JP6895218B2 - 血管内皮細胞増殖因子（ｖｅｇｆ）阻害剤 - Google Patents
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Description
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤に関する。
血管内皮細胞増殖因子（VEGF）は、血管新生や血管透過性上昇に関与するタンパク質として知られている。
現在、血管新生を伴う疾患や血管新生を病因とする疾患の治療剤として、抗VEGF抗体や、VEGF受容体（VEGFR）へのVEGFの結合を阻害する分子が活発に開発されている。例えば、VEGF結合阻害剤として、マクジェン（商品名）やLucentis（登録商標）等が市販されており、黄斑変性症等の治療に利用されている（例えば、非特許文献１参照）。
Anne E. Fung et al., 2007 Am J of Ophthalmol vol. 143, No. 4, pp.566-583
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤を提供することを目的とする。
本発明の一実施形態は、リグニン配糖体を有効成分として含有する血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤であって、前記リグニン配糖体は、以下の性質を有することを特徴とする血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤である。
（１）リグニン及び多糖類が結合
（２）分子量は８０００から１００００
（３）リグニンと多糖類の結合比は１：１〜２：１（分子比）
（４）多糖類はウロン酸１０〜２０％、中性糖８０〜９０％で構成されている。
（２）分子量は８０００から１００００
（３）リグニンと多糖類の結合比は１：１〜２：１（分子比）
（４）多糖類はウロン酸１０〜２０％、中性糖８０〜９０％で構成されている。
前記リグニン配糖体は、以下の工程で単離されてもよい。
（１）ゴヨウマツの松かさを熱水処理する工程
（２）前記熱水処理した松かさをエタノール処理する工程
（３）前記エタノール処理した松かさを乾燥させる工程
（４）前記乾燥させた松かさを水酸化ナトリウムで処理して抽出液を得る工程
（５）前記抽出液を中和する工程
（６）（５）で中和した前記抽出液にエタノールを添加し、沈殿物を回収する工程
前記リグニン配糖体は、部分構造として下記構造式を有してもよい。
（２）前記熱水処理した松かさをエタノール処理する工程
（３）前記エタノール処理した松かさを乾燥させる工程
（４）前記乾燥させた松かさを水酸化ナトリウムで処理して抽出液を得る工程
（５）前記抽出液を中和する工程
（６）（５）で中和した前記抽出液にエタノールを添加し、沈殿物を回収する工程
前記リグニン配糖体は、部分構造として下記構造式を有してもよい。
上記リグニン配糖体は、以下の工程で単離されるものであってよい。
（１）ゴヨウマツの松かさを熱水処理する工程
（２）前記熱水処理した松かさをエタノール処理する工程
（３）前記エタノール処理した松かさを乾燥させる工程
（４）前記乾燥させた松かさを水酸化ナトリウムで処理して抽出液を得る工程
（５）前記抽出液を中和する工程
（６）（５）で中和した前記抽出液にエタノールを添加し、沈殿物を回収する工程
本発明の他の一実施形態は、血管新生が病態に関与する疾病の治療剤及び予防剤、及び血管透過性上昇が病態に関与する疾病の治療及び予防剤のうちのいずれか１つ以上として用いられる医薬であって上記いずれかリグニン配糖体を有効成分として含有する医薬である。
（２）前記熱水処理した松かさをエタノール処理する工程
（３）前記エタノール処理した松かさを乾燥させる工程
（４）前記乾燥させた松かさを水酸化ナトリウムで処理して抽出液を得る工程
（５）前記抽出液を中和する工程
（６）（５）で中和した前記抽出液にエタノールを添加し、沈殿物を回収する工程
本発明の他の一実施形態は、血管新生が病態に関与する疾病の治療剤及び予防剤、及び血管透過性上昇が病態に関与する疾病の治療及び予防剤のうちのいずれか１つ以上として用いられる医薬であって上記いずれかリグニン配糖体を有効成分として含有する医薬である。
前記血管新生を病因とする疾病、又は血管透過性上昇を病因とする疾病が、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症等による黄斑浮腫、新生血管緑内障、増殖糖尿病網膜症、脈絡膜新生血管による近視性血管新生黄斑症又は特発性脈絡膜新生血管、加齢性黄斑変性、網膜虚血、クロウ・深瀬症候群（別名POEMS症候群）、末梢動脈閉塞疾患、カサバッハ-メリット症候群、脳浮腫、局所脳虚血、多嚢性卵巣症候群、子宮内膜症から選ばれる少なくとも１つであってよい。（Andreoli CM and Miller JW 2007 Curr Opin Ophthalmol vol.18, No.6, pp.502-508）
上記リグニン配糖体は、霊芝と併用されないことが好ましい。また、上記リグニン配糖体を細胞増殖阻害剤と併用する抗腫瘍剤としてもよい。
上記リグニン配糖体は、霊芝と併用されないことが好ましい。また、上記リグニン配糖体を細胞増殖阻害剤と併用する抗腫瘍剤としてもよい。
本発明によって、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤を提供することが可能になった。
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
（１）松かさリグニン配糖体
本発明の血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤に含まれる化合物は、マツ科植物に含まれるリグニン配糖体の一種であって、以下の性質を有する。
（Ｉ）リグニン及び多糖類が結合
（ＩＩ）分子量は８０００から１００００
（ＩＩＩ）リグニンと多糖類の結合比は１：１〜２：１（分子比）
（ＩＶ）多糖類はウロン酸１０〜２０％、中性糖８０〜９０％で構成されている。中性糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、アラビノースが例示できる。
本発明の血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤に含まれる化合物は、マツ科植物に含まれるリグニン配糖体の一種であって、以下の性質を有する。
（Ｉ）リグニン及び多糖類が結合
（ＩＩ）分子量は８０００から１００００
（ＩＩＩ）リグニンと多糖類の結合比は１：１〜２：１（分子比）
（ＩＶ）多糖類はウロン酸１０〜２０％、中性糖８０〜９０％で構成されている。中性糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、アラビノースが例示できる。
このリグニン配糖体は、以下のようなゴヨウマツの松かさからの抽出方法によって特定できる。
（Ｉ）熱水処理
まず、ゴヨウマツの松かさを熱水処理する。水の量は、松かさの量に応じて、適宜決めればよい。水の温度は特に限定されないが、９０℃以上が好ましく、１００℃がより好ましい。処理時間は特に限定されず、１時間〜１昼夜で、数回処理しても良いが、２時間、３回処理することが好ましい。
（ＩＩ）エタノール処理
次に、熱水処理した松かさをエタノール処理する。エタノールの量は、松かさの量に応じて、適宜決めれば良い。松かさは乾燥状態のまま、１００％エタノールに浸すことが好ましく、１時間〜１昼夜静置すればよいが、２時間室温に静置することが好ましい。
（ＩＩＩ）乾燥処理
エタノール処理した松かさをアセトン洗浄し、エタノールを除去する。アセトンの量は、松かさの量に応じて、適宜決めれば良い。その後、放置して、松かさを乾燥させる。
（ＩＶ）水酸化ナトリウム処理
乾燥させた松かさを水酸化ナトリウムで処理して抽出液を得る。水酸化ナトリウムの量は、松かさの量に応じて、適宜決めれば良い。水酸化ナトリウムの濃度は特に限定されないが、０．１Ｎ〜１Ｎであることが好ましく、０．３Ｎであることがより好ましい。処理時間は、１時間〜１昼夜静置すればよいが、１昼夜室温に静置することが好ましい。その後、松かさを除去して、抽出液を回収する。
（Ｖ）中和処理
こうして得られた抽出液を中和する。用いる酸は、特に限定されないが、塩酸または酢酸が好ましい。最終pHは、５〜６であることが好ましく、５．５であることがより好ましい。
（ＶＩ）エタノール沈殿
中和した前記抽出液にエタノールを添加し、好ましくは４℃で、１時間〜１昼夜静置し、リグニン配糖体を沈殿させ、吸引濾過して上清を除去する。
（ＶＩＩ）精製
最後に、沈殿物を精製する。例えば、ゲル濾過で分画して、各画分に対し、公知の方法によって、VEGF阻害作用を評価し、VEGF阻害画分を得ることができる。
まず、ゴヨウマツの松かさを熱水処理する。水の量は、松かさの量に応じて、適宜決めればよい。水の温度は特に限定されないが、９０℃以上が好ましく、１００℃がより好ましい。処理時間は特に限定されず、１時間〜１昼夜で、数回処理しても良いが、２時間、３回処理することが好ましい。
（ＩＩ）エタノール処理
次に、熱水処理した松かさをエタノール処理する。エタノールの量は、松かさの量に応じて、適宜決めれば良い。松かさは乾燥状態のまま、１００％エタノールに浸すことが好ましく、１時間〜１昼夜静置すればよいが、２時間室温に静置することが好ましい。
（ＩＩＩ）乾燥処理
エタノール処理した松かさをアセトン洗浄し、エタノールを除去する。アセトンの量は、松かさの量に応じて、適宜決めれば良い。その後、放置して、松かさを乾燥させる。
（ＩＶ）水酸化ナトリウム処理
乾燥させた松かさを水酸化ナトリウムで処理して抽出液を得る。水酸化ナトリウムの量は、松かさの量に応じて、適宜決めれば良い。水酸化ナトリウムの濃度は特に限定されないが、０．１Ｎ〜１Ｎであることが好ましく、０．３Ｎであることがより好ましい。処理時間は、１時間〜１昼夜静置すればよいが、１昼夜室温に静置することが好ましい。その後、松かさを除去して、抽出液を回収する。
（Ｖ）中和処理
こうして得られた抽出液を中和する。用いる酸は、特に限定されないが、塩酸または酢酸が好ましい。最終pHは、５〜６であることが好ましく、５．５であることがより好ましい。
（ＶＩ）エタノール沈殿
中和した前記抽出液にエタノールを添加し、好ましくは４℃で、１時間〜１昼夜静置し、リグニン配糖体を沈殿させ、吸引濾過して上清を除去する。
（ＶＩＩ）精製
最後に、沈殿物を精製する。例えば、ゲル濾過で分画して、各画分に対し、公知の方法によって、VEGF阻害作用を評価し、VEGF阻害画分を得ることができる。
こうして抽出されたリグニン配糖体（本明細書では、松かさリグニン配糖体と称する）は、部分構造として以下の構造式を有すると推定される。
上記の松かさリグニン配糖体の製法は、本発明で用いる松かさリグニン配糖体の特定方法にすぎず、実際にこの松かさリグニン配糖体を用いる場合の抽出方法は特に限定されず、公知の方法を用いればよい。例えば、日本国特許公報第278260号や日本国特許公報第2784605号に記載されている抽出方法を用いることができる。
（２）血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤
松かさリグニン配糖体は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害作用があるので、VEGF阻害剤として使用することができる。ここで、VEGFの由来は特に限定されないが、ヒトであっても、ヒト以外の脊椎動物であってもよい。
松かさリグニン配糖体は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害作用があるので、VEGF阻害剤として使用することができる。ここで、VEGFの由来は特に限定されないが、ヒトであっても、ヒト以外の脊椎動物であってもよい。
VEGFは、血管新生を誘発する、血管透過性を上昇させる等の機能を有するため、生体内で、VEGFを阻害することによって、血管新生阻害作用、血管透過性上昇阻害作用等を発揮させることができる。従って、松かさリグニン配糖体を有効成分として含有するVEGF阻害剤は、血管新生阻害作用、血管透過性上昇阻害作用等を通して、血管新生及び／又は血管透過性上昇が病態に関与し、血管新生及び／又は血管透過性上昇を阻害することが治療に繋がる様々な疾病の治療又は予防に使用することができる。疾病例として、糖尿病網膜症、網膜静脈閉そく症などによる黄斑浮腫、新生血管緑内障、増殖糖尿病網膜症、脈絡膜新生血管による近視性血管新生黄斑症又は特発性脈絡膜新生血管、加齢性黄斑変性、網膜虚血、クロウ・深瀬症候群（別名POEMS症候群）、末梢動脈閉塞疾患、カサバッハ-メリット症候群、脳浮腫、局所脳虚血、多嚢性卵巣症候群、子宮内膜症、腫瘍などに使用することができる。
（３）松かさリグニン配糖体の薬品用途
松かさリグニン配糖体は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害作用があるので、例えば薬品組成物（医薬品組成物及び試薬品組成物）に用いることができ、当業者に周知の方法を用いて、医薬または試薬を製造するのに使用することができる。こうした組成物の原料として、事実上純化された松かさリグニン配糖体を用いてもよいが、不純物が混入した松かさなどの抽出物を用いても良く、例えば、上記精製方法において、（ＶＩ）のエタノール沈殿までを行った抽出物を用いてもよい。ここで、松かさの由来とする松は、松かさリグニン配糖体を含有する松であれば特に限定されないが、特に松かさリグニン配糖体を多量に含有するゴヨウマツが好ましい。
松かさリグニン配糖体は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害作用があるので、例えば薬品組成物（医薬品組成物及び試薬品組成物）に用いることができ、当業者に周知の方法を用いて、医薬または試薬を製造するのに使用することができる。こうした組成物の原料として、事実上純化された松かさリグニン配糖体を用いてもよいが、不純物が混入した松かさなどの抽出物を用いても良く、例えば、上記精製方法において、（ＶＩ）のエタノール沈殿までを行った抽出物を用いてもよい。ここで、松かさの由来とする松は、松かさリグニン配糖体を含有する松であれば特に限定されないが、特に松かさリグニン配糖体を多量に含有するゴヨウマツが好ましい。
松かさリグニン配糖体を含有する医薬としては、（２）に記載した疾患のいずれをも対象にすることができる。松かさリグニン配糖体を含有する医薬は、抗がん剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗菌剤、免疫増強剤、血液流動改善剤を除いた使用が好ましい。
医薬の製造は、当業者に周知の方法を用いればよく、形状は特に限定されず、錠剤、カプセル、袋詰め、シロップ、坐薬、瓶詰め、軟膏、点眼又は点鼻薬等であってもよい。
松かさリグニン配糖体を含有する試薬は、in vitroまたはin vivoにおける、様々な研究用試薬として用いることもできる。その目的は限定されず、例えば、医薬開発であってもよく、基礎研究であってもよい。また、用いる対象も限定されず、例えば、細胞から抽出したものであっても、細胞であっても、生体であってもよい。
（４）リグニン配糖体と、その他の医薬との併用
本発明のリグニン配糖体は、Lucentis（登録商標）等の抗VEGF抗体に代表される、公知のVEGF阻害物質と併用してもよく、当業者に周知の方法を用いて、薬品を製造するのに使用することができる。好ましくは、霊芝と併用される用途を除く。それらの具体的な実施態様は、（３）に記載したものと同様である。
本発明のリグニン配糖体は、Lucentis（登録商標）等の抗VEGF抗体に代表される、公知のVEGF阻害物質と併用してもよく、当業者に周知の方法を用いて、薬品を製造するのに使用することができる。好ましくは、霊芝と併用される用途を除く。それらの具体的な実施態様は、（３）に記載したものと同様である。
一方、松かさリグニン配糖体は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害作用があるので、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害作用を有さない医薬とは、相乗効果を発揮でき、特に好ましく併用可能である。例えば、抗腫瘍剤として、細胞増殖阻害剤である抗腫瘍剤と併用することによって、相乗効果が期待される。
（５）本発明のVEGF阻害剤の使用方法
本発明のVEGF阻害剤は、VEGFを阻害する目的で、あらゆる用途に使用できる。
本発明のVEGF阻害剤は、VEGFを阻害する目的で、あらゆる用途に使用できる。
例えば、医薬品に使用する場合、松かさリグニン配糖体を含有する医薬品の投与対象は、（２）や（３）に記載の疾患に罹患したヒトまたはヒト以外の脊椎動物である。投与方法は限定されず、経口であっても非経口であっても、全身投与であっても局部投与であってもよい。
松かさリグニン配糖体を含有する試薬品は、ヒト以外の哺乳類生体内などのin vivoでも、培養細胞や培養組織などのin vitroでも用いることができる。
松かさリグニン配糖体を含有する試薬品は、ヒト以外の哺乳類生体内などのin vivoでも、培養細胞や培養組織などのin vitroでも用いることができる。
（１）松かさリグニン配糖体の調製
ゴヨウマツの松かさ１００ｇを１Ｌの熱湯に入れ、２時間放置し、熱湯を交換して、同様の処理を２回繰り返した。半乾燥状態のまま、１Ｌの１００％エタノールに浸し、２時間室温に静置した。その後、３００mLのアセトンで洗浄し、一昼夜室温に静置して乾燥させた。
このように前処理した松かさを０．３Ｎ水酸化ナトリウム１Ｌに浸して一昼夜室温に静置した後、松かさを濾過して除去した。得られた抽出液に２Ｎ塩酸を滴下して、ｐＨを５．５に調整した。この溶液に等量の１００％エタノールを加えて、４℃で一昼夜静置した。生成した沈殿物を吸引濾過にて回収した後、重量／容量比で等量の水に溶解し、多量の水に対して一昼夜透析した後、得られた溶液を凍結乾燥させ、粉末を得た。
ゴヨウマツの松かさ１００ｇを１Ｌの熱湯に入れ、２時間放置し、熱湯を交換して、同様の処理を２回繰り返した。半乾燥状態のまま、１Ｌの１００％エタノールに浸し、２時間室温に静置した。その後、３００mLのアセトンで洗浄し、一昼夜室温に静置して乾燥させた。
このように前処理した松かさを０．３Ｎ水酸化ナトリウム１Ｌに浸して一昼夜室温に静置した後、松かさを濾過して除去した。得られた抽出液に２Ｎ塩酸を滴下して、ｐＨを５．５に調整した。この溶液に等量の１００％エタノールを加えて、４℃で一昼夜静置した。生成した沈殿物を吸引濾過にて回収した後、重量／容量比で等量の水に溶解し、多量の水に対して一昼夜透析した後、得られた溶液を凍結乾燥させ、粉末を得た。
この粉末を１ｍＬの水に溶解し、カラムクロマトグラフィー（セファロースＣＬ−４Ｂ）で精製した。
この粉末を１ｍＬの１０％エタノールに溶解し、カラムクロマトグラフィー（トヨパールＨＷ４０−Ｆ）で精製し、松かさリグニン配糖体を含んだ粉末を得た。
（２）松かさリグニン配糖体（PLG）のVEGF阻害効果
松かさリグニン配糖体の細胞毒性、及び、VEGF阻害効果の一例としてVEGFが誘発する血管新生の阻害効果の確認実験を行った。
松かさリグニン配糖体の細胞毒性、及び、VEGF阻害効果の一例としてVEGFが誘発する血管新生の阻害効果の確認実験を行った。
CS-C培地（without serum and growth factor, Cell Systems Corporation製）に、CS-S培地の1/10量のFBS、1/100量のヘパリン（50 IU/mL）、及び1/100量のペニシリン−ストレプトマイシン（100 U/mL-100μg/mL）を加えた培地を調製した。以下、この培地を「実験用培地」と称する。
次いで、調製した実験用培地を９６ウェルプレートに注入し、ヒト網膜血管内皮細胞（Human Retinal Endothelial Cells (HREC), Cell Systems Corporation製）を、ウェルあたり１０4個播種し、温度３７℃、５％ＣＯ2で２日間培養した。
次いで、２日間培養に使用した実験用培地をウェルから除去して、表１に示す物質を加えた実験用培地と交換した。VEGFの実験用培地における濃度は、3 ng/mLとした。なお、交換用の各培地は、３７℃で１時間プレインキュベートしたものを用いた。そして培地交換後、温度３７℃、５％ＣＯ2で更に２日間培養した。ここで、表１において、群１〜４が細胞毒性を確認するための培地であり、群５〜９は、VEGF阻害効果を確認するための培地である。また、各群あたり、４つのウェルを使って培養を行った。
また、対照実験として、VEGFの代わりに、血管内皮細胞増殖因子の一つである繊維芽細胞増殖因子（aFGF）を用い、表２に示す被験物質を加えた実験用培地を用いて同様の条件で培養を行った。なお、aFGFの実験用培地における濃度は、10 ng/mLとした。
次いで、各ウェルの、HRECを含む培地の490nmにおける吸光度（OD490）を測定した。各群について４つのウェルの平均値を求め、この平均値を、生細胞数の指標とした。
以上の結果を図１に示す。図１上図において、左から順に表１の群の１〜９の結果を示し、図１下図においては、左から順に表２の群の１〜６の結果を示す。
（３）結果
図１上図に示すように、従来知られていた抗VEGF抗体、つまりVEGF阻害剤であるLucentis（登録商標）は、VEGFの誘発する血管内皮細胞増殖を阻害した。同様に、本発明の松かさリグニン配糖体も、VEGFの誘発する血管内皮細胞増殖を阻害した。松かさリグニン配糖体の濃度が高い程、増殖阻害効果は高かった。なお、松かさリグニン配糖体は、１００μｇ／ｍＬでも、細胞毒性を示さなかった。
図１上図に示すように、従来知られていた抗VEGF抗体、つまりVEGF阻害剤であるLucentis（登録商標）は、VEGFの誘発する血管内皮細胞増殖を阻害した。同様に、本発明の松かさリグニン配糖体も、VEGFの誘発する血管内皮細胞増殖を阻害した。松かさリグニン配糖体の濃度が高い程、増殖阻害効果は高かった。なお、松かさリグニン配糖体は、１００μｇ／ｍＬでも、細胞毒性を示さなかった。
一方で、図１下図に示すように、松かさリグニン配糖体は、aFGFの誘発する血管内皮細胞増殖を阻害しなかった。
このように、松かさリグニン配糖体は、特異的にVEGFを阻害するVEGF阻害剤として有効である。
このように、松かさリグニン配糖体は、特異的にVEGFを阻害するVEGF阻害剤として有効である。
Claims (3)
- リグニン配糖体を有効成分として含有する血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤であって、
前記リグニン配糖体は、以下の性質を有する、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤（ただし、抗腫瘍剤及び血糖低下剤としての使用を除く）。
（１）リグニン及び多糖類が結合
（２）分子量は８０００から１００００
（３）リグニンと多糖類の結合比は１：１〜２：１（分子比）
（４）多糖類はウロン酸１０〜２０％、中性糖８０〜９０％で構成されている。 - 血管新生が病態に関与する疾病の治療剤及び予防剤、及び血管透過性上昇が病態に関与する疾病の治療剤及び予防剤のうちのいずれか１つ以上として用いられる医薬であって、
請求項１に記載の血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤を有効成分として含有する医薬（ただし、抗腫瘍剤及び血糖低下剤としての使用を除く）。 - 前記血管新生が病態に関与する疾病、又は前記血管透過性上昇が病態に関与する疾病が、網膜静脈閉そく症などによる黄斑浮腫、新生血管緑内障、脈絡膜新生血管による近視性血管新生黄斑症又は特発性脈絡膜新生血管、加齢性黄斑変性、網膜虚血、クロウ・深瀬症候群（別名POEMS症候群）、末梢動脈閉塞疾患、カサバッハ-メリット症候群、脳浮腫、局所脳虚血、多嚢性卵巣症候群、子宮内膜症から選ばれる少なくとも１つである、請求項２に記載の医薬。
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