び／又は化学療法を受ける毎に対象体に投与してもよい。本明細書に開示された幾つかの実施形態は、癌治療を受けている対象体の治療に関する。癌治療には、限定するものではないが、以下の治療が含まれる：膀胱癌、乳癌、腎臓癌、白血病、肺癌、骨髄腫、脂肪肉腫、リンパ腫、舌癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、子宮癌、黒色腫、膵臓癌、眼の癌、及び他の公知の癌。

本明細書に開示された幾つかの実施形態は、前立腺癌を有する対象体を治療することに関する。これらの実施形態によると、性交不能又は勃起不全の発症、前立腺癌治療の一般的な副作用を低減するために、前立腺癌を有する男性対象体を、放射線療法及び／又は化学療法の前、療法中、又は療法後に、本明細書に開示された組成物で治療することができる。

ある実施形態では、対象体は哺乳動物である。幾つかの実施形態では、上記哺乳動物は、ヒトである。更に他の実施形態では、対象体は、妊婦又は幼児である。他の実施形態では、対象体は、ペット、飼育動物、又は家畜である。

他の実施形態では、対象体又は哺乳動物は、捕獲された又は捕獲されていない野生動物等の非飼育哺乳動物であってもよい。
ある実施形態では、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないヒトＡＡＴ突然変異体を含む組成物を、記載されている方法で使用するための本明細書に開示された構築体（例えば、ＡＡＴ融合ペプチド誘導体又は反応中心ループ関連突然変異融合ポリペプチド）に使用することができる。これらの実施形態によると、本明細書に開示された組換え分子又は融合タンパク質構築体は、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たない。免疫分子（例えば、Ｆｃ）と結合するこれら構築体を生成することができる。免疫分子との結合を構築体の迅速精製に使用し、それにより精製ステップを低減してＡＡＴ又はそのカルボキシ末端の活性を保存することができる。ある実施形態では、精製ステップは、親和性プロセス（例えば、プロテインＡ）を使用した一段階である。こうしたプロセスは、他の市販の製剤（例えば、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）、Ｚｅｍａｉｒａ（商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ Ｃ（商標）、及びＧｌａｓｓｉａ（商標））で使用される有害精製ステップを低減することにより、本明細書に開示された構築体の立体構造を保存する。他の実施形態は、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を示さないように構成されたＡＡＴ由来断片構築体に関する。本明細書の構築体には、限定するものではないが、以下のものを含む構築体が含まれる：ＡＡＴに対応するカルボキシ末端ペプチド又はアミノ末端ペプチド、それらの類似体、セルピン−酵素複合体（ＳＥＣ）受容体と結合するＡＡＴカルボキシ末端の任意の誘導体、又は免疫分子（例えば、ＩｇＧ分子）と結合するそれらの組み合わせ。

本明細書で企図されている医薬組成物には、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗ウイルス剤、抗病原体剤、抗菌剤、プロテアーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される作用剤が更に含まれていてもよい。これらの作用剤の幾つかには、限定するものではないが、以下のものの１つ又は幾つかが含まれる：インターフェロン、ベータセロン、ベータ−インターフェロンを含むインターフェロン誘導体、イロプロスト、シカプロストを含むプロスタン誘導体；コルチゾール、プレドニゾロン、メチル−プレドニゾロン、デキサメタゾンを含むグルココルチコイド；シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキセートを含む免疫抑制剤；ジロートン、ＭＫ−８８６、ＷＹ−５０２９５、ＳＣ−４５６６２、ＳＣ−４１６６１Ａ、ＢＩ−Ｌ−３５７を含むリポキシゲナーゼ阻害剤；ロイコトリエンアンタゴニスト；ＡＣＴＨ及びその類似体を含むペプチド誘導体；可溶性ＴＮＦ受容体；ＴＮＦ−抗体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の可溶性受容体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の受容体に対する抗体；並びにカルシポトリオール；Ｃｅｌｃｅｐｔ（商標）、ミコフェノール酸モフェチル、及び単独で又は組み合わせのいずれかで採用されるそれらの類似体。

他の実施形態は、癌関連療法を受けている対象体を治療するための併用療法に関する。例えば、本明細書に開示された組成物は、腫瘍を退縮又は除去するか、対象体の腫瘍の転移を低減するか、又は対象体の癌の他の態様を治療することが知られている任意の他の作用剤と組み合わせることができる。

ある実施形態では、本明細書に包含されている組成物で対象体を治療して正常細胞損傷を調節することは、組成物で治療しなかった対象体と比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の調節であり得る。

そのため、当業者であれば、本発明の実施形態の幾つかの特徴及び利点を実施するための他の方法を設計する基盤として、本開示が基づく概念を直ちに使用することができることを認識するであろう。

以下の図面は、本明細書の一部を形成しており、本明細書に開示された実施形態を更に説明するために含まれている。実施形態は、本明細書に示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら図面の１つ又は複数を参照することにより更によく理解することができる。

ある実施形態で組換えＡＡＴを生産するための、本明細書に開示された幾つかの実施形態に使用することが企図されているＡＡＴ構築体の模式図である。また、本発明のある実施形態を使用してＡＡＴペプチド断片を生産することができる。 本明細書に開示された幾つかの実施形態に使用することが企図されている免疫分子に結合されたヒトＡＡＴ構築体の模式図である。 本明細書に開示された実施形態により生成される幾つかの融合分子の泳動を例示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。 本明細書に開示されたＡＡＴ融合分子と接触させたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルにおけるサイトカイン産生（例えば、ＴＮＦα、腫瘍壊死因子−アルファ）をヒストグラムプロットにより示す図である。 市販のＡＡＴ製剤と比較して、本明細書に開示されたＡＡＴ融合分子と接触させたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルにおけるサイトカイン産生（例えば、ＴＮＦα、腫瘍壊死因子−アルファ）をヒストグラムプロットにより示す図である。 ＡＡＴ融合分子（ｒＡＡＴ即ち組換えＡＡＴ）を用いた又は用いないＬＰＳの存在下で又は非存在下での種々の炎症誘発性サイトカインの発現の低減を示す図である。 ＡＡＴ融合分子（ｒｅｃＡＡＴ−Ｆｃ；組換えＦｃ−ＡＡＴ）の量を減少させた場合のＩＬ−１Ｒａ発現の低減を示す図である。 ＡＡＴ融合分子、Ｆｃ−ＡＡＴ２と比べた、血漿由来ＡＡＴの存在下でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ４５陽性細胞の発現パーセントを示す図であり、約１００〜約１０００倍少ない組換えＡＡＴ（Ｆｃ−ＡＡＴ２）が、これらの有害分子に対して同じ阻害効果を示したことが見出された。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体４は、５００ｎｇ又は１００ｎｇのいずれでも、５００μｇの血漿由来ＡＡＴと同様に効果的である。 ＡＡＴ融合分子、Ｆｃ−ＡＡＴ２と比べた、血漿由来ＡＡＴの存在下でのＴＬＲ４発現のパーセントを示す図であり、約１００〜約１０００倍少ない組換えＡＡＴ（Ｆｃ−ＡＡＴ２）が、これらの有害分子に対して同じ阻害効果を示したことが見出された。 ＡＡＴ融合分子、Ｆｃ−ＡＡＴ２と比べた、血漿由来ＡＡＴの存在下でのＴＬＲ２発現のパーセントを示す図であり、約１００〜約１０００倍少ない組換えＡＡＴ（Ｆｃ−ＡＡＴ２）が、これらの有害分子に対して同じ阻害効果を示したことが見出された。 本明細書に開示された幾つかの実施形態の融合分子の関節腫脹に対する効果に関する、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ痛風性関節炎アッセイ（２つのＦｃ ＡＡＴ融合分子の比較）を表すヒストグラムデータプロットを示す図である。 本明細書に開示された幾つかの実施形態の融合分子の関節腫脹に対する効果に関する、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ痛風性関節炎アッセイ（７Ａ）と同じモデルにおけるＩＬ−６産生を表すヒストグラムデータプロットを示す図である。 本明細書に開示された幾つかの実施形態の融合分子の関節腫脹に対する効果に関する、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ痛風性関節炎アッセイ（Ｆｃ ＡＡＴ融合分子対対照）を表すヒストグラムデータプロットを示す図である。 本明細書に開示された幾つかの実施形態の融合分子の関節腫脹に対する効果に関する、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ痛風性関節炎アッセイ（７Ａ）と同じモデルにおけるＦｃ ＡＡＴ融合分子との接触の効果及びＩＬ−１βの経時的な阻害（２４〜７２時間）を表すヒストグラムデータプロットを示す図である。 マウスが虚血再灌流を起こす心筋梗塞誘導マウスモデルを使用した、心臓事象後のＦｃ−ＡＡＴ２（２つの濃度の組換えＡＡＴ）の存在下又は非存在下での梗塞サイズを表すヒストグラムプロットを示す図である。 マウスが虚血再灌流を起こす心筋梗塞誘導マウスモデルを使用した、心臓事象後の、各々が完全Ｆｃに結合された完全ＡＴＴ分子を有する２つのＦｃ−ＡＡＴ（同じ濃度）の存在下又は非存在下での梗塞サイズを表すヒストグラムプロットを示す図である。 本発明のある実施形態のＦｃ−ＡＡＴ融合分子の模式図を示す図である。

定義：
本明細書で使用される場合、「１つ」は、項目の１つ又は複数を意味する場合がある。
本明細書で使用される場合、「約」は、プラス又はマイナス１０％を意味することができ、例えば、約１０分は、９分以上１１分以下を意味することができる。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ−ＡＡＴ」又は「ＡＡＴ−Ｆｃ」は、ＡＡＴ又はＡＡＴカルボキシ末端断片に結合されたＦｃ断片であって、ＡＡＴポリペプチドのカルボキシ端末又はアミノ末端のいずれかに結合されたＦｃ断片を意味する場合がある。

詳細な説明
以下のセクションでは、本発明の種々の実施形態を詳述するために、種々の例示的な組成物及び方法が説明されている。当業者であれば、種々の実施形態の実施は、本明細書で概説されている特定の詳細の全て又は幾つかの使用をさえ必要とせず、むしろ、濃度、時間、及び他の特定の詳細は、日常的な実験作業により改変することができることは明白であろう。ある場合には、周知の方法又は成分は、説明に含まれていない。

ＡＡＴ（アルファ−１アンチトリプシン）抗炎症活性は、従来より、セリンプロテアーゼ、及び特に好中球エラスターゼを阻害するその能力に起因すると考えられてきた。これが、ＡＡＴ欠乏を有するヒトの補充療法にＡＡＴを使用する根拠である。現在、ヒト用に市販されているＡＡＴは、他のＡＡＴ関連活性ではなく、その抗エラスターゼユニットにより標準化されている。こうした市販製剤は、プールされたヒト血漿から精製されるが、他のヒト血清タンパク質を含有しているため（程度の差はあるが）純粋ではない。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの並びにｉｎ ｖｉｖｏモデルでのヒトＡＡＴに関する研究の多くは、各々がヒト用に認可されている、セリンプロテアーゼ阻害活性に対するこれらの市販調製物の使用に依存している。種々のＡＡＴ欠乏疾患を有するヒトへのＡＡＴ注入は、安全であると考えられているが、混入タンパク質の役割は不明である。本明細書の実施形態には、共精製された夾雑物血漿タンパク質の問題を克服するための、高純度及び高活性の組換え形態のＡＡＴの迅速な生産が報告されている。

本明細書に開示された実施形態では、好中球エラスターゼの阻害が、ＡＡＴによる増強治療の治療的利益の唯一の機序であるという長年の概念に関する検証が示されている。本明細書で明らかにされた１つの寄与は、ＡＡＴの精製を支援するだけでなく、天然の市販組成物よりも活性が高い、Ｆｃ融合体等の新規形態のＡＡＴ融合分子の創出である。数十年間にわたり、科学者らは、同様の又は同じ有益な効果を保持する組換え形態のＡＡＴの生成を試みてきたが、そのほとんどは成功していない。Ｆｃ融合タンパク質は、安全性について長い歴史があり、多くは、何十万人の治療に使用されている（例えば、関節リウマチ治療に使用される、例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）及びＡｌａｂａｃｅｐｔ（商標））。本明細書に示されているＦｃ−ＡＡＴ融合分子は、容易に大量に生産及び精製することができ、他の構築体の副作用を低減した。加えて、本明細書に示されている融合構築体は、抗炎症活性及び抗免疫活性等のＡＡＴ活性に関して、市販の製剤（例えば、Ｚｅｍａｉｒａ（商標）、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（商標）等）と比較して、最大１０倍、最大２０倍、最大３０倍、最大４０倍、最大５０倍．．．最大１００倍、及びある場合には最大１，０００倍高い効力を有する。市販の精製血漿由来ＡＡＴ製剤の場合、精製中に抗炎症ドメインを破壊する可能性が高いため、ある態様では、本明細書に示されている融合構築体は、部分的には市販の製剤より優れていると考えられる。ある方法では、血漿由来ＡＡＴの精製における初期ステップの１つは、高度に酸化性の低温アルコール析出である。したがって、本明細書で提供される融合分子は、ＡＡＴ欠乏患者のＣＯＰＤを治療するための、移植片拒絶の影響を低減するための、炎症性疾患を治療するための優れた治療等の臨床適用のいずれかのための、ＡＡＴの優れた代替物を提供する。それは、他の製剤ではＡＡＴ活性が全体として保存されているが、本明細書に開示された製剤は、部分的には、エラスターゼ阻害ではなくＡＡＴの抗炎症ドメインの維持に着目しているからである。

本明細書に開示された他の実施形態は、種々の形態のＡＡＴに結合された修飾Ｆｃ分子に関する。これらの実施形態によると、ＡＡＴ又はＡＡＴのペプチド断片に融合された免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であってもよい。ある実施形態では、ＡＡＴの融合分子は、ＡＡＴとの融合前に１２アミノ酸のヒンジ領域が、突然変異、切断、又は除去されているＩｇＧ２を含んでいてもよい。例えば、本明細書に開示された１つの融合分子は、ＡＡＴに融合されたヒンジ欠失を有するＩｇＧ２（クローン３又はＦｃ３とも呼ばれる）に関する。ＩｇＧ２のヒンジ領域の切断、突然変異、又は除去は、融合分子のｉｎ ｖｉｖｏ副作用を低減する。幾つかの実施形態には、補体及び他の活性を活性化する能力の低減が含まれる。本明細書に開示された融合分子は、天然ＡＡＴ、血漿由来組成物（例えば、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）等の市販の組成物）よりも優れた活性を保持する。

過剰な炎症又は炎症活性化は、幾つかの慢性疾患、例えば、慢性の破壊性又は消耗性疾患の発症、進行、及び破壊的性質をもたらす場合がある。これらには、以下のものに限定されないが、関節リウマチ等の自己免疫疾患、狼瘡（全身性エリトマトーデス）、インスリン産生ベータ細胞が免疫攻撃により破壊される場合がある１型等の糖尿病が含まれる。本明細書に開示された組成物及び方法により治療することができる他の疾患には、２型糖尿病が含まれる。自己免疫疾患に加えて、冠動脈の慢性炎症は、心臓発作又は脳卒中のリスクを増加させる場合がある。また、慢性炎症は、腸の炎症に寄与する（例えば、クローン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、又は潰瘍性大腸炎）。対象体の炎症を制御する幾つかの天然タンパク質は、対象体内で日々産生されている。ＡＡＴは、こうしたタンパク質の１つである。ＡＡＴを用いた療法の１つの欠点は、市販されているＡＡＴが、ヒト供血者の血漿から単離されており、したがって、供給は、入手可能な血漿に制限されるということである。治療用ＡＡＴの用途は、その応用が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及びＡＡＴ補充療法等の現行用途に限定されないため、増加している。

本明細書のある実施形態では、血漿由来ＡＡＴと同様に及びある態様ではそれよりも効率的にＡＡＴ欠乏疾患又はＡＡＴ応答性疾患の治療に機能的である有効な組換え形態のヒトアルファ１アンチトリプシンが報告されている。ある実施形態では、本明細書に開示された組成物及び方法は、免疫分子又はその断片（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）に融合されたＡＡＴ（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）に関する。他の実施形態では、融合タンパク質には、切断型のＡＡＴが含まれていてもよい。これらの実施形態によると、ある融合ポリペプチドは、ＡＡＴ又はその断片のアミノ末端により結合されていてもよい。幾つかの実施形態は、Ｆｃ等の免疫グロブリン分子に融合されたＡＡＴの構築体に関する。ある実施形態では、ＡＡＴ又はそのカルボキシ末端ペプチド断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２に由来するＦｃに結合されていてもよい。例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃは、骨髄性細胞の補体受容体に結合し、ＩｇＧ２は、ある組成物及び方法において優れていることが見出されたため、ＩｇＧ２に由来するＦｃを使用してもよい。

ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩと呼ばれる３つの異なるタイプのＦｃ−ガンマ（γ）受容体が生じ、それらは、ヒト白血球に見出される。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単球、マクロファージ、好中球、骨髄性前駆体、及び樹状細胞上に発現される高親和性受容体である。ＦｃγＲＩは、単量体ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３に対して高い親和性を有するが、ＩｇＧ２には結合しない。ＩｇＧのＦｃ部分に対するＦｃγＲの結合は、炎症性メディエーターの放出を含む細胞のエフェクター機能の誘導を支援することが示されている。

例えば、４つのＩｇＧサブクラスは、それらのエフェクター機能が互いに異なり、例えば、ヒンジ領域の長さ及び柔軟性が異なることが明らかになっている。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順で低下する。Ｆｃ ＩｇＧ２は、ヒンジ領域に１２個のアミノ酸を有しており、Ｆｃ ＩｇＧ１ほど柔軟ではない。補体活性化を含むがそれに限定されない、融合分子の更なるｉｎ ｖｉｖｏ副作用を低減するために、Ｆｃ断片の任意のヒンジ領域を操作して、ヒンジ領域を欠失又は修飾することが企図される。１つ又は複数のアミノ酸を修飾又はこの領域から取り除いて、未修飾対照と比較して、ＡＡＴ活性が増加した融合分子を生成することができる。ある実施形態では、構築体の柔軟性を調節するために、Ｆｃに対するｉｎ ｖｉｖｏ副作用を低減するために、又は本明細書で企図されているＦｃ−ＡＡＴ構築体のＡＡＴ活性を増強するように三次構造を変更するために、ヒンジ領域を短縮してもよい。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されたＦｃ−ＡＡＴ構築体は、血漿由来ＡＡＴ製剤と比較して、半減期の増加を示す。

加えて、Ｆｃ ＩｇＧ２は、プロテアーゼに耐性であり、以前に記載されているように、高親和性ＦｃγＲＩと結合せず、並びに補体を活性化する能力が弱い。ある実施形態では、本明細書で企図されている融合タンパク質に使用されるＦｃは、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２、又はＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来してもよい。他の実施形態では、Ｆｃは、受容体と結合しない突然変異分子であってもよい。更に他の実施形態では、Ｆｃは、ＡＡＴ又はそのカルボキシ末端ペプチドに結合されたＩｇＧ２に由来する野生型又は突然変異形態であってもよい。ある実施形態では、Ｆｃ分子を、ＡＡＴ分子と結合させて、例えば、ジスルフィド結合により結合されたＦｃ−ＡＡＴの２量体を製作してもよい。他の実施形態では、Ｆｃ−ＡＡＴの単量体分子を生成し、本明細書に開示された方法に使用してもよい。開示されたある構築体は、例えば、この領域のアミノ酸を更に取り除くことによりヒンジ領域の柔軟性を更に低減するように、構築体のＦｃが修飾されているＦｃ−ＡＡＴに関する。本明細書に記載の分子はいずれも、例えば、プロテインＡカラム若しくはマトリックス、又は迅速分離用の他の迅速な精製法若しくは濃縮法を使用して迅速に精製し、活性を保存することができる。

本明細書の実施形態では、現行の市販ＡＡＴ組成物よりも優れた特性を有するアルファ−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）又はそのカルボキシ末端断片の構築体の生成が報告されている。他の実施形態では、融合タンパク質又はペプチドを精製するための方法、及び本明細書に開示された精製ＡＡＴ融合分子のその後の使用が報告されている。血漿に由来する市販のＡＡＴは、供給が不足しており、現在、ＡＡＴの重要な特性を破壊する方法により精製されており、合成的に生産されたＡＡＴが、天然型のＡＡＴ又はＡＡＴ由来ペプチドと同様に、そうでなければ天然型のＡＡＴ又はＡＡＴ由来ペプチドよりも良好に作用することが可能であるこの分子の合成型又は最新の精製方法に対する必要性が存在する。

セリンプロテアーゼ阻害以外のＡＡＴ活性に関して、ＡＡＴは、幾つかの機序により抗炎症性特性を発揮する。抗プロテアーゼ部位の突然変異（例えば、抗プロテアーゼ活性を無視できるレベルに低減するための）を使用した予備的データは、ＡＡＴの活性は、ＡＡＴの抗プロテアーゼ特性を必要としないという概念を支持する。ある実施形態では、分子の抗炎症特性を評価するために、天然ヒトＡＡＴ（例えば、３９４ＡＡ、Ｍ_ｒが約５１，０００）の様々な組換え切断型及び突然変異型が生成される。この手法により、種々の組成のＡＡＴ分子を産生することが可能になり、それは、血漿由来ＡＡＴの標準的方法を使用することでは非常に困難であり、不可能に近い。ＡＡＴの抗炎症特性は、現在用いられている市販組成物の精製手順により酸化される場合があることが示された。本明細書に開示された方法は、記載されている融合分子及び構築体のこの活性を保存するための優れた精製法を提供する。

以前に開示されているある方法では、ＡＡＴが、マウスモデル及びヒト膵島細胞でＩＬ−１βの毒性活性を阻止することが示されている。本明細書の幾つかの実施形態は、この活性を模倣することが可能なＡＡＴ融合分子の組換え体産生に関する。ある実施形態では、ＩＬ−１βの毒性活性又は産生を阻止するための、及びカスパーゼ−１活性を低減するための、組換え的に産生されるヒトＡＡＴのカルボキシル末端領域の融合ペプチドが生成される（実施例セクションを参照）。これら融合ペプチドは、炎症誘発性分子の産生又は活性を阻止又は低減するのに有用であり、したがって、多くの健康状態の治療及び予防に有用である。

アルファ１−アンチトリプシン又はα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤として最初に分類された。ＡＡＴは、一般的に、血清トリプシン阻害剤として知られている。また、ＡＡＴは、多種多様なプロテアーゼを阻害するため、アルファ−１プロテイナーゼインヒビター（Ａ１ＰＩ）と呼ばれる場合がある。ＡＡＴは、炎症細胞の酵素、特に好中球のエラスターゼから組織を保護し、典型的には、約１．５〜３．５グラム／リットルの血中範囲を有するが、濃度は、急性炎症時に何倍にも上昇する場合がある。α_１−アンチトリプシンの１００個を超える様々な変異体が、種々の集団で記録されている。最も一般的な種類のＡＡＴは、ＩＥＦゲルでの泳動に基づき、Ｍと命名されている。他の変異体は、Ｍバンドに対して近位に泳動するか又は遠位に泳動するかに応じて、Ａ〜Ｌ及びＮ〜Ｚと命名されている。ＩＥＦに異常なバンドが存在することは、ＡＡＴ欠乏の存在を示す場合がある。上記に示されているように、Ｍ型ＡＡＴには幾つかのサブタイプがあり、それらサブタイプは全て、本明細書での使用が企図されている。

ＡＡＴの治療用濃縮物を得るための現在の傾向は、供血者の血漿からＡＡＴを調製することである。供血者の血漿は、供給が限られており、商品にするのに多大な精製ステップが必要である。これまでのところ、米国食品医薬品局は、ヒト血漿に由来する幾つかの市販製品の使用を認可している。例えば、これらの製品の幾つかには、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ Ｃ（商標）（Ｔａｌｅｃｒｉｓ社（現在はＧｒｉｆｏｌｓ社、ローリー市、ノースカロライナ州）、Ｚｅｍａｉｒａ（商標）、及びＡｒａｌａｓｔ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ社）が含まれる。Ｋａｍａｄａ社は、エアゾル用製品及び静脈内注射用製品を両方とも有する（Ｋａｍａｄａ社、イスラエル）。これらの製剤のほとんどは、ＡＡＴ欠乏患者のＡＡＴ療法のために静脈内投与され、１患者当たり年間１００，０００ドルもの費用がかかる場合がある。血漿から単離されたＡＡＴは、血液由来のＡＡＴと比較して活性の低減を示す。本明細書に開示された組成物は、血漿由来ＡＡＴではなく血液のＡＴＴに類似した抗炎症活性の増加を示し、抗プロテアーゼ活性に基づく活性を有する市販の製剤よりも高い活性を示した。

１つの研究では、ＦＤＡ認可製品のうち３つが、その一次構造及びグリコシル化の点で分析及び比較された。製品の幾つかは、正常ヒト血漿ＡＡＴと比較して、精製手順中に導入された可能性が高い相違を示した。加えて、ある研究では、セリンプロテアーゼ阻害活性及びＡＡＴ純度に関して大きなばらつきがあることが、市販の製剤を比較することにより以前に示された。最近、標準的な市販製剤の１つであるＰｒｏｌａｓｔｉｎ（商標）が評価されたが、新しい製剤であるＰｒｏｌａｓｔｉｎ Ｃ（商標）は、最終製品の抗プロテアーゼ活性（例えば、セリンプロテアーゼ阻害活性）を増加させるために、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（商標）とは精製が異なっていた。これら製品の報告された活性は全て、抗炎症性でないセリンプロテアーゼ阻害活性、又は免疫調節活性、又は別のＡＡＴ関連活性に向けられている。

ある実施形態では、本明細書で生成された組成物は、エアゾル製剤とした時、部分的には静脈内注射法よりも下気道に到達するため、他の形態よりも有用である場合がある。本明細書では、構築体製剤はいずれも、当技術分野で知られている任意の方法により、薬学的に許容される製剤として、対象体に導入することができることが企図されている。

血漿由来ＡＡＴ製剤を向上させる試みにも関わらず、ＡＡＴを調製するために利用可能な血漿の供給には限りがあり、生産が高価である。したがって、組換えＡＡＴ分子が求められている。組換えＡＡＴ分子を開発する研究者が直面した問題の１つは、血漿由来製剤と比較して、これらの分子は活性が低いということである。以前に生成された組換え分子は、セリンプロテアーゼ阻害剤アッセイにより分析すると、以前に適用されている市販製剤と比較して活性が低いことが多かった。したがって、血漿の供給に限りがあり、過去の組換えＡＡＴ分子が劣っているため、過去に又は最近発見された方法のために適切な供給量のＡＡＴを生成する余地が残されている。

本明細書の幾つかの実施形態は、当技術分野で知られている任意のＡＡＴ法又は治療に使用される市販の製剤と比べて、高度に活性で、高度に機能的な組換えＡＡＴ構築体を生成することに関する。ある実施形態では、本明細書に開示された組換えＡＡＴは、全長分子又はそのカルボキシ末端ペプチド誘導体を含む。幾つかの実施形態は、各々が免疫学的要素（例えば、Ｆｃ断片又は他の断片）と結合されており、共精製される、ＡＡＴ分子を有する複数の構築体の同時合成に関する。他の実施形態は、例えば、１つ又は複数の免疫分子と結合して、本明細書に開示された方法及び使用のための構築体を形成する分子の最後の８０、７０、６０、４０、３０個のアミノ酸の断片又はカルボキシ末端の他の断片を含む、ＡＡＴの１つ又は複数のカルボキシ末端誘導体又は断片の構築体を生成することに関する。

本明細書中で企図されている構築体のＡＡＴ分子は、天然アルファ−１アンチトリプシン（例えば、ヒト又は他の哺乳動物）又はその断片若しくは誘導体、又はＡＡＴの突然変異型、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たない任意のＡＡＴ、又はそれらの対立遺伝子（例えば、およそ１００個の天然ＡＡＴ変異体が存在する）、又はそれらの類似体、又はそれらの融合タンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧの断片）に関する。これらの実施形態によると、構築体は、各々が免疫学的断片（例えば、２分子のＡＡＴに結合されたＦｃ断片）に結合されている２量体ＡＡＴ構築体を含むことができ、このＦｃ−ＡＡＴ構築体は、１つ又は複数のジスルフィド結合により共に結合されている。例えば、本明細書に開示されている図１及び図２を参照されたい。ある方法では、組換えＡＡＴ又はＡＡＴペプチドと免疫分子との複合体の精製は、精製ステップを顕著に減らして、ＡＡＴ又はＡＡＴペプチドの効力を顕著に増加させることにより、ＡＡＴ又はＡＡＴペプチドの活性を増加させる。これらの実施形態によると、本明細書で企図された組換えＡＡＴ分子は、融合ポリペプチド（２量体又は単量体形態）として使用してもよく、又は精製後にその免疫分子から切り離してもよく、市販の製剤よりも低い濃度で使用することができる。幾つかの実施形態は、市販の製剤と比較して、１／１００〜１／１０００の濃度を使用することに関する。ある例では、これらの分子は、対照と比較して（例えば、天然ＡＡＴの典型的な精製及び市販製剤の精製）、サイトカインを阻害するか又は分子の免疫及び炎症機能を調節するための組成物に使用することができる。１つの実施形態では、本出願の組換え分子は、市販の製剤よりも１００〜１０００倍高い活性を示した。本発明のＡＡＴ構築体に関して興味の対象となっていることが知られている活性には、免疫調節活性又は炎症調節活性が含まれる。幾つかの実施形態では、本明細書に開示された構築体は、市販の組成物と比較して、ＩＬ−１β受容体アンタゴニスト活性の増加を示した。

健康状態の治療における組換えＡＡＴの使用
本明細書で報告されている幾つかの実施形態は、組換えＡＡＴ又は融合タンパク質、又はそのカルボキシ末端断片融合分子を使用して、ＡＡＴ療法、ＡＡＴ置換、又はＡＡＴ補充を必要とする対象体を治療することに関する。ＡＡＴ治療は、限定するものではないが、以下のものを含む種々の疾患での使用が報告されている：アポトーシス関連疾患、酸化窒素関連疾患、虚血再灌流機能不全誘導性疾患、移植片拒絶及び細胞拒絶、糖尿病、気腫、他の肺疾患、細菌性感染症の治療及び予防、ウイルス性感染症の治療及び予防、及び放射線誘導性傷害等。

本明細書の幾つかの実施形態は、炎症性障害（例えば、ＩＢＤ、クローン病、関節炎）を治療するために使用される、本明細書に開示された融合分子の組成物に関する。幾つかの実施形態では、本明細書に開示された融合分子は、市販のＡＡＴ組成物と比較して、増強した抗炎症活性を有する。幾つかの実施形態は、合成的に生成されたＡＡＴ又はそのカルボキシ末端切断型（例えば、ＡＡＴの最後の３６〜８０個のアミノ酸）に融合されたヒンジ欠失型、切断型、又は突然変異型ＩｇＧ２ Ｆｃに関する。１つの実施形態では、Ｆｃ−ＡＡＴは、合成的に生成された完全なＡＡＴ分子に結合されて、ある場合にはクローン３として参照されるものを形成する、アミノ酸２個のリンカーを有するＩｇＧ２ヒンジ欠失を含む。

ある実施形態では、本明細書中に開示された組成物及び方法は、対象体の炎症性腸障害の発症を低減又は予防するために使用することができる。これらの実施形態によると、対象体のＩＢＳ関連疾患の低減は、約１０〜２０％、又は約３０〜４０％、又は約５０〜６０％、又は約７５〜１００％程度の低減又は阻害であってもよい。これらの実施形態によると、ＩＢＳ又はＩＢＤを有する対象体は、ＡＡＴ又はＡＡＴ−カルボキシ末端ペプチドの組換え又は融合タンパク質（ヒンジ欠失又はヒンジ切断を有するＦｃ−ＡＡＴ）の薬学的に許容される組成物を用いて治療して、そのような組成物を受容しない対照対象体と比較して、消耗を低減するか、又は喪失を低減するか、又はバリア機能を回復させることができる。他の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、炎症性腸障害の発症を低減するために使用することができる。

本明細書の幾つかの実施形態は、急性又は慢性疾患を有する対象体の腸又は腸管過透過性を回復させることに関する。これらの実施形態によると、腸又は腸管過透過性又はバリア機能の喪失は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、炎症性腸疾患、１型糖尿病、アレルギー、及び喘息等の慢性疾患による場合がある。ある実施形態では、医療従事者は、腸又は腸管過透過性を有する対象体を、１日１回、週２回、週１回等の所定の投薬計画、又は他の所定の投薬計画で治療することができる。

ある実施形態では、本明細書に開示された組成物は、限定するものではないが、糖尿病（例えば、１型及び２型）、自己免疫疾患等の免疫疾患、炎症性疾患、心障害、及び感染症等を含むある徴候を治療するために使用することができる。本明細書に開示された幾つかの疾患は、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は肺疾患等とみなすことができる喘息のように、複数の範疇に入る場合がある。ある実施形態では、本明細書に開示された組成物には、限定するものではないが、以下のものを含む自己免疫疾患を治療するために使用することができる：関節リウマチ等のリウマチ性疾患、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、並びに甲状腺、腸、及び中枢神経系の自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合性結合組織疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群、及びベーチェット病）；中枢神経系の自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、又は脳脊髄炎）；消化器系の自己免疫疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、スプルー）；甲状腺の自己免疫疾患（例えば、橋本甲状腺炎、又はグレーブス病）及び眼の自己免疫疾患（例えば、ブドウ膜炎）。本明細書で企図されている自己免疫障害は、以下のものに関していてもよい：円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、クローン病、円盤状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、ギラン−バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少症紫斑（ＩＴＰ）、過敏性大腸疾患（ＩＢＤ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、１型又は免疫媒介性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎等の血管炎、尋常性白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患、リウマチ性疾患、リウマチ性関節炎、及びエリテマトーデス。

他の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、限定するものではないが、アレルギー性障害、又は例えば、関節炎、炎症性骨溶解症、喘息、慢性炎症（例えば、慢性ウイルス性又は細菌性感染症に由来する）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬（例えば、プラーク乾癬、膿胞性乾癬、乾癬性紅皮症、滴状乾癬、又は逆乾癬）、肺線維症、未分化関節症、未分化脊椎関節障害を含む炎症性疾患等の疾患を治療することが含まれ得る。他の疾患には、限定するものではないが、呼吸異常、例えば、喘息、ＣＯＰＤ、気腫が含まれ得る。ある実施形態は、融合分子がＦｃ−ＡＡＴ（ヒンジ欠失型又はヒンジ切断型）を含む、組換え的に産生された融合分子の形態のＡＡＴを１０倍〜１００倍少ない量で使用し、月１回、週１回、２週に１回、１日１回、１日２回、又は他の投与計画で対象体を治療して、炎症の有害効果を低減することに関する。ある例では、Ｆｃ−ＡＡＴ３又はＦｃ−ＡＡＴ４を組成物に使用して、これらの障害の有害効果を阻害し、それらの関連疾患を改善することができる。

放射線防護及び癌
ある実施形態では、組成物（例えば、構築体組成物）及び方法は、対象に対する放射線の有害効果を調節することに関する。幾つかの実施形態では、組成物及び方法は、例えば癌を有するか又は悪性腫瘍の発生が疑われるか又は細胞増殖制御不能の対象体に投与される場合、放射線療法又は放射線を受けている対象体を治療することに関する。本明細書に開示された他の実施形態は、部分的には放射線治療の有害作用を低減するために、例えば偶発的に又は意図的な行為により放射線に被曝した対象を治療することに関する。

本明細書に開示された幾つかの実施形態は、癌治療を受けている対象体の治療に関する。これらの実施形態によると、癌治療を受けている対象体は、本明細書に開示された組成物で治療して、治療の有害効果（例えば、放射線及び／又は化学療法による治療に由来する）を低減又は予防することができる。癌治療には、限定するものではないが、膀胱癌、乳癌、腎臓癌、白血病、肺癌、骨髄腫、脂肪肉腫、リンパ腫、舌癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、子宮癌、黒色腫、膵臓癌、脳腫瘍、眼癌、皮膚癌、及び他の公知の癌の治療が含まれる。

他の実施形態では、本明細書に開示された組成物は、癌を有する対象体を治療するために使用することができる。これらの実施形態のために企図されている癌には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、カポージ肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管がん、絨毛膜癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、又は他の公知の癌。

本明細書に開示された放射線防護及び組成物に関する他の実施形態は、三叉神経痛の治療、重篤な甲状腺眼疾患の治療、翼状片の治療、色素性絨毛結節性滑膜炎の治療、ケロイド瘢痕増殖の予防、異所性骨化の予防、美容手術又は再建手術の応用手術（例えば、瘢痕形成の縮小）、化学療法中、ホルモン療法との併用、及び／又は免疫療法の組み合わせに関していてもよい。

ある副作用は、放射線被曝中に、及び放射線療法又は化学療法の副作用としてでさえ発生する場合がある。本明細書の幾つかの実施形態は、本明細書に開示された組成物で対象体を治療することにより、対象体におけるこれらの副作用を低減又は予防することに関する。組成物には、ＡＡＴ、ＡＡＴカルボキシ末端ペプチド（例えば、８０マー、３６マー等）、組換え／融合形態のＡＡＴ、及び／又は組換え／融合形態のＡＡＴカルボキシ末端ペプチドが含まれ得る。放射線療法の副作用には、限定するものではないが、細胞損傷、痛み、膨潤、局所刺激、線維症、瘢痕、組織完全性の喪失、組織脆弱性の増加、嚥下困難、及び放射線治療又は被爆に伴う他の症状が含まれ得る。低減又は予防することができる他の副作用は、例えば、骨髄移植中の全身照射（ＴＢＩ）に由来する副作用に関する。これらの副作用には、上記のものに加えて、急性及び慢性免疫不全症及び日和見感染が含まれ得る。

本明細書に開示された幾つかの実施形態は、前立腺癌を有するか又は発症が疑われる対象体を治療することに関する。これらの実施形態によると、これらの療法に起因する副作用を低減するために、前立腺癌を有するか又は発症が疑われる男性対象体を、放射線療法及び／又は化学療法の前、療法中、又は療法後に、本明細書に開示された組成物で治療することができる。例えば、副作用は、限定するものではないが、性交不能又は勃起不全の発症であってもよい。

本明細書で企図されている他の疾患には、以下のものが含まれる：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ又は狼瘡）、慢性関節リウマチ、敗血症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ又は狼瘡）、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、自己免疫疾患、粥状動脈硬化症、アルツハイマー病、関節炎、筋ジストロフィー、ダウン症候群、多発性硬化症、脳卒中、神経変性障害、他の炎症性疾患又は症状、及び血清反応陰性脊椎関節症。

ある実施形態では、本明細書に開示された組成物は、敗血症ショックの対象体を治療するために使用することができる（これらの確認研究の動物モデルを参照：Ｄｏｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ 第１１９巻、１０月１０日号、２００９年；ｆｏｒ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｐｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）。血漿由来ＡＡＴは、マウスモデル及びヒトコホート研究にて、ウイルス性感染症及び細菌性感染症の両方を治療するために全身性に使用することができることが示されており、したがって、血漿由来ＡＡＴと比較して向上したことが示されたＦｃ−ＡＡＴ（Ｆｃのヒンジ欠失又はヒンジ切断型、例えば、ＦｃＡＡＴ３）を、敗血症の治療に使用することができる。例えば、１つ又は複数の感染症又は他の原因による敗血症を有する対象体は、本明細書に開示された組成物で治療して、対象体の疾患を改善し、潜在的に死亡を防止することができる。

ある実施形態では、対象体は、哺乳動物である。幾つかの実施形態では、上記哺乳動物は、ヒトである。更に他の実施形態では、対象体は、男性、女性、妊娠している女性、幼児、又は年少者である。

移植片拒絶及び移植片生着
他の実施形態では、本明細書で企図されている組換え又は融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ−ＡＡＴ又はＦｃ−ＡＡＴ断片）は、臓器又は非臓器（例えば、細胞）移植等の移植を受けている対象体を治療するために使用することができる。ある実施形態では、細胞移植には、骨髄、膵島細胞（例えば、膵島移植）、角膜細胞、幹細胞、皮膚（例えば、細胞性又はより大型の）、死体からの一時的な皮膚移植（例えば、軟組織、顔面組織又はその他）、又は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）等の細胞移植拒絶反応に関連する症状が含まれ得る。本発明の実施形態は、移植を受けたか又は移植を必要とする対象体が経験する症状又は徴候を改善するための方法を提供する。これらの実施形態によると、症状又は徴候には、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）又は移植片拒絶に伴う疾患が含まれていてもよい。１つの例では、本明細書に開示された方法は、骨髄移植を受けた対象体を治療するために使用することができる。他の実施形態では、本明細書に開示された方法は、幹細胞又は他の細胞移植を受けた対象体を治療するために使用することができる。これらの実施形態によると、対象体を治療して、移植拒絶を低減し、移植片の細胞を保存し、及び／又は移植した細胞（移植片）の生着を延長することができる。他の実施形態には、心臓、肺、腸、肝臓、膵臓、腎臓、又は他の臓器移植等の臓器移植を受けている対象体を治療することが含まれ得る。

１つの例では、本明細書に開示された方法は、骨髄移植を受けている対象体を治療するために使用することができる。これらの実施形態によると、骨髄移植の前、移植中、又は移植後に対象体を治療して、対象体の移植片拒絶及び／又はＧＶＨＤを低減又は予防することができる。

他の実施形態では、本明細書に開示された組成物及び方法は、移植臓器拒絶の発生を予防又は低減することに関する。他の実施形態では、本明細書に開示された組成物及び方法は、臓器移植の延長に関する。本明細書で企図されている移植は、腎移植、心移植、肝移植、軟組織移植、顔面成分移植、腸管移植、及び膵移植に関していてもよい。加えて、本明細書に開示された組成物は、臓器又は非臓器の移植に伴う症状の軽減又は予防に関する場合がある。移植を受けている対象体を本明細書に開示された組成物を用いて治療することにより、低減又は予防することができる症状には、移植片拒絶、腎不全、肺不全、心不全、粘膜潰瘍、膵島機能低下（グルコース増加、真性糖尿病）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、胃腸（ＧＩ）潰瘍、肺不全、皮膚潰瘍、凝血異常、ＣＮＳ機能不全、及び昏睡が含まれ得る。

本発明の更に他の態様は、移植前の臓器又は細胞の保存に関する。例えば、凍結保護又は輸送中の保護又は他の保存方法は、臓器、組織、又は細胞を、本明細書に開示された組成物と接触させることにより向上させることができる。本明細書のある実施形態は、移植又は凍結保護に備えて、臓器、組織、又は細胞を保存するために、本明細書に開示された組成物を使用することに関する。これらの実施形態によると、臓器、組織、又は細胞には、明細書に開示されたもの、例えば、膵島細胞、幹細胞、骨髄細胞、腎臓、肝臓、肺、及び他の臓器又は細胞移植片のいずれが含まれていてもよい。

本発明の実施形態は、それを必要とする対象体に、組換えＡＡＴ又はその融合タンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む治療上有効量の組成物を投与することを含む、対象体の移植片生着及び機能の延長を促進するための方法を提供する。

本発明のある実施形態では、本明細書に開示された組成物には、併用療法が更に含まれていてもよい。例えば、併用療法には、以下のものの１つ又は複数が含まれていてもよい：インターフェロン、ベータセロンを含むインターフェロン誘導体、β−インターフェロン、イロプロスト、シカプロストを含むプロスタン誘導体；コルチゾール、プレドニゾロン、メチル−プレドニゾロン、デキサメタゾンを含むグルココルチコイド；シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキセートを含む免疫抑制剤；ジロートン、ＭＫ−８８６、ＷＹ−５０２９５、ＳＣ−４５６６２、ＳＣ−４１６６１Ａ、ＢＩ−Ｌ−３５７を含むリポキシゲナーゼ阻害剤；ロイコトリエンアンタゴニスト；ＡＣＴＨ及びその類似体を含むペプチド誘導体；可溶性ＴＮＦ受容体；ＴＮＦ−抗体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の可溶性受容体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の受容体に対する抗体；及びカルシポトリオール；Ｃｅｌｃｅｐｔ（商標）、ミコフェノール酸モフェチル、及び単独で又は組み合わせのいずれかで採用されるそれらの類似体。

形成外科手術及び瘢痕の低減／予防
本明細書に開示された他の態様は、副作用の低減、及び再建外科手術からの回復向上、又は美容外科手術の向上に関する（例えば、選択的、美容的、熱傷被害者、又は放射線等の治療を原因とするもの）。再建形成外科手術は、例えば、熱傷；顔面骨折及び破断等の外傷；口蓋裂又は口唇裂等の先天性異常；発育異常；ウイルス性又は細菌性感染症及び疾患；及び癌又は腫瘍により引き起こされる機能障害を矯正するために実施される場合がある。再建形成外科手術は、機能を向上させるために実施される場合があるが、対象体を正常な外観に再形成するために実施してもよい。

最も一般的な再建手術の１つは、腫瘍摘出、裂傷修復、瘢痕修復、手の手術、及び乳房縮小術である。幾つかの他の一般的な再建外科手術には、乳房切除術後の乳房再建術、口唇口蓋裂術、熱傷生存者の拘縮手術、及び先天的に欠損している場合に新しい外耳を形成することが含まれる。医療従事者は、局所組織が利用可能でない場合、顕微手術を使用して組織を移植し、欠損を被覆することが多い。皮膚の皮弁、筋肉、硬骨、脂肪、又は組み合わせを、対象体自身の体内から切除して、体内の別の部位に移動させ、血液供給等に再結合することができる。したがって、本明細書に開示された組成物は、該当する場合、再建外科手術又は美容外科手術の前に、手術中に、又は手術後に、瘢痕を低減し、組織移植及び保持（例えば、移植片拒絶及び瘢痕の低減）を向上させるために使用することができる。ある実施形態では、Ｆｃ−ＡＡＴ（ヒンジ欠失又は完全なヒンジ領域）等のＡＡＴ融合分子を含む治療用組成物を使用して、炎症の予防又は低減等の美容手術及び再建手術の副作用、膨潤及び組織損傷に結び付く場合があるこれらの外科手術の一般的な副作用を低減することができる。他の実施形態には、本明細書に開示された組成物を使用して、再建手術を受けたか又は受けている対象体を治療して、回復時間を短縮し、再建プロセスを向上させ、そのようなプロセスを受けている対象体の炎症反応及び免疫反応を増強又は改善することが含まれていてもよい。本明細書に開示された組成物を使用して、医療従事者により決定される必要性に応じて全身的に又は患部に直接塗布（例えば、軟膏剤又はローション剤又は他の様式として塗布される）することにより対象体を治療することができる。

糖尿病
幾つかの実施形態は、本明細書に開示された組成物を使用して、糖尿病を有するか又は発症の疑いがある対象体を治療することに関する。これらの実施形態によると、糖尿病を有する任意の対象体に、本明細書に開示された組成物を投与して、対象体の疾患を治療することができる。１型又は２型糖尿病を有する対象体を、本明細書に開示された組成物で治療することができる。これらの治療は、当技術分野で知られている糖尿病のあらゆる治療と併用することができる。ある実施形態では、本明細書に開示された組成物は、糖尿病を有する対象体を治療するために現在入手可能な市販製剤と比較して、低いレベル（例えば、濃度）で対象体に投与することができる。これらの実施形態によると、糖尿病を有する対象体は、５年以内に診断された早期発症１型糖尿病を有する対象体であって、例えば、検出可能なｃ−ペプチドレベル、及び／又は検出可能なインスリン産生、及び／又は残存膵島細胞機能を有する対象体であってもよい。

他の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、膵島細胞機能を保存又は回復させるために）又はｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、移植の輸送中に）膵島細胞を保護するために、本明細書に開示された組成物を使用することに関していてもよい。本明細書に開示された組成物を使用して、ある程度の残存膵島細胞機能を有する糖尿病対象体を治療することができ、及び／又は膵島細胞の完全性及び機能を保存するために膵島細胞を対象体に移植する前に膵島細胞を処理することができることが企図される。したがって、対象体は、膵島細胞移植の前に、又は移植中に、又は移植後に治療されることが企図される。他の実施形態では、糖尿病治療には、インスリン抵抗性糖尿病、Ｉ型、及びＩＩ型を有する対象体を治療することが含まれていてもよい。本明細書に開示されたＦｃ−ＡＡＴ融合分子は、顕著に低い濃度においてでさえ、血漿由来ＡＡＴで観察されるように炎症誘発性サイトカインの産生を調節可能であることが示された。Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子（ヒンジ欠失型又はヒンジ切断型）を含む組成物を使用して、それを必要とする対象体の膵島細胞集団を保存することができる。

心臓疾患
本発明の幾つかの実施形態は、心臓疾患を有するか又は心臓の介入措置（例えば、外科手術、予防的治療）を受けている対象体を治療することを含む。これらの実施形態によると、心臓疾患を有する対象体は、限定するものではないが、以下の症状の１つ又は複数を有していてもよい：梗塞、心筋虚血、慢性全身性の動脈性及び静脈性高血圧、肺性の動脈性及び静脈性高血圧、先天性心疾患（心臓内シャンティングを伴うもの及び伴わないもの）、弁膜性心疾患、特発性拡張型心筋症、感染性及び非感染性心筋炎、ストレス心筋症（重症管理疾病、身体的及び感情的ストレス、及び頭蓋内出血及び脳卒中に伴って観察されるような）、敗血性心筋症、心房性及び心室性不整脈、心内膜炎、心膜炎、心筋への損傷、心筋麻痺、心拍停止、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、心筋虚血再灌流傷害、心室リモデリング、求心性肥大、遠心性肥大、及び他の公知の心臓疾患。

ある実施形態では、心筋梗塞を有するか又は有する疑いのある対象体に、本明細書に開示された組成物を投与して、心臓疾患の症状又は副作用等の症状を改善することができる。ある実施形態では、Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子及び薬学的に許容される担体を含む、本明細書に開示された組成物を使用して、心臓の心室リモデリングを低減又は予防するか、又は虚血再灌流の影響を低減することができる。本明細書に開示された任意の心臓疾患を治療するための方法には、心臓事象の前に、事象中に、又は事象後に組成物を投与することが含まれていてもよい。ある実施形態では、組成物は、心臓事象が対象体に生じた後、医療従事者が最も有益であると決定した期間にわたって対象体に投与することができる。例えば、対象体は、事象後、最大１週間、最大２週間、又はそれを超える期間、組成物で治療することができる。ある実施形態では、本明細書に記載の対象体に投与される組成物は、例えば組換え又はＦｃ−ＡＡＴ融合分子で１用量当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ等、市販のＡＡＴ製剤（例えば、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）、Ｚｅｍａｉｒａ（商標）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ Ｃ（商標））の使用量と比べて、５倍、１０倍、１００倍、又は１，０００倍少ない場合がある。

胃腸障害
本発明の幾つかの実施形態には、胃腸のある症状又は疾患（例えば、間欠性疾患、単発性疾患、又は慢性疾患）、又は炎症性腸障害を有する対象体を治療することが含まれる。これらの実施形態によると、胃腸の疾患を有する対象体は、限定するものではないが、以下の疾患の１つ又は複数を有していてもよい：炎症性腸疾患（例えば、ＩＢＳ又はＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、アレルギー関連腸疾患、１型糖尿病関連腸疾患、他の大腸炎タイプ（例えば、コラーゲン大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、不確定大腸炎）、腸の炎症に伴うベーチェット症候群及び他の腸障害。ある実施形態では、腸障害の症状又は副作用は、本明細書に開示された組成物により治療することができる。例えば、腸障害の副作用には、限定するものではないが、皮膚症状、体重減少、結腸短縮、腸粘膜、腸又は腸管過透過性が含まれ、それらは、Ｆｃ−ＡＡＴ融合構築体（例えば、ヒンジ欠失又はヒンジ切断型）及び薬学的に許容される担体を有する組成物で改善することができる。ある実施形態には、本明細書に開示された組成物を用いて腸障害を有する対象体を治療して、障害を有する対象体の体重減少を低減又は予防することが含まれていてもよい。本明細書に開示された組成物は、Ｆｃ−ＡＡＴ（ＩｇＧ１）が、胃腸マウスモデルで示された血漿由来ＡＡＴよりも優れた抗炎症活性を有しており、Ｆｃ−ＡＡＴ３（ＩｇＧ１に由来するＦｃのヒンジ欠失型）が、Ｆｃ−ＡＡＴ（ＩｇＧ１）と同様の抗炎症活性を有するという以前の観察により支援される。

細菌性疾患
本発明の幾つかの実施形態には、細菌性感染症を有する対象体を治療することが含まれる。他の実施形態には、対象体の細菌性感染症を予防するために、本明細書に開示された組成物を投与することが含まれていてもよい。本明細書で企図されている細菌性感染症には、限定するものではないが、グラム陰性又はグラム陽性細菌又はミコバクテリウム生物が含まれていてもよい。グラム陰性細菌には、限定するものではないが、以下のものが含まれていてもよい：Ｎ．ゴノレア（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎ ｉｎｇｉｔｉｄｉ）、Ｍ．カタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｊｉｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、全てのクレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ ｓｐｐ）、全てのエンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）全てのセラチア種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．）、全てのサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、全てのプロビデンシア種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐｐ．）、全てのモルガネラ種（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、全てのシトロバクター種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、全てのパスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、全てのエロモナス種（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、シュードモナス−セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、全てのシゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、全てのアシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、全てのレジオネラ種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、Ｙ．エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、他のエルジニア症（Ｙｅｒｓｉｎｏｉｉｏｓｉｓ）、Ｈ．デュクレー（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｅｉｉ）、全てのクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｉｄｉａ ｓｐｐ．）、マイコプラズマ肺炎、ミコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｐ．メラニノゲニカ（Ｐ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、全てのモラクセラ属種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐｐ．）全てのボルテデラ種（Ｂｏｒｔｅｄｅｌｌａ ｓｐｐ．）、及びＰ．マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）。

本明細書で企図されているミコバクテリアには、限定するものではないが、以下のものが含まれる：Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）生物、及びＭ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ． ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ハンセン病を引き起こす（癩菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、Ｍ．フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖａｓｃｅｎｓ）、Ｍ．レプラムリウム（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、Ｍ．ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ．ケロネイ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ）、Ｍ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ．マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｉｕｍ）、Ｍ．ブルーリ（Ｍ．ｂｕｒｕｌｉ）、Ｍ．フォーツイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ヘモフィルム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．リットラレ（Ｍ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、Ｍ．マルモエンセ（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、Ｍ．マリアヌム（Ｍ．ｍａｒｉａｎｕｍ）、Ｍ．シミアエ（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、Ｍ．ツルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、Ｍ．ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、Ｍ．フレイ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、Ｍ．ノンクロモゲニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｍ．テラエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、Ｍ．トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌ）、Ｍ．スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、Ｍ．ゼノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．ヘモフィルム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｍ．ゲナベンセ（Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）、Ｍ．シミアエ、Ｍ．バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）。

本明細書で企図されているグラム陽性細菌には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＧストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｌｌｅｒｉ）群、緑色連鎖球菌（Ｖｉｒｉｄａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、全てのリステリア種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、全てのスタフィロコッカス種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）、Ｓ．アウレウス（ＭＲＳＡ）、Ｓエピデルミデス（Ｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、全てのクロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、Ｃ．ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｔｈｅｒｉｅａ）、Ｃ．ジェイケイウム（Ｃ．ｊｅｉｋｉｕｍ）、全てのロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、全てのリューコノストック種（Ｌｅｕｋｏｎｏｓｔｏｃ ｓｓｐ．）、及びバチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（例えば、炭疽病を引き起こす）。

ある実施形態では、本明細書に開示された組成物を使用して、細菌性疾患を有する対象体を治療し、細菌関連疾患の発症を低減又は予防することができる。
更に他の実施形態は、対象体の敗血症ショックを治療又は低減することに関する。敗血症ショックは、対象体の全身性細菌性感染症、例えば、グラム陰性リポポリサッカリド等の菌体内毒素により引き起こされる場合がある。ある実施形態では、酸化窒素産生過剰が、敗血症ショックに寄与すると考えられている。ＮＯ産生の低減は、敗血症ショックの症状を低減することが示されている。これらの実施形態によると、本明細書に開示された方法は、Ｆｃ−ＡＡＴ等のＡＡＴ融合分子を投与することにより、敗血症を治療することに関する。幾つかの実施形態には、他の療法、例えば炎症誘発性サイトカイン等に対する抗体と共にＡＡＴ融合分子を投与することが含まれる。又は、リポポリサッカリドを低減する作用剤は、腫瘍壊死因子又はインターロイキン−１発現、又はインターロイキン−１受容体アンタゴニスト発現、又は可溶性ＴＮＦ若しくはＩＬ−１受容体を低減する。ある実施形態では、マクロファージ及び内皮が、酸化窒素活性阻害の細胞標的であり得る。現在まで、敗血症ショックの治療に成功した療法はない。

ウイルス性疾患
本発明の幾つかの実施形態には、ウイルス性感染症を有する対象体を治療することが含まれる。本明細書の他の実施形態には、ウイルスと接触した対象体でのウイルス性感染症の発症を予防するために、本明細書に開示された組成物を投与することが含まれていてもよい。本明細書で企図されているウイルス性感染症には、限定するものではないが、以下のものが含まれていてもよい：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＡＩＤＳ、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ型、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７）、帯状疱疹、単純ヘルペス、ヒトパピローマウイルス、大痘瘡ウイルス（天然痘）、ラッサ熱ウイルス、鳥インフルエンザ、ＡＩＤＳ関連症候群、水疱瘡（水痘）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、ＨＰＶ、伝染性単核症、ムンプス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、西ナイル病、黄熱病、マールブルグ出血熱、麻疹、及び他のウイルス関連障害。

本明細書に開示された他の実施形態は、本明細書に開示された組成物を使用して、対象体のウイルス複製及び／又は感染を阻害することにより、ウイルス感染に起因する癌の発症を低減又は予防することに関する。ウイルスにより誘発される癌には、限定するものではないが、以下のものが含まれ得る：ラウス肉腫誘導性癌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘導性癌（例えば、子宮頚癌）、ポリオーマウイルス誘導性癌、Ｂ型肝炎ウイルス誘導性癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、脊索腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑液膜腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、脂腺癌、腺癌、汗腺癌、乳頭状癌、肝癌、嚢胞腺癌、乳頭腺癌、気管支癌、髄様癌、腎細胞癌、セミノーマ、胆管がん、子宮頚癌、ヴィルムス腫瘍、胚性癌、肺癌、絨毛膜癌、精巣腫瘍、膀胱癌、上皮癌、小細胞肺癌、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、星細胞腫、神経膠腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、及び白血病。更に他の実施形態は、ウイルス性肺炎及び気管支肺炎に関する。

ある実施形態では、本明細書に開示された組成物を使用して、ウイルス性感染症を有する対象体を治療し、ウイルス関連疾患の発症を低減又は予防することができる。例えば、本明細書に開示された組成物を使用して、ウイルス性感染症を有する対象体を治療し、ウイルスの伝染を低減し、対象体でのウイルス複製（例えば、インフルエンザ又は対象体間で伝染する他の疾患）を低減し、それにより対象体間での伝染を低減することができる。

種々のペプチドの構築体
本明細書の実施形態は、ＡＡＴ融合分子、全長ＡＡＴ又はＡＡＴに由来するカルボキシ末端ペプチド（例えば、ＡＡＴの最後の８０個のアミノ酸に見出されるＡＡＴのカルボキシ末端ペプチド、又はＡＡＴの最後の３６個のアミノ酸に見出されるＡＡＴのカルボキシ末端ペプチド等）のいずれかの迅速な生成及び使用を提供する。

本発明の１つの実施形態では、組成物は、ＡＡＴ療法（例えば、哺乳動物由来のＡＡＴ）、例えば、ＡＡＴ及びその誘導体に対応するカルボキシ末端アミノ酸ペプチドを含む一連のペプチドを必要とする対象体を治療するための構築体を含んでいてもよい。これらのペプチドには、以下のものを含むペンタペプチドが含まれていてもよい：ＦＶＦＬＭ（配列番号２）、ＦＶＦＡＭ（配列番号３）、ＦＶＡＬＭ（配列番号４）、ＦＶＦＬＡ（配列番号５）、ＦＬＶＦＩ（配列番号６）、ＦＬＭＩＩ（配列番号７）、ＦＬＦＶＬ（配列番号８）、ＦＬＦＶＶ（配列番号９）、ＦＬＦＬＩ（配列番号１０）、ＦＬＦＦＩ（配列番号１１）、ＦＬＭＦＩ（配列番号１２）、ＦＭＬＬＩ（配列番号１３）、ＦＩＩＭＩ（配列番号１４）、ＦＬＦＣＩ（配列番号１５）、ＦＬＦＡＶ（配列番号１６）、ＦＶＹＬＩ（配列番号１７）、ＦＡＦＬＭ（１８）、ＡＶＦＬＭ（配列番号１９）、及びそれらの任意の組み合わせ。

他の実施形態では、また、本明細書の構築体、医薬組成物、及び方法に使用されることが企図されているＡＡＴペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸に関連する、配列番号１又は配列番号３３（３９４アミノ酸の天然ＡＡＴ、最も一般的な形態は、サブタイプＭ１、Ｍ２、Ｍ３等を有するＭ型であり、これらも本明細書で企図されている）のこうした特定のＡＡＴペプチドのいずれか又は全てを含むことが意図されている。抗炎症性活性及び／又は免疫調節活性を有するＡＡＴポリペプチドは全て、本明細書に開示された方法での使用が企図されている。３１５〜３９４の範囲のアミノ酸、３２５〜３８４、３５８〜３９４、３４０〜３８０等の範囲のアミノ酸等の、ＡＡＴ又はＡＡＴ様活性を模倣する連続アミノ酸のあらゆる組み合わせを使用することができる。加えて、カルボキシ末端の５マー、１０マー、１５マー、２０マー、２５マー、３０マー、３５マー等の連続アミノ酸配列の組み合わせも使用することができる。例えば、配列番号１ ＡＡ３１４〜３９４に由来する５マー、１０マー、１５マー、２０マーの連続アミノ酸の任意の組み合わせを、本明細書で企図された構築体の開発又は精製に使用することができる。

ある実施形態は、ＡＡＴ分子全体（例えば、配列番号１又は３３）を、又はＡＡＴのカルボキシ末端アミノ酸領域に由来するペプチド分子を、ＩｇＧ（例えば、Ｆｃ、又は例えばヒンジ領域を低減させた突然変異Ｆｃ）又はその断片に結合させることを含む、組換え融合タンパク質の生成に関する。ＡＡＴの１つの一般的な形態は、配列番号３３に示されている。本明細書で企図されている１つの構築体は、配列番号３２として参照されている（例えば、全長ＡＡＴ、リーダー配列、及び免疫グロブリン分子のＦｃ部分／断片）。これらの構築体は、本明細書に開示された組成物中に２量体形態として使用されてもよく又は単量体形態として使用されてもよい。これらの実施形態によると、薬学的に許容される組成物は、Ｆｃ−ＡＡＴの２量体、又はＦｃ−ＡＡＴの単量体、又はＦｃから切断されたＡＡＴ、又はそれらの組み合わせ、及び薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。加えて、Ｆｃ領域に点突然変異を導入して、ヒンジ領域の柔軟性を低減させ、新規のＦｃ−ＡＡＴ分子を生成することができる。他の実施形態では、ＦｃをＡＡＴ又はＡＡＴペプチドに結合する前に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に由来するＦｃのヒンジ領域を、欠失又は切断することができる。Ｆｃを更に操作して上記領域を修飾し、受容体相互作用を低減させ、Ｆｃ−ＡＡＴ構築体活性を増強することができる。例えば、Ｆｃ領域に点突然変異を導入して、ヒンジ領域の柔軟性を低減させてもよく、又はこの領域に欠失又は付加を導入し、この領域に関する二次的相互作用に影響を及ぼすか又は融合分子の三次構造を変更して、新規のＦｃ−ＡＡＴ分子を生成してもよい。

他の実施形態では、ＡＡＴプロテアーゼ結合ドメインは、この分子のプロテアーゼ機能を低減又は除去し、エラスターゼ活性を阻害しないように突然変異させることができる。これらの分子は、Ｆｃ−ＡＡＴ突然変異体等の、本明細書で企図された任意の構築体に使用することができる。ある実施形態では、突然変異ＡＡＴを使用して、本明細書に開示された方法によりＡＡＴ構築体を生成することができる。他の実施形態では、突然変異分子（例えば、プロテアーゼ活性が低減されているか又は本質的に活性がない）は、その抗炎症効果及び／又は免疫調節効果を保持しており、抗炎症性分子として、ＡＡＴ療法を必要とする対象体に使用することができる。当業者であれば、ＡＡＴの非プロテアーゼ結合ドメイン、並びに天然ＡＡＴのカルボキシ末端の最後の８０個のアミノ酸と呼ばれるものを理解するであろう。

上述の方法の各々では、α１−アンチトリプシン又はそのカルボキシ末端ペプチド誘導体は、本明細書の組成物に使用することが企図されている。これらのペプチド誘導体には、限定するものではないが、ＡＡＴの最後の８０個のカルボキシ末端由来アミノ酸を含有するアミノ酸ペプチドが含まれていてもよい：ＧＩＴＫＶＦＳＮＧＡ（配列番号２０）、ＤＬＳＧＶＴＥＥＡＰ（配列番号２１）、ＬＫＬＳＫＡＶＨＫＡ（配列番号２２）、ＶＬＴＩＤＥＫＧＴＥ（配列番号２３）、ＡＡＧＡＭＦＬＥＡＩ（配列番号２４）、ＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦ（配列番号２５）、ＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥ（配列番号２６）、ＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧ（配列番号２７）、ＫＶＶＮＰＴＱＫ（配列番号２８）、ＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭ（配列番号２９）；及びＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦ（配列番号３０）、ＧＡＤＬＳＧＶＴＥＥＡＰＬＫＬＳＫＡＶＨＫＡＶＬＴＩＤＥＫＧＴＥＡＡＧＡＭＦＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＶＶＮＰＴＱＫ（配列番号３１）、配列番号３４又はそれらの任意の組み合わせ。ある実施形態では、ＡＡＴのカルボキシ末端ペプチドは、配列番号３３により特定される天然Ｍ型アミノ酸配列と、８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９９％同一である。ある実施形態では、約３個、約４個、又は約５個のアミノ酸が、Ｍ型配列のカルボキシ端末側に由来する８０マーとは異なっていてもよい（例えば、点突然変異）。

ある実施形態には、融合分子配列番号３２、又はＦｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４、又は更にＩｇＤに由来するＦｃヒンジ領域を有する又は有していない他のＦｃ−ＡＡＴ融合分子の組成物が含まれる。これらの実施形態によると、組成物は、医薬組成物であってもよい。

ある実施形態では、ＳＥＣ受容体に結合可能な組換えＡＡＴ又はＡＡＴ由来カルボキシ末端ペプチドの組成物、又はＡＡＴ様活性を有する組成物を、それを必要とする対象体に投与することができる。本明細書に開示されているように、ＡＡＴのカルボキシ末端領域は、他のヒトＡＡＴ分子又は他の天然ＡＡＴ分子の最後の８０個のアミノ酸（配列番号３１）を含む。他の実施形態では、ＡＡＴに由来するペプチドには、５マー、１０マー、２０マー、２５マー、３０マー、３５マー、４０マー、５０マー、及び最大８０マーのＡＡＴ分子が含まれていてもよく、企図されたペプチドはいずれも、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たず、ＡＡＴのカルボキシ末端に由来しており、放射線を受けている対象体、又は偶然に若しくは他の原因で大量の放射線に被曝した対象体を治療するために使用することが可能である。

本発明の１つの実施形態では、構築体は、ＳＥＣ受容体と係合又は結合する化合物を含んでいてもよい。記載されている方法の幾つかでは、本発明の方法で使用するために企図された、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないＡＡＴ突然変異体又はＡＡＴ由来ペプチド（例えば、哺乳動物に由来する）は、ＡＡＴに対応するカルボキシ末端アミノ酸ペプチドを含む一連のペプチドを含むことができる。加えて、アミノ酸５マー又は１０マー又は２０マー又は３０マー以上の組み合わせも使用することができる。例えば、１つ又は複数の５マー又は１０マー又は２０マー等は、配列番号１として表されている天然ＡＡＴのＡＡ３１５から開始し、ＡＡ３９４で終了する連続アミノ酸を含むことができる。本明細書で企図されているように、カルボキシ端部に向かう配列の後半部分は、カルボキシ末端と呼ばれる。ある実施形態では、カルボキシル末端から逆方向に進行するＡＡＴのカルボキシルドメインは、異種間で大部分が保存されているアミノ酸として規定され、ＡＡＴのプロテアーゼ結合ドメインには寄与しない。加えて、他の実施形態では、ＡＡＴプロテアーゼ結合ドメインは、この分子のプロテアーゼ機能を低減又は除去するために突然変異させることができる。この分子は、本明細書で企図された任意の構築体に使用することができる。他の実施形態では、突然変異分子は、その抗炎症効果及び／又は免疫調節効果を保持することができる。また、本明細書では、カルボキシルドメインは、非プロテアーゼ結合ドメインであることが企図されている。当業者であれば、ＡＡＴの非プロテアーゼ結合ドメインを理解するであろう。

上述の方法の各々では、本明細書の組成物には、ＡＡＴのカルボキシ末端に由来するペプチドが含まれていてもよい。ある実施形態では、本明細書の方法及び組成物で使用されるＡＡＴ結合分子には、限定するものではないが、配列番号１、天然ＡＡＴ（血清から単離されるＡＡＴのおよそ９０％を占める３９４ＡＡ長の分子）、他のＡＡＴ Ｍ型、又は他のＡＡＴ分子の組成物が含まれていてもよい。

本明細書に開示された組換え又は融合分子との比較用及び／又は対照用の市販製剤には、以下の市販製剤中の血漿由来ＡＡＴが含まれていてもよい：Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ社）、Ｚｅｍａｉｒａ（商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｂｅｈｒｉｎｇ社）、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（商標）、又はＰｒｏｌａｓｔｉｎＣ（商標）（Ｔａｌｅｃｒｉｓ社）、Ａｐｒｏｔｏｎｉｎ（商標）、又はＴｒａｓｙｌｏｌ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）、Ｕｌｉｎｉｓｔａｔｉｎ（商標）（小野薬品工業株式会社）、及び吸入及び／又は注射可能なＡＡＴ、Ｇｌａｓｓｉａ（商標）（Ｋａｍａｄａ，Ｌｔｄ．社、イスラエル）、又は任意の他の市販ＡＡＴ組成物、又はそれらの任意の組み合わせ。

他の実施形態は、ヒトＡＡＴの突然変異体に関し、上記突然変異体は、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないように生成される。突然変異体を生成するための当技術分野で知られている任意の方法が企図される。幾つかの実施形態には、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないｈＡＴＴを生成するために、部位特異的突然変異誘発を使用することが含まれる（実施例セクション及びｐＥＦ−ｈＡＡＴを参照）。幾つかの実施形態では、組成物は、突然変異ヒトアルファ−１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）を有する医薬組成物であってもよく、上記ＡＡＴは、ＡＡＴの反応中心ループ（ＲＣＬ）内のＡＡＴのプロテアーゼ結合部位に１つ又は複数の点突然変異を有するＡＡＴを含む。これら１つ又は複数の点突然変異は、対照ヒトＡＡＴと比較して、ＡＡＴのセリンプロテアーゼ阻害活性を顕著に低減又は除去する場合がある。他の方法には、ｈＡＡＴを加熱するなどの他の破壊方法によりｈＡＡＴのセリンプロテアーゼ阻害領域を破壊すること、又はＲＣＬ内の３５７位でプロリン残基がシステイン残基に修飾されたＲＣＬ突然変異体等の突然変異体を生成して、セリンプロテアーゼ阻害活性を除去又は劇的に低減すること、又は化学的にＡＡＴ（例えば、ヒトＡＡＴ）を修飾することが含まれる。ある実施形態では、融合分子は、ＲＣＬ（例えば、天然ＡＡＴのアミノ酸３５５〜３６３）内のアミノ酸の１つ又は複数に１つ又は複数の点突然変異を有するＡＡＴ突然変異体に、操作されたＦｃ（例えば、ＩｇＧ１、２、３、又は４）又はＦＡＢを結合させることを含むことができ、このＡＡＴ突然変異体は、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たず、ＲＣＬは完全性を維持している。

医薬組成物
本明細書の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの医薬品投与に好適な生物学的適合形態で、対象体に組成物を投与することが提供される。「ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に好適な生物学的適合形態」とは、活性作用剤の治療効果が任意の毒性効果を上回るように投与される活性作用剤の形態（例えば、実施形態の医薬用化学薬品、タンパク質、遺伝子、抗体等）を意味する。治療上活性量の治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な用量及び期間で有効な量と定義される。例えば、治療上活性量の化合物は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重等の要因、及び抗体が所望の応答を個体に誘発する能力により様々であってもよい。投与計画は、最適な治療効果を提供するために調整することができる。

ＡＡＴ又はそのペプチド断片又はその類似体又はその突然変異体又はその機能的誘導体（例えば、幾つかの実施形態の医薬用化学薬品、タンパク質、ペプチド）を含有する医薬組成物は、例えば、皮下、静脈内、心臓内、冠内、筋肉内、経口投与、吸入、経皮塗布、膣内塗布、局所塗布、鼻腔内、又は直腸内投与により、対象体に投与することができる。投与経路に応じて、活性化合物は、酵素、酸、及び化合物を不活化する他の自然条件による分解から化合物を保護する物質でコーティングされていてもよい。好ましい実施形態では、化合物は、経口投与することができる。別の好ましい実施形態では、化合物は、静脈内投与することができる。１つの特定の実施形態では、組成物は、吸入等、鼻腔内投与することができる。

本明細書に開示された幾つかの実施形態は、ステント又はカテーテルを使用して、癌を有するか又はその疑いのある治療中の対象体に１つ又は複数の化学治療剤（例えば、本明細書に開示された組成物と共に）を送達することに関する。１つ又は複数の作用剤を腫瘍部位に直接送達することができるあらゆるステント又は当技術分野で知られている他の送達方法が企図される。これらの送達技術は、単独で又は他の送達方法と組み合わせて使用することができる。

化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、又はそれらの混合物）は、適切な担体又は希釈剤を用いて対象体に投与してもよく、酵素阻害剤と同時投与してもよく、又はリポソーム等の適切な担体を用いて投与してもよい。用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、生理食塩水又は緩衝水溶液等の希釈剤を含むことが意図される。化合物は、その不活化を防止する物質でコーティングするか、又はそのような物質と同時投与することが必要な場合がある。また、活性作用剤は、非経口投与又は腹腔内投与してもよい。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物で、及び油中で分散物を調製してもよい。保管及び使用の通常条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有していてもよい。

注射可能な使用に好適な医薬組成物は、当技術分野で知られている手段により投与することができる。例えば、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散物、及び無菌注射溶液又は分散物の即時調製のための無菌粉末を使用することができる。

無菌注射溶液は、必要量の活性化合物（例えば、セリンプロテアーゼ活性を低減する化合物）を、上記の成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒中に組み込み、その後必要に応じてろ過滅菌をすることにより調製することができる。

水性組成物には、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散された、有効量の治療用化合物、ペプチド、エピトープコア領域、刺激因子、及び阻害剤等が含まれていてもよい。本明細書に開示された化合物及び生体材料は、当技術分野で知られている方法により精製することができる。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水で調製することができる。

製剤化に際して、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療上有効量のような量で投与されることになる。製剤は、上述したタイプの注射用溶液等の様々な剤形で容易に投与される。徐放カプセル、持続放出微粒子等も使用することができることが企図される。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に好適である。

活性治療剤は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０又は更には約１〜１０グラムを含むように、混合物内に製剤化されてもよい。また、単一用量又は複数用量は、毎日、隔週、毎週、隔月等の所定の条件の適切なスケジュールで投与することができる。医薬組成物は、副作用を調節するのに有効な量及び頻度で投与される。正確な用量及び治療の継続期間は、公知の試験プロトコールを経験的に使用して、又は当技術分野で知られているモデル系で組成物を試験し、そこから推定することにより決定することができる。また、用量は、疾患の重症度に応じて様々であってもよい。ある実施形態では、組成物範囲は、対象体に１日１回又は週１回で導入される１．０〜７５ｍｇ／ｋｇであってもよい。また、α１−アンチトリプシン、ペプチド、又はα１−アンチトリプシン若しくはペプチドと同様の活性を有する薬剤の治療上有効量は、モル濃度で測定することができ、約１ｎＭ〜約２ｍＭの範囲であってもよい。

別の実施形態では、点鼻液又はスプレー、エアゾル又は吸入剤を、目的化合物の送達に使用することができる。他の投与方法に好適な更なる製剤には、坐剤及びペッサリーが含まれていてもよい。また、直腸ペッサリー又は坐剤を使用してもよい。一般的に、坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれていてもよく、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物で形成されていてもよい。

リポソーム又は微粒子を、医薬品送達系として使用することができ、公知の実験室技術により調製することができる。加えて、以前の記載のように調製された乾燥脂質又は凍結乾燥リポソームは、活性作用剤（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、又は化学薬品）の溶液で再構成し、その溶液を、当業者に知られている好適な溶媒で適切な濃度に希釈してもよい。カプセルに封入される活性作用剤の量は、標準的な方法により決定することができる。

幾つかの実施形態では、医薬構築体組成物は、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないが、他のα１−アンチトリプシン活性を有するＡＡＴ分子又はその類似体に由来する構築体に関し、対象体を治療するために、単一治療用量で、急性様式で、又は慢性様式で使用することができる。例えば、本明細書で企図されている融合ポリペプチドは、顕著なプロテアーゼ阻害活性を持たない融合ポリペプチドであってもよい。

ある実施形態では、本明細書の組成物は、経口で、全身的に、移植片により、持続放出又は徐放組成物（例えば、ゲル、微粒子等）により、静脈内に、局所的に、髄腔内に、皮下に、吸入により、経鼻的に、又は当技術分野で知られている他の方法、又はそれらの組み合わせで投与することができる。

発現タンパク質及び構築体
標的遺伝子又は遺伝子の一部が決定されれば、遺伝子を適切な発現系に挿入することができる。任意の数の様々な組換えＤＮＡ発現系で遺伝子を発現させて、大量のポリペプチド産物を生成することができ、その後それらを精製し、本明細書に開示された組成物及び方法に使用することができる。

当業者に知られている発現系の例には、大腸菌等の細菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母、バキュロウイルス、及びＣｏｓ又はＣＨＯ細胞等の哺乳動物発現系が含まれる。遺伝子全体を発現させてもよく、或いは、ポリペプチドの一部をコードする遺伝子の断片を産生してもよい。

ＡＡＴ遺伝子又はポリペプチドをコードする遺伝子断片は、標準的サブクローニング技術により発現ベクターに挿入することができる。組換えポリペプチドを融合タンパク質として産生する大腸菌発現ベクターを使用し、タンパク質の迅速な親和性精製を可能にすることができる。そのような融合タンパク質発現系の例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ社、ベバリー、マサチューセッツ州）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ社、ニューヘブン、コネティカット州）、及び６×Ｈｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ社、チャッツワース、カリフォルニア州）である。

また、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を調製してもよい。これらは、例えば、天然変異により集団内に生じるポリペプチドの軽微な配列変異体であってもよく、他の種に見出される相同体であってもよい。また、それらは、天然ではないが、同様に機能するのに及び／又は天然形態のポリペプチドと交差反応する免疫応答を誘発するのに十分な程度に類似している配列であってもよい。配列変異体は、膜貫通配列を除去するために本明細書に記載されているもの等の、指定部位突然変異誘発の標準的方法により調製してもよい。

ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、置換、挿入、又は欠失変異体であってもよい。欠失変異体は、機能又は免疫原性活性に不可欠ではない、天然タンパク質の１つ又は複数の残基を欠如しており、膜貫通配列を欠如する変異体がその代表例である。

原核生物系又は真核生物系で発現させるためのＤＮＡセグメントの遺伝子操作は、組換え発現における当業者に一般的に知られている技術により実施することができる。事実上、あらゆる発現系を、特許請求されている核酸配列の発現に使用することができると考えられる。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子操作された」及び「組換え」細胞は、ＡＡＴ全長ｃＤＮＡ又は遺伝子等の外来性ＤＮＡセグメント又は遺伝子が、人工的に導入されている細胞を指すことが意図されている。したがって、遺伝子操作された細胞は、組換え的に導入された外来性ＤＮＡセグメント又は遺伝子を含有していない天然細胞と識別可能である。組換え細胞には、導入ｃＤＮＡ又はゲノム遺伝子を有するものが含まれ、特定の導入遺伝子に天然では関連しない異種性プロモーターに隣接して配置されている遺伝子も含まれる。

本明細書の実施形態によると、全長ＡＡＴ突然変異体であるか、その野生型であるか、若しくはカルボキシ末端ペプチドであるかに関わらず、組換えコード化タンパク質又はペプチドを発現するために、当技術分野で知られている１つ又は複数のプロモーターの制御下にあるか又はプロモーターに作用可能に結合されている単離された核酸を含む発現ベクターを調製することができる。タンパク質又はペプチド発現を様々な宿主発現系で達成するための、適切な核酸及び転写／翻訳調節配列を含有する発現ベクターの構築には、多くの標準的技術が使用可能である。発現に使用可能な細胞タイプには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、大腸菌及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌が含まれる。

原核生物宿主の例は、大腸菌株ＲＲ１、大腸菌ＬＥ３９２、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）並びに大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ラムダ−、原栄養株、ＡＴＣＣ番号２７３３２５）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の桿菌；及びサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及び種々のシュードモナス種等の他の腸内細菌である。

一般的に、レプリコン、及び宿主細胞と適合する種に由来する配列である制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主と共に使用される。ベクターは、通常、複製部位、並びに形質転換細胞の表現型選択を提供することが可能なマーカー配列を保持する。

加えて、レプリコン及び宿主微生物と適合する制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主の形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ファージラムダＧＥＭ（商標）−１１を、大腸菌ＬＥ３９２等の宿主細胞の形質転換に使用可能な組換えファージベクターの製作に使用することができる。

後で精製及び分離又は切断するためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質の生成に使用される更なる有用なベクターには、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５年）及びｐＧＥＸベクターが含まれる。他の好適な融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ又はユビキチン等を有するものである。

組換えＤＮＡ構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。これらが最も一般的に使用されるものであるが、他の微生物プロモーターが発見及び使用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されており、当業者であれば、それらをプラスミドベクターに機能的にライゲーションすることが可能である。

サッカロマイセスでの発現には、例えば、プラスミドＹＲｐ７が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠如する酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、１９７７年）に選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を既に含有している。したがって、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１の機能障害が存在することにより、トリプトファンの非存在下で増殖させることにより、形質転換を検出するための効果的な環境が提供される。酵母ベクターの好適なプロモーター配列は、当技術分野で公知である。好適な発現プラスミドを構築する場合、これらの遺伝子に関連する終止配列も、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終止を提供するために発現されることが望ましい配列の３’側で発現ベクターにライゲーションされる。また、増殖条件により転写が制御されるという更なる利点を有する他の好適なプロモーターが、本明細書で企図される。

微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養物も、宿主として使用することができる。原理的には、脊椎動物か又は無脊椎動物かに関わらず、任意のそのような細胞培養物が使用可能である。哺乳動物細胞に加えて、これらには、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、及び組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ、又は他の植物）に感染したか、又は１つ若しくは複数のコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系が含まれる。昆虫系も企図される。

有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、及びＭＤＣＫ細胞系である。加えて、挿入配列の発現を調節するか、又は所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、コードされたタンパク質の機能に重要な場合がある。

様々な宿主細胞が、タンパク質の翻訳後プロセシング及び修飾の特徴的及び特異的な機序を有する。発現された外来タンパク質の修飾及びプロセシングが正確に行われるように、適切な細胞系又は宿主系を選択することができる。哺乳動物細胞で使用される発現ベクターは、通常、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列に加えて、複製開始点（必要に応じて）、発現させようとする遺伝子の前に配置されたプロモーターを含む。複製開始点は、例えばＳＶ４０又は他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源等に由来するような外来性起点を含むようにベクターを構築することにより提供してもよく、又は宿主細胞染色体複製機序により提供されてもよい。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、後者で十分なことが多い。プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム由来であってもよい。また、更に、所望の遺伝子配列に通常関連するプロモーター又は制御配列を使用することが可能であり、それが望ましい場合がある。ただし、そのような制御配列が宿主細胞系と適合性であることを条件とする。

アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体（例えば、後期プロモーター及び３連リーダー配列）にライゲーションすることができる。その後、このキメラ遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）への挿入は、感染宿主中でタンパク質を発現可能な生存能力のある組換えウイルスをもたらすであろう。

また、特定の開始シグナルが、特許請求されている単離された核酸コード配列の効率的な翻訳に必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳調節シグナルを、更に提供する必要がある場合がある。当業者であれば、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を保証するために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフレーム（又はインフェーズ）でなければならないことは周知である。これらの外来性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、由来が様々であってもよく、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント又は転写ターミネーターの包含により増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７年）。

また、真核生物発現では、典型的には、元のクローニングセグメント内に含まれていない場合は、適切なポリアデニル化部位（例えば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）を転写ユニットに組み込むことが望ましいであろう。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写終結の前に位置するタンパク質の終止部位の約３０〜２０００ヌクレオチド「下流に」配置される。

組換えタンパク質の長期高収率産生には、安定した発現が好ましい。例えば、タンパク質をコードする構築体を安定的に発現する細胞系を遺伝子操作してもよい。ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）及び選択可能なマーカーにより制御されるベクターで形質転換してもよい。外来性ＤＮＡを導入した後、遺伝子操作した細胞を、栄養豊富な培地で１〜２日間増殖させ、その後選択培地に切り換えてもよい。組換えプラスミドにある選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が自身の染色体にプラスミドを安定的に組み込み、増殖してコロニーの形成を可能にし、次いでそれをクローニングして、細胞系へと拡張することができる。

多くの選択系を使用することができ、それらには、以下のものに限定されないが、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−細胞中の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ、コフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ、及びヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ、又は当技術分野で知られている他の方法の代謝拮抗剤耐性を、選択基準として使用してもよい。

本発明の単離された核酸は、「過剰発現」させることができ、つまり、ヒト前立腺、膀胱、又は乳房細胞におけるその天然発現と比べて、又は組換え宿主細胞での他のタンパク質の発現と比べた場合でさえ、増加したレベルで発現させることができることが企図される。そのような過剰発現は、放射性物質標識及び／又はタンパク質精製を含む、様々な方法により評価することができる。しかしながら、単純で直接的な方法、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びタンパク質染色又はウエスタンブロッティングの後、その結果生じたゲル又はブロットを濃度測定走査すること等、定量分析することを含むものが好ましい。宿主細胞により産生される他のタンパク質に対する特定のタンパク質の相対的存在量と同様に、天然ヒト前立腺、膀胱、又は乳房細胞中のレベルと比較して、組換えタンパク質又はペプチドのレベルが特異的に増加することが、過剰発現の特徴であり、例えば、ゲルで可視化される。

本明細書では、免疫分子（例えば、Ｆｃ部分）を使用して生成された構築体は、種々の親和性カラムを使用して単離することができることが企図されている。加えて、Ｆｃ断片は、ヒンジ領域の除去等、更に操作することもできる。これらのＦｃ断片には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＤのいずれが含まれていてもよい。ヒンジ領域は、免疫断片をＡＡＴ標的分子に結合させる前に、除去又は切断又は突然変異させることができる。

単離されたタンパク質
１つの実施形態は、単離されたタンパク質及びその生物学的に活性なペプチドに関する。１つの実施形態では、天然ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を使用して、適切な精製スキームにより、細胞又は組織供給源から単離することができる。ある実施形態では、天然ポリペプチドを、加熱又はそうでなければ処理して、セリンプロテアーゼ阻害活性を低減又は除去することができる。ある特定の実施形態では、セリンプロテアーゼ阻害活性は、低減され、顕著な活性は残存しない。別の実施形態では、本明細書で企図されたポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成技術を使用して、ポリペプチドを化学的に合成してもよい。本明細書に開示された組成物での使用が企図されているペプチド又はタンパク質分子はいずれも、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たない組成物であってもよい。例えば、ＡＡＴ組成物は、セリンプロテアーゼ阻害活性を低減又は除去するために突然変異又は切断されていてもよく、又はＡＡＴポリペプチドは単離されていてもよく、その場合、ポリペプチドは、セリンプロテアーゼ阻害活性が低減されているか又は顕著な活性を持たない。

「単離された」又は「精製された」タンパク質又はその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する細胞又は組織供給源に由来する細胞性物質又は他の夾雑タンパク質を実質的に含んでいないか、又は化学的に合成された場合は、化学的前駆物質又は他の化学薬品を実質的に含んでいない。したがって、細胞性物質が実質的に含まれていないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量による）未満の異種性タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質調製物を含む。また、タンパク質又はその生物学的活性部分は、組換え的に産生される場合、培養培地を実質的に含んでいないことが好ましい。タンパク質は、化学合成により生成される場合、化学的前駆物質又は他の化学薬品が実質的に含まれていないことが好ましい。例えば、タンパク質のそのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学的な前駆物質又は化合物が、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量による）未満である。

ある実施形態では、ポリペプチドをコードするヌクレオチドを、当技術分野で知られている任意の構築体に挿入して、ペプチド又はタンパク質を生成することができる。それらのペプチドには、ＡＡＴ又はＡＡＴ対立遺伝子のカルボキシ末端の最後の８０個のアミノ酸の一部又は全てに対応する連続アミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれていてもよい。他の有用なタンパク質は、カルボキシ末端の任意の部分と実質的に同一であり、セリンプロテアーゼ阻害活性以外の、対応する天然タンパク質のペプチドの機能的活性を保持しているが、天然対立遺伝子変異又は突然変異誘発のためアミノ酸配列が異なる。

ある実施形態では、本明細書に開示されたＦｃ−ＡＡＴ構築体の精製は、プロテインＡカラム又はプロテインＡマトリックス等（Ｐｉｅｒｃｅ社又は他のＩｇＧ精製キット）を使用することを含んでいてもよい。ある実施形態では、本明細書に開示された構築体の精製は、標的ＡＡＴタンパク質又はペプチドの抗炎症活性又は免疫調節活性を保存するために、最低限のステップを使用することによるものであってもよい。これらの実施形態によると、本明細書で企図されている構築体の精製は、一段階（例えば、Ｆｃ−ＡＡＴ分子のプロテインＡカラム精製）によるものであってもよい（例えば、Ｋｉｎ−Ｍｉｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１巻６号、４９５〜５００頁、１９９８年；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／Ｆｃ／Ｆｃ−Ｘ／ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；ａｎｄ ｄｉａｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照）。

本明細書では、それ自体に可逆的に結合することができる（例えば、ジスルフィド又は他の結合により）任意のタンパク質又はペプチドをコードする核酸を、本明細書に開示されたＡＡＴ構築体の生成に使用することができることが企図されている。これらの構築体は、機能喪失を低減する精製を向上させるためにＡＡＴの２量体として使用することができ、また、２量体分子として治療応用又は研究目的に使用することができる。これらの実施形態によると、ＡＡＴ又はカルボキシ末端断片に結合された部分は、免疫原性の増加が所望でない限り、不活性であるか又は本質的に非免疫原性であってもよい。更に、本明細書に開示された構築体中のＦｃは、補体相互作用又は活性化を低減又は除去するために操作されている（例えば、ヒンジが欠失されている）。ＡＡＴのカルボキシ末端領域にＦｃを配置しても、抗炎症及びエラスターゼ阻害等のあるＡＡＴ活性が妨害されないことが示されている。

他の使用
本明細書に開示された幾つかの組成物は、より全体的に又は部分的に、過剰なセリンプロテアーゼ活性により引き起こされる生理学的な疾患を治療するための治療剤として使用することができる。加えて、生理学的な疾患を、全体的に又は部分的に阻害することができる。本明細書で企図されているペプチドは、遊離ペプチド又はその薬学的に許容される塩としての組成物で投与することができる。ペプチドは、ほとんどの場合、融合分子及び薬学的に許容される賦形剤又は薬学的に許容される担体又はその薬学的に許容される塩製剤を含む医薬組成物として対象体に投与することができる。

ＡＡＴ又はそのペプチド誘導体の生物学的活性部分は、タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか又はそれに由来するアミノ酸配列を含んでいてもよい（例えば、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す配列番号２〜３２、３４、４９、又は５１のいずれかにより捕捉されるアミノ酸配列）。本発明のタンパク質の生物学的活性部分は、例えば、５、１０、２０、３０、又は４０アミノ酸以上の長さのポリペプチドであってもよい。更に、タンパク質の他の領域が欠失されている、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たない他の生物学的活性部分は、組換え技術により調製することができ、本明細書に開示されたポリペプチドの天然形態の機能的活性の１つ又は複数で評価することができる。

ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２〜３２、３４、４９、又は５１のアミノ酸配列を有していてもよい。他の有用タンパク質は、配列番号１〜３４、４９、及び５１、及び配列番号４９、５６、５７、５８により表されるＦｃに結合されたＡＡＴ、又はＦｃヒンジ領域が操作されている又は操作されていない他の構築体のいずれかと実質的に（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、又は９９％）同一である。

顕著なセリンプロテアーゼ活性を持たないＡＡＴ分子の変異体は、突然変異誘発、例えば別々の点突然変異、又は切断により生成することができる。例えば、反応中心ループ（ＲＣＬ）の完全性を依然として維持し、ＡＡＴ又はペプチドとのセリンプロテアーゼ結合能力を妨害又は防止するものの、放射線有害効果を調節するその能力が保持される点突然変異を、ＡＡＴ又はそのペプチド誘導体に導入してもよい。アゴニストは、顕著なセリンプロテアーゼ活性が残存しないことを除いて、天然形態のタンパク質と実質的に同じ生物学的活性又はそのサブセットを保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的タンパク質を含む細胞のシグナル伝達カスケードの下流又は上流メンバーと競合的に結合することにより、天然形態のタンパク質の活性の１つ又は複数を阻害することができる。したがって、機能が限定された変異体を用いて治療することにより、特定の生物学的効果を誘発することができる。天然形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体を用いて対象体を治療することにより、天然形態のタンパク質を用いた治療と比べて、対象体の副作用をより少なくすることができる。

融合ポリペプチド
他の実施形態では、ＡＡＴ及び／又はその類似体又はそのペプチド誘導体若しくは断片等の作用剤は、融合ポリペプチドの一部であってもよい。１つの例では、融合ポリペプチドは、ＡＡＴ（例えば、ヒト等の天然哺乳動物α１−アンチトリプシン）又はその類似体又はその断片、及びＩｇＧ断片等の免疫断片（例えば、Ｆｃヒンジ欠失若しくはヒンジ切断型又はその突然変異体）であってもよい様々なアミノ酸配列を含んでいてもよい。加えて、本明細書に開示された融合ポリペプチドは、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含んでいてもよい。融合タンパク質又は融合ペプチドを生成するためのあらゆる公知の方法が、本明細書で企図される。

更に別の実施形態では、ＡＡＴポリペプチド又はペプチド融合タンパク質は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ融合タンパク質であってもよい。融合発現ベクター及び精製及び検出手段は、当技術分野で公知である。発現ベクターは、当技術分野で知られている手段により、原核生物（例えば、大腸菌）、又は真核細胞（例えば、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞）中で本発明の融合ポリペプチドを発現するように、日常的に設計することができる。更に別の実施形態では、本発明の核酸は、当技術分野に記載されている哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。

本明細書に開示されたＦｃ−ＡＡＴは、それらが切断又は還元されて２つのＦｃ−ＡＡＴ単一分子を生成しない限り、２つのＡＡＴ分子の２量体として生じるため、本明細書に開示された融合分子と比較して、ある系に対する血漿由来ＡＡＴ製剤の効果を検討する場合、タンパク質濃度を考慮に入れる。本明細書に開示された組成物に使用されるＦｃ−ＡＡＴ融合分子には、本明細書で提供されている又は当技術分野で知られている血漿由来ＡＡＴ治療に応答する炎症性疾患又は他の疾患を有する対象体を治療するための、配列番号３２、４９、５１、５３、又は５５〜５８の１つ又は複数の薬学的に許容される組成物が含まれていてもよい。ある実施形態では、ＡＡＴ、突然変異ＡＡＴ形態、又はＡＡＴペプチド断片に結合されたＦｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＴの半減期を増加させるか、又はｉｎ ｖｉｖｏでの構築体の細胞取り込み及び輸送を促進する場合がある。したがって、組換え形態のＡＡＴの生成に関して、血漿由来ＡＡＴ及び他の組換え体と比較して複数の向上が観察され、並びにＦｃ−ＡＡＴ（ＩｇＧ１、Ｆｃ−ＡＡＴ２）と比較してｉｎ ｖｉｖｏでの向上が観察された新規の分子が製作された。

併用療法
本明細書で詳述されている実施形態はいずれも、本明細書に開示された組成物と組み合わせて、１つ又は複数の他の治療上有効な作用剤を更に含んでいてもよい。ある実施形態では、これらの代替的作用剤は、癌治療における癌関連薬物を含むことができる。例えば、これらの療法には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：アスピリン、及び例えば、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバンを含む他の抗血小板療法；ヘパリン及び誘導体；直接的トロンビン阻害剤又はＸａ阻害剤；ワルファリン；アンギオテンシン変換酵素阻害剤又はアンギオテンシン受容体遮断剤；ベータ−及びアルファ−アドレナリン受容体遮断剤；カルシウムチャネル遮断剤；ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、スタチン）；ナイアシン及び誘導体；フェノフィブラート；魚油；アルドステロン遮断剤；ヒドララジン及びニトロ誘導体；ホスホジエステラーゼ阻害剤；直接的グアニリルシクラーゼ活性化因子、抗微生物薬、抗炎症剤、免疫調節剤、又は免疫抑制剤、又はそれらの組み合わせ。

抗細菌性作用剤の例には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：ペニシリン、キノロン、アミノグリコシド、バンコマイシン、モノバクタム、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、及びモノバクタム、並びにそれらの種々の塩、酸、塩基、及び他の誘導体。

本明細書で使用が企図されている抗真菌作用剤には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：カスポファンギン、テルビナフィン塩酸塩、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、グリセオフルビン、ケトコナゾール、硝酸ミコナゾール、フルシトシン、フルコナゾール、イトラコナゾール、クロトリマゾール、安息香酸、サリチル酸、及び硫化セレン。

本明細書で使用が企図されている抗ウイルス剤には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：バルガンシクロビル、アマンタジン塩酸塩、リマンタジン、アシクロビル、ファムシクロビル、ホスカルネット、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、リバビリン、ソリブジン、トリフルリジン、バラシクロビル、ビダラビン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、インターフェロンアルファ、及びエドクスジン。

本明細書で使用が企図されている抗寄生虫剤には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：ピレトリン／ピペロニルブトキシド、ペルメトリン、ヨードキノール、メトロニダゾール、ジエチルカルバマジンクエン酸塩、ピペラジン、ピランテルパモ酸塩、メベンダゾール、チアベンダゾール、プラジカンテル、アルベンダゾール、プログアニル、キニジングルコナート注射剤、キニーネ硫酸塩、リン酸クロロキン、メフロキン塩酸塩、リン酸プリマキン、アトバクオン、コトリモキサゾール、（スルファメトキサゾール／トリメトプリム、及びペンタミジンイセチオネート。

免疫調節剤には、以下のものが含まれていてもよい：例えば、免疫系の細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は抗原提示細胞（ＡＰＣ））の細胞活性を刺激又は抑制することにより、又は免疫系以外の成分に作用し、次いで免疫系を刺激、抑制、又は調節することにより、免疫系に直接的又は間接的に作用する作用剤（例えば、ホルモン、受容体アゴニスト又はアンタゴニスト、及び神経伝達物質）。他の免疫調節剤には、免疫抑制剤又は免疫賦活剤が含まれていてもよい。抗炎症剤には、例えば、炎症応答、傷害に対する組織反応を治療する作用剤、免疫系、脈管系、又はリンパ系を治療する作用剤、又はそれらの任意の組み合わせが含まれていてもよい。

本明細書での使用が企図されている抗炎症又は免疫調節薬又は作用剤には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：インターフェロン誘導体、例えばベータセロン、β−インターフェロン；プロスタン誘導体、イロプロスト、シカプロスト；コルチゾール、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン等のグルココルチコイド；シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、メトキサレン、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキセート等の免疫抑制剤；リポキシゲナーゼ阻害剤、例えば、ジロートン、ＭＫ−８８６、ＷＹ−５０２９５、ＳＣ−４５６６２、ＳＣ−４１６６１Ａ、ＢＩ−Ｌ−３５７；ロイコトリエンアンタゴニスト；ペプチド誘導体、例えば、ＡＣＴＨ及び類似体；可溶性ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−受容体；ＴＮＦ−抗体；インターロイキン、他のサイトカイン、Ｔ細胞タンパク質の可溶性受容体；インターロイキン、他のサイトカイン、及びＴ−細胞タンパク質の受容体に対する抗体。

本明細書の組成物と組み合わせて使用される他の作用剤は、セリンプロテアーゼ阻害活性を有する分子であってもよい。例えば、本明細書での使用が企図されている他のセリンプロテアーゼ阻害剤には、限定するものではないが、白血球エラスターゼ、トロンビン、カテプシンＧ、キモトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、及びプラスミンが含まれていてもよい。

加えて、本明細書に開示された方法の他の併用組成物には、ある抗体に基づく療法が含まれていてもよい。非限定的な例には、ポリクローナル抗リンパ球抗体、Ｔ細胞抗原レセプター複合体（ＯＫＴ３、ＴＩＯＢ９）に対するモノクローナル抗体、インターロイキン−２受容体アルファを含む追加の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体が含まれる。ある実施形態では、抗体に基づく療法は、本明細書に開示された組成物及び方法と組み合わせた誘導療法として使用することができる。

本明細書で企図されている対象体には、ヒト対象体、男性又は女性、成人又は幼児、又は胎児、又は限定するものではないが、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、モルモット、鳥類、及びげっ歯動物を含む非ヒト対象体等の他の対象体が含まれていてもよい。

ＡＡＴ
ヒトＡＡＴは、内部ジスルフィド結合を有しておらず、通常はシステイン又はグルタチオンのいずれかに分子間ジスルフィド結合された単一のシステイン残基のみを有する単一のポリペプチド鎖である。ＡＡＴの１つの反応部位は、メチオニン残基を含有しており、それは、タバコ煙又は他の酸化汚染物質と接触すると酸化されやすい。そのような酸化は、ＡＡＴのエラスターゼ−阻害活性を低減させ、したがって、その位置を別のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、グリシン、フェニルアラニン、アルギニン、又はリジン）で置換すると、より安定した形態のＡＡＴが産生される。天然ＡＡＴは、配列番号１若しくは３３又は他の公知の天然ＡＡＴ分子の配列により表すことができる。

本明細書に開示された融合分子を産生及び精製することが知られているあらゆる手段が企図されている（例えば、哺乳動物細胞中で、細菌により、真菌又は他の生物により、又は植物中で生成される）。

キット
また更なる実施形態では、上述の組成物、構築体（例えば、組換え及び／又は融合分子）、及び方法で使用するためのキットが企図される。キットは、以下のものを含んでいてもよい：ＡＡＴ融合又は組換え構築体（例えば、Ｆｃ−ＡＡＴ、Ｆｃ−突然変異体ＡＡＴ、ＡＡＴ又はＡＡＴのカルボキシ末端誘導体に結合されたＩｇＧ２突然変異体、又はＦｃヒンジ欠失構築体、配列番号３２及び４９〜５８等）、ＡＡＴに由来する１つ又は複数のペプチドの構築体、突然変異ＡＡＴ構築体組成物、遺伝子治療送達系に関連する突然変異ＡＡＴ分子、又は他の組み合わせ。低分子、タンパク質、又はペプチドは、開示された方法のいずれに使用されてもよい。加えて、抗細菌剤等の他の作用剤、免疫抑制剤、抗炎症剤が、キットに提供されていてもよい。キットは、好適な容器手段、タンパク質、又はペプチド、又は類似体作用剤、及び任意に１つ又は複数の追加作用剤を含んでいてもよい。

キットは、記載されている治療応用のための標準曲線又は検出アッセイを準備するために使用することができる、標識又は非標識のいずれでもよい、コードされたタンパク質又はポリペプチド抗原の適切に等分された（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）構築体組成物を更に含んでいてもよい。

キットの容器は、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、又は他の容器、又は他の送達デバイス（例えば、ステント又はカテーテル）を含む。また、キットは、一般的に、他の併用作用剤を入れることができる第２の、第３の、又は他の追加容器を含む。そのような容器には、そこに所望のバイアルが保持される射出又はブロー成形プラスチック容器が含まれていてもよい。

ある実施形態では、キットは、限定するものではないが、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないＡＡＴ、ＡＡＴ断片、又はＡＡＴ類似体若しくはポリペプチドの構築体を含む組成物を含んでいてもよい。これらの実施形態によると、キットは、顕著なセリンプロテアーゼ阻害活性を持たないＡＡＴ又はその類似体を含んでいてもよい。

実施例
以下の例は、種々の実施形態を例示するために含まれている。当業者であれば、以下の例において開示された技術は、特許請求されている方法、組成物、及び装置の実施において十分に機能することが発見された技術であることが理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、開示されている幾つかの実施形態に変更を行い、それでも同様の又は類似の結果を得ることができることを理解すべきである。

実施例１
組換えヒトＡＡＴ産生用の発現プラスミドの生成
１つの例示的な方法では、Ｆｃ−ＡＡＴ構築体を生成することができる。図１に示されているように、融合分子用の組換えＡＡＴを生成することができる。ヒトＡＡＴ（又はカルボキシ末端ペプチド等のＡＡＴペプチド）配列の、発現ベクターｐＣＡＧＧＳへの挿入。１２６０塩基対のヒト全長ＡＡＴ ｃＤＮＡを、ヒト肝臓ライブラリーから単離し、図１に示されているように、ｐＣＡＧＧＳに挿入した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、発現用のプラスミドで形質移入した。限界希釈法を使用して、ＡＡＴ陽性クローンを選択し、無血清培地で増殖させた。上清を収集してプールした。ヒトＡＡＴに対する抗体を使用して、約５５ｋＤａのバンドをウエスタンブロット（データ非表示）で観察し、ＡＡＴであることを確認した。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４（様々なヒンジ領域欠失、突然変異、及び最大でヒンジ領域全体の欠失を有するか又は有していない）Ｆｃ受容体との融合タンパク質を使用して、組換えＡＡＴ又はその融合分子を生成した。これらの構築体を精製した。ある例示的な方法では、これらの構築体を、Ｆｃと結合するプロテインＡ（カラム又はマトリックス等として）を使用して精製し、標的融合分子を溶液から迅速に単離した。本明細書で産生された融合分子（例えば、Ｆｃ−ＡＡＴ２／ＡＡＴ−Ｆｃ２及びＦｃ−ＡＡＴ−６／ＡＡＴ−Ｆｃ６）の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離は、図３を参照されたい。

実施例２
別の例示的な方法では、本明細書に開示された融合構築体を精製し、市販のＡＡＴ組成物により治療されることが知られている任意の疾患又は他の炎症性疾患のための方法又は治療的処置に使用することができる。

ヒトＦｃ ＩｇＧプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社から購入することができる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４等）。ヒトｃＤＮＡを切り出し、ＰＣＲクローニングによりヒトＦｃベクターに挿入した。確認のためインフレーム配列解析を実施した。プラスミドをＣＨＯ細胞に形質移入し、限界希釈して単一クローンを取得した後、幾つかの安定クローンを単離した。安定クローンを増殖させ（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、無血清培地を使用して更に選択した。大規模細胞培養を実施し、上清を収集及びプールした。

Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子を含有する上清は、ゲル又はカラム中でプロテインＡをマトリックスとして使用して精製することができる。ある方法では、本明細書で生成されたヒトＦｃ−ＡＡＴを、グリシン（約ｐＨ２．４）を使用してプロテインＡから溶出させ、その後迅速に生理学的ｐＨ、約ｐＨ７．４に中和した。これらの方法は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに単一のバンドをもたらした。その後、精製されたＦｃ−ＡＡＴ融合構築体を、エラスターゼ阻害アッセイ、抗炎症アッセイ（例えば、サイトカインレベル等に影響する）等のＡＡＴ関連活性について、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）、Ｇｌａｓｓｉａ（商標）、ＰｒｏｌａｓｔｉｎＣ（商標）等の市販製剤とすぐに比較することができた。

ヒトＡＡＴ Ｆｃの精製：ウエスタンブロットでは、ＩｇＧ１由来のＦｃに操作を加えていない２つのＦｃ−ＡＡＴ全長分子の完全な２量体を表すバンド（約１７０ｋＤａ）が示された。ウエスタンブロットの他のレーンには、ジスルフィド結合が全て破壊され、ＦＣ−ＡＡＴの２つの単一分子が形成された場合が示されていた。非還元ゲル並びに還元ゲルは両方とも、ＡＡＴ構築体の純度レベルを示した。Ｆｃ−ＡＡＴを、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、哺乳動物細胞培養液上清から一段階で精製し、したがってＡＡＴ活性に有害な精製の副作用を劇的に低減させることができる。以下のクローンを生成した：クローン２：ＩｇＧ１及びＡＡＴのカルボキシ末端へのリンカーを使用したＦｃ−ＡＡＴ：クローン３：Ｆｃのヒンジ領域が除去されたＩｇＧ１、及びＡＡＴのカルボキシ末端に再び結合されているリンカーを使用したＦｃ−ＡＡＴ。ヒンジ領域欠失を有する及び有していないＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に由来するＦｃを含む他のクローンを生成した。留意すべきことに、Ｆｃ−ＡＡＴ２及びＦｃ−ＡＡＴ３は、エラスターゼ阻害活性を保持するが、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で比較すると、ある条件下では挙動が異なる。このことは、セリンプロテアーゼ阻害活性領域以外の別のＡＡＴ活性領域が関与することを示唆しており、それは、抗炎症及び抗免疫活性領域ＡＡＴであると考えられる。

実施例３
サイトカイン誘導性のマウスＲＡＷマクロファージ由来ＴＮＦαに対するＦｃ−ＡＡＴ（又はマウスＡＡＴ Ｆｃ）の効果は、部分的には、クローンが迅速精製され、ＡＡＴ活性が保存されているため、天然ＡＡＴ（例えば、市販製剤）の活性よりも強力にＴＮＦαを低減するであろうと考えられた。また、完全なヒンジ欠失を有するクローン３は、試験する活性によっては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでより強力である場合があるが、二次的活性の問題（例えば、補体活性等）が低減されるために、ｉｎ ｖｉｖｏ用としても改善された製剤であると考えられる。１つの例示的な方法では、望ましくない免疫活性を試験するために、ＡＴＴ−Ｆｃ２／Ｆｃ−ＡＡＴ２（クローン２ 完全なＩｇＧ１ヒンジ）及びＡＡＴ−Ｆｃ３／Ｆｃ−ＡＡＴ（クローン３、欠失ＩｇＧ１ヒンジ）を、免疫刺激活性の自然発生、マウスＴＮＦα産生に対する効果について試験した。

ＡＡＴ融合分子のサイトカインアッセイ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカイン産生についての細胞培養のアッセイ。ＲＡＷマクロファージを、以下の実験に使用した。Ｒａｗ２６４．７細胞を９６ウエルプレートで使用した（１ウェル当たり３×１０^５細胞）。図に示されるように、漸増濃度のＡＡＴ−Ｆｃ２及びＡＡＴ−Ｆｃ３を適用して、マウスＲＡＷ細胞を刺激した。ＡＡＴ−ＦｃによるマウスＴＮＦα産生の平均±ＳＥＭを、標準的ＥＬＩＳＡキットにより、製造業者の説明書（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ミネソタ州）に従って測定した。ここでは、２つの異なるＡＡＴ−Ｆｃ分子によるマウスＴＮＦαの自然誘導の差を試験した。これらの結果は、ＡＡＴ−Ｆｃ３（ヒンジ欠失）が、このｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてでさえ、ＴＮＦα産生、炎症誘発性サイトカインマーカーの低減に、より効果的であることを支持している。図４Ａには、２つの融合分子、Ｆｃ−ＡＡＴ２及びＦｃＡＡＴ３の比較、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ系でのＴＮＦα産生の効果が示されている。図４Ｂには、２つの融合分子、Ｆｃ−ＡＡＴ２及びＦｃ−ＡＡＴ３の、市販の血漿由来ＡＡＴ製剤（Ａｒａｌａｓｔ（登録商標））との比較が示されている。Ｆｃ−ＡＡＴ３は、血漿由来ＡＡＴ（Ａｒａｌａｓｔ（登録商標））と同等の優れた結果を示した。留意すべきことに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、カケキシン、又はカケクチンは、以前は腫瘍壊死因子−アルファ又はＴＮＦ−αとして知られており、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する一群のサイトカインのメンバーである。それは、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞、及びニューロン等の多くの他の細胞タイプにより産生されるが、主に活性化マクロファージ（Ｍ１）により産生される。このｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ヒンジ領域が欠失又は修飾されているＦｃ−ＡＡＴが、完全なＦｃヒンジ領域を有するＦｃ−ＡＡＴよりも優れた性質を有し、血漿由来製剤と同様にＴＮＦ産生の阻害に活性であることを支持する。

これらの実験は、３回実施して、ＡＡＴ−Ｆｃ２（ＩｇＧ１、クローン２）及びＡＡＴ−Ｆｃ３（ヒンジ欠失、ＩｇＧ２、クローン３）の観察結果が、同等であり、市販の製剤と比較したそれらの効力を正確に反映することを保証した（例えば、図４Ａ及び４Ｂを参照）。その際、ＡＡＴ−Ｆｃ２（ＩｇＧ１）及びＡＡＴ−Ｆｃ３（ヒンジ欠失）によるマウスＴＮＦαの自然産生に顕著な違いがあったことが観察され（図４Ａ）、ＡＡＴ−Ｆｃ２と比較して、ＡＡＴ−Ｆｃ３のＴＮＦα誘導が劇的に低減されている。更に、市販の製剤（例えば、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標））を、ＡＡＴ−Ｆｃ２（クローン２）及びＡＡＴ−Ｆｃ３（クローン３）と比較すると、劇的な違いがあった。

同様のデータが、刺激因子としてヒトＩＬ−３３を使用して観察された。また、組換えマウスＩＬ−３３を試験した。１００及び５００ｎｇ／ｍＬレベルのＦｃ−ＡＡＴ（全長ＡＡＴを有する完全ＩｇＧ１ Ｆｃ（データ非表示））によるＴＮＦαの一貫した抑制が示された。

実施例４
ＩＬ−１受容体アンタゴニスト誘導及びＩＬ−８誘導
この例示的な方法では、ＩＬ−８の産生を評価する。ＩＬ−８は、炎症性分子であり、その産生は、炎症応答誘導の指標である。この例では、ヒト血中好中球（３×１０^６細胞／ｍｌ）を、単独で又はＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、組換えＡＡＴ（クローン２）（１０μｇ／ｍｌ）、又はこの２つの組み合わせの存在下で６時間インキュベートした。細胞培養上清中でのＩＬ−８の産生を測定した（Ｎ＝３）。組換えＡＡＴは、刺激因子ＬＰＳの存在下でＩＬ−８発現を劇的に低減したことが示された。クローン３（ＩｇＧ１のヒンジ欠失）は、Ｆｃが操作されているものの、このクローンのＡＡＴ部分は完全であるため、この実験（図５Ａを参照）で反映されているのと同様の活性を有すると考えられる。このデータは、血漿由来ＡＡＴを使用した以前のデータにより支援される（データ非表示）。したがって、これらの分子は、炎症を阻害することが可能である。

別の例示的な方法では、別の炎症マーカーに対する組換え分子製剤の効果を評価するために、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を分析した。この例では、ヒト好中球細胞に由来するＩＬ−１受容体アンタゴニストの産生を、種々の濃度の組換えＡＡＴで測定した（Ｆｃ−ＡＡＴ２、クローン２：図Ｙ２を参照、ｃｏｎは、分子を誘導しない陰性対照である）。これらの実験により、非常に低レベルの組換えＡＡＴが、ＩＬ−１Ｒａ産生を劇的に抑制することができたことが明らかにされた。このクローンに見出されるＡＡＴの領域は、Ｆｃ−ＡＡＴ３（ヒンジ無し）と同一であるため、このデータは、本明細書で示されているＦｃ−ＡＡＴ２と比較して、同様の活性がＦｃ−ＡＡＴ３でも得られるであろうということを支持する（図５Ｂを参照）。

実施例５
他のサイトカイン発現を試験し、ＦｃＡＡＴ（クローン２）の効果を分析した（例えば、ＩＬ−１ベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１７等）。これらの結果の一部は、下記の表１に示されている。Ｆｃ融合を有する組換えＡＡＴが、有害なサイトカイン産生を阻止可能であることが示された。

図６Ａ〜６Ｃには、Ｆｃ−ＡＡＴ２と比較した、血漿由来ＡＡＴの存在下でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ４５陽性細胞の発現パーセント並びにＴＬＲ４及びＴＬＲ２発現のパーセントが示されており、約１００〜約１０００倍少ない組換えＡＡＴ（Ｆｃ−ＡＡＴ２）が、これらの有害分子に対して同じ阻害効果を示すことが見出された。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体４は、５００ｎｇ又は１００ｎｇのいずれでも、５００μｇの血漿由来ＡＡＴと同様に効果的である（図６Ａを参照）。

実施例６
痛風モデル
痛風関節炎のモデルである、尿酸一ナトリウム結晶で刺激したＰＢＭＣにおけるＩＬ−１β産生に対する組換えＦｃ−ＡＡＴの効果。Ｃ−１８（Ｃ１８）脂肪酸と共に尿酸一ナトリウム結晶（ＭＳＵ）で刺激したＰＢＭＣにおけるＦｃ−ＡＡＴ誘導性ＩＬ−１β産生の効果を、以前に記述されている痛風モデルを使用して分析した。

ｉｎ ｖｉｖｏ炎症研究でのＩＬ−１β産生
マウス痛風（痛風関節炎）モデルを使用して実験を実施し、Ｆｃ−ＡＡＴ２（ＩｇＧ１）対Ｆｃ−ＡＡＴ３（ヒンジ欠失）の効果をｉｎ ｖｉｖｏで比較した（図７Ａを参照）。Ｆｃ−ＡＡＴ３（及び欠失ヒンジを有する他のＦｃ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｆｃ−ＡＡＴ２（完全ヒンジのＩｇＧ１）よりも優れた結果を示すと考えられた。最初に、ＡＡＴ−Ｆｃ−２及びＡＡＴ−Ｆｃ−３のタンパク質濃度を決定した。マウスを計量し、用量を２．０ｍｇ／ｋｇに調節した。２時間後、ＭＳＵ Ｃ１６．０を、関節内に注射した。４時間後、マウスを安楽死させ、関節をスコアリングした。滑膜組織をサイトカインレベルについて均一化した（例えば、１４４，０００ｇ／Ｌ＝１モル；１４４，０００ｍｇ／ｍＬ＝１Ｍ：１４４ｍｇ／ｍＬ＝１ｍＭ：１４４μｇ／ｍＬ＝１μＭ：１４μｇ／ｍＬ＝１００ｎＭ）。血漿由来ＡＡＴの分子量＝４２，０００（低グリコシル化）４２マイクログラム／ｍＬの血漿由来ＡＡＴは、２４０ｎＭであり、ＡＡＴ−Ｆｃの分子量＝１４４，０００（低グリコシル化）１４マイクログラム／ｍＬのＡＡＴ−Ｆｃは、７ｎＭである。更なる研究は、ＡＡＴの存在下又は非存在下でＩＬ−６を評価することに関し、市販の製剤（Ｚｅｍａｉｒａ（商標））をＦｃ−ＡＡＴ２及びＦｃ−ＡＡＴ３と比較した（図７Ｂ）。カンジダ・アルビカンスにより誘導されたヒト血液単球細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを使用して、ＩＬ−６発現の劇的な低減が認められた。組換え製剤は両方とも、天然ＡＡＴ製剤（Ｚｅｍａｉｒａ（商標））よりも優れていた（図７Ｂを参照）。市販の製剤は、Ｆｃ−ＡＡＴ２及びＦｃ−ＡＡＴ３と比較して、ＩＬ−６発現を顕著には阻害しなかった。

痛風マウスモデルを使用して別の実験を行い、完全なＩＬ−１レセプター阻害を観察した（図７Ｃを参照）。更に別の例示的な方法では、ＩＬ−１βのレベルに対するＦｃ−ＡＡＴ２（クローン２）の経時的分析を評価した。経過時間は、種々の量の組換えＡＡＴと接触させた後の０〜７２時間とした。実施したＦＣ−ＡＡＴ２の経時的研究では、腹腔内前処理として融合分子を導入した後に、尿酸一ナトリウム（ＮＳＵ）結晶を膝関節に滴注した。滴注の約４時間後に、マウスを犠牲にし、膝関節を摘出して培養した。培養の約２時間後、培養上清中のＩＬ−１βを測定した（１群当たりＮ＝１０）。データは図７Ｄに示されている。ＩＬ−１βは、ＦｃＡＡＴ２で前処理すると４８時間を超えて阻害された。したがって、新規の組換え体が、ＩＬ−１β有害効果の阻害に役割を果たし、痛風患者の有望な治療であることが支持された。例えば、Ｊｏｏｓｔｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０１０年１１月；６２巻（１１号）：３２３７〜３２４８頁の実験手順を参照されたい。

方法の要約：１０μｌ ＰＢＳ中の用量範囲の高度に純粋なＭＳＵ（３０〜３００μｇ）、２００μＭのＣ１８．０、ＭＳＵ／Ｃ１８．０（３００μｇ／２００μＭ）又は２５μｇのＳＣＷ（ラムノース含有量）を、未感作マウスの右膝関節に関節内注射（ｉ．ａ．）することにより、関節の炎症を誘導することができる。ｉ．ａ．注射の４時間後に、関節腫脹を測定し、滑膜組織を単離し、膝関節を組織学的検査のために摘出した。関節腫脹測定は、巨視的スコアリング又は９９ｍＴｃ取込み法のいずれかにより測定することができる。巨視的関節腫脹を、０〜３の範囲の尺度でスコアリングする。皮膚を除去した後、膝関節をスコアリングした：０＝腫脹無し及び３＝重症腫脹。９９ｍＴｃ取込み法は、以前に記述されている通り実施した（２１、２２）。関節腫脹は、対照関節（左膝関節）に対する、炎症部位での９９ｍＴｃ取込みの比率として表される。１．１０を超える値は全て、関節腫脹とする。

実施例７
心筋梗塞モデル
別の例示的な方法では、心筋梗塞マウスモデルを使用して、以前に血漿由来ＡＡＴモデルで示されているように（データ非表示）、Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子が、心臓リモデリングを阻害し、梗塞サイズを低減する能力を評価した。一過性の心筋虚血（３０分間）によるＡＭＩ（急性心筋梗塞）の実験モデルは、再灌流ＡＭＩを有する患者の臨床背景を模倣する。マウスは、虚血性損傷を経験し、その後再灌流傷害を経験する。平均梗塞サイズは、左心室の１５〜２０％である。マウスは、左心室の拡張及び機能不全を有する穏やかな形態の拡張型心筋症を発症する。このモデルのＡＭＩでは、７日目に、ＬＶＥＤＤ及びＬＶＥＳＤの増加、及びＬＶＦＳの低下（全ての比較で、対照に対してｐ＜０．０５）が観察された。Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子の濃度を１０又は５０マイクログラムに増加させると、梗塞により影響を受けた左心室のパーセントとしての梗塞サイズ測定値が、両方の濃度で顕著に低減されたことが示されている（図８）。この濃度は、血漿由来ＡＡＴ製剤と比較して（比較試験では、およそ１００倍を使用した。腹腔内に２ミリグラム）（データ非表示）、劇的に低減されている。

恒久的な冠動脈閉塞によるＡＭＩの別の実験モデルは、非再灌流広範囲ＡＭＩを有する患者の臨床背景を模倣する。マウスは、重症の虚血性損傷を経験する。平均梗塞サイズは、左心室の２５〜３５％である。マウスは、左心室の拡張及び機能不全を有する重症形態の拡張型心筋症を発症し、致死率は高い。また、このモデルでは、血漿由来ＡＡＴが、急性心筋梗塞の影響を低減するのに有効であることが示された。

更に、図９に示されているように、心臓発作を模倣する別のマウスモデルを使用して、エラスターゼ活性を持たないことが示されたＦｃ−ＡＡＴ１（クローン１）、及びエラスターゼを阻害することが示されたＦｃ−ＡＡＴ２（クローン２）は、梗塞サイズとして測定された心臓リモデリングの低減に等しく効果的であった。両組換え分子は、５日間の２ｍｇ／マウスの他の作用剤（ＩＶＩＧ）と比較して、単一用量（５０マイクログラム／マウス）で有効であった。Ｆｃ−ＡＡＴ３（クローン３、ＩＧｇ１のヒンジ無し）が、このｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、心臓リモデリング及び虚血再灌流の他の影響を低減するのに、更により効果的であると考えられる。したがって、これらの実験は、本明細書に開示された融合分子が、虚血再灌流傷害の有害な影響及び有害な心臓疾患の低減に効果的であることを支持する。

Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子は、虚血再灌流損傷を制限し、梗塞サイズを低減する。
Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子は、虚血再灌流後のサイトカイン放出を制限する。
血漿由来ＡＡＴは、非再灌流ＡＭＩでの梗塞サイズを縮小せず、ＡＡＴが、再灌流傷害に関連する炎症成分に影響を及ぼし（データ非表示）、したがって有害な心臓疾患を治療するためのＦｃ−ＡＡＴ融合分子の役割を支持することが示唆される。

４）Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子は、ＡＭＩの両モデルで有害心臓モデリングを制限する。
実施例８
図１０には、ヒンジ領域が欠失、切断、又は突然変異されている、本明細書で企図された幾つかのＦｃ−ＡＡＴ融合分子が示されている。

実施例９
大腸炎／ＩＢＤモデル
上記に示されているように、Ｆｃ−ＡＡＴ３は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、サイトカインの産生を阻害し、したがって、炎症誘発性サイトカインの有害効果を調節する。このデータ及び大腸炎／ＩＢＤモデルにおける血漿由来ＡＡＴの従来の研究は両方とも、炎症性腸疾患の治療又は予防におけるＦｃ−ＡＡＴ（ヒンジ欠失）の役割を支持する。

血漿由来ＡＡＴ治療は、マウスのＤＳＳ大腸炎モデルでは、このモデルにおける炎症性腸疾患活性の最も信頼できる指標の１つである体重減少を軽減することが示されている。加えて、結腸外植片の上清に分泌されるサイトカインが顕著に減少する。

ＤＳＳモデルでは、Ｆｃ−ＡＡＴ（２マイクログラム〜２ｍｇ／日ｉ．ｐ）を用いて、マウスを、媒体で治療されたマウス及び対照血漿由来ＡＡＴ製剤（２ｍｇ／日）と比較することができる。マウスを、種々の時間で計量し、その後犠牲にして体重を評価し、天然ＡＡＴで観察されるような結腸短縮の減少を評価する。本明細書で示された裏付けとしての証拠は、融合分子で治療したＤＳＳ大腸炎マウスにて体重減少及び結腸短縮が観察されることにより、更に裏付けられると考える。更に、血漿由来ＡＡＴ（陽性対照）と同じか又は同様の結果が観察される融合分子の濃度は、約１０倍及び最大１０００倍少ないはずであると予想される。加えて、結腸外植片によるサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、及びＫＣ）を評価し、対照マウスと比較する。

実施例１０
膵島細胞毒性誘導シナリオにおけるグルコース調節を評価するためのマウスモデルを使用して、Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子が、細胞移植拒絶反応を低減し、例えば、血漿由来ＡＡＴが膵島細胞を分解から保護することができるという以前の観察により更に支持されるように、膵島細胞分解を低減する能力を評価する。ある方法では、標準的な毒素を、マウスモデル膵島ベータ細胞毒性アッセイ 毒素ストレプトゾトシン（ＳＴＺ） で使用することができる。以前に示されているように、市販のＡＡＴ（Ａｒａｌａｓｔ（登録商標））は、ＳＴＺ誘導性糖尿病で膵島細胞を保護することが示されている。以前の研究では、単一用量のＳＴＺを使用して、ベータ細胞死を誘導した。ＳＴＺを２回注射した後、マウスは糖尿病になる（血糖が４００ｍｇ／ｄＬ超に上昇する）。この２倍の用量を、ベータ細胞の免疫破壊の許容されるモデルとして使用する。膵島の保護効果を評価するために、Ｆｃ−ＡＡＴ融合分子を、血漿由来ＡＡＴと比較する。対照（ＰＢＳ）、血漿由来ＡＡＴ（市販）、又はＦｃ−ＡＡＴ（完全ヒンジ及びヒンジ欠失、１マウス当たり約１マイクログラム又は１０分の１未満）のいずれかを、毎日注射する。ＡＡＴの市販製剤は、有害効果を回復させ、膵島細胞機能を保存することが以前に観察された。Ｆｃ−ＡＡＴ（ヒンジ欠失）は、血漿由来ＡＡＴと比較して優れた効果を有し、ヒンジ欠失のないＦｃ−ＡＡＴよりも少ない副作用を示し、したがって、細胞及び臓器移植を支援して臓器拒絶を低減し移植片を保存するための本明細書に開示された組成物の使用を支持すると予測される。

本明細書に開示された融合分子を、移植前、移植中、及び／又は移植後に使用することが支持される。ある実施形態では、本明細書に開示されたＦｃ−ＡＡＴ融合分子を使用して、移植片を維持し、及び／又はＧＶＨＤ等の移植片拒絶の有害効果を低減することができる。

また、予備的データは、Ｆｃ−ＡＡＴ（ヒンジ欠失）の融合分子を使用して、例えば、炎症及び免疫応答の有害効果から対象体の膵島細胞を保護することにより、糖尿病の発症を低減又は予防することができることを支持する。

実施例１１
Ｆｃ−ＡＡＴの切断変異体の構築。ある例示的な実施形態では、ＡＡＴプロテアーゼ切断は、プロテアーゼ部位、例えばタバコモザイクウイルスプロテアーゼの、ＡＡＴ配列内への単なる挿入であり得る。プロテアーゼ認識部位の挿入は、ＡＡＴの切断型カルボキシル末端を生成する。この部位は、天然ＡＡＴのカルボキシ−３６−末端ペプチド：ＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＶＶＮＰＴＱＫ（配列番号３４）の上流にある。

これらの切断型ＡＡＴ分子は、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦαを阻害することが可能である。二価切断型融合分子は、血漿半減期の増加の点でペプチド自体よりも優れているであろう。天然ＡＡＴは、細胞膜の脂質ラフトに見出される可能性が高いことを考慮すれば、挿入が、Ｃ末端ではなく、Ｎ−末端である可能性は低いであろう。したがって、Ｃ末端の３６個のアミノ酸をＦｃに結合させて二価構造にすることは、脂質ラフトにてより効果的である可能性が高い。

Ｆｃドメインの切断。Ｆｃ断片を除去するための別の切断部位は、Ｆｃそれ自体の切断部位である。この部位は、単量体ＡＡＴ又は切断型ＡＡＴを生成する。しかしながら、Ｆｃ−ＩｇＧ１の酵素は、Ｆｃ−ＩｇＧ２の酵素とは異なる。

Ｎ末端の融合タンパク質。Ｎ末端ＡＡＴの構築体は、ＡＡＴの抗炎症特性がエラスターゼ阻害特性に依存しないことを示すデータに基づく新規の概念である。したがって、Ｎ末端をインフレーム構築に使用することにより、二価Ｃ末端を有する分子の形成が容易になる。各構築体では、グリコシル化が分子の重要な要素であるため、ＣＨＯでの発現が不可欠である。したがって、ＣＨＯ細胞を、野生型並びに切断型ＡＡＴ−Ｆｃの発現に使用することになるであろう。他の例には、カルボキシ末端で結合された構築体（例えば、Ｆｃ−ＡＡＴ２及びＦｃ−ＡＡＴ３）が含まれる。

切断型ＡＡＴ−Ｆｃの精製及びアッセイ。プロテアーゼ挿入部位の場合、分子を切断するプロテアーゼを、最初に導入し、その後プロテインＡを使用して断片のみを単離することができる。それにより、ほぼ純粋な形態の産物が得られるであろう。ある方法では、Ｆｃ切断部位の場合等、分子をプロテインＡで精製し、Ｆｃ切断プロテアーゼを添加し、その後プロテインＡでＦｃ断片を除去して、残りのタンパク質をほぼ純粋にすることが最善であろう。

実施例１２
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）における、ＩＬ−１β誘導性ＩＬ−１７に対するＦｃ−ＡＡＴの効果。

２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）では、免疫系細胞、特にＰＢＭＣ画分の単球が、炎症を促進する役割を果たすという証拠が示されている。Ｔ２Ｄ患者に由来する単球は、ＩＬ−１βを含む重要な炎症誘発性サイトカインを過剰産生する。ＩＬ−１βは、Ｔ２Ｄ患者に由来するＴ細胞による炎症誘発性ＩＬ−１７産生へとヒトＴ細胞を歪めること（ｓｋｅｗｉｎｇ）に関与し（非糖尿病の供与体と比較して）、構成的に及び刺激に応答して上昇する。ＩＬ−１β誘導性ＩＬ−１７の産生に対する、Ｆｃ−ＡＡＴ（ｒｅｃ−ＡＡＴ、ｒＡＡＴ）の効果を、モデルとしてのＰＢＭＣで試験する。

ＡＡＴ Ｔｇ^ｗｔマウスの生成。ＡＡＴ Ｔｇ系統とは異なるこれらのマウスの特徴は、プロモーターである。この新しい系統は、ニワトリベータアクチングローバルプロモーターを有し、血中レベルは、２型肺上皮でＡＡＴを発現するＡＡＴ Ｔｇマウスの血中レベルよりも高いであろう。生成したら、ヘテロ接合体マウス（１コピーの野生型ＡＡＴを発現する）を、ｉｎ ｖｉｖｏ負荷アッセイにかける。ａ．ＡＡＴ Ｔｇ^ｗｔマウスの特徴付け。ＤＮＡ分析によりヘテロ接合体マウスを確認したら、種々の組織を使用してウエスタンブロット評価を実施し、定常状態での発現を試験する。それらには、組織の組織学的検査が含まれる。ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカイン産生に関する初代細胞のアッセイ。ヒトと同様に、マウスのＰＢＭＣに由来するサイトカインを研究することが可能である。刺激因子には、全てのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、並びにＩＬ−１８及びＩＬ−１２の組み合わせが含まれる。ｃ．種々の負荷後のｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン応答。ＬＰＳ又は加熱死スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を、腹腔内に注射し、血中サイトカインを特定の時間間隔で測定する。また、ＩＬ−１８及びＩＬ−２のモデルも試験する。このモデルでは、マウスは、低体温、大腸炎、及び低血糖を示す消耗症候群を発症する。予備的データでは、ＡＡＴ Ｔｇマウスは、このモデルに耐性である。ｄ．膵島同種移植片拒絶反応に対する効果。ＡＡＴ Ｔｇ^ｗｔマウスがＴＬＲ負荷に耐性であることが示されたら、マウスを、膵島同種移植片拒絶反応及びマウス膵島に関する関連研究について評価する。

セリンプロテアーゼ阻害活性を示さないＡＡＴ（ＡＡＴ Ｔｇ^ｍｕ）の突然変異及びクローニング。以前に示されているように、ヒトＡＡＴのシステインの突然変異は、プロテアーゼを阻害する能力を持たない分子をもたらす（下記の表では、非機能性と表記されている）。上記で示されているＡＡＴプラスミドを、標準的ＰＣＲ法により突然変異させ、ＣｙｓをＡｌａに置換する。配列を確認する。これは、既に突然変異されており、ヒトＡＡＴのＣｙｓは、ＥＢＶ遺伝子発現ベクターに挿入されていた。野生型ＡＡＴ ＥＢＶ遺伝子発現ベクターを、高圧ボーラスを使用して野生型マウスの尾静脈に注射すると、ＤＮＡは肝細胞に進入し、ＡＡＴが肝臓で発現され、ＡＡＴの血清レベルが上昇する。

本明細書に開示及び特許請求された組成物及び方法は全て、本開示に照らして過度の実験作業を行わずに作製及び実施することができる。組成物及び方法は、好ましい実施形態の点で説明されているが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに、組成物及び方法に、及び本明細書に記載の方法のステップに若しくはステップの順序に変更を適用することができることは明白であろう。より詳しくは、化学的にも生理学的にも関連するある作用剤を、本明細書に記載の作用剤の代わりに使用し、同じか又は同様の結果を達成することができることは明白であろう。当業者にとって明白なそのような類似代替物及び修飾は全て、添付の特許請求の範囲により規定されている本発明の趣旨、範囲、及び概念に含まれるものとみなされる。

Claims (17)

1. 配列番号４９、配列番号５６、配列番号５７、又は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
2. 抗炎症効果又は免疫調節効果を誘発する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
3. 請求項１又は２に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築体。
4. 請求項１又は２に記載の融合ポリペプチド、又は請求項３に記載の核酸構築体と、賦形剤とを含む組成物。
5. 前記賦形剤は薬学的に許容される賦形剤であり、前記組成物は医薬組成物である、請求項４に記載の組成物。
6. 請求項３に記載の核酸構築体を含むベクター。
7. 請求項６に記載のベクターを含む形質転換細胞。
8. 請求項１又は２に記載の融合ポリペプチドを含む、発現された封入体の単離調製物。
9. ＡＡＴ療法を必要とする対象体を治療するための請求項５に記載の医薬組成物であって、前記治療は、前記対象体に請求項５に記載の医薬組成物を、次のいずれかの量：（ｉ）抗炎症反応を開始させるのに有効な量であって、前記医薬組成物を前記対象体に投与することが、前記対象体の炎症反応を低減させる量、（ｉｉ）免疫調節応答を達成するのに有効な量、（ｉｉｉ）糖尿病を治療するのに有効な量であって、前記医薬組成物を前記対象体に投与することが、前記対象体の糖尿病を治療する量、（ｉｖ）対象体の虚血性再灌流傷害を治療するのに有効な量、（ｖ）対象体の移植拒絶反応を抑制又は治療するのに有効な量、（ｖｉ）対象体の感染症を治療するのに有効な量、（ｖｉｉ）対象体のＡＡＴ欠乏を低減させるのに有効な量、（ｖｉｉｉ）対象体の痛風を調節するのに有効な量、（ｉｘ）対象体の心臓疾患を調節するのに有効な量、又は（ｘ）移植片対宿主疾患を治療又は予防するのに有効な量で投与することを含む、医薬組成物。
10. 対象体を治療するための請求項５に記載の医薬組成物であって、前記治療は、前記対象体に請求項５に記載の医薬組成物を、（ｉ）ＡＡＴ欠乏の治療、（ｉｉ）移植拒絶反応の抑制又は治療、（ｉｉｉ）痛風の調節、又は（ｉｖ）移植片対宿主疾患の治療又は予防に有効な量で投与することを含む、医薬組成物。
11. 経口、皮下、経皮、心臓内、冠内、筋肉内、直腸内、髄腔内、静脈内、鼻腔内、膣内、局所、又は吸入により投与されるように製剤化されている、請求項５、９、及び１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 徐放又は持続放出用にさらに製剤化されている、請求項５に記載の医薬組成物。
13. 病原性生物による感染症を有する対象体において、その感染症を治療し又は発症を低減するための請求項５に記載の医薬組成物。
14. 前記病原性生物による感染症は、細菌性感染症、ウイルス性感染症、真菌性感染症又は寄生虫感染症を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 対象体において心臓疾患を治療するための請求項５に記載の医薬組成物であって、前記心臓疾患は、心筋梗塞又は心臓事象後のリモデリングを含む、医薬組成物。
16. 対象体に移植するための臓器、組織、又は細胞を保存するための生体外で実施される方法であって、前記臓器、組織、又は細胞を移植又は保管のために保存するのに有効な量の請求項３に記載の核酸構築体又は請求項４に記載の組成物を、前記臓器、組織、又は細胞と接触させることを含む方法。
17. 前記病原性生物はウイルスを含み、前記医薬組成物はウイルスの複製及び／又は伝染を低減する、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。

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