JP6823792B2 - 細胞培養装置および細胞培養方法 - Google Patents
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Description
本願は、2016年3月8日に日本に出願された特願2016−45024号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
ここで、生体を構成する臓器の多くは隔膜型の構造をしている。例えば、小腸では腸間膜を隔てて栄養分が吸収され、腎臓では腎尿細管上皮細胞膜を介して代謝産物や老廃物を排泄している。また全身を巡る血管においても血管壁を介して周囲の組織に酸素や栄養素が供給され、老廃物が排泄されている。このような隔膜型の臓器機能を生体外で再構成するために、ボイデンチャンバーやトランズウェルといった隔膜型の培養容器が利用されてきた。しかしながら、これらの培養容器では、隔膜の一方の面側および他方の面側に液を流すことができないため、生理的な機能が発現しない、膜下部における細胞の状態の悪化、複数臓器を連結したBody-on-a-chipに適用できないといった問題がある。
(2)複数の前記細胞培養ユニットの前記第1培養液貯留室のうち少なくとも2つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている(1)に記載の細胞培養装置。
(3)前記細胞培養ユニットは、液体が貯留される気密構造の第1液体貯留室と、前記液体が貯留される第2液体貯留室と、前記第1液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第2液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第1液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する(1)または(2)に記載の細胞培養装置。
(4)複数の前記細胞培養ユニットの前記第1液体貯留室のうち少なくとも2つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている(3)に記載の細胞培養装置。
(5)前記第1培養液貯留室と、前記第2培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する(1)〜(4)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(6)前記培養液導出流路から前記第2培養液貯留室への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている(1)〜(5)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(7)前記逆流防止機構は、前記培養液導出流路から前記第2培養液貯留室へ向かう方向の前記培養液の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁である(6)に記載の細胞培養装置。
(8)前記第1培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、(1)〜(5)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(9)前記逆流防止機構は、前記第1培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを許容し、かつ前記第1培養液貯留室から前記培養液導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である(8)に記載の細胞培養装置。
(10)前記培養液導入流路と培養液導出流路のうち少なくともいずれか一方は、流路断面積が他の部位に比べて1/10以下である抵抗流路部位を有する(1)〜(9)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(11)前記流通空間は、前記隔膜の厚さ方向の距離が1μm〜1000μmである、(1)〜(10)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(12)前記貯留槽は、前記主培養液室、前記第1培養液貯留室および前記第2培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記主培養液室、前記第1培養液貯留室および前記第2培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する(1)〜(11)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(13)前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する(12)に記載の細胞培養装置。
(14)前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、前記主培養液室、前記第1培養液貯留室および前記第2培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である(12)または(13)に記載の細胞培養装置。
(15)前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する、(14)に記載の細胞培養装置。
(16)前記第1培養液貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている、(1)〜(15)のうちいずれか1つに記載の細胞培養装置。
(17)1または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、前記培養液が貯留される気密構造の第1培養液貯留室と、前記培養液が貯留される第2培養液貯留室と、前記培養液を前記第1培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、前記培養液を前記流通空間から前記第2培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第1培養液貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する細胞培養装置を使用し、前記第1培養液貯留室に前記通気孔を通して気体を供給して前記第1培養液貯留室を加圧し、前記第1培養液貯留室内の圧力上昇によって、前記第1培養液貯留室内の培養液を前記培養液導入流路を通して前記主培養液室に導くとともに、前記主培養液室内の培養液を前記培養液導出流路を通して前記第2培養液貯留室に導く、細胞培養方法。
複数の細胞培養ユニットを有する細胞培養装置によれば、容易な操作で、複数の試験を並列的に行うことができる。そのため、多数の被検体(薬剤等)を効率よく評価できる。
[細胞培養装置]
第1実施形態の細胞培養装置10について、図面を参照して説明する。
図1は、細胞培養装置10を模式的に示す断面図である。図2は、細胞培養装置10を模式的に示す斜視図である。
図1および図2に示すように、細胞培養装置10は、貯留槽11と、加圧ポンプ14とを備えている。貯留槽11は、1つの細胞培養ユニット9を備えている。貯留槽11は、容器状の槽本体12と、蓋部13と、を備えている。
主培養液室3は、主室3cと、主室3cの底面3eに形成された凹部3dとを有する。
主室3cの内部空間は培養液C1が流通する流通空間3aである。凹部3dの内部空間のうち隔膜4の内面4a側の空間は流通空間3aの一部である。凹部3dの内部空間のうち隔膜4の外面4b側の空間は、外面側空間3bである。図1において、外面側空間3bは流通空間3aの下方に位置している。貯留槽11には、外面側空間3bに連通するサンプリング孔(図示略)を形成することができる。これによって、サンプリング孔を通して外面側空間3b内の液体を採取することができる。主培養液室3は、貯留槽11内に形成された中空部である。
流通空間3aの高さ(隔膜4の厚さ方向の距離)は、次のように定めることによって、流通空間3aを流れる培養液C1の流速を高め、隔膜4上の細胞20に対して十分なシェアストレスを付加することが可能となる。
図2に示すように、付加されるシェアストレス(τ)は、流通空間3aの幅(w0)、高さ(h0)、培養液C1の流量(Q)、および培養液C1の粘度(μ)に基づいて、式(1)により推算できる(非特許文献15:F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006.を参照)。
一方、医薬品候補化合物や化成品のin vitro細胞アッセイに使用する際の1アッセイあたりの培養液量は培養液のコストとハンドリングを考えると10μl〜10ml程度が現実的である。よって、適切なシェアストレスを実現するためには、上記(1)式より、流通空間3aの高さは、1μm〜1000μmの範囲にあることが好ましい。
なお、流通空間3aの高さh0は、隔膜4の内面4a(上面)と、流通空間3aの内天面との距離(隔膜4の厚さ方向の距離)である。
第1培養液貯留室1は、主室1cと、主室1cの底面1eに形成された細胞保持凹部1d(細胞保持部)とを有する。第1培養液貯留室1の内部空間は培養液貯留空間1aである。
第2培養液貯留室2は、主室2cと、主室2cの底面2eに形成された細胞保持凹部2d(細胞保持部)とを有する。第2培養液貯留室2の内部空間は培養液貯留空間2aである。
培養液導出流路6は、一端が主培養液室3の主室3cの底部に接続され、他端が第2培養液貯留室2の主室2cの底部に接続されている。培養液導出流路6は、培養液C1を主培養液室3の流通空間3aから第2培養液貯留室2に導くことができる。
連絡流路7は、一端が第2培養液貯留室2の主室2cの底部に接続され、他端が第1培養液貯留室1の主室1cの底部に接続されている。連絡流路7は、培養液C1を第2培養液貯留室2から第1培養液貯留室1に導くことができる。
第1培養液貯留室1には、連絡流路7の他端に、連絡流路7から第1培養液貯留室1へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁32が設けられている。
第2培養液貯留室2には、培養液導出流路6の他端に、培養液導出流路6から第2培養液貯留室2へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁34が設けられている。
逆止弁32,34としては、例えば弁孔を有する弁座と、弁体とを備えた構造の逆止弁を例示できる。この逆止弁は、液が順方向に流れる際には、弁体が弁座から離れることにより弁孔が開かれるため、液は弁孔を通過して順方向に流れる。液が逆方向に流れる際には、弁体が弁座に当接して弁孔が閉止されるため、当該方向の液の流れは阻止される。
逆止弁32,34は、液体の流れを制御する逆流防止機構の例である。
ラプラス弁31の構造と機能を、図10A〜図10Cを用いて説明する。図10Aは、ラプラス弁117が設けられた液体貯留室の部分拡大図を示す。図10Bは、ラプラス弁117を介して下流口114から連絡流路115に培地131が流入する場合の模式図を示す。図10Cは、下流口114に空気が流入した際に、ラプラス弁117が機能している際の模式図を示す。図10Cに示すように、微細な流路内において、培地131と空気との間には界面張力による圧力差、すなわちラプラス圧が発生する。流路の表面が液体培地で濡れている場合は、ラプラス圧未満の空気圧条件下において液体が満たされた微細流路に空気は流入しえない。このような条件下で微細流路は受動的な空気流入防止機構として扱うことができる。
ラプラス弁に空気が流入してしまう圧力(ラプラス圧、限界圧力)(ΔPLap)は界面張力(γ)およびラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅(wL)および深さ(hL)によって以下の式(2)で計算できる。
仮に細胞の耐圧性を生体内の血圧の上限程度(30kPa=225mmHg)とすると、実施形態の細胞培養装置を駆動するために現実的な圧力範囲は1kPa〜30kPa程度となる。培養液の界面張力は60mN/m程度であり、ラプラス弁を構成するマイクロ流路の断面が正方形の場合、つまりwL=hLの場合、30kPaで空気が流入するマイクロ流路の寸法は上記式(2)よりwL=hL=8μm程度、1kPaで空気が流入するマイクロ流路の寸法はwL=hL=240μm程度と推算される。
ラプラス弁を構成するマイクロ流路の寸法を上記寸法(30kPaのときのwL=hL=8μm、1kPaのときのwL=hL=240μm)よりも小さくすることで、想定する圧力で運用した際にラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
すなわち、ラプラス弁が機能するための限界の圧力であるラプラス圧ΔPLapが、実施形態の細胞培養装置で使用する圧力範囲よりも大きくなるように、ラプラス弁を構成するマイクロ流路を形成すれば、ラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
なお、wLとhLの比率が1:1でない場合も同様に式(2)に基づいて流路の寸法を設計することが可能である。
細胞培養装置10では、例えば、培養液導入流路5の幅および深さをそれぞれ200μmおよび25μmと設計し、ラプラス圧が5.4kPaと推算して、圧力がこの値以下となるように液体を培養液導入流路5に流すことができる。
ラプラス弁31は、液体の流れを制御する逆流防止機構の例である。
断面が矩形のマイクロ流路を流れる液体の流量(Q)と圧力損失(ΔP)には以下の関係がある(F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006を参照)。
例えば、細胞培養装置10では、培養液導入流路5、培養液導出流路6、および連絡流路7は、流量を調節するために流路断面積が1/10以下となっている抵抗流路部位5a,6a,7aを備えていてもよい。
流路5,6,7において、抵抗流路部位と、それ以外の部分の部位との長さが等しい場合を考える。抵抗流路の断面積が他の部位の断面積の1/10となると、幅w、深さhが1/100.5となり、式(4)の抵抗流路の流路抵抗Rが、抵抗流路以外の部位の流路抵抗Rの100倍となる。
式(3)より、圧力損失についても抵抗流路の圧力損失が、抵抗流路以外の部位の圧力損失の100倍となる。流路全体を流れる流量を推算する際に、抵抗流路の抵抗と流路全体にかかる圧力のみを考慮して流量を推算した場合の推算誤差が1/100となり、これは許容できる誤差と言える。
すなわち、流路の一部に流量を調節するために流路断面積が1/10以下となっている抵抗流路部位が設けられた場合には、抵抗流路の圧力損失のみを考慮して流路設計をすることで流路網の設計が容易になるという利点がある。
なお、抵抗流路部位は、培養液導入流路5および培養液導出流路6の一方にのみ形成してもよい。
加圧ポンプ14は、例えばコンプレッサである。
次に、細胞培養装置10を用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
図1および図2に示すように、細胞20を隔膜4の内面4aに播種して接着させる。主培養液室3の流通空間3aには培養液C1を導入してもよい。
隔膜4に播種する細胞20としては、尿細管細胞、脳血管内皮細胞などが使用できる。尿細管細胞を用いることによって、腎臓モデルが得られる。脳血管内皮細胞を用いることによって、血液脳関門モデルが得られる。
加圧ポンプ14を稼働させ、通気孔1hを通して第1培養液貯留室1に気体(例えば空気)を供給して第1培養液貯留室1内を加圧する。この際、第2培養液貯留室2は通気孔2hを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第1培養液貯留室1内の圧力上昇によって、第1培養液貯留室1内の培養液C1は、培養液導入流路5を通って主培養液室3の流通空間3aに導入される。流通空間3a内の培養液C1は、培養液導出流路6を通って第2培養液貯留室2に導入される。
培養液C1は、第1培養液貯留室1から主培養液室3の流通空間3aを経て第2培養液貯留室2に流れるため、シェアストレスが加えられる環境下で細胞20の培養を行うことができる。
加圧ポンプ14によって、通気孔2hを通して第2培養液貯留室2に気体(例えば空気)を供給して各室内を加圧すると、第2培養液貯留室2内の圧力上昇によって、第2培養液貯留室2内の培養液C1は、連絡流路7を通って第1培養液貯留室1に導入される。なお、この際、第1培養液貯留室1は大気に開放しておくことが好ましい。
工程2,3を繰り返すことによって、第1培養液貯留室1、主培養液室3(流通空間3a)、第2培養液貯留室2の間で培養液C1を循環させることができる。
[細胞培養装置]
第2実施形態の細胞培養装置10Aについて、図面を参照して説明する。以下、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図3に示すように、細胞培養装置10Aにおいて、貯留槽11Aは、複数の細胞培養ユニット9を有する。細胞培養ユニット9の数は、2以上の任意の数であってよい。
複数の細胞培養ユニット9のうち、隣り合う2つの細胞培養ユニット9,9の第1培養液貯留室1,1は、気体流路18(接続流路)によって互いに連通されている。
気体流路18の一端および他端は、第1培養液貯留室1,1内の上部気相空間1f,1fに接続されているため、気体流路18は、気体が流通可能となるように第1培養液貯留室1,1を接続している。
細胞培養ユニット9の数が3以上である場合には、少なくとも2つの細胞培養ユニット9の第1培養液貯留室1が気体流路18によって互いに連通されていればよい。
また、少ない数の加圧ポンプ14(図1参照)によって送液が可能となるため、装置の構造を簡略にすることができる。そのため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
上述の非特許文献8,10,11等に示す装置では、それぞれ、シリンジポンプ、カートリッジ式のペリスタポンプを用いて送液する構造が採用されており、1つの被検体を評価するために1台のポンプと1つのOrgan-on-a-chipを使用している。
この構造で複数の被検体を評価しようとすると、対象となる被検体の数だけポンプやペリスタポンプのカートリッジを増設する必要があるため、送液のための配管接続が増えてしまう。
図3に示す細胞培養装置10Aは、容易な操作で、多数の被検体(薬剤等)を効率よく評価できる点で、非特許文献8,10,11等に示す装置より優れている。
[細胞培養装置]
第3実施形態の細胞培養装置10Bについて、図面を参照して説明する。
図4は、細胞培養装置10Bを模式的に示す断面図である。
図4に示すように、細胞培養装置10Bは、貯留槽11Bと、加圧ポンプ(図示略)とを備えている。貯留槽11Bは、1つの細胞培養ユニット9Bを備えている。貯留槽11Bは、槽本体12Bと、蓋部13Bと、を備えている。
細胞培養ユニット9Bは、主培養液室3と、第1培養液貯留室1と、第2培養液貯留室2と、隔膜4と、培養液導入流路5と、培養液導出流路6と、連絡流路7と、第1液体貯留室21と、第2液体貯留室22と、液体導入流路25と、液体導出流路26と、連絡流路27と、を有する。
第1液体貯留室21は、主室21cと、主室21cの底面21eに形成された細胞保持凹部21d(細胞保持部)とを有する。第1液体貯留室21の内部空間は培養液貯留空間21aである。
第2液体貯留室22は、主室22cと、主室22cの底面22eに形成された細胞保持凹部22d(細胞保持部)とを有する。第2液体貯留室22の内部空間は培養液貯留空間22aである。
液体導出流路26は、一端が主培養液室3の凹部3dの底部に接続され、他端が第2液体貯留室22の底部に接続されている。液体導出流路26は、培養液C2を主培養液室3の外面側空間3bから第2液体貯留室22に導くことができる。
連絡流路27は、一端が第2液体貯留室22の主室22cの底部に接続され、他端が第1液体貯留室21の主室21cの底部に接続されている。連絡流路27は、培養液C2を第2液体貯留室22から第1液体貯留室21に導くことができる。
蓋部13Bが上部開口1b,2b,21b,22bを気密に閉止する構造としては、例えば、蓋部13が、上部開口1b,2b,21b,22bのそれぞれを包囲するように与えられたパッキン15を介して槽本体12Bの上面に当接する構造を例示できる。
第1液体貯留室21には、連絡流路27の他端に、連絡流路27から第1液体貯留室21へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁36が設けられている。
第2液体貯留室22には、液体導出流路26の他端に、液体導出流路26から第2液体貯留室22へ向かう方向の液体の流れを許容し、かつその逆の方向の流れを阻止する逆止弁38が設けられている。
液体導入流路25、液体導出流路26、および連絡流路27には、それぞれ抵抗流路部位25a,26a,27aが形成されている。
次に、細胞培養装置10Bを使用した細胞培養方法の一例について説明する。
細胞20Aを主培養液室3の隔膜4の内面4aに播種して接着させる。細胞20Bを第2液体貯留室22の凹部22dに播種する。
第2培養液貯留室2に培養液C1を導入するとともに、第2液体貯留室22に培養液C2を導入し、蓋部13Bを閉じる。
通気孔2h、22hを通して第2培養液貯留室2および第2液体貯留室22に気体(例えば空気)を供給して各室内を加圧する。この際、第1培養液貯留室1および第1液体貯留室21は大気に開放しておくことが好ましい。
第2培養液貯留室2内の圧力上昇によって、第2培養液貯留室2内の培養液C1は、連絡流路7を通って第1培養液貯留室1に導入される。第2液体貯留室22内の圧力上昇によって、第2液体貯留室22内の培養液C2は、連絡流路27を通って第1液体貯留室21に導入される。
通気孔1h、21hを通して第1培養液貯留室1および第1液体貯留室21に気体(例えば空気)を供給して各室内を加圧する。この際、第2培養液貯留室2および第2液体貯留室22は大気に開放しておくことが好ましい。
第1培養液貯留室1内の圧力上昇によって、第1培養液貯留室1内の培養液C1は、培養液導入流路5を通り、主培養液室3の流通空間3aを経て第2培養液貯留室2に流れる。第1液体貯留室21内の圧力上昇によって、第1液体貯留室21内の培養液C2は、液体導入流路25を通り、主培養液室3の外面側空間3bを経て第2液体貯留室22に流れる。
細胞培養装置10Bは、細胞20Aに脳血管内皮細胞を用い、細胞20Bに脳神経細胞を用いることで脳への薬物輸送・薬効発現評価モデルとして使用できる。
[細胞培養装置]
第4実施形態の細胞培養装置10Cについて、図面を参照して説明する。
図5は、細胞培養装置10Cを模式的に示す断面図である。
図5に示すように、細胞培養装置10Cは、貯留槽11Cと、加圧ポンプ(図示略)とを備えている。貯留槽11Cは、1つの細胞培養ユニット9Cを備えている。貯留槽11Cは、槽本体12Cと、蓋部13Cと、を備えている。
隔膜4(4C2)は、貯留空間8aと外面側空間8bとを隔てるように設置されている。隔膜4(4C2)の内面4a(一方の面)は貯留空間8aに臨み、外面4b(他方の面)は外面側空間8bに臨んでいる。
第1連絡流路7C1は、一端が第2培養液貯留室2の主室2cの底部に接続され、他端が第1培養液貯留室1の主室1cの底部に接続されている。第1連絡流路7C1は、培養液C1を第2培養液貯留室2から第1培養液貯留室1に導くことができる。
第2連絡流路7C2は、一端が第1培養液貯留室1の主室1cの底部に接続され、他端が第3培養液貯留室8の凹部8dの底部に接続されている。第2連絡流路7C2は、培養液C1を第2培養液貯留室2から第3培養液貯留室8の外面側空間8bに導くことができる。
培養液導入流路5C、第1連絡流路7C1、および第2連絡流路7C2には、それぞれ抵抗流路部位5Ca,7C1a,7C2aが形成されている。
(1)工程1
細胞20Aを第3培養液貯留室8の隔膜4(4C2)の内面4aに播種して接着させる。細胞20Bを第1培養液貯留室1の凹部1dに播種する。細胞20Cを第2培養液貯留室2の凹部2dに播種する。細胞20Dを主培養液室3の隔膜4(4C1)の内面4aに播種して接着させる。
(2)工程2
第2培養液貯留室2に培養液C1を導入するとともに、第2液体貯留室22に液体培地M1(液体)を導入し、蓋部13Cを閉じる。
第2培養液貯留室2および第2液体貯留室22に気体を供給して各室内を加圧する。
培養液C1は、第2培養液貯留室2、第1連絡流路7C1、第1培養液貯留室1の順に流れる。
液体培地M1は、第2液体貯留室22、連絡流路27、第1液体貯留室21の順に流れる。
第1培養液貯留室1および第1液体貯留室21に気体を供給して各室内を加圧する。
培養液C1は、第1培養液貯留室1、第3培養液貯留室8の外面側空間8b、主培養液室3の流通空間3a、第2培養液貯留室2の順に流れる。
液体培地M1は、第1液体貯留室21、主培養液室3の外面側空間3b、第2液体貯留室22の順に流れる。
図6は、細胞培養装置10Bを示す斜視図である。図7は、細胞培養装置10Bの分解斜視図である。図8Aは細胞培養装置10Bの分解状態の正断面図である。図8Bは細胞培養装置10Bの正断面図である。図9Aは細胞培養装置10Bの分解状態の側断面図である。図9Bは細胞培養装置10Bの側断面図である。
貯留槽11Bは、槽本体12Bと、蓋部13Bと、基体部40と、蓋部押圧部41と、壁部押圧部47と、を備えている。
基体部40は、底板51と、底板51の側縁から上方に突出して形成された厚肉部52,52と、底板51の端縁から上方に突出して形成された端壁部53,53と、を備えている。底板51と、厚肉部52,52と、端壁部53,53とは、底部プレート45を収容する収容空間54を画成している。厚肉部52の両端面には、押圧バー43の端部が挿入される挿入穴52a、および押圧バー48の端部が挿入される挿入穴52bが形成されている。基体部40は、底板51上に置かれた槽本体12Cを支持する。
壁部46は、厚さ方向に貫通して形成された複数の貫通孔部50を有する。第1培養液貯留室1、第2培養液貯留室2、主培養液室3、第1液体貯留室21、および第2液体貯留室22は、貫通孔部50と、底部プレート45とによって区画される空間であり、平面視形状はそれぞれ長円形である。
壁部押圧部47は、底部プレート45に向けて壁部46を押圧する押圧バー48(押圧部材)を有する。押圧バー48は、例えば金属などで構成されており、両端部を挿入穴52bに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、厚肉部52に沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。押圧バー48は、壁部46の両側部に形成された係止凹部56に係止させることができる。これによって、壁部46を底部プレート45に対して押圧し、底部プレート45に隙間なく密着させることができる。壁部押圧部47は、押圧バー48によって、壁部46を底部プレート45に向けて押さえつけた状態で保持することができる。
樹脂としては、シリコーン系樹脂(例えばポリジメチルシロキサン(PDMS))、アクリル系樹脂(例えばポリメタクリル酸メチル(PMMA))、スチレン系樹脂(例えばポリスチレン)、ポリビニルピリジン系樹脂(ポリ(4−ビニルピリジン)、4−ビニルピリジン−スチレン共重合体等)、ポリオレフィン系樹脂(例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂)、ポリエステル樹脂(ポリエチレンテレフタレート樹脂(PET))、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
なかでも、シリコーン系樹脂(例えばポリジメチルシロキサン(PDMS))、アクリル系樹脂(例えばポリメタクリル酸メチル(PMMA))、スチレン系樹脂(例えばポリスチレン)は、高い透明性を有するため好ましい。
細胞培養装置10Bは、容易な操作で、多数の被検体の影響を効率よく評価できる点で優れている。
例えば、図4等に示す細胞培養装置10Bの貯留槽11Bは、槽本体12Bと蓋部13Bとを有するが、これに限らず、一体型の貯留槽を採用してもよい。
本実施形態は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。特に、医薬品の開発、細胞生物学の基礎研究に有用である。
1d,2d,3d,21d,22d 細胞保持凹部(細胞保持部)
1h,2h,21h,22h 通気孔
2 第2培養液貯留室
3 主培養液室
3a 流通空間
4 隔膜
4a 内面(一方の面)
5 培養液導入流路
6 培養液導出流路
5a,6a 抵抗流路部位
9,9B,9C 細胞培養ユニット
10,10A,10B,10C 細胞培養装置
11,11A,11B,11C 貯留槽
12,12B,12C 槽本体
13,13B,13C 蓋部
14 加圧ポンプ(加圧手段)
21 第1液体貯留室
22 第2液体貯留室
25 液体導入流路
26 液体導出流路
32,34,36,38 逆止弁
31,35,37 ラプラス弁
41 蓋部押圧部
43 押圧バー(押圧部材)
45 底部プレート
46 壁部
47 壁部押圧部
48 押圧バー(押圧部材)
C1,C2 培養液
M1 液体培地(液体)
Claims (17)
- 細胞培養装置であって、
複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、
細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、
前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、
前記培養液が貯留される気密構造の第1培養液貯留室と、
前記培養液が貯留される第2培養液貯留室と、
前記培養液を前記第1培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、
前記培養液を前記流通空間から前記第2培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第1培養液貯留室に対して気体を供給および排出する第1通気孔を有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記第1培養液貯留室のうち少なくとも2つには、気体が流通可能となるように互いに連通された第1気体流路が設けられ、
前記第1気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において、前記第1培養液貯留室を加圧したときに、前記培養液を前記第1培養液貯留室から前記流通空間に一括的に送ることが可能なように構成されている、
細胞培養装置。 - 前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、前記培養液を前記第2培養液貯留室から前記第1培養液貯留室に導く連絡流路をさらに有し、
前記貯留槽は、前記第2培養液貯留室に対して気体を供給および排出する第2通気孔をさらに有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記第2培養液貯留室のうち少なくとも2つには、気体が流通可能となるように互いに連通された第2気体流路が設けられ、
前記第2気体流路は、複数の前記細胞培養ユニットの間において、前記第2培養液貯留室を加圧したときに、前記培養液を前記第2培養液貯留室から前記第1培養液貯留室に一括的に送ることが可能となるように構成されている、請求項1記載の細胞培養装置。 - 前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、
液体が貯留される気密構造の第1液体貯留室と、
前記液体が貯留される第2液体貯留室と、
前記第1液体貯留室を供給源とする前記液体を、前記隔膜の他方の面側の空間から前記第2液体貯留室に導く液体導出流路と、を有し、
前記貯留槽は、前記第1液体貯留室に対して気体を供給および排出する通気孔を有する、請求項1または2に記載の細胞培養装置。 - 前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記第1液体貯留室のうち少なくとも2つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項3に記載の細胞培養装置。
- 前記第1培養液貯留室と、前記第2培養液貯留室とは、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項1〜4のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記培養液導出流路から前記第2培養液貯留室への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項1〜5のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記逆流防止機構は、前記培養液導出流路から前記第2培養液貯留室へ向かう方向の前記培養液の流れを許容し、かつ前記流れの逆の方向の流れを阻止する逆止弁である、請求項6に記載の細胞培養装置。
- 前記第1培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを制御する逆流防止機構をさらに備えている、請求項1〜5のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記逆流防止機構は、前記第1培養液貯留室から前記培養液導入流路への前記培養液の流れを許容し、かつ前記第1培養液貯留室から前記培養液導入流路への気体の流れを阻止するラプラス弁である、請求項8に記載の細胞培養装置。
- 前記培養液導入流路と培養液導出流路のうち少なくともいずれか一方は、流路断面積が他の部位に比べて1/10以下である抵抗流路部位を有する、請求項1〜9のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記流通空間は、前記隔膜の厚さ方向の距離が1μm〜1000μmである、請求項1〜10のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記貯留槽は、前記主培養液室、前記第1培養液貯留室および前記第2培養液貯留室が形成された容器状の槽本体と、前記主培養液室、前記第1培養液貯留室および前記第2培養液貯留室の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する、請求項1〜11のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材を有する、請求項12に記載の細胞培養装置。 - 前記槽本体は、前記液体導出流路を有する底部プレートと、前記底部プレートの一方の面に設けられた壁部とを備え、
前記主培養液室、前記第1培養液貯留室および前記第2培養液貯留室は、前記底部プレートと前記壁部とによって区画された空間である、請求項12または13に記載の細胞培養装置。 - 前記壁部を前記底部プレートに向けて押さえつけて保持する壁部押圧部をさらに備え、 前記壁部押圧部は、前記底部プレートに向けて前記壁部を押圧する押圧部材を有する、請求項14に記載の細胞培養装置。
- 前記第1培養液貯留室内を加圧可能な加圧手段をさらに備えている、請求項1〜15のうちいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 細胞培養方法であって、
複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記複数の前記細胞培養ユニットの各々は、細胞の培養液が流通する流通空間を有する主培養液室と、前記細胞が接着可能な一方の面が前記流通空間に臨む透過性の隔膜と、前記培養液が貯留される気密構造の第1培養液貯留室と、前記培養液が貯留される第2培養液貯留室と、前記培養液を前記第1培養液貯留室から前記主培養液室の前記流通空間に導く培養液導入流路と、前記培養液を前記流通空間から前記第2培養液貯留室に導く培養液導出流路と、を有し、前記貯留槽は、前記第1培養液貯留室に対して気体を供給および排出する第1通気孔を有し、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける複数の前記第1培養液貯留室のうち少なくとも2つには、気体が流通可能となるように互いに連通された第1気体流路が設けられ、
前記第1気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において、前記第1培養液貯留室を加圧したときに、前記培養液を前記第1培養液貯留室から前記流通空間に一括的に送ることが可能なように構成されている細胞培養装置を使用し、
前記第1培養液貯留室に前記第1通気孔を通して気体を供給して前記第1培養液貯留室を加圧し、前記第1培養液貯留室内の圧力上昇によって、前記第1培養液貯留室内の培養液を前記培養液導入流路を通して前記主培養液室に導くとともに、前記主培養液室内の培養液を前記培養液導出流路を通して前記第2培養液貯留室に導く、細胞培養方法。
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