CN103173419A - 抗趋化因子4单克隆抗体、杂交瘤细胞系及应用 - Google Patents

Abstract

一种生物技术领域的抗趋化因子4单克隆抗体、杂交瘤细胞系及应用，涉及用重组人源CXCL4蛋白免疫大鼠和将大鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并对形成的杂交瘤细胞筛选两个阶段；本发明的另外一个目的是提供抗趋化因子4的单克隆抗体在拮抗化疗所造成的小肠黏膜损伤等方面的用途。本发明单克隆抗体能抗人趋化因子4和抗鼠趋化因子4，具备预防和治疗肿瘤化疗毒副作用的效果。

Description

抗趋化因子4单克隆抗体、杂交瘤细胞系及应用

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的抗体，具体是一种抗趋化因子4单克隆抗体、杂交瘤细胞系及应用。 

背景技术

目前，化疗药物是治疗恶性肿瘤的主要方法之一。然而，化疗药物在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常的组织或器官也有严重的毒副作用，其中肠黏膜损伤是抗癌药物常见的剂量毒性反应和并发症，临床应用中化疗病人的发病率达到50%-80%，症状包括恶心，呕吐，厌食以及腹泻等(Wadler S,Benson AB,3rd,Engelking C,Catalano R,Field M,Kornblau SM,et al.Recommended guidelines forthe treatment ofchemotherapy-induced diarrhea.JClin Oncol.1998,16:3169-3178；Benson AB,3rd,Ajani JA,Catalano RB,Engelking C,Kornblau SM,Martenson JA,Jr.,et al.Recommended guidelines for the treatment of cancer treatment-induced diarrhea.2004,J Clin Oncol22:2918-2926)。这些严重的副作用不仅大大地阻碍了癌症的化疗疗效，也是引起化疗中止或者药物剂量减少的主要原因，其中，以腹泻为主要表现的肠黏膜损伤是化疗药物的主要毒副作用之一。 

现在认为，化疗药物引起的肠黏膜损伤是一系列细胞生理反应的综合结果，这些反应包括炎症反应、细胞凋亡、细胞增殖能力降低以及直接的细胞毒性作用等（Daniele B,Secondulfo M,De Vivo R,Pignata S,De Magistris L,Delrio P,et al.Effect of chemotherapy with5-fluorouracil on intestinal ermeability and absorption in patients with advanced colorectal cancer.J Clin Gastroenterol2001,32:228-230；Duncan M,Grant G.Oral and intestinal mucositis-causes and possible treatments.AlimentPharmacol Ther.2003,18:853-874；Bowen JM,Gibson RJ,Cummins AG,Keefe DM.Intestinal mucositis:the role of theBcl-2family,p53and caspases in chemotherapy-induced damage.Support Care Cancer2006,14:713-731）。其中,小肠隐窝上皮细胞的凋亡是化疗所引起的肠黏膜损伤的主因之一（Anilkumar TV,SarrafCE,Hunt T,Alison MR(1992).The nature of cytotoxic drμg-induced cell death in murine intestinal crypts.Br J Cancer65:552-558；Pritchard DM,Potten CS,Hickman JA.The relationships between p53-dependent apoptosis,inhibition of proliferation,and5-fluorouracil-induced histopathology in murine intestinal epithelia.Cancer Res.1998,58:5453-5465；KeefeDM,Brealey J,Goland GJ,Cummins AG.Chemotherapy for cancer causes apoptosis that precedes hypoplasia in crypts of the small intestine in humans.2000,Gut47:632-637；Inomata A,Horii I,Suzuki K.5-Fluorouracil-induced intestinal toxicity:what determines the severity ofdamage to murine intestinal crypt epithelia.ToxicolLett2002,133:231-240）。有研究表明使用化疗药物5-FU注射小鼠后,导致小肠隐窝细胞凋亡，且在化疗后第一天最严重，而在这期间小肠组织的形态学差异并不大，这表明5-FU注射后24小时内启动的凋亡在化疗导致的肠黏膜炎中扮演了重要角色（Yasuda M,Kato S,Yamanaka N,Iimori M,Matsumoto K,Utsumi D,Kitahara Y，Amagase K,Horie S,Takeuchi K.Serotonin5-HT3receptor antagonists ameliorate 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis by suppression of apoptosis in mice intestinal crypt cells.BrJPharmacol.2012Oct16.）。研究发现，这类细胞凋亡与趋化因子4及其受体的参与有密切关系。 

血小板作为一类特殊并且丰富的趋化因子来源，已经被证实参与很多组织器官的炎症以及损伤过程，其中包括胃肠道组织。目前,作为血小板中最丰富的趋化因子CXCL4在胃肠道损伤方面的研究还不是很清晰。 

趋化因子（chemokines）是一类能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，分子量多在8~12KD之间，根据其N端所含的1~2个半胱氨酸的位置，趋化因子可分为CXC、CC、C及C3XC四个亚族（Oppenheim JJ,Zachariae CO,Mukaida N,Matsushima K:Properties of the novel proinflammatory supergene“intercrine”cytokine family.Ann Rev Immunol,1991,9:617；Rollins BJ:Chemokines.Blood1997,90:909）。趋化因子4（PF4/CXCL4），是一个肝素结合蛋白，存在于血小板ɑ-颗粒致密体中，在血小板黏附、聚集、活化时，以蛋白多糖复合物的形式从血小板中释放。趋化因子4既是巨核细胞成熟和血小板活化的标记物，同时也是从血小板中分离出的第一个趋化因子（Hannah AL.Kinases as drμg discovery targets in hematologic malignancies.Curr Mol Med.2005,5(7):625-42）。在结构上，人趋化因子4是对称的，由四个相同的亚基组成四聚体（Grazia Gentilini,NancyE.Kirschbaum,James A.Aμgustine,Richard H.Aster,and Gian Paolo Visentin.Inhibition of Human Umbilical Vein Endothelial Cell Proliferation by the CXC Chemokine,Platelet Factor4(PF4),Is Associated With Impaired Downregulation of p21Cip1/WAF1.Blood， Vol93,No1,1999:pp25-33）。趋化因子4是趋化因子CXC亚族的一员。与大多数其他的趋化因子不同，趋化因子4还参与了许多重要的生物学事件，包括细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖和细胞存活等。此外,趋化因子4还支持造血干细胞的存活（Han ZC,Lu M,Li J,Defard M,Boval B,et al.Platelet factor4and other CXC chemokines support the survival of normal hematopoietic cells and reduce the chemosensitivity ofcells to cytotoxic agents.Blood1997,89:2328-2335），抑制血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖（Watson JB,Getzler SB,Mosher DF Platelet factor4modulates the mitogenic activity of basic fibroblast growth factor.J Clin Invest.1994,94:261268）同时,还能抑制巨核细胞的生成（Han,Z.C.,Bellucci,S.,Walz,A.,Baggiolini,M.,Caen,J.P.Negative regulation of human megakaryocytopoiesis by human platelet factor4(PF4)and connective tissue-activating peptide(CTAP-III).Int.J.Cell Clon.e,1990,8,253–259）等。最近有研究表明，趋化因子4在小肠组织的损伤中扮演了调节子的角色（LapchakpH,IoannouA,Rani P，Lieberman LA,et al.(2012)The role of platelet factor4in local and remote tissue damage in a mouse model of mesenteric ischemia/reperfusioninjury.Introduction)。 

趋化因子受体CXCR3在上皮细胞，内皮细胞和淋巴细胞中都存在着广泛表达（Wuyts.A,Proost.P，Lenaerts.J.P，Ben-Baruch.A,Van Damme.J and Wang.J.M.Eur.J. Biochem.1998,255(1),67-73），并且参与调节人体的各种病理生理反应。其生物学功能主要是提供一种与趋化因子配体相结合的位点，使配体和表达CXCR3受体的细胞结合，从而发挥生物学功能（Colvin RA,Campanella GS,Sun J,et al.Intracellular domains of CXCR3that mediate CXCL9,CXCL10,and CXCL11 function.JBiol Chem2004,279:30219–30227）。已有研究证实，在乳糜泻疾病中，CXCR3在小鼠和人肠上皮细胞以及粘膜组织中的表达都有所升高（Karen M,Lammers,Ruliang Lu,Julie Brownley，Bao Lu,et al.Gliadin Induces an Increase in Intestinal Permeability and Zonulin Release by Binding to the Chemokine Receptor CXCR3.Gastroenterology2008,135:194–204）。 

因此，本领域需要研究能抑制化疗毒副作用的物质，特别是能预防和治疗化疗导致的肠粘膜损伤的药物。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种抗趋化因子4单克隆抗体、杂交瘤细胞系及应用，涉及用重组人源CXCL4蛋白免疫大鼠和将大鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并对形成的杂交瘤细胞筛选两个阶段；本发明的另外一个目的是提供抗趋化因子4的单克隆抗体在拮抗化疗所造成的小肠黏膜损伤等方面的用途。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种抗趋化因子4杂交瘤细胞系，所述的杂交瘤细胞16D6-3的保藏号为CCTCC No.C2012186；于2012年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，430072。 

本发明涉及上述杂交瘤细胞系的应用，将其用于制备抗趋化因子4单克隆抗体。 

所述的制备具体是指： 

a）扩增保藏号为CCTCC No.C2012186的杂交瘤细胞16D6-3； 

b）腹腔注射小鼠； 

c）回收腹水并从腹水中分离抗趋化因子4单克隆抗体。 

所述的抗趋化因子4单克隆抗体，由轻链和重链构成，其中：轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。 

所述的重链的编码基因选自如下序列之一： 

1）其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述的重链氨基酸的DNA分子； 

3）与1）限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述的重链氨基酸的DNA分子。 

所述的轻链的编码基因选自如下序列之一： 

I）其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 

II）在严格条件下与I）限定的DNA序列杂交且编码所述的轻链氨基酸的DNA分子； 

III）与I）限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述的轻链氨基酸的DNA分子。 

本发明涉及一种重组载体，通过将如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子进行克隆并与T4载体进行连接处理得到的重组载体。 

本发明涉及一种表达盒，包含上述核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的编码基因。 

本发明涉及上述抗趋化因子4单克隆抗体在制备治疗或预防肿瘤化疗毒副作用的药物、以及制备预防或治疗化疗哺乳动物小肠粘膜损伤的药物中的应用。 

所述的药物优选包括上述单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物。 

所述的哺乳动物优选为人或小鼠。 

小肠黏膜损伤与修复是一个动态过程，有多种细胞因子共同参与，运用基因芯片技术，本发明对小肠黏膜再生过程中基因表达变化的规律进行了系统研究。结果表明，5-FU化疗后相关细胞因子的变化趋势可以分为3类：（1）表达基本没有变化；（2）表达谱先上升后下降；（3）表达谱先下降后上升。根据本实验室已有的造血基因芯片结果及其相关细胞因子在造血调控中的研究结果，本发明推测，与化疗后小鼠的肠黏膜损伤修复调控相关的细胞因子的分泌，可能会呈现出表达水平先上升后下降的趋势，而趋化因子4(CXCL4)与其受体CXCR3无论在基因水平还是蛋白质水平都符合这一趋势，提示CXCL4与其受体CXCR3可能参与了肠黏膜损伤修复的调控过程。 

本发明以最贴近于临床实际的化疗小鼠模型为基础，进行了少量Anti-CXCL4(抗趋化因子4)单克隆抗体防治化疗小鼠肠黏膜炎的药效和药理机制研究。实验结果证明在CXCR3激活的p38MAPK通路的参与下，Anti-CXCL4(抗趋化因子4)单克隆抗体通过中和CXCL4调控的p53与Bax的表达，防止了小肠隐窝细胞的凋亡，从而减轻了化疗导致的肠粘膜损伤。本发明为Anti-CXCL4单克隆抗体成为防治肿瘤化疗肠道毒副作用候选药物，提供了充分的实验依据。 

进一步,本发明需要制备和纯化Anti-CXCL4单克隆抗体。本发明以纯化的重组人 CXCL4为抗原，与弗氏佐剂混合制成乳液，采取多点注射方式免疫SD大鼠。首次免疫后，每2周免疫一次，重复3次。分别用重组人CXCL4（rhcxcl4-his）和重组鼠CXCL4（rmcxcl4-his）做包被抗原，用ELISA方法检测大鼠血清中的抗体滴度，待抗体滴度大于1∶20000后准备细胞融合。细胞融合前3天，用PBS溶液稀释CXCL4抗原，加强免疫1次，免疫剂量为400μg，腹腔注射。 

取适量的免疫SD大鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞，在50%PEG4000的作用下进行细胞融合。在HAT选择性培养基中筛选融合细胞。每天观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积约一半以上时吸出上清。以重组鼠CXCL4（rmcxcl4-his）做包被抗原，用ELISA方法检测融合细胞的阳性率，筛选时，设SP2/0骨髓瘤细胞上清液为阴性对照，以带有his标签的CXCL4蛋白为阳性对照，去除his阳性杂交瘤干扰。发现OD值大于或等于阴性孔2.1倍的样品即来自阳性孔，当阳性孔数量较多时，可选取其中部分OD值相对较高的孔用有限稀释法进行克隆化筛分。经过3次克隆化筛分出稳定分泌抗重组人和小鼠CXCL4单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并保存细胞株，将它命名为16D6-3。 

细胞株体外连续培养1个月，经ELISA方法检测证明，抗体分泌能力稳定。用该细胞株注射裸鼠收集腹水，样品经过亲和柱HiTrap protein G HP(GE Healthcare)分离，纯化腹水中的抗体，SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度达到98%(图3D-a)，应用蛋白质印迹(Western blot）方法检测单克隆抗体与重组人CXCL4蛋白的结合活性（图3D-b）为阳性。用BIAcore检测纯化得到的单克隆抗体与重组人CXCL4的亲和力，经Biaevaluation软件分析数据，采用一对一Langmuir结合模型计算结合率（k_on）和解离率（k_off），发现分别为1.79×10^-6(1/s)和97.8（1/ms），平衡解离常数（Kd）计算为1.83×10^-8M（图3A）。 

本发明将ACHN细胞用10μg/mL-100μg/mL的重组人rhCXCL4蛋白孵育，72小时后MTT检测发现rhCXCL4(IC₅₀=72.6μg/mL)有效降低了ACHN细胞的存活率，与文献报道一致（图3B），而Anti-CXCL4单克隆抗体则有效阻断了CXCL4(72.6μg/mL)对ACHN细胞的生长抑制作用，并且呈现浓度依赖性（图3C）。本发明从稳定分泌抗体的杂交瘤细胞中提取RNA，逆转录cDNA，通过PCR及序列分析获得了该抗体序列，借助NCBI以及IMGT等网站对结果加以分析,并对抗体的重链、轻链进行比对和分区。结果证实，Anti-CXCL4单克隆抗体的DNA序列（SEQ ID No.1和SEQ ID No.2）以及氨基酸序列（SEQ ID No.3和SEQ ID No.4）符合典型的大鼠IgG序列特征（图1）。 

实验结果充分说明了16D6-3细胞株分泌的Anti-CXCL4单克隆抗体能够有效地中和（或抑制）CXCL4的生物学功能，防止细胞凋亡，从而有可能将该单克隆抗体用于治疗化疗药物（如5-FU）所引起的肠黏膜损伤等毒副效应。 

以腹泻为主要表现的肠黏膜损伤是化疗药物的主要毒副作用之一，研究发现预防性使用 Anti-CXCL4单克隆抗体通过拮抗化疗损伤初期表达上调的CXCL4，有效推迟了化疗后小鼠腹泻的发生时间以及减轻了腹泻的严重程度，并且大大提高小鼠对高剂量化疗药物的耐受性。 

虽然化疗导致肠黏膜炎的机制尚未完全研究清楚，但初步认定这一过程涉及一系列细胞生理变化，包括炎症浸润，细胞凋亡，细胞增殖能力降低，以及细胞毒性等(Daniele B,Secondulfo M,De Vivo R,Pignata S,De Magistris L,Delrio P,et al.Effect of chemotherapy with5-fluorouracil on intestinal permeability and absorption inpatients with advanced colorectal cancer.J Clin Gastroenterol.2001,32:228-230.；Duncan M,Grant G.Oral and intestinal mucositis-causes and possible treatments.Aliment Pharmacol Ther2003,18:853-874；Bowen JM,Gibson RJ,Cummins AG,Keefe DM.Intestinal mucositis:the role of theBcl-2family,p53and caspases in chemotherapy-induced damage.Support Care Cancer.2006,14:713-731)。而小肠隐窝上皮细胞的凋亡是化疗导致肠粘膜损伤的主因之一(（Anilkumar TV,SarrafCE,Hunt T,Alison MR(1992).The nature of cytotoxic drμg-induced cell death in murine intestinal crypts.Br J Cancer65:552-558；Pritchard DM,Potten CS,Hickman JA.The relationships between p53-dependent apoptosis,inhibition of proliferation,and5-fluorouracil-induced histopathology in murine intestinal epithelia.Cancer Res.1998,58:5453-5465；KeefeDM,Brealey J,Goland GJ,Cummins AG.Chemotherapy for cancer causes apoptosis that precedes hypoplasia in crypts of the small intestine in humans.2000,Gut47:632-637；Inomata A,Horii I,Suzuki K.5-Fluorouracil-induced intestinal toxicity:what determines the severity ofdamage to murine intestinal crypt epithelia.ToxicolLett2002,133:231-240）。有研究表明5-FU化疗导致的小肠隐窝细胞凋亡在化疗后第一天最严重，在这期间小肠组织的形态学差异并不大，这说明5-FU注射后24小时内启动的凋亡在化疗导致的肠黏膜炎中扮演了重要角色。因此推断Anti-CXCL4单克隆抗体对肠粘膜损伤的保护机制与减少化疗后小肠隐窝细胞的凋亡相关。通过对C57BL/6野生型与CXCR3-/-小鼠预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体，本发明证实了在CXCR3的介导下，抗体通过拮抗化疗后小鼠小肠组织中CXCL4的高表达，有效地减少了小肠隐窝中凋亡细胞的比例，保护了肠粘膜的损伤。 

Anti-CXCL4单克隆抗体不仅有效减轻了化疗所致的小鼠肠粘膜损伤，并且这种保护作用是由CXCR3受体介导的，是以一种p53依赖机制防止小肠隐窝上皮细胞的凋亡来实现的。同时，本发明的研究还表明p38信号通路也参与到这一保护机制中。 

研究还发现预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体通过拮抗化疗损伤初期表达上调的CXCL4，有效推迟了化疗后小鼠腹泻的发生时间以及减轻了腹泻的严重程度，并且大大提高小鼠对高剂量化疗药物的耐受性。推断Anti-CXCL4单克隆抗体对肠粘膜损伤的保护机制与减少化疗后小肠隐窝细胞的凋亡相关。通过对C57BL/6野生型与CXCR3-/-基因敲除小鼠预防性地使用Anti-CXCL4单克隆抗体，本发明的确证实了在CXCR3的介导下，抗体通过拮抗化疗后 小鼠小肠组织中的CXCL4的表达水平，有效地减少了小肠隐窝中凋亡细胞的比例，从而防止了肠粘膜的损伤。 

附图说明

图1为小鼠化疗后不同时间大肠和小肠组织中CXCL4和CXCR3蛋白质和基因表达水平的变化图； 

图中：A为对小鼠一次性腹腔注射5-FU（250mg/kg），化疗后第0、1、2、3、5、7天分别取小鼠的小肠与大肠组织进行检测，CXCL4在mRNA水平的基因芯片结果显示CXCL4在mRNA水平呈现先上升后下降的趋势，并且在1.5d达到最高峰。（n=3） 

B为Elisa检测小鼠化疗后大肠与小肠组织中CXCL4的表达变化图；化疗后第5天CXCL4在大肠与小肠中的表达量达到最高值，分别比正常表达量提高了2.25和2.02倍。（n=3） 

C为RT-PCR检测小鼠化疗后大肠与小肠组织中CXCL4在基因水平的表达变化图；化疗后第2天CXCL4在大肠与小肠中的表达量达到最高值，分别比正常表达量提高了5.52和24.72倍。（n=3） 

D为RT-PCR检测小鼠化疗后大肠与小肠组织中CXCR3在基因水平的表达变化图；化疗后第3天CXCR3在大肠与小肠中的表达量达到最高值，分别比正常表达量提高了5.17和1.48倍。（n=3）（*P<0.05,**P<0.01vs第0天）。 

图2为使用免疫组化方法对CXCR3在小鼠小肠隐窝中的表达定位图。 

图中：一次性注射5-FU（250mg/kg）后免疫组化方法分别对第0,3,5,7天CXCR3在小鼠小肠隐窝中的表达定位(400×)。 

图3为Anti-CXCL4单克隆抗体特性的鉴定示意图； 

图中：A为BIAcore方法分析Anti-CXCL4单克隆抗体的亲和力。用一对一的朗格缪尔结合模型计算结合率(k on)和解离率(k off)。平衡解离常数(k d)为k on与k off的比值；B为趋化因子4对ACHN细胞的影响图，其中：趋化因子4对ACHN细胞存在生长抑制作用，且呈现浓度依赖性；C为Anti-CXCL4单克隆抗体拮抗了趋化因子4(72.6μg/mL)对ACHN细胞的抑制作用，且呈现浓度依赖性；D为SDS/PAGE(8%)(a)与Western blotting(b)方法分析纯化的Anti-CXCL4单克隆抗体。 

实验结果用平均值±SD表示。**P<0.01versus anti-CXCL4mAb of0。对照组代表未经趋化因子4以及单抗处理的ACHN细胞。 

图4为Anti-CXCL4单克隆抗体降低5-FU化疗导致的小鼠腹泻以及小鼠的死亡率比较示意图； 

图中：A为5-FU(250mg/kg)化疗前2小时,实验组BALB/c小鼠腹腔注射Anti-CXCL4 单克隆抗体(1mg/kg)，对照组注射同体积生理盐水，观察小鼠腹泻程度。（n=10）； 

B为5-FU(400mg/kg)化疗前2小时,实验组C57/BL6小鼠腹腔注射Anti-CXCL4单克隆抗体(1mg/kg)，对照组注射同体积生理盐水，观察小鼠死亡情况。（n=10） 

其中：实验结果以平均值±SE表示。*P<0.05,**P<0.01。 

图5为预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体防止5-FU化疗导致的小肠隐窝上皮细胞凋亡的作用图； 

图中：A为Tunel方法检测生理盐水，5-FU化疗以及抗体处理后野生型小鼠与CXCR3敲除小鼠小肠隐窝细胞的凋亡情况。（n=3）； 

B为凋亡指数统计：随机选取3个视野，每个视野计算10个隐窝的Tunel阳性细胞个数。（n=3） 

C为Western blots方法检测生理盐水，5-FU化疗以及抗体处理后野生型小鼠与CXCR3敲除小鼠小肠，组织中p53和Bax的表达情况。光密度测定法对各组p53和Bax的表达变化进行统计。（n=3） 

其中：实验结果以平均值±SD表示。*P<0.05,**P<0.01。 

图6为趋化因子4诱导小肠上皮细胞（IEC-6）的凋亡伴随p53和Bax表达的上调图； 

图中：A为Tunel方法检测不同浓度趋化因子4(a:0,b:5μg/mL,c:10μg/mL,d:20μg/mL)处理24小时后对IEC-6细胞的促凋亡作用。（箭头指向凋亡小体）； 

B为MTT检测不同浓度趋化因子4对IEC-6细胞增殖的影响； 

C为Western blots检测IEC-6细胞中p53和Bax在趋化因子4(10μg/mL)刺激后，不同时间点的表达变化； 

D为Western blots检测IEC-6细胞中caspases3，8，9的剪切形式。分别在趋化因子4（10μg/mL）孵育0,6,12,24小时后收集IEC-6细胞。β-actin设立为参比对照； 

其中：实验结果以平均值±SD表示。*P<0.05,**P<0.01。 

图7为CXCL4通过调控CXCR3介导的p38MAPK与ERK通路，诱导IEC-6细胞的凋亡示意图； 

图中：Western blots检测IEC-6细胞中phospho-p38，p38，phospho-Erk和Erk的表达变化。分别在趋化因子4（10μg/mL）孵育0h,6h,12h,24h小时后收集IEC-6细胞。β-actin设立为参比对照。 

图8为Anti-CXCL4单克隆抗体降低放疗导致的小鼠腹泻以及小鼠的死亡率示意图； 

图中：A为辐照(8Gy)前1小时,实验组BALB/c小鼠腹腔注射Anti-CXCL4单克隆抗体(1mg/kg)，对照组注射同体积生理盐水，观察小鼠腹泻程度。（n=10）； 

B为辐照(8Gy)前1小时,实验组BALB/c小鼠腹腔注射Anti-CXCL4单克隆抗体(1mg/kg)，对照组注射同体积生理盐水，观察小鼠死亡情况。（n=10）； 

图中：实验结果以平均值±SE表示。*P<0.05,**P<0.01。 

图9为Anti-CXCL4单克隆抗体降低环磷酰胺化疗导致的小鼠腹泻以及小鼠的死亡率示意图； 

图中：A为环磷酰胺(450mg/kg)化疗前2小时,实验组BALB/c小鼠腹腔注射Anti-CXCL4单克隆抗体(1mg/kg)，对照组注射同体积生理盐水，观察小鼠死亡情况。（n=10）； 

B为环磷酰胺(500mg/kg)化疗前2小时,实验组BALB/c小鼠腹腔注射Anti-CXCL4单克隆抗体(1mg/kg)，对照组注射同体积生理盐水，观察小鼠死亡情况。（n=10） 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1 

重组人抗趋化因子4（rhcxcl4-his）和重组鼠抗趋化因子4（rmcxcl4-his）的制备 

一.基因序列： 

rhcxcl4-his：NM_002619.3 

rmcxcl4-his：NM_019932.4 

二.纯化工艺流程简介：破菌缓冲液重悬菌体→破菌→亲和层析→变性→复性→阳离子交换层析 

三.纯化过程： 

一）rhcxcl4-his的纯化： 

取发酵菌体20g，按照10mL破菌缓冲液：1g菌体的比例加入1×中文（his-tag binding buffer）在冰上悬浮菌体； 

分别用500,700,800bar高压匀浆破菌； 

破菌液经过4℃，10000rpm离心30min，取上清弃沉淀，上清留样1mL，4℃保存； 

纯水清洗10mL亲和层析柱3-5CV，去除20%乙醇，流速2mL/min； 

1×组氨酸标签电荷缓冲液（his-tag charge buffer）洗3-5CV，流速2mL/min； 

1×组氨酸标签结合缓冲液his-tag binding buffer洗3-5CV，流速2mL/min； 

上样，流速2mL/min； 

1×his-tag binding buffer洗2CV，流速2mL/min； 

1×组氨酸标签洗涤缓冲液（his-tag wash buffer）洗3-5CV直至洗脱峰回到基线，收集洗 脱峰取1mL留样； 

1×组氨酸标签洗脱缓冲液（his-tag elutionbuffer）洗脱，收集洗脱峰即为目的蛋白； 

收集到的蛋白溶液加入8M尿素边加边搅拌，再加入终浓度为10mM的DTT，室温搅拌1h； 

按照变性液：复性液为1∶10的比例加入复性液，4-10℃条件下1h内加完，边加边搅拌，放置过夜； 

第二天复性液调节pH值为7.0上SP柱； 

SP阳离子交换层析步骤（20mL SP sephrose FF）： 

纯水洗3-5CV，去除20%乙醇； 

Wash buffer平衡柱子5CV，3mL/min流速； 

上样，3mL/min流速； 

Wash buffer洗柱子5CV，3mL/min流速； 

Elution buffer洗脱，0-100%B（即NaCl浓度0-1M）,40min洗脱完毕，收集洗脱峰，25mL，4-10℃保存； 

样品用0.22um过滤后取样检测蛋白浓度，SDS-PAGE； 

样品用PEG20000浓缩约5倍后重新检测蛋白浓度，内毒素及SDS-PAGE检测合格的样品于超净台0.22um过滤后分装于无热源EP管中，低温保存。 

二）rmcxcl4-his的纯化： 

1.摇瓶菌体7g解冻，按照10mL连接缓冲液（binding buffer）（不含盐酸胍）：1g菌体充分悬浮（冰浴中操作），分别用500,700,800bar高压匀浆破菌，破菌液OD600值＜1，菌液经过10000rpm×30min取上清，沉淀-20℃冻存，上清留样1mL，4℃保存； 

2.50%硫酸铵进行盐析，冰浴沉淀1h，取沉淀弃上清； 

3.上述硫酸铵沉淀与变性液比例为1：10变性（室温搅拌2小时），肉眼观测样品乳光是否严重，若乳光严重10000rpm×15min离心； 

4.变性后的样品参考rhcxcl4亲和纯化方案亲和层析； 

5.收集到的样品4℃保存； 

6.第二天将样品按照与复性液比例为1：10体积进行稀释复性，一小时内完成，复性后样品加入终浓度为0.2%亚硫酸钠； 

7.复性后的样品进行SP层析，收集洗脱峰（0.8MNaCl洗脱），4℃保存。 

实施例2 

抗人和小鼠趋化因子4（CXCL4）单克隆抗体的制备 

1.实验材料 

1.1试剂:RPMI1640培养液购自invitrogen，血清购自hyclone，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，HT和HAR购自Sigma公司，培养板为Corning公司产品，HRP标记的羊抗大鼠二抗购自Jackson公司，免疫用rhcxcl4-his和rmcxcl4-his均为本实验室生产。 

1.2细胞株及实验小鼠:人骨髓瘤细胞系SP2/0用含10%FBS的1640培养液悬浮培养，SD大鼠，10-12周，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。 

2.实验方法 

2.1SD大鼠免疫：选取3只雄性SD大鼠，将rhcxcl4-his抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化完全后皮下多点注射，每只大鼠的免疫剂量为200μg，首次免疫后每2周免疫一次，将rhcxcl4-his抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，乳化完全后皮下多点注射，重复3次后，分别用rhcxcl4-his和rmcxcl4-his做包被抗原，ELISA检测大鼠血清滴度，待滴度大于1∶20000可以准备融合。融合前3天加强免疫1次，PBS稀释抗原，免疫剂量为400μg，腹腔注射。 

2.2抗人和大鼠趋化因子4（CXCL4）单克隆抗体的制备：取免疫SD大鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG4000的作用下进行细胞融合。在HAT选择性培养基中进行筛选，每天观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积约一半以上时吸出上清，分别用rmcxcl4-his和rhcxcl4-his做包被抗原，ELISA法检测融合细胞的阳性率，同时设SP2/0骨髓瘤细胞上清液作为阴性对照。筛选时增加有带有his标签的CXCL14蛋白作为对照，去除his阳性杂交瘤干扰。OD值大于或等于阴性孔的2.1倍即为阳性孔，当阳性孔数量较多时，可选取其中部分OD值相对较高的孔用有限稀释法进行克隆化。经过3次克隆化筛出一株稳定分泌抗CXCL4单克隆的杂交瘤细胞株16D6-3（保藏号CCTCC NO:2012186），将该杂交瘤细胞系扩大培养并冻存保种。 

实施例3 

单克隆抗体理化性质的鉴定 

本发明制备了具有中和人源以及鼠源CXCL4蛋白能力的Anti-CXCL4单克隆抗体，并对其进行分离纯化，抗体特性的鉴定，以及生物学活性检测。以纯化的重组人CXCL4免疫SD大鼠,经细胞融合以及3次克隆化得到了一株分泌抗重组人和小鼠CXCL4单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为16D6-3。细胞株体外连续培养1个月，经ELISA方法检测证明，抗体分泌能力稳定。用该细胞株注射裸鼠收集腹水，亲和柱HiTrap protein G HP(GE Healthcare)纯化腹水中的抗体，SDS-PAGE检测抗体纯度达到98%(图3D-a),并用Western blot方法检测单克隆抗体与重组人CXCL4蛋白的结合活性（图3D-b）。用BIAcore检测纯化得到的单克隆抗体与重组人CXCL4的亲和力，经Biaevaluation分析软件处理数据，采用一对一Langmuir结合模型计算结合率（k_on）和解离率（k_off）分别为1.79×10^-6(1/s)和97.8（1/ms），平衡解离常数（Kd）为1.83×10^-8 M（图4A）。 

根据文献报道本发明将ACHN细胞用10μg/mL-100μg/mL的rhCXCL4蛋白孵育，72小时后MTT检测发现rhCXCL4(IC50=72.6μg/mL)有效抑制了ACHN细胞的生存率，与文献报道一致（图4B）（Lasagni L,Francalanci M,Annunziato F,Lazzeri E,Giannini S,Cosmi L,et al.An alternatively spliced variant of CXCR3mediates the inhibition of endothelial cell growth induced by IP-10,Mig,and I-TAC,and acts as functional receptor for platelet factor4.J Exp Med.2003,197(11):1537-49），而Anti-CXCL4单克隆抗体有效阻断了CXCL4(72.6μg/mL)对ACHN细胞的生长抑制作用，并且呈现浓度依赖性。本发明从稳定分泌抗体的杂交瘤细胞中提取RNA,逆转录cDNA，通过PCR等方法获得了该抗体序列，经NCBI以及IMGT等网站对结果加以分析,并对抗体的重链、轻链进行比对和分区。结果也证实，anti-CXCL4单克隆抗体符合典型大鼠IgG序列特征（图1）。重链由重链可变区(VH)、重链恒定区1(CH1)、铰链区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)组成。以下为Anti-CXCL4单克隆抗体DNA与氨基酸序列的分析。 

VL: 

VH: 

实验结果充分说明了16D6-3分泌的抗体能够有效中和CXCL4的生物学功能。 

实施例4 

5-FU化疗后CXCL4及其受体CXCR3在小鼠小肠组织中的表达呈现平行变化 

本发明以最贴近于临床实际的化疗小鼠模型为基础进行研究，通过基因芯片技术，对5-FU诱导小肠黏膜损伤及自我修复过程中基因表达谱的变化进行了研究，本发明发现，趋化因子CXCL4与其受体CXCR3在5-FU化疗后小肠粘膜的损伤期表达量上调，而在小肠粘膜修复期的表达量下降。与对照组相比，5-FU化疗后CXCL4的表达在第1.5天达到了最高值，第3天开始下降（图1A）。该结果提示趋化因子4与其受体CXCR3参与了化疗导致的肠黏膜的损伤修复过程。应用ELISA和real-time PCR的方法检测CXCL4和CXCR3在5-FU化疗后第0h、1h、2h、3h、5h、7h的表达水平变化，结果同样发现存在先升后降的趋势。CXCL4蛋白及其受体CXCR3在5-FU化疗后表达上的平行变化，表明它们二者参与了肠黏膜损伤修复的过程。 

实施例5 

抗趋化因子4单克隆抗体的预防性用药对减轻化疗导致的小鼠腹泻且降低小鼠死亡率的作用 

为了进行深入地研究，本发明制备了具有中和人源以及鼠源CXCL4蛋白作用的Anti-CXCL4单克隆抗体，并对其进行分离纯化、抗体特性的鉴定以及生物学活性检测。 

本发明通过预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体，观察其对化疗导致的腹泻是否有抑制作用。实验结果显示，与对照组相比，Anti-CXCL4单克隆抗体有效推迟了腹泻发生时间，减轻了腹泻严重程度(图4A)，腹泻评分结果显示在5-FU化疗后的第3至7天Anti-CXCL4单克隆抗体的保护作用更加显著(p＜0.01)。 

本发明又进一步研究了预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体在5-FU高剂量（400mg/kg）化疗下对小鼠存活的保护作用。与对照组相比，单抗有效地提高了小鼠对5-FU的耐受性，仅 在化疗后第14天有一只小鼠死亡，死亡率为10%，而对照组的小鼠从化疗后第7天开始死亡，截止第10天全部死亡(log-rank test p＜0.01)(图4B)。 

表1.5-FU化疗后第3天到第7天抗体组与对照组小鼠腹泻评分 

以上实验结果表明，Anti-CXCL4单克隆抗体的预防性用药可有效地减轻5-FU化疗导致的小鼠肠粘膜损伤，极大的提高了小鼠的存活率。 

实施例6 

抗趋化因子4单克隆抗体的预防性用药对小肠隐窝上皮细胞凋亡的作用 

5-FU化疗导致的肠粘膜损伤主要由于小肠隐窝上皮细胞的凋亡造成，于是推断Anti-CXCL4单克隆抗体对化疗导致的小肠隐窝上皮细胞凋亡具有一定防护作用。5-FU(300mg/kg)化疗前2h，分别对C57/BL6 WT（野生型）和cxcr3基因敲除鼠(CXCR3-/-)腹腔注射1mg/kg Anti-CXCL4单克隆抗体，24小时后TUNEL检测小肠隐窝细胞中的凋亡发生情况。结果显示5-FU化疗后24小时，WT与cxcr3基因敲除鼠小肠隐窝中的凋亡细胞都显著增加；然而，预防性注射Anti-CXCL4单克隆抗体后，减少了WT小鼠中的TUNEL阳性细胞（p＜0.01），而对CXCR3-/-并无此作用（图6A 及图6B）。由于5-FU诱导小肠隐窝上皮细胞的凋亡是p53相关性的，本发明用Western blotting方法分析了p53和Bax在蛋白水平的表达变化，实验结果显示Anti-CXCL4单克隆抗体显著阻断了WT小鼠中化疗导致的p53及Bax的上调（p＜0.05），而对CXCR3-/-并无此阻断作用（图5C）。 

以上结果表明，Anti-CXCL4单克隆抗体通过调控小肠组织中p53与Bax的表达保护了5-FU化疗导致的小肠隐窝上皮细胞凋亡，并且这种保护作用是CXCR3受体依赖的。 

实施例7 

CXCL4对IEC-6细胞的凋亡的调控作用 

已有研究表明，在5-FU化疗的肠粘膜损伤模型中，CXCL4及其受体CXCR3的表达与肠粘膜损伤修复过程相关，而Anti-CXCL4单克隆抗体能够有效减少5-FU化疗导致的小肠隐窝上皮细胞的凋亡，体内实验结果提示本发明，CXCL4可能能够通过CXCR3受体直接诱导小肠隐窝上皮细胞的凋亡。 

已有文献报道大鼠隐窝上皮细胞IEC-6细胞表面能够表达CXCR3(Karen M,Lammers,Ruliang Lu,Julie Brownley，Bao Lu,et al.Gliadin Induces an Increase in Intestinal Permeability and Zonulin Release by Binding to the Chemokine Receptor CXCR3.Gastroenterology2008,135:194–204)，本发明选用不同浓度的CXCL4(0-80μg/mL)对IEC-6细胞进行刺激，结果发现在体外CXCL4对IEC-6细胞存在生长抑制作用，且呈现浓度依赖性(图6B)(*P<0.05,**P<0.01)。TUNEL染色显示5μg/mL的CXCL4能够诱导IEC-6细胞的凋亡(图6A-b,箭头所指为凋亡小体)，随着CXCL4浓度增加，凋亡细胞的比例也增加(图6A)。 

在明确了CXCL4对IEC-6细胞的生长抑制源于细胞凋亡后，本发明用Western blotting的方法检测了参与调控凋亡的因子，与体内实验结果的提示一致，p53与Bax在IEC-6细胞中的表达随着CXCL4作用时间的增加而上调(图6C)，并且含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3,8和9（Caspase-3，8和9）分别于CXCL4作用6h，6h，12h后被激活(图6D)。 

以上实验结果表明在CXCL4诱导的IEC-6细胞的凋亡中，p53表达的上调起到了非常重要的作用，同时被激活的Caspase家族也参与到此过程中。 

实施例8 

CXCL4对IEC-6细胞的凋亡的诱导 

已有文献报道CXCR3受体能够介导p38MAPK，Erk以及AKt信号通路的活化，为了确定CXCL4诱导IEC-6细胞凋亡的信号传导通路，本发明用Western blotting的方法检测了相关通路，结果显示CXCL4作用12h后磷酸化的p38表达显著上升，而p-ERK显著下降，提示本发明CXCL4诱导IEC-6细胞的凋亡可能通过CXCR3增加磷酸化的p38的表达，激活其下游信号通路完成，同时p-ERK表达量的降低则对IEC-6细胞的生长起到了一定的抑制作用(图7)。[00143]有研究表明5-FU化疗引起的小肠隐窝细胞凋亡是p53依赖性的，而p53也被证实能够在转录水平激活Bax的表达（Pritchard DM,Potten CS,Hickman JA(1998).The relationships between p53-dependent apoptosis,inhibition of proliferation,and5-fluorouracil-induced histopathology in murine intestinal epithelia.Cancer Res58:5453-5465），预防性注射Anti-CXCL4单克隆抗体显著抑制了化疗上调的p53以及Bax。提示本发明化疗后表达上调的CXCL4很有可能协同5-FU一起诱导p53与Bax促凋亡因子的上调。 

已有文献报道CXCL4在CXCR3的介导下能够直接或间接促进细胞的凋亡（Lasagni L,Francalanci M,Annunziato F,Lazzeri E,Giannini S,Cosmi L,et al.An alternatively spliced variant of CXCR3mediates the inhibition of endothelial cell growth induced by IP-10,Mig,and I-TAC,and acts as functional receptor for platelet factor4.J Exp Med.2003,197(11):1537-49；Platelet factor4induces cell apoptosis by inhibition of STAT3via upregulation of SOCS3expression in multiple myeloma.Haematologica.2012Aμg28），本发明首次发现CXCL4在体外能够直接促进大鼠隐窝细胞（IEC-6）的凋亡，并且诱导p53与Bax表达的上升，而这一过程同时伴随着caspase3,8,9活性的激活，启动了细胞的内源性凋亡。 

到目前为止CXCL4调节的信号转导通路尚未完全研究清楚。有研究提出在HMEC细胞中，CXCL4在CXCR3B的介导下能激活下游p38MAPK（Activation ofp38(MAPK)mediates the angiostatic effect of the chemokine receptor CXCR3-B.Int J Biochem Cell Biol.2008,40(9):1764-74）信号通路，在单核细胞中，CXCL4通过激活p38MAPK影响呼吸链导致氧自由基释放，造成单核细胞的凋亡(Kasper B,Brandt E,Brandau S,Petersen F.Platelet factor4(CXC chemokine ligand4)differentially regulates respiratory burst,survival,and cytokine expression of human monocytes by using distinct signaling pathways.J Immunol.2007Aμg15,179(4):2584-91)。而ERK同样作为CXCR3的下游信号传导通路能够被双向调节(Signal transduction by the chemokine receptor CXCR3:activaion of Ras/ERK,Src,and phosphaidylinositol3-kinase/Akt controls cell migration and proliferation in human vascular pericytes.JBiol Chem.2001Mar30,276(13):9945-54)从而影响细胞的迁移、增殖。为了进一步确证CXCL4能够激活CXCR3介导下游信号通路，本发明对细胞增殖与凋亡相关的通路进行了研究，结果发现在CXCL4的刺激下,IEC-6细胞中的p38MAPK被激活，同时磷酸化ERK的表达被抑制。这一结果提示本发明，CXCL4在促进IEC-6细胞凋亡同时可能抑制了该细胞的增殖。 

实施例9 

Anti-CXCL4单克隆抗体的预防性用药对减轻放疗导致的小鼠腹泻且降低小鼠死亡率的作用 

本发明通过预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体，观察其对放疗导致的腹泻是否有抑制作用。本发明采用铯137致死剂量8Gy辐照小鼠，实验结果显示，与对照组相比，Anti-CXCL4单克隆抗体有效减轻了腹泻严重程度(图8A)。腹泻评分结果显示（表2）在化疗后的第3至7天Anti-CXCL4单克隆抗体的保护作用更加显著(p＜0.01)。 

本发明又进一步研究了预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体在该致死辐照剂量下对小鼠存活的保护作用。与对照组相比，单抗有效地提高了小鼠对辐照的耐受性，将小鼠开始死亡的时间从辐照后第8天推迟到了第10天，并且延长了辐照小鼠的存活时间。(log-rank test p＜0.01)(图8B)。 

表2.放疗后第3天到第7天抗体组与对照组小鼠腹泻评分 

以上实验结果表明，Anti-CXCL4单克隆抗体的预防性用药可有效地减轻放疗导致的小 鼠肠粘膜损伤，并且延长了小鼠的存活时间。 

实施例10 

Anti-CXCL4单克隆抗体的预防性用药对减轻环磷酰胺化疗的毒副作用，延长小鼠的生存时间。 

为了进行更深入全面地研究，本发明通过预防性使用Anti-CXCL4单克隆抗体，观察其对环磷酰胺导致的腹泻是否有抑制作用。环磷酰胺是一种最常用的烷化剂类抗肿瘤药物，与5-氟尿嘧啶不同的是，它具有细胞周期非特异性。实验结果显示，与对照组相比，Anti-CXCL4单克隆抗体通过对抗环磷酰胺化疗的毒副作用推迟了小鼠开始死亡的时间，并且显著延长了化疗小鼠的存活时间。 

本发明研究了Anti-CXCL4单克隆抗体在环磷酰胺高剂量（500mg/kg）以及次高剂量（450mg/kg）化疗下对小鼠存活的保护作用。在500mg/kg化疗剂量下,单抗能够对抗环磷酰胺化疗的毒副作用，有效地提高了小鼠对环磷酰胺的耐受性（10B）。对照组小鼠在化疗后第1天全部死亡，而单抗组小鼠则持续到化疗后第9天全部死亡，抗体非常显著的延长了高剂量环磷酰胺化疗小鼠的生存时间(log-rank test p＜0.01)。在450mg/kg化疗剂量下，单抗同样推迟了化疗小鼠的开始死亡时间，且将小鼠的存活时间从化疗后8天延长到了13天(log-rank test p＜0.01)(图9A)。 

以上实验结果表明，Anti-CXCL4单克隆抗体的预防性用药有效地减轻了环磷酰胺化疗导致的毒副作用，极大的延长了小鼠的生存时间。 

结论 

市面上已有抗趋化因子4单克隆抗体基本上是作为一种检测试剂在使用，不需要空间结构完整，因此一般不能够中和cxcl4的生物学活性，且大多都不适用于动物实验，通常应用于Elisa，Western，Immunohistochemistry等技术。而且同时结合人cxcl4和鼠cxcl4的抗体仅有多克隆抗体，尚无单克隆抗体。如下表所示： 

表3市售的抗cxcl4抗体比较 

Claims (13)

1.一种抗趋化因子4杂交瘤细胞系，其特征在于，该杂交瘤细胞16D6-3的保藏号为CCTCCNo.C2012186；于2012年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.根据权利要求1所述杂交瘤细胞系的应用，将其用于制备抗趋化因子4单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述杂交瘤细胞系的应用，所述的制备具体是指：

a）扩增保藏号为CCTCC No.C2012186的杂交瘤细胞16D6-3；

b）腹腔注射小鼠；

c）回收腹水并从腹水中分离抗趋化因子4单克隆抗体。

4.一种抗趋化因子4单克隆抗体，其特征在于，根据权利要求2或3所述制备得到。

5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征是，该单克隆抗体由轻链和重链构成，其中：轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其特征是，所述的重链的编码基因选自如下序列之一：

1）其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述的重链氨基酸的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述的重链氨基酸的DNA分子。

所述的轻链的编码基因选自如下序列之一：

I）其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

II）在严格条件下与I）限定的DNA序列杂交且编码所述的轻链氨基酸的DNA分子；

III）与I）限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码所述的轻链氨基酸的DNA分子。

7.一种重组载体，其特征在于，通过将如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子进行克隆并与T4载体进行连接处理得到的重组载体。

8.一种表达盒，其特征在于，包含核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的编码基因。

9.一种权利要求2至6中任意所述抗趋化因子4单克隆抗体在制备治疗或预防肿瘤化疗毒副作用的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征是，所述的药物包括上述单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物。

11.一种权利要求2至6中任意所述抗趋化因子4单克隆抗体在制备预防或治疗化疗哺乳动物小肠粘膜损伤的药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征是，所述的药物包括上述单克隆抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征是，所述的哺乳动物为人或小鼠。

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