JP6878610B6

JP6878610B6 - シナピン酸の合成エステルを含有する局所用組成物及びケラチン表面の処置方法

Info

Publication number: JP6878610B6
Application number: JP2019548561A
Authority: JP
Inventors: パーノデット，ナディーン; チェン，チア−ウェン; ドン，ケリー; ファン，ジンユ; コッホ，オスカー; バグダーン，ニコラス
Original assignee: イーエルシーマネージメントエルエルシー; シムライズアーゲー
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2021-06-23
Anticipated expiration: 2038-03-06
Also published as: US20210137805A1; WO2018165189A1; CA3055798C; EP3592341A1; ES2900203T3; AU2018230712B9; KR20190118666A; CA3055798A1; US20240108559A1; JP2020510019A; EP4039254A1; CN110573149A; KR102254506B1; JP6878610B2; EP3592341B1; AU2018230712A1; AU2018230712B2; EP3592341A4; BR112019018562A2

Description

本発明は、シナピン酸の合成エステルを含有する局所用組成物およびケラチン表面の改良のための処置方法に関する。

植物は生存のために日光を必要とする。それらは、有害なUVB線から保護し、植物の生命を維持するのに必要な光の通過を可能にするシナピン酸エステルの形態の固有のサンスクリーンを持っている。シナピン酸エステルを生産できないように遺伝子操作された植物は、成長の阻害や枯れにつながる壊滅的な障害を被る。紫外線領域の光は280〜400の波長にわたり、UVA光波長は315〜400、UVB光は280〜315である。

シナピン酸エステルを得るための植物材料の抽出は複雑であり、非常に低い収率を提供する。わずかな量の抽出物を得るために多数の植物を破壊することは、費用対効果や実用性に乏しいだけである。

シナピン酸エステルの調製のための費用効果が高く、効率的な合成プロセスが発見された。さらに、この合成プロセスに従って調製されたシナピン酸エステルは、皮膚に対して種々の有益な効果を有することが見出されている。

本発明は、シナピン酸エステルである合成化合物を含む局所用組成物を対象とする。
本発明はまた、（a）UV照射からの保護、（b）皮膚細胞におけるDNA損傷の阻害、（c）皮膚炎症の阻害または低減、または（d）シナピン酸エステルである合成化合物の有効量を含む組成物を局所的に適用することによる皮膚上のフリーラジカルの除去、から選択される1つ以上の利益を提供するために皮膚を処置する方法に関する。

本発明はまた、以下のステップを含むリンゴ酸シナポイル（sinapoyl malate）を合成する方法にも関する:
（a）（i）シリンガアルデヒド（syringaldehyde）を無水酢酸及びアルカリ金属酢酸塩と反応させること、又は（ii）シナピン酸を無水酢酸と反応させること、
（b）（a）のアセチル保護反応生成物の無水物を水及び脂肪族アルコールに曝露することにより切断して保護されたシナピン酸を形成すること、
（c）保護されたシナピン酸をアルキル保護されたカルボン酸エステルと反応させることによりエステル化して保護リンゴ酸シナポイルを形成すること、
（d）保護されたリンゴ酸シナポイルを水性酸と反応させてリンゴ酸シナポイルを生成させること。

リンゴ酸シナポイル（SM）およびカフタル酸フェネチルエステル（CAPE）について、0、1週間、2週間、4週間で、かつ4℃、25℃、40℃、および50℃の温度で、1.4百万分の1（ppm）および14ppmの濃度で、UV範囲内の吸光度を試験するための測定された吸光度ピークおよび谷を表に示す。リンゴ酸シナポイルとCAPEはUV領域で異なる吸光度のピークと谷を示すことから、構造的な違いがUV吸収の違いをもたらすことが実証された。リンゴ酸シナポイルおよびCAPEの吸光度ピークの経時的および温度に対する安定性を示す。SM#1は、リンゴ酸シナポイルピーク#1、SM#2はピーク番号2を意味する。CAPE#1は、最初のCAPEピークを意味する。CAPE#2は2番目のCAPEピークを意味する。上のグラフは1.4ppm濃度での安定性を示す。下のグラフは14ppm濃度での安定性を示す。いずれの場合も、リンゴ酸シナポイルは経時的により一貫した安定性を示すことがわかる。対照的に、CAPE安定性は上下に波動し、吸光度ピークは変化するか、維持されない。 20、40、および60 mJ/cm²のUVBを照射されない、または照射された正常ヒト表皮ケラチノサイトの細胞生存性を示す。結果は、0.0025〜0.25％の範囲の濃度のリンゴ酸シナポイルが、様々な線量のUVB放射線への曝露後の細胞の健康と生存性を改善することを示す。非照射細胞および40 mJ/cm²のUVを照射された細胞の両方において、UV損傷に対する保護における0.025〜0.05％の範囲の濃度のリンゴ酸シナポイルの有効性をグラフで示す。照射細胞および非照射細胞におけるIL1-αおよびIL1-βの阻害能における抗炎症剤としてのリンゴ酸シナポイルの有効性を示す。濃度範囲0.01〜0.1％にわたる抗酸化剤としてのリンゴ酸シナポイルの有効性をグラフで示す。

I. シナピン酸の合成カルボン酸エステル
本発明の局所用組成物および方法に使用される合成化合物は、シナピン酸のエステルである。エステルはモノ-、ジ-、またはトリエステルであってよい。一実施形態において、エステルは1〜18個の炭素原子を有し得、直鎖または分岐鎖であり得る。好ましいのは、カルボン酸エステルがαまたはβヒドロキシ酸エステルである場合である。エステルがリンゴ酸シナポイルであるαヒドロキシルジエステルである場合がより好ましい。
リンゴ酸シナポイルは、実施例１で定義された数字が続く「S」で示し、以下のように合成することができる。

出発物質は、シナピン酸またはシリンガアルデヒドのいずれかであり得る。シナピン酸は高価なので、シリンガアルデヒドから出発する方がより望ましいかもしれない。

アセチル保護されたシナピン酸S3は、実施例にさらに記載されるようにPERKIN型反応を用いて合成することができる。シナピン酸S1は適当な塩基の存在下で無水酢酸と反応し、アセチル保護されたシナピン酸を形成する。より好ましくは、シリンガアルデヒドS2を無水酢酸、酢酸ナトリウム、水、および脂肪族アルコール、好ましくはメタノールと反応させて、アセチル保護されたシナピン酸を形成することができる。

得られたアセチル保護されたシナピン酸S3は、好ましくはジメチルまたはジエチルエステルであるアルキル保護されたリンゴ酸エステルS4、またはより好ましくはジイソプロピルカルボジイミド、またはより好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミドなどのカルボジイミドカップリング試薬を用いたSTEGLICH条件を用いたジイソプロピルエステルでエステル化して、完全に保護されたリンゴ酸シナポイルS5を得ることができる。完全な脱保護は、硫酸または塩酸のような水性酸で加水分解することによって達成され、リンゴ酸シナポイルS6を生じ得る。

本発明の局所用組成物は、シナピン酸の合成エステルを0.01〜10重量％、好ましくは約0.05〜8重量％、より好ましくは約0.1〜5重量％含有することができ、特に断らない限り、本明細書に記載された全てのパーセンテージは重量によるパーセンテージである。

II. 局所用組成物
局所用組成物は、溶液、ゲル、クリーム、ローション、エマルジョンまたは無水製品の形態であってよい。リンゴ酸シナポイルを約10〜90％の水および10〜90％の油を含むエマルジョンに配合したものが好ましい。組成物は、本明細書に記載されたものを含むがこれらに限定されない他の成分を含んでいてもよい。

A. 油
本発明の組成物がエマルション形態である事象では、組成物は油相を含むであろう。油性成分は、皮膚湿潤化および保護特性のために望ましい。好適な油としては、限定するものではないが本明細書中に説明されるものをはじめとする、シリコーン、エステル、植物油、合成油が挙げられる。油は、揮発性または非揮発性であり得、好ましくは室温で流動性の液体（pourable liquid）の形態である。「揮発性」との用語は、油が、測定可能な蒸気圧、または20℃にて少なくとも約2mm・水銀の蒸気圧を有することを意味する。「非揮発性」との用語は、油が、20℃にて約2mm・水銀未満の蒸気圧を有することを意味する。存在する場合、そのような油は、約0.01〜85％、好ましくは約0.05〜80％、より好ましくは約0.1〜50％の範囲であり得る。

好適な揮発性油は、一般的に、25℃で約0.5〜5センチストークスの範囲の粘度を有し、直鎖シリコーン、環状シリコーン、パラフィン系炭化水素、またはそれらの混合物が挙げられる。

環状および直鎖揮発性シリコーンは、Dow Corning Corporation社およびGeneral Electric社をはじめとする様々な商業的供給源から入手可能である。Dow Corning社の直鎖揮発性シリコーンは、商品名Dow Corning 244、245、344、および200 fluidの下に販売されている。これらのfluidとしては、ヘキサメチルジシロキサン（粘度0.65センチストークス（cstと略記））、オクタメチルトリシロキサン（1.0cst）、デカメチルテトラシロキサン（1.5cst）、ドデカメチルペンタシロキサン（2cst）およびそれらの混合物が挙げられる（全ての粘度測定値は25℃でのもの）。
好適な分岐鎖揮発性シリコーンとしては、以下の一般式を有するメチルトリメチコンなどのアルキルトリメチコンが挙げられる：

メチルトリメチコンは、商品名TMF-1.5の下に信越シリコーン社から購入でき、25℃にて1.5センチストークスの粘度を有する。

様々な非揮発性油もまた、本発明の組成物での使用のために好適である。非揮発性油は、一般的に、25℃にて約5〜10センチストークス超の粘度を有し、25℃にて最大約1,000,000センチポアズまでの粘度の範囲であり得る。非揮発性油の例としては、限定するものではないが、モノエステル、ジエステル、およびトリエステルが挙げられる。

モノエステルは、式R-COOHを有するモノカルボン酸（式中、Rは2〜45個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖飽和または不飽和アルキルであるか、またはフェニルである）と；式R-OHを有するアルコール（式中、Rは2〜30個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖飽和または不飽和アルキルであるか、またはフェニルである）の反応により形成されるエステルであると定義される。アルコールと酸の両方が、1個以上のヒドロキシル基で置換されていることができる。酸またはアルコールの一方または両方が、「脂肪」酸またはアルコールであり得、直鎖もしくは分岐鎖、飽和または不飽和形態で、約6〜30個の炭素原子、より好ましくは12、14、16、18、または22個の炭素原子を有することができる。本発明の組成物中で用いることができるモノエステル油の例としては、ラウリン酸ヘキシル、イソステアリン酸ブチル、イソステアリン酸ヘキサデシル、パルミチン酸セチル、ネオペンタン酸イソステアリル、ヘプタン酸ステアリル、イソノナン酸イソステアリル、乳酸ステアリル（steary lactate）、オクタン酸ステアリル、ステアリン酸ステアリル、イソノナン酸イソノニルなどが挙げられる。

好適なジエステルは、ジカルボン酸と脂肪族もしくは芳香族アルコールとの反応生成物、または少なくとも2個の置換されたヒドロキシル基を有する脂肪族もしくは芳香族アルコールとモノカルボン酸との反応生成物である。ジカルボン酸は、2〜30個の炭素原子を含有することができ、直鎖もしくは分岐鎖、飽和または不飽和形態であり得る。ジカルボン酸は、1個以上のヒドロキシル基で置換されていることができる。脂肪族または芳香族アルコールもまた、2〜30個の炭素原子を含有することができ、直鎖もしくは分岐鎖、飽和または不飽和形態であり得る。好ましくは、1種以上の酸またはアルコールが、脂肪酸または脂肪アルコールであり、すなわち、12〜22個の炭素原子を含む。ジカルボン酸はまた、αヒドロキシ酸であり得る。エステルは、二量体または三量体形態であり得る。本発明の組成物中で用いることができるジエステル油の例としては、リンゴ酸ジイソステアリル（diisotearyl malate）、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、セバシン酸ジブチル、ジリノール酸ジセテアリルダイマー、アジピン酸ジセチル、アジピン酸ジイソセチル、アジピン酸ジイソノニル、ジリノール酸ジイソステアリルダイマー、フマル酸ジイソステアリル、リンゴ酸ジイソステアリル、リンゴ酸ジオクチルなどが挙げられる。

好適なトリエステルは、トリカルボン酸と脂肪族もしくは芳香族アルコールとの反応生成物、または3個以上の置換ヒドロキシル基を有する脂肪族もしくは芳香族アルコールとモノカルボン酸との反応生成物を含む。上記のモノエステルおよびジエステルと同様に、酸およびアルコールは2〜30個の炭素原子を含み、飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖であり得、1個以上のヒドロキシル基で置換されていることができる。好ましくは、1種以上の酸またはアルコールが、12〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸または脂肪アルコールである。トリエステルの例としては、アラキドン酸、クエン酸またはベヘン酸のエステル、例えば、トリアラキジン、クエン酸トリブチル、クエン酸トリイソステアリル、クエン酸トリC_12-13アルキル、トリカプリリン、クエン酸トリカプリリル、ベヘン酸トリデシル、クエン酸トリオクチルドデシル、ベヘン酸トリデシルまたはトリデシルココアート（tridecyl cocoate）、イソノナン酸トリデシルなどが挙げられる。

組成物中での使用のために好適なエステルは、「エステル」の分類の下に、C.T.F.A. Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Eleventh Edition, 2006にさらに記載されている（その文章は、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。

組成物中に1種以上の非揮発性炭化水素油を組み込むことが望ましい場合がある。好適な非揮発性炭化水素油としては、パラフィン系炭化水素およびオレフィン、好ましくは約20個超の炭素原子を有するものが挙げられる。そのような炭化水素油の例としては、C_24-28オレフィン、C_30-45オレフィン、C_20-40イソパラフィン、水添ポリイソブテン、ポリイソブテン、ポリデセン、水添ポリデセン、鉱油、ペンタヒドロスクアレン、スクアレン、スクアランおよびそれらの混合物が挙げられる。1つの好ましい実施形態では、そのような炭化水素は約300〜1000ダルトンの範囲の分子量を有する。

脂肪酸の合成または天然に存在するグリセリルエステル（すなわちトリグリセリド）もまた、組成物中での使用に好適である。植物および動物供給源の両方を用いることができる。そのような油の例としては、ヒマシ油、ラノリン油、C_10-18トリグリセリド、カプリル酸/カプリン酸/トリグリセリド、スイートアーモンド油、杏仁油、ゴマ油、カメリナ・サティバ（camelina sativa）油、テリハボク種子油、ココナツ油、トウモロコシ油、綿実油、アマニ油、インク油、オリーブ油、パーム油、イリッペ脂、アブラナ油、ダイズ油、グレープシード油、ヒマワリ種子油、クルミ油などが挙げられる。

合成または半合成グリセリルエステル、例えば、改変された天然油脂または油である脂肪酸モノ-、ジ-およびトリグリセリド、例えば、グリセリンなどのポリオールのモノ-、ジ-またはトリエステルもまた好適である。例えば、脂肪(C_12-22)カルボン酸を、1つ以上の繰り返しグリセリル基と反応させる。ステアリン酸グリセリル、ジイソステアリン酸ジグリセリル、イソステアリン酸ポリグリセリル-3、イソステアリン酸ポリグリセリル-4、リシノール酸ポリグリセリル-6、ジオレイン酸グリセリル、ジイソステアリン酸グリセリル、テトライソステアリン酸グリセリル、トリオクタン酸グリセリル、ジステアリン酸ジグリセリル、リノール酸グリセリル、ミリスチン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、PEGヒマシ油、オレイン酸PEGグリセリル、ステアリン酸PEGグリセリル、牛脂脂肪酸PEGグリセリル（PEG glyceryl tallowates）など。

水溶性および水不溶性の非揮発性シリコーン油もまた、組成物での使用に好適である。そのようなシリコーンは、好ましくは、25℃で約5超〜800,000cst、好ましくは20〜200,000cstの範囲の粘度を有する。好適なシリコーンとしては、アモジメチコン、ジメチコン、フェニルジメチコン、ジフェニルジメチコン、フェニルトリメチコン、またはトリメチルシロキシフェニルジメチコンなどのアミン官能性シリコーンが挙げられる。他の例としては、アルキルジメチコン、例えばセチルジメチコンなどが挙げられ、ここで、少なくとも１つのRは、脂肪アルキル（C₁₂、C₁₄、C₁₆、C₁₈、C₂₀、またはC₂₂）であり、他のRはメチルであり、Aはトリメチルシロキシエンドキャップ単位であり、ただし、そのようなアルキルジメチコンは室温で流動性の液体（pourable liquid）である。フェニルトリメチコンは、商品名556 Fluidの下にDow Corning Corporation社から購入することができる。トリメチルシロキシフェニルジメチコンは、商品名PDM-1000の下にWacker-Chemie社から購入することができる。液体シリコーンワックスとも呼ばれるセチルジメチコンは、Fluid 2502としてDow Corning社から、または商品名Abil Wax 9801もしくは9814の下にDeGussa Care & Surface Specialties社から購入することができる。

組成物は、1種以上の保湿剤を含有し得る。存在する場合、これらは、約0.01〜75％、好ましくは約0.5〜70％、より好ましくは約0.5〜40％の範囲であり得る。好適な保湿剤の例としては、グリコール、糖などが挙げられる。好適なグリコールは、モノマー型またはポリマー型であり、PEG4-10（4〜10個の繰り返しエチレンオキシド単位を有するポリエチレングリコール）などのポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール；ならびにプロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコール等などのC_1-6アルキレングリコールが挙げられる。その一部は多価アルコールでもある好適な糖もまた、好適な保湿剤である。そのような糖の例としては、グルコース、フルクトース、蜂蜜、水添蜂蜜、イノシトール、マルトース、マンニトール、マルチトール、ソルビトール、スクロース、キシリトール、キシロースなどが挙げられる。尿素もまた好適である。好ましくは、本発明の組成物中で用いられる保湿剤は、C_1-6、好ましくはC_2-4アルキレングリコール、最も好ましくはブチレングリコールである。

B. 界面活性剤
特にエマルション形態である場合に、1種以上の界面活性剤を含有することが組成物にとって望ましい場合がある。しかしながら、組成物が溶液、懸濁液、または無水である場合にも、そのような界面活性剤を用いることができ、極性を有する成分（例えば顔料）の分散を助けるであろう。そのような界面活性剤は、シリコーンまたは有機ベースであり得る。界面活性剤はまた、油中水型または水中油型のいずれかの安定なエマルション形成も助けるであろう。存在する場合、界面活性剤は、組成物全体の重量当たり約0.001〜30％、好ましくは約0.005〜25％、より好ましくは約0.1〜20％の範囲であり得る。

組成物は、1種以上の非イオン性有機界面活性剤を含み得る。好適な非イオン性界面活性剤としては、アルコールと、通常はエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドであるアルキレンオキシドとの反応により形成される、アルコキシル化アルコールまたはエーテルが挙げられる。好適なアルコールとしては、一価、二価、または多価短鎖（C1-6）アルコール；コレステロールの芳香族もしくは脂肪族飽和または不飽和脂肪（C12-40）アルコールなどが挙げられる。

一実施形態では、アルコールはコレステロールであるか、あるいは6〜40個、好ましくは約10〜30個、より好ましくは約12〜22個の炭素原子を有し得る芳香族もしくは脂肪族飽和または不飽和脂肪アルコールである。例としては、オレイルアルコール、セテアリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコールなどが挙げられる。そのような成分の例としては、オレス（Oleth）2-100；ステアレス（Steareth）2-100；ベヘネス（Beheneth）5-30；セテアレス（Ceteareth）2-100；セテス（Ceteth）2-100；コレス（Choleth）2-100が挙げられ、ここで数値範囲は繰り返しエチレンオキシド単位の数を意味し、例えば、セテス2-100とは、繰り返しエチレンオキシド単位の数が2〜100の範囲であるセテスを意味する。アルコキシル化アルコールの誘導体、例えばそのリン酸エステルなどもまた好適である。
一部の好ましい有機非イオン性界面活性剤としては、オレス-3、オレス-5、オレス-3リン酸、コレス-24；セテス-24などが挙げられる。

一価、二価、または多価短鎖アルコール（例えば、約1〜6個の炭素原子を有するもの）を用いて形成されたアルコキシル化アルコールもまた好適である。例としては、グルコース、グリセリン、またはそれらのアルキル化誘導体が挙げられる。例としては、グリセレス（glycereth）2-100；グルセス（gluceth）2-100；メチルグルセス（methyl gluceth）2-100などが挙げられる。メチルグルセス-20；グリセレス-26などがより好ましい。

一般的にPEG12〜200と称される様々な数の繰り返しEO基を有するエチレンオキシドポリマーをはじめとする他のタイプのアルコキシル化アルコールは好適な界面活性剤である。PEG-75がより好ましく、これは商品名Carbowax PEG-3350の下にDow Chemical社から購入することができる。

他の好適な非イオン性界面活性剤としては、アルコキシル化ソルビタンおよびアルコキシル化ソルビタン誘導体が挙げられる。例えば、ソルビタンのアルコキシル化、特にエトキシル化は、ポリアルコキシル化ソルビタン誘導体をもたらす。ポリアルコキシル化ソルビタンのエステル化は、ポリソルベートなどのソルビタンエステルをもたらす。例えば、ポリアルコキシル化ソルビタンは、C6-30、好ましくはC12-22脂肪酸を用いてエステル化することができる。そのような成分の例としては、ポリソルベート20-85、オレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、パルミチン酸ソルビタン、セスキイソステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸ソルビタンなどが挙げられる。

様々なタイプのシリコーンまたはシランベースの界面活性剤もまた好適である。例としては、INCI名PEG-1ジメチコン；PEG-4ジメチコン；PEG-8ジメチコン；PEG-12ジメチコン；PEG-20ジメチコンなどを有するものをはじめとする、ポリエチレングリコールを用いて置換されたジメチコンであるPEGジメチコンなどの、エチレンオキシド基またはプロピレンオキシド基を用いて置換されたオルガノシロキサンが挙げられる。

ビス-PEG-18メチルエーテルジメチルシランなどの種々のタイプのPEGメチルエーテルシランなどの、エトキシ基もしくはプロポキシ基またはその両方を用いて置換されたシランもまた好適である。
シリコーンベースの界面活性剤のさらなる例としては、一般名ジメチコンコポリオール；セチルジメチコンコポリオールなどを有するものが挙げられる。

局所用組成物はまた、保存剤、pH調整剤などを含むが、これらに限定されない種々の他の成分を含んでもよい。
局所用組成物の例としては、以下を含有する水及び油のエマルジョンが挙げられる：
0.01〜10％のシナピン酸エステル、好ましくはリンゴ酸シナポイル、
0.1〜90％の水、
0.1〜40％の油、好ましくはシリコーン油又はエステル、
0.1〜10％の界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤。

組成物は、クリーム、ローション、またはセラムの形態であってよい。組成物はまた、ファンデーションメーキャップ、コンシーラー、プライマー、アイシャドウなどのようなカラーコスメティック組成物の形態であってもよい。

III. 方法
本発明は、皮膚細胞におけるUV損傷を阻害するために、皮膚上のフリーラジカルを低減または阻害するための抗酸化剤として、UV光に曝露された皮膚細胞におけるDNA損傷を低減または阻害するために、および皮膚刺激、炎症および感受性を低減させるための抗炎症剤として、シナピン酸の合成エステルを含有する局所用組成物を適用することによって皮膚を処理する方法を含む。

本発明はまた、有効量のリンゴ酸シナポイルを含有する組成物を局所的に適用することによって、細胞の健康および生存性を改善する方法にも関する。
本発明はまた、有効量のリンゴ酸シナポイルを含有する組成物を局所的に適用することによって、皮膚細胞におけるDNA損傷を阻害および／または修復する方法にも関する。

本発明はまた、有効量のリンゴ酸シナポイルを含有する局所用組成物を適用することによって皮膚刺激または炎症を低減する方法にも関する。より好ましいのは、リンゴ酸シナポイルが、皮膚細胞におけるIL1-αおよび／またはIL1-βの産物を低減または阻害することによって、刺激または炎症を阻害する場合である。

本発明はまた、有効量のリンゴ酸シナポイルを含有する組成物を局所的に適用することによって、皮膚上のフリーラジカルを除去する（scavenging）方法にも関する。

所望の利益は、有効量でリンゴ酸シナポイルを含有する局所用組成物を皮膚に適用することによって得られ得る。適用される組成物のタイプは、本明細書に示されるものであり得る。組成物は、レジメンで、または朝若しくは夕に、または１日の他の時間に適用することができる。

IV. 合成法
本発明はまた、以下のステップを含むリンゴ酸シナポイルを合成する方法にも関する：
(a)(i)シリンガアルデヒドを無水酢酸及びアルカリ金属酢酸塩と反応させること、又は（ii）シナピン酸を無水酢酸と反応させること、
(b)(a)で得られた中間体を水及び脂肪族アルコールに曝露することによって切断して保護されたシナピン酸を形成させること、
(c)保護されたシナピン酸をアルキル保護されたカルボン酸エステルと反応させることによってエステル化して保護されたリンゴ酸シナポイルを生成させること、
（d）保護されたリンゴ酸シナポイルを水性酸と反応させてリンゴ酸シナポイルを生成させること。

出発物質が、アルカリ金属酢酸塩（例えば、ナトリウム）、アルカノール（メタノール、プロパノール、ブタノール）、および無水酢酸と反応するシリンガアルデヒドである場合が好ましい。得られたアセチル保護されたシナピン酸は、次に、リンゴ酸エステルCO₂R-C(OH)-CO₂Rと反応することによってエステル化され得、ここでRは、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピルまたはブチルから選択され得、すべてのヒドロキシル基が保護されたシナピン酸エステルを生じる。保護基は、塩酸または硫酸のような水性無機酸および適当な有機溶媒と反応させることにより加水分解して、リンゴ酸シナポイルを得ることができる。

本発明を、例示の目的のみのために説明される以下の実施例と関連付けてさらに説明する。
［実施例１］
本発明のシナピン酸エステルを以下のように調製した。

ステップ１：4-アセトキシ-シナピン酸、S3の合成

1リットルフラスコ中で、シリンガアルデヒド（150g、0.82モル）、無水酢酸（293g、2.87モル）および酢酸ナトリウム（59g、0.72モル）の反応混合物を80℃に5時間予熱した後、さらに8時間加熱還流した。その後、大気を500 mbarに下げ、混合物から酢酸を除去した。残留物を90℃に冷却し、メタノール（900g）を加えた後、室温（25℃)で水（240g）を加えた。反応混合物をこの温度で3時間徹底的に撹拌した。その後、メタノールを減圧除去した。得られた残渣にトルエン（750g）を添加し、有機相と水相を分離してトルエン中の粗生成物を得た。生成物が沈殿し始めるまでトルエンを減圧除去した。反応混合物を0℃に冷却し、この温度でさらに1時間撹拌した。沈殿物を濾過により除去し、冷トルエンで洗浄した。生成物の収量は76g（35％）であり、分光データにより正しい化合物と確認した。

ステップ２：4-アセトキシ-シナポイル-ジ-イソプロピルマレート、S5の合成

4-アセトキシ-シナピン酸S3（40g、0.15mol）、新たに蒸留したリンゴ酸ジイソプロピル（32.7g、0.15mol）およびアセトン（415g）を入れた1リットルのフラスコに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（34g、0.165mol）、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP、7.4g、0.06mol）のアセトン（150g）中の溶液を室温で滴加した。得られた反応混合物をこの温度で5時間撹拌した。沈殿物を濾過により除去し、アセトンで洗浄し、溶媒を減圧除去した。得られた残留物をメチル-tert-ブチルエーテル（200g）に溶解し、減圧除去して所望の粗生成物S5（83g）を得、これを更なる精製なしに次の反応ステップに直接使用した。分光データにより所望の化合物と確認した。

ステップ３：リンゴ酸シナポイル、S6の合成

アセトン（750g）中の4-アセトキシシナポイル-ジ-イソプロピルマレートS5（83g）を含む2リットルのフラスコに、硫酸水（40％、290g）を加えた。混合物を脱保護が完了するまで8時間還流条件で加熱した。部分減圧（700 mbar）下で、混合物からアセトンを蒸発させ、水性残留物を得た。酢酸エチル（600g）を加え、相分離し、有機相を水で洗浄し、溶媒を減圧除去して褐色の残渣を得た。粗生成物をメチル-tert-ブチルエーテル（350g）に溶解し、飽和NaHCO₃溶液で抽出した後、H₂SO₄で酸性化し、その後メチル-tert-ブチルエーテルで抽出し、有機相を蒸発乾固した後、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン：酢酸エチル、1:1）後、淡黄色固体（10g、20％、2段階）としてリンゴ酸シナポイルを得た。融点55-65℃、1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.00 (s, 1H), 7.59 (d, J=15.8 Hz, 1H), 7.06 (s, 2H), 6.59 (d, J=15.9 Hz), 5.33 (dd, J=8.8, 3.9 Hz, 1H), 3.86-3.77 (m, 6H), 2.89 (dd, J=16.7, 3.9 Hz, 1H), 2.77 (dd, J=16.7, 8.8 Hz, 1H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6): 170.61, 170.27, 165.71, 147.90, 146.36, 138.40, 124.12, 113.89, 106.29, 68.28, 55.99, 40.02, 39.81, 39.60, 39.39, 39,18, 38.98, 38.77, 35.81; HR-LCMS (ESI) m/z 339.0717 (M-H+), 4.49 分; HPLC 4.67 分。

全てのHPLCクロマトグラムは、溶離液として5％〜50％（10分間）及び50-100％（2分間）の水（0.1％ギ酸）及びアセトニトリルの勾配、40℃で流速0.40ml/分を用い、poroshell 120 SB-C18カラム（2.7μm, 50×2.1 mm）を使用したHPLCシステム上で記録した。検出器として、DAD UV 220-320nmを使用した。全てのLCMSクロマトグラムは、溶離液として0-95％（22分間）の水（0.1％ギ酸）及びアセトニトリル（0.09％ギ酸）の勾配、50℃で流速0.55 ml/分を用い、Kinetex RP-C18カラム（1.7μm, 100×2.1 mm）を使用したHPLCシステム上で記録した。MS検出器として、Bruker micrOTOF Q-11を使用した。

［実施例２］
実施例１で調製した以下の構造を有するシナピン酸エステル（リンゴ酸シナポイル）：

を、以下の構造を有するカフタル酸フェネチルエステル（CAPE）と比較して試験した：

リンゴ酸シナポイルおよびCAPEについて、UV吸収を評価した。各化合物50および100ppmを水およびイソプロパノールの2番目の試料セットに溶解した。0.025％および0.05％の各成分を水およびブチレングリコールの50/50混合物に溶解して、リンゴ酸シナポイルおよびCAPEの追加試料を調製した。更に希釈して1.4ppmと14ppmの濃度を得た。

試料は、時間0、1週間、2週間、および4週間で、200〜450nmの範囲の波長でAgilent 8453 UV可視分光分析システムで測定することによって、UV範囲にわたるUV吸収について試験した。「NA」という用語は、以前に観察された吸光度ピークがもはや見えなくなったことを意味する。「ピーク」という用語は、UVスペクトルにおける2つの最も高い吸光度ピークを意味する。「谷」という用語は、吸光度ピーク間の2つの最低点を意味する。ピークまたは谷が1つしかない場合には、以前に観察されたもう一方のピークまたは谷が安定性試験の時点および温度で悪化（deteriorated）したことを意味する。すべてのピークと谷が「NA」と表示されている場合は、サンプルが完全に劣化し、もはやUV範囲では吸収がなくなったことを意味する。

数値結果を図1に、グラフを図2に示す。リンゴ酸シナポイル（「S」）の吸光度ピークは、CAPE（「C」）の吸光度ピークとは異なり、識別できることがわかる。加えて、リンゴ酸シナポイルは、1.4および14ppmの濃度で、経時的および温度的により安定である。対照的に、CAPEは経時的および温度的にはるかに安定性が低い。従って、2つの化合物の間の化学構造の違いは、UV吸光度のピークと谷の両方の予想外の違いならびに長期安定性を実証し、1.4および14ppmの最終濃度を有する水とブチレングリコールの50/50混合物に溶解したリンゴ酸シナポイル（「SM」）およびCAPEを含む試料でUV範囲の吸光度ピークを測定した場合、SMはCAPEとは異なる吸光度ピークを示し、時間および温度にわたってCAPEよりも有意に改善された全体的安定性を示した。2つの化合物間の構造の類似性を考慮すると、これは予想外のことである。用語「NA」は、このペアから以前に観察された吸光度ピークがもはや目に見えないか、または測定できないことを意味する。

［実施例３］
実施例１で調製したリンゴ酸シナポイルを、0、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1および0.25％の範囲の濃度で、照射されていない、および20、40、および80 mJ/cm² UVBを照射した正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）に対する細胞の健康及び生存性に対する影響についてAlmar Blueアッセイで試験した。
より具体的には、正常ヒト皮膚ケラチノサイトを採取し、上記の濃度のリンゴ酸シナポイルで処理したまたは未処理の場合の細胞生存性についてアッセイした。

細胞を、96ウェルプレートにて、48時間試験ではプレート当たり150,000個の細胞、および24時間試験ではプレート当たり300,000個の細胞の濃度で播種した。細胞を37℃、5％CO₂、および95％湿度にて24時間インキュベートした。試験組成物は、以下の通りに調製した：
試験組成物を適用することにより、細胞を48時間処理した。細胞を、上記の条件を用いてインキュベーター中で維持した。

48時間後、細胞をDPBSで洗浄し、DPBSの薄い層（約100μL）を用いて覆った。DPBSを除去し、続いて100μLの試験組成物を、24時間細胞上に置いた。細胞を、本明細書中に記載される条件を用いてインキュベーター中で維持した。

細胞の他のバッチには、20、40、および80 mJ/cm² UVB（Dr. Groebel, UV-Electronik, GmbH）を照射した。DPBSを吸引除去し、処理組成物を24時間、再度適用した。次の日の朝、培地を吸引除去し、100μLの10％Alamar Blue溶液を加えた。プレートを37℃で1.5〜2時間インキュベートした。Spectra Max Geminiリーダーを用いて、530/590ナノメートルで蛍光を測定した。細胞生存性を算出し、過酸化水素を用いて処理した細胞の生存率（％）として表わした。結果は表３に示され、リンゴ酸シナポイルがUV照射前及び照射後の双方でケラチノサイトの健康及び生存を促進する上で有効であったことが実証される。

［実施例４］
リンゴ酸シナポイルをDNA断片化試験で試験し、細胞をUV線に曝露したときのDNA断片化の修復または阻害能を確認した。ケラチノサイトを60mmのディッシュに100,000細胞/ディッシュで播種し、ヒトケラチノサイト成長サプリメント（ThermoFisher、cat#S-001-5）を添加したEpiLife培地（ThermoFisher、cat#M-EPI-500-CA）中で50％コンフルエントに達するまで増殖させた。細胞をDPBSで洗浄し、次いで、0.005％または0.025％のリンゴ酸シナポイルを含むDPBSの薄層（2mL）で覆い、Dr.Grobel照射チャンバーで100 mJ/cm² UVBを照射した。細胞をDPBSで再び洗浄し、培地中で6時間インキュベートした。NHEKをトリプシン処理し、PBSで洗浄し、PBS中に1x10⁵細胞/mLで懸濁した。次いで、細胞を1:10の比率で37℃で融解アガロース（Trevigen、cat#4250-050-02）中に分散させた。細胞/アガロース混合物75μlをコメットスライド（Trevigen、cat#4250-050-03）の各スポットに均等にピペットで添加し、次いで4℃で10分間インキュベートした。スライドを氷上の冷溶解液（Trevigen、cat#4250-050-01）に一晩浸した。スライドを溶解液から取り出し、アルカリ溶液（300mM NaOH、1mM EDTA、pH＞13）中に室温で30分間置いた。次いで、スライドをコメットアッセイESII電気泳動システムに置いた。冷アルカリ電気泳動溶液（200mM NaOH、1mM EDTA、pH＞13）をスライドをちょうど覆うように装置に注入した。電気泳動は23Vで30分間行った。電気泳動後、スライドをH₂Oですすぎ、70％ EtOHに5分間浸した。スライドをEtOH溶液から取り出し、タオル上に置いて一晩風乾した。SYBR金（ThermoFisher、cat#S11494）をTE緩衝液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 7.5）1:30000に希釈した。100μlの薄めたSYBR金を各スポットにピペットで添加した。スライドを室温で30分間インキュベートした。次いで、スライドから過剰なSYBR金を除去した後、スライドを再び乾燥させた。スライドを20x対物レンズ付きFITCフィルターでEVOS顕微鏡下で観察した。Tri TekのComet Scoreソフトウェアを用いてテールモーメントを測定した。

結果は、図４に示され、0.005％および0.025％の濃度のリンゴ酸シナポイルで処理され、照射されなかった細胞（グラフの左側）、およびUVで照射され、0.005％および0.025％のリンゴ酸シナポイルに曝露された細胞の両方において、リンゴ酸シナポイルがケラチノサイトにおけるDNA損傷を阻害または防止するのに非常に効果的であったことを示す。

［実施例５］
リンゴ酸シナポイルの抗炎症活性は、双方が炎症の指標であるインターロイキン‐1α（IL1‐α）およびIL1‐βを阻害するその能力を試験することによって実証された。IL1種は損傷組織の炎症を刺激する原因となる。

ケラチノサイトを実施例４に記載のように処理した。細胞を照射後にインキュベートした培地を6時間後に回収し、メーカーのプロトコールに従ってMilliplex_MAPヒトサイトカインアッセイ（Millipore、cat#HCYTMAG-60K-PX29）で分析した。細胞由来の培地を、予め混合した磁性ビーズと共に、800rpmのシェーカー上、4℃で一晩インキュベートした。ビーズを洗浄し、次に800rpmのシェーカー上、室温で1時間検出抗体とインキュベートした。ストレプトアビジン‐フィコエリトリンをビーズに加え、800rpmのシェーカー上、室温で30分間インキュベートした。ビーズを洗浄し、シース液中に懸濁し、Luminex上で読み取った。

結果を、リンゴ酸シナポイルを指す「BIO3815」を用いて図５に示す。結果は、リンゴ酸シナポイルがIL1‐αとIL1‐βの両方を用量依存的に阻害することを示し、抗炎症活性剤としての有効性を示した。

［実施例６］
リンゴ酸シナポイルの抗酸化活性を、この物質の許容可能な非細胞毒性濃度を最初に決定することによって試験した。これらの結果に基づいて、正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）を、ウェル当たり2 x 10⁴細胞の力価で2枚の96ウェルマイクロタイタープレート上に播種した。未処理の対照サンプルに加えて、0.01％から0.1％の範囲の濃度でリンゴ酸シナポイルを添加し、一晩（約15時間）インキュベートした。翌日、細胞培養培地を吸引し、細胞を100μlのDulbeccoリン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4（D-PBS）で洗浄し、再度吸引し、次いで30μlのD-PBSを添加した。一方のプレートを偽照射試料として細胞培養フード中に保持し、他方のプレートを50mJ/cm²のUVBに曝露した。曝露およびさらなる吸引の後、対照およびUVB照射プレートを、D-PBS中の10μM 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（DCFda）100μlで、37℃で6時間処理した。加えて、25mM NaN₃の100μlをインキュベーションに20分間加えた。6時間インキュベーションの終わりに、蛍光を、485nm励起および538nm発光に設定されたSpectraMax Gemini EM蛍光プレートリーダーで、530nmに設定された波長カットオフを用いて測定した。蛍光の増加は、活性酸素種（ROS）、特に過酸化水素（H₂O₂）の増加を示すが、これは最も長く残存するROSであるからである。逆に、蛍光の減少は抗酸化活性を示す。このようにして、内因性およびUVB誘導ROSの両方を測定し、抗酸化剤としてのリンゴ酸シナポイルの有効性を測定した。

結果は図6に示され、リンゴ酸シナポイルが、0.01％、0.05％、および0.10％の濃度で未処理細胞およびUV照射された細胞の両方に対して非常に有効な抗酸化剤であったことを示す。

好ましい実施形態と関連付けて本発明を説明してきたが、明示された特定の形態へと本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲内に入り得るような代替物、改変物、および等価物を包含することが意図される。
本発明は以下を提供する。
（１）シナピン酸の合成エステルを含有する局所用組成物。
（２）上記エステルがα又はβヒドロキシル酸エステルである、上記（１）記載の組成物。
（３）上記エステルがαヒドロキシル酸エステルである、上記（３）記載の組成物。
（４）合成化合物がリンゴ酸シナポイル（sinapoyl malate）である、上記（１）記載の組成物。
（５）クリーム、ローション、セラム、ゲル、溶液、懸濁液、又は無水組成物の形態である、上記（１）記載の組成物。
（６）水及び油のエマルジョンの形態である、上記（５）記載の組成物。
（７）（a）UV照射からの保護、（b）皮膚細胞におけるDNA損傷の阻害、（c）皮膚炎症の阻害または低減、及び（d）シナピン酸のエステルである合成化合物を含む組成物を局所的に適用することによるフリーラジカルの除去（scavenging）、から選択される1つ以上の利益を提供するために皮膚を処置する方法。
（８）合成化合物がリンゴ酸シナポイルである、上記（７）記載の方法。
（９） UVA及びUVB照射に対して皮膚が保護される、上記（７）記載の方法。
（１０）皮膚細胞におけるDNA損傷が阻害される、上記（７）記載の方法。
（１１） IL1-α若しくはIL-1β又はその双方を阻害することによって炎症が阻害される、上記（７）記載の方法。
（１２）化合物がリンゴ酸シナポイルである、上記（１１）記載の方法。
（１３）リンゴ酸シナポイルが、0.001〜0.05％の濃度である、上記（１２）記載の方法。
（１４）リンゴ酸シナポイルが皮膚に局所適用された場合にフリーラジカルを除去する、上記（８）記載の方法。
（１５）リンゴ酸シナポイルが局所適用された場合に皮膚細胞におけるDNA損傷を低減又は阻害する、上記（８）記載の方法。
（１６）リンゴ酸シナポイルが局所適用された場合にUV照射に対して皮膚細胞を保護する、上記（８）記載の方法。
（１７）以下のステップを含む、リンゴ酸シナポイルの合成方法：
(a)(i)シリンガアルデヒド（syringaldehyde）を無水酢酸及びアルカリ金属酢酸塩と反応させるか、または(ii)シナピン酸を無水酢酸と反応させること、
(b)（a）のアセチル保護された反応生成物の無水物を水及び脂肪族アルコールに曝露することにより切断して保護されたシナピン酸を形成させること、
（c）保護されたシナピン酸をアルキル保護されたカルボン酸エステルと反応させることによりエステル化して保護されたリンゴ酸シナポイルを形成させること、
（d）保護されたリンゴ酸シナポイルを水性酸と反応させてリンゴ酸シナポイルを生成させること。
（１８）ステップ(a)が(a)(i)である、上記（１）記載の方法。
（１９）シリンガアルデヒドを酢酸ナトリウム及び無水酢酸と反応させる、上記（１８）記載の方法。
（２０） (b)における脂肪族アルコールがメタノールであり、(c)におけるアルキル保護されたカルボン酸エステルがリンゴ酸であり、(d)における水性酸が塩酸、硫酸またはその組合せである、上記（１８）記載の方法。

Claims

リンゴ酸シナポイル（sinapoyl malate）を0.001〜0.05％の濃度で含有する局所用組成物であって、リンゴ酸シナポイルが合成化合物である、上記組成物。
クリーム、ローション、セラム、ゲル、溶液、懸濁液、又は無水組成物の形態である、請求項１記載の組成物。
水及び油のエマルジョンの形態である、請求項２記載の組成物。
合成化合物であるリンゴ酸シナポイルを0.001〜0.05％の濃度で含有する、皮膚細胞におけるUV損傷阻害のための化粧品。
合成化合物であるリンゴ酸シナポイルを0.001〜0.05％の濃度で含有する、皮膚細胞におけるDNA損傷阻害のための化粧品。
合成化合物であるリンゴ酸シナポイルを0.001〜0.05％の濃度で含有する、炎症阻害のための化粧品。
皮膚細胞におけるIL1-αおよび／またはIL1-βを阻害する、請求項６記載の化粧品。
合成化合物であるリンゴ酸シナポイルを0.001〜0.05％の濃度で含有する、皮膚におけるフリーラジカル除去又は酸化防止のための化粧品。