JP6798988B2 - 完全型免疫グロブリン形態の細胞質浸透能を有する抗体を利用して細胞内活性化されたｒａｓを抑制する方法及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の細胞質浸透能を有する抗体を利用して細胞内活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを抑制する方法に関する。

また、本発明は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が細胞質に浸透して細胞質内活性化されたＲＡＳと結合することを誘導する重鎖可変領域（ＶＨ）及びこれを含む抗体に関する。

また、本発明は、前記抗体を利用して癌または腫瘍細胞の成長を抑制させる方法及び癌または腫瘍を治療する方法に関する。

また、本発明は、細胞質内ＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域のスクリーニング方法に関する。

また、本発明は、前記抗体に融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子及びリポソームからなる群から選択された生体活性分子に関する。

また、本発明は、前記抗体、またはこれに融合されるペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子及びリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む、癌の予防、治療または診断用組成物に関する。

また、本発明は、前記軽鎖可変領域及び抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。

完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、５０ｋＤａ）タンパク質二つと、軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、２５ｋＤａ）タンパク質二つで作られたＹ字形の非常に安定した構造（分子量、１５０ｋＤａ）を形成している。抗体の軽鎖と重鎖は、アミノ酸配列が抗体毎にそれぞれ異なる可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とアミノ酸配列が同じ不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）に分けられていて、重鎖不変領域には、ＣＨ１、ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインが存在して、軽鎖不変領域には、ＣκまたはＣλドメインが存在する。抗体の重鎖および軽鎖可変領域の中には、抗体毎にアミノ酸配列が特に異なる部分があるが、抗原と結合する部位を構成しているため相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＤＲｓ）とも呼ばれる。抗体の立体構造を調べると、これらのＣＤＲｓは、抗体の表面で輪（ｌｏｏｐ）の形状をしていて、輪の下にはこれを構造的に支持するＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）が存在する。重鎖と軽鎖には、それぞれ３個ずつ輪構造が存在して、これらの６個の輪地域の構造は互いに合わせて抗原と直接的に接触している。抗体の重鎖不変領域（Ｆｃ）は、ＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との結合を介して血液内長い半減期を保障して、この特により小分子薬物とは異なり体内で長時間持続することができる。またＦｃγＲ（Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等との結合を介して抗体−依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）および補体−依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を介して標識物質を過発現する細胞に対する特異的細胞死滅誘導が可能である。近年、ヒトの様々な疾病に対する治療目的でいくつかの種で開発された抗体の場合、免疫原性を克服するために、ヒト抗体ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）でＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇする方法など、多様なヒト化方法を介して向上した治療効果が期待できる。

既存抗体は、大きいサイズと親水性特徴により、生きている細胞の内部に直接浸透はできない。従って、既存の多くの抗体は、細胞外に分泌されたタンパク質または細胞膜タンパク質を特異的に標的している（Ｋｉｍ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，２００５）。一般的抗体と高分子バイオ医薬品は、疏水性である細胞膜通過が不可能で、細胞質内部の多様な疾病関連物質と結合および阻害できない限界がある。一般に、細胞の生長、特異的抑制などのような機序の研究のための実験で使用される細胞の内部物質と特異的結合する商業的抗体は、生きている細胞に対して直接処理できず、細胞の内部物質と結合するためには、両親媒性グリコシドであるサポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）を利用した細胞膜透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）過程を介して細胞膜に穿孔を形成するための前処理過程が必ず必要である。低分子物質、核酸またはナノ粒子などの場合、種々の試薬、電気穿孔法または熱衝撃などの方法を使用して生きている細胞の内部に輸送が可能であるが、タンパク質および抗体の場合、前記した大部分の試薬と実験条件などが、固有な３次構造に悪影響を及ぼして活性を消失し得る。細胞の内部タンパク質を特異的結合して、活性を阻害する細胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）が開発されているが、これも生きている細胞の細胞膜を浸透する活性がなく遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）用途でだけ適用が可能で、今後応用の可能性が非常に制限される（Ｍａｎｉｋａｎｄａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

前記の通り、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）抗体を含む様々な形態の抗体切片、組換えタンパク質など高分子物質とは反対に小分子物質の場合、小さいサイズと疏水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）の特徴を利用して、効果的に生きている細胞の内部に浸透が容易である。しかし、小分子薬物は、細胞の内部の多様な疾病関連物質に対して特異的結合をするために標的物質表面に疏水性ポケット（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｏｃｋｅｔ）が必要で、このような疏水性ポケットを有する標的物質は、細胞の内部の全体疾患関連物質の約１０％内外であるため、多くの細胞の内部の病原性タンパク質を特異的に標的することができない（Ｉｍａｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

癌を含む様々な疾患で細胞内タンパク質−タンパク質相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ＰＰＩ）に重要な役割をする酵素または転写、信号伝達関連の様々なタンパク質の突然変異および非正常的過発現する現象が発生する。特に、このようなタンパク質中広いかつ扁平な表面を介して構造複合性相互作用を成している疾患関連物質に対しては前述した通り小分子薬物による特異的阻害が難しい（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。一例で、現在効果的な治療物質がない細胞質重要腫瘍関連因子中一つであるＲＡＳは、細胞膜受容体を介して細胞の外部の信号を細胞内信号伝達体系に伝達する分子的スイッチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈ）役割をして、ヒト癌の約３０％、主に大腸癌とすい臓癌で細胞内に発癌関連突然変異体による常時活性化していて、このような発癌関連突然変異は、既存の坑癌治療に対する強い耐性を与えて主要な腫瘍関連因子として知られている（Ｓｃｈｅｆｆｚｅｋ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

現在技術的限界を克服するために、タンパク質−タンパク質相互作用を効果的に阻害できる抗体切片または組換えタンパク質のような高分子物質を生きている細胞の内部に浸透能を与えるための様々な研究が行われたが、塩基性アミノ酸配列および疏水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）、両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）の特性を有するタンパク質透過ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ，ＰＴＤ）が、生きている細胞に対して細胞浸透能を有することが明らかになり（Ｌｅｅｎａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）、これを利用した細胞の内部特定タンパク質を認識するために、透過ドメインを遺伝工学的に様々な形態の抗体切片と融合する試みが多く行われた。しかし、融合タンパク質の場合、ほとんどの動物細胞で分泌されないか、ほんの少量だけ上澄み液として流出して（ＮａＫａｊｉｍａ Ｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）、アルギニンが豊富なタンパク質透過ドメインとの融合タンパク質は、宿主のプリンプロテアーゼ（Ｆｕｒｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ）に脆弱である生産的問題を有している（Ｃｈａｕｈａｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。また、融合タンパク質の細胞の内部に浸透効率が良くないため治療用抗体への開発が難しい問題がある（Ｆａｌｎｅｓ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００１）。発現問題を克服するために、タンパク質を精製した後、細胞透過ドメインを化学的共有結合またはビオチン−ストレプトアビジン（ｂｉｏｔｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）等の結合等を介して融合する研究が進行されているが、該当タンパク質の構造に変形を招いている。

その他一部自己抗体を利用した研究で抗体および単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）抗体切片がエンドサイトーシスを介して細胞の内部に浸透が可能であるとの報告がある。自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ）は、自己免疫疾患を有するヒトとマウスで主に発見される抗−ＤＮＡ抗体（ａｎｔｉ−ＤＮＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり、この中の一部は生きている細胞に対して細胞の内部に浸透する特性を有する（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｊｅｓｋｅ Ｚａｃｋ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。現在まで報告された細胞浸透自己抗体は、多くは細胞の内部に流入した後に核に位置して、核で活性を示す特定タンパク質との融合を介して効果をみるための研究が盛んに行われている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。しかし、自己抗体を利用した生きている細胞に対する細胞浸透は、最終的に核に位置して細胞の内部の細胞質にある様々な疾患関連物質を特異的結合および活性を阻害できない限界を有している。

自然界高分子物質中、細胞の内部に浸透する特性を有する代表物質としてウイルス（ＨＩＶ、ＨＳＶ）、毒素（コレラ毒素、ジフテリア毒素）がある。これらは、能動的細胞の内部輸送機序であるエンドサイトーシス（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞内に浸透すると知られている。このようなエンドサイトーシスは、大きく三つの経路に分類されて、リガンド結合による受容体のエンドサイトーシスに関与するｃｌａｔｈｒｉｎによる内胞作用またはコレラ毒素などのような一部毒素で確認されるｃａｖｅｏｌａｅによる内胞作用、デキストリン、エボラウイルスなどで確認されるｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓがある。Ｃｌａｔｈｒｉｎとｃａｖｅｏｌａｅが関与する内胞作用は、主に膜に分布する受容体が特定リガンドと結合しながら始まる。Ｃｌａｔｈｒｉｎは、細胞膜内側表面に位置するが、物質が受容体と結合するとｃｌａｔｈｒｉｎタンパク質が繊維質の殻を作って小胞を形成して小胞が細胞質中に移動することになる。Ｃａｖｅｏｌａｅは、ｃａｖｅｏｌｉｎ−１タンパク質が作用して、オリゴマーを形成しながらｃａｖｅｏｓｏｍｅという安定した構造の小胞を作って、細胞質中に移動することになる。Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓは、細胞膜の一部分が突出して物質を覆いｍａｃｒｏｐｉｎｏｓｏｍｅを形成して細胞質中に移動することになる（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。このようなエンドサイトーシス経路を介して細胞質浸透した物質は、追加的なエンドソーム脱出機序がない場合、多くは、リソソーム経路を介して分解される。

前記のようなリソソーム経路を介して分解されることを避けるために、ウイルス、毒素などはエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）で細胞質に脱出する機序を有している。いまだにエンドソーム脱出機序（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）については明らかになっていないが、現在までエンドソーム脱出機序に対する仮説は、大きく三つがある。最初の仮説は、エンドソーム膜に穴を形成する機序であり、エンドソーム膜に陽イオン両親媒性ペプチド（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のような物質が負電荷の細胞二重脂質膜に結合して内部応力（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔｒｅｓｓ）または内膜収縮を起こして結果的に円筒形の穴（ｂａｒｒｅｌ−ｓｔａｖｅ ｐｏｒｅ）またはドーナツ型の通路（ｔｏｒｏｉｄａｌ ｃｈａｎｎｅｌ）を形成するものであり（Ｊｅｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、二番目の仮説は、陽子スポンジ効果によってエンドソームが裂ける機序で陽子化アミン基（ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）によってアミン基を有する物質が高い緩衝効果を介してエンドソームの浸透圧増加でエンドソーム膜が崩壊され得るというものである（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｅｎｇｂｅｒｓｅｎ，２００８）。三番目は、中性で親水性コイル形を維持するが、エンドソームのような酸性では、疏水性螺旋形構造に変形される特定モチーフがエンドソーム膜との融合を介してエンドソームを脱出する仮説がある（Ｈｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。しかし、前記仮説で現在まで自然界に存在する様々な物質に対するエンドソーム脱出機序を証明するための研究結果が不足している。

従って、本発明者は、重鎖可変領域（ＶＨ）ライブラリーを構築を介して活性化されたＲＡＳに対して特異的結合能を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を選別して、これを前記細胞の内部に浸透および細胞質に分布する特徴を有するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖と同時発現して完全型免疫グロブリン形態の抗体を構築することによって、生きている細胞の内部に浸透して細胞質にある活性化されたＲＡＳに特異的に結合する完全型免疫グロブリン形態の抗−ＲＡＳ細胞質浸透抗体を製作した。

また、本発明者は、生きている細胞の内部に浸透および細胞質に分布する完全型免疫グロブリン形態の抗体を探し出するために、細胞の内部に浸透および細胞質に分布するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメインを開発した。また、安定した完全型免疫グロブリン形態の単クローン性抗体構築のため、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域単一ドメイン（ＶＬ）抗体切片を様々なヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と相互作用結合が容易でありかつ細胞の内部に浸透および細胞質に分布する活性を維持するように改良して、細胞の内部に浸透および細胞質に分布する完全型免疫グロブリン形態の単クローン性抗体（Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）を開発した。

さらに、本発明者は、前記抗−ＲＡＳ細胞質浸透単一クローン抗体が、多様なＲＡＳ突然変異依存的癌細胞株の内部に浸透して、細胞質にあるＲＡＳ突然変異特異的中和による細胞生長阻害を示すことを確認して、前記抗体が、腫瘍組織特異性を与えるためのペプチドを融合した形態でも細胞質浸透および活性化されたＲＡＳ中和能に対する悪影響なしに、ＲＡＳ突然変異依存的腫瘍で活性化されたＲＡＳを特異的抑制させる活性を発揮することを確認して本発明を完成するに至った。

従って、本発明の一様態は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の細胞質浸透能を有する抗体を利用して細胞内活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを抑制する方法を提供することを目的とする。

また、本発明の一様態は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が細胞質に浸透して細胞質内活性化されたＲＡＳと結合することを誘導する重鎖可変領域（ＶＨ）及びこれを含む抗体を提供することを目的とする。

また、本発明の一様態は、前記抗体を利用して癌または腫瘍細胞の成長を抑制させる方法及び癌または腫瘍を治療する方法を提供することを目的とする。

また、本発明の一様態は、細胞質内ＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

また、本発明の一様態は、前記抗体に融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子及びリポソームからなる群から選択された生体活性分子を提供することを目的とする。

また、本発明の一様態は、前記抗体、またはこれに融合されるペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子及びリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む、癌の予防、治療または診断用組成物を提供することを目的とする。

また、本発明の一様態は、前記重鎖可変領域または抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。

前記目的を達成するために本発明は、生きている細胞にエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）及びエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）介して能動的に細胞質に浸透する完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の細胞質浸透能を有する抗体を利用して、細胞内活性化されたＲＡＳを抑制する方法であって、前記抗体は、細胞質内活性化されたＲＡＳに特異的に結合するものである、方法を提供する。

以下本発明を詳細に説明する。
本発明の前記方法、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が細胞質に浸透して細胞質内活性化されたＲＡＳと結合することを誘導する重鎖可変領域（ＶＨ）によって細胞内活性化されたＲＡＳを抑制させる。

完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体に生きている細胞膜をエンドサイトーシスを介して浸透後、エンドソーム脱出して細胞質に位置するように誘導できる軽鎖可変領域（ＶＬ）によって、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が細胞膜に浸透して細胞質に位置することができる。

すなわち、本発明の前記方法は、抗体が細胞質を透過して細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）腫瘍関連因子ＲＡＳに特異的結合及び活性を阻害するように誘導する方法を提供する。

前記抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化された抗体であってもよい。

また、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥであってもよく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ５、またはＩｇＤタイプであってもよく、最も好ましくはＩｇＧタイプのクローン性抗体であってもよい。

完全型免疫グロブリン形態の抗体は、二つの全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および二つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ，ＳＳ−ｂｏｎｄ）によって連結され、抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有して、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。

「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」とは、抗原に特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび三つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む全長重鎖およびそれの断片を共に含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」とは、抗原に特異性を与えるための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を共に含む意味で解釈される。

本発明の一具体例で、前記抗体は、細胞質内活性化されたＲＡＳを標的にして特異的に結合するものであってもよい。前記活性化されたＲＡＳは、ＧＴＰが結合された腫瘍関連因子であって、前記ＲＡＳは突然変異形態であってもよい。前記ＲＡＳの突然変異は、疾患と関係する様々な形態でその種類に制限がないが、例えば、ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、ＮＲａｓの１２番Ｇｌｙｃｉｎｅ、１３番Ｇｌｙｃｉｎｅ、６１番ｇｌｕｔａｍｉｎｅ残基の置換された突然変異であってもよい。

前記のような完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体と細胞内活性化されたＲＡＳとの結合は、細胞質内の活性化されたＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）によるものである。

本発明の一様態で、細胞質内の活性化されたＲＡＳに特異的に結合する前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３および２６からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；
配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４および２７からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；及び
配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５および２８からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上である配列を含んでもよい。

前記配列番号の配列情報は下記のとおりである。

本発明の一具体例で、本発明の重鎖可変領域は、配列番号８のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、及び配列番号１０のＣＤＲ３を含むものであってもよい。

本発明の一具体例で、本発明の重鎖可変領域は、配列番号１１のＣＤＲ１、配列番号１２のＣＤＲ２、及び配列番号１３のＣＤＲ３を含むものであってもよい。

本発明の一具体例で、本発明の重鎖可変領域は、配列番号１４のＣＤＲ１、配列番号１５のＣＤＲ２、及び配列番号１６のＣＤＲ３を含むものであってもよい。

本発明の一具体例で、本発明の重鎖可変領域は、配列番号１７のＣＤＲ１、配列番号１８のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３を含むものであってもよい。

本発明の一具体例で、本発明の重鎖可変領域は、配列番号２０のＣＤＲ１、配列番号２１のＣＤＲ２、及び配列番号２２のＣＤＲ３を含むものであってもよい。

本発明の一具体例で、本発明の重鎖可変領域は、配列番号２３のＣＤＲ１、配列番号２４のＣＤＲ２、及び配列番号２５のＣＤＲ３を含むものであってもよい。

本発明の一具体例で、本発明の重鎖可変領域は、配列番号２６のＣＤＲ１、配列番号２７のＣＤＲ２、及び配列番号２８のＣＤＲ３を含むものであってもよい。

また、本発明の好ましい具体例で、前記重鎖可変領域は、配列番号１〜７からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。

前記配列番号の配列情報は下記のとおりである。

前記ＲＡＳに特異的に結合および阻害する重鎖可変領域は、下記のような方法によってスクリーニングした。

本発明の一具体例では、構築されたヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１）が融合している状態でＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３地域に計１８個の残基に対して人為的な突然変異が誘導されたライブラリーを利用して選別した。

また、本発明の一具体例では、前記ヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１）が融合しているライブラリーを利用して細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）と結合された状態でも活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳに対して特異的に結合が可能な重鎖可変領域を選別した。

本発明の一具体例では、標的分子として活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳ突然変異体であるＫＲａｓ Ｇ１２Ｄを使用した。本発明の一具体例において、発癌関連ＲＡＳ突然変異は主に１２番、１３番、６１番残基で発生して、１２番、１３番残基は、ＲＡＳタンパク質のＰ−ｌｏｏｐに位置していて、ＲＡＳタンパク質と結合しているＧＴＰを加水分解して非活性化された形態でタンパク質構造変化を誘導するＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の結合に影響を与える。また、６１番残基は、ＧＡＰの加水分解活性部位と結合してＧＴＰ加水分解を防ぐ役割をするので、様々な発癌関連ＲＡＳ突然変異は、ＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異と信号伝達に関連した地域（Ｓｗｉｔｃｈ Ｉ、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩ）が同じであるため、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ突然変異に限定されない。

また、前記一具体例において、ＮＲａｓ、ＨＲａｓは、ＫＲａｓとＧドメインと呼ばれる触媒ドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）１番から１６５番残基までの類似度が８５％以上であり、この中で下位信号物質と結合する部位Ｓｗｉｔｃｈ Ｉ（３２番〜３８番）、Ｓｗｉｔｃｈ ＩＩ（５９番〜６７番）ドメインは１００％一致する。但し、１６５番から１８９番までのＣ−末端超可変形部位は、１５％の類似度を有しているが、構造的に下位信号伝達に影響を与えないので、標的分子で使用した活性化したＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに限定されない。

本発明の一具体例において、酵母細胞表面発現システムを利用して重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１）が発現した状態で活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳに対して初期選別以後、細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖を発現および分泌する酵母と酵母接合を介してこの結合されたＦａｂ形態で選別した。

本発明の一具体例で、前記抗体、は生きている細胞に能動的に浸透することができ、このような細胞浸透能は、エンドサイトーシスを介して細胞内に浸透した後、エンドソーム脱出によるものであってもよい。

前記のような細胞質浸透能は、抗体が細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むことによって発揮することができる。

本発明の一具体例で、前記軽鎖可変領域は、
配列番号３２、３５および３８からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；及び
配列番号３４，２７および４０からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上である配列を含んでもよい。

前記配列番号の配列情報は下記のとおりである。

また、前記一具体例において、前記軽鎖可変領域は、配列番号３３、３６および３９からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２またはこれと相同性が９０％以上である配列をさらに含んでもよい。

本発明の一具体例で、前記軽鎖可変領域は、配列番号３２のＣＤＲ１、配列番号３３のＣＤＲ２、および配列番号３４のＣＤＲ３を含んでもよい。

また、本発明の他の具体例で、前記軽鎖可変領域は、配列番号３５のＣＤＲ１、配列番号３６のＣＤＲ２、および配列番号３７のＣＤＲ３を含んでもよい。

また、本発明の他の様態で、前記軽鎖可変領域は、配列番号３８０のＣＤＲ１、配列番号３９のＣＤＲ２、および配列番号４０のＣＤＲ３を含んでもよい。

本発明の一様態で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から２番目および４番目のアミノ酸がそれぞれロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）およびメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）で置き換えられたものであってもよい。

これはＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に位置しているＣＤＲ構造決定部位（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ）に含まれる残基中細胞質浸透能が保存されたＣＤＲ構造を得るために重要な２番目、４番目の残基を置換させたものである。

また、本発明の一様態で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から９、１０、１３、１７、１９、２１、２２、４２、４５、５８、６０、７９、および８５番目のアミノ酸がそれぞれセリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ，Ｄ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）で置き換えられたものであってもよい。

これは、ＦＤＡ承認後、市場に販売されているヒト化治療用抗体中、安定性が非常に高くＶＨ３小グループの重鎖可変領域とＶκ１小グループの軽鎖可変領域からなるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の軽鎖可変領域との配列分析を介して計１４個の残基に差があることを確認してこれを置き換えたものである。

また、本発明の他の様態で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から８９番目および９１番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｙ）で置き換えられたものであってもよい。

これは、ヒト抗体可変領域間のインターフェース（ＶＨ−ＶＬ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）分析を介して、既存細胞質浸透軽鎖可変領域のマウス由来ＣＤＲ３に位置した２個の残基が差があることを確認してこれを置き換えたものである。

本発明の好ましい様態で、前記軽鎖可変領域は、配列番号２９、３０、および３１からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。

前記配列番号の配列情報は下記のとおりである。

但し、本明細書で提供する配列番号に明示されたすべての残基番号は、Ｋａｂａｔ番号を使用した（Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。

本発明の一具体例で、前記抗体と細胞質内活性化されたＲＡＳの結合は、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−ＲａｆまたはＰＩ３Ｋと活性化されたＲＡＳの結合を抑制するものであってもよい。

本発明の一様態で、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が細胞質に浸透して細胞質内活性化されたＲＡＳと結合することを誘導する重鎖可変領域（ＶＨ）を提供する。

前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３および２６からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；
配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４および２７からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；及び
配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５および２８からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上である配列を含んでもよい。

また、本発明の一具体例で、前記重鎖可変領域は、配列番号１〜７からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。

また、本発明の一様態は、前記重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体を提供する。

また、本発明の一様態で、前記抗体は、生きている細胞に能動的に浸透して細胞質内活性化されたＲＡＳに特異的に結合するものであってもよい。

前記抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化された抗体であってもよい。

また、本発明の一具体例で、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択されたものであってもよい。

また、抗体は、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含んでもよい。前記細胞浸透能は、エンドサイトーシスを介して細胞内に浸透した後、エンドソーム脱出によるものであってもよい。

本発明の一具体例で、前記軽鎖可変領域は、
配列番号３２、３５および３８からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；及び
配列番号３４，２７および４０からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上である配列を含んでもよい。

本発明の一具体例で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から２番目および４番目のアミノ酸がそれぞれロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）およびメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）で置き換えられたものであってもよい。

本発明の他の具体例で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から９、１０、１３、１７、１９、２１、２２、４２、４５、５８、６０、７９、および８５番目のアミノ酸がそれぞれセリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ，Ｄ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）で置き換えられたものであってもよい。

また、本発明の他の具体例で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から８９番目および９１番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｙ）で置き換えられたものであってもよい。

本発明の好ましい具体例で、前記軽鎖可変領域は、配列番号２９、３０、および３１からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。

本発明の一様態は、癌または腫瘍細胞の成長を抑制させる方法であって、前記方法は、個体内細胞を細胞質内活性化されたＲＡＳに特異的に結合する抗体に露出させる工程を含むものである、方法を提供する。
また、本発明の一様態は、癌または腫瘍を治療する方法であって、前記方法は、個体に薬学的に有効な量の細胞質内活性化されたＲＡＳに特異的に結合する抗体を投与する工程を含むものである、方法を提供する。

前記細胞質内活性化されたＲＡＳに特異的に結合する抗体は、生きている細胞の内部に浸透して細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを特異的認知が可能な抗体であって、生きている細胞の内部の細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを標的及びその活性を阻害することができる。これにより、本発明に係る抗体の重鎖可変領域、これを含む抗体は、既存の様々な腫瘍治療剤の主な薬物抵抗性関連因子であるＲＡＳ突然変異を選択的阻害が可能であるところ、癌または腫瘍細胞の成長を抑制させて、癌または腫瘍を治療することができる。
また、本発明の一様態は、細胞質内ＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域のスクリーニング方法を提供する。

前記方法は（１）ＧＴＰが結合されたＲＡＳに結合できる重鎖可変領域ライブラリーを酵母表面発現システムを利用して発現する工程；
（２）ＧＴＰが結合されたＲＡＳと前記ライブラリーを結合させる工程；及び
（３）前記ＧＴＰが結合されたＲＡＳと前記ライブラリーとの結合の親和度を測定する工程を含む。

また、本発明一様態は、前記抗体に融合されたペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を提供する。

前記タンパク質は、抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体、または化学的に改質されたタンパク質等であってもよい。

本発明の具体的な実施例では、細胞質浸透を介して活性化された（ＧＴＰと結合する）ＲＡＳを特異的結合および阻害する完全型免疫グロブリン形態抗体の軽鎖可変領域のＮ−末端に配列番号４１からなるＲＧＤ４Ｃまたは配列番号４２からなるＲＧＤ１０ペプチドを融合した形態を提供する。前記本発明の一具体例において、軽鎖可変領域Ｎ−末端とＲＧＤ４Ｃペプチドは（Ｇ_４Ｓ）_１連結子（ｌｉｎｋｅｒ）で融合して、ＲＧＤ１０ペプチドは（Ｇ_４Ｓ）_１連結子（ｌｉｎｋｅｒ）で融合することが好ましいが、これに制限されない。

本発明において、小分子薬物は、約１０００ダルトン未満の分子量を有して疾病の治療剤として活性度を有する有機化合物、無機化合物または有機金属化合物を示すもので、本願で広範囲に使用される。本願で小分子薬物は、オリゴペプチドおよび約１０００ダルトン未満の分子量を有するその他のバイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。

本発明において、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、直径１〜１０００ｎｍ大きさを有する物質からなる粒子を意味し、前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む金属シェルで構成される金属／金属コアシェル複合体、金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む非金属シェルで構成される金属／非金属コアシェルまたは非金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む金属シェルで構成される非金属／金属コアシェル複合体であってもよい。一具体例によると、前記金属は、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、パラジウム、白金、磁性鉄およびその酸化物から選択されるものであってもよいが、これに限定せず、前記非金属は、シリカ、ポリスチレン、ラテックスおよびアクリレート系列の物質から選択されてもよいが、これに限定しない。

本発明において、リポソームは、自己自ら会合できる、水性内部区画を囲む一つ以上の脂質二重層膜で構成される。リポソームは、膜タイプおよびその大きさによって特定することができる。小さいユニラメラ小胞（ＳＵＶ）は単一膜を有して２０ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有することができる。大きいユニラメラ小胞（ＬＵＶ）は、５０ｎｍ以上の直径を有することができる。オリゴラメラ大きい小胞およびマルチラメラ大きい小胞は、多重、一般に同心円、膜層を有して直径が１００ｎｍ以上であってもよい。多くの非同心円膜を有するリポソーム、すなわちより大きい小胞内で含まれた多くの小さい小胞は、マルチ小胞性小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）という。

本発明において、「融合」とは、機能または構造が異なるか同じ二つの分子を一体化するもので、前記タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームに前記腫瘍浸透性ペプチドが結合できるいずれの物理、化学的または生物学的方法による融合であってもよい。前記融合は、好ましくは連結子ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）によって行われ、この連結子ペプチドは、本発明の抗体軽鎖可変領域、抗体、またはこれの切片の様々な位置で前記生体活性分子との融合を中継することができる。

また、本発明は、前記抗体、またはこれに融合されたペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、すい臓癌、膠芽腫、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、および頭頸部癌からなる群から選択されるものであってもよい。

前記組成物は、癌の予防または治療用薬学的組成物で製造されている場合、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。前記薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

前記癌の予防または治療用薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃腸からの分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。

前記癌の予防または治療用薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方されることができる。前記組成物の好ましい投与量は、成人基準で０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ範囲内である。用語「薬学的有効量」とは、癌を予防または治療するのに、または血管新生による疾患の予防または治療するのに十分な量を意味する。

前記組成物は、当該当業者が容易に実施できる方法に従って、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化することによって単位容量形態で製造されたり、または多用量容器内に取り込んで製造できる。この時、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳剤形態やエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。また、前記組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与されることができる。一方、前記組成物は、抗体また、抗原結合断片含むので、免疫リポソームで剤形化されることができる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法により製造されることができる。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングルリコル−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物として逆相蒸発法によって製造されることができる。例えば、抗体のＦａｂ’断片はジスルフィド−交換反応を介してリポソームに接合されることができる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加でリポソーム内に含まれることができる。

また、本発明は、前記抗体、またはこれに融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む、癌の診断用組成物を提供する。
本明細書で使用された用語「診断」とは、病態生理の存在または特徴を確認することを意味する。本発明での診断は、癌の発病の有無および経過を確認するものである。

前記完全型免疫グロブリン形態の抗体およびこれの切片は、映像を介して癌を診断するために分子映像用蛍光体と結合することができる。

前記分子映像用蛍光体は、蛍光を発生させるあらゆる物質をいい、赤色や近赤外線（ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ）の蛍光を発光することが好ましく、量子収得量（ｑｕａｎｔａｕｍ ｙｉｅｌｄ）が高い蛍光体がより好ましいが、これに限定されない。

前記分子映像用蛍光体は、前記完全型免疫グロブリン形態の抗体およびこれの切片に特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチドと結合できる蛍光体、蛍光タンパク質または、その他映像用物質が好ましいがこれに限定されない。

蛍光体は、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ＢＯＤＹＰＹ）、テトラメチルローダミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）またはこれらの誘導体が好ましいが、これに限定されない。

蛍光タンパク質は、Ｄｒｏｎｐａタンパク質、蛍光発色遺伝子（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光プロテイン（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲＦＰ）、近赤外線蛍光を示すシアニン蛍光体であるＣｙ５．５またはその他蛍光タンパク質が好ましいがこれに限定されない。

その他映像用物質は、酸化鉄、放射性同位元素などが好ましいが、これに限定されず、ＭＲ、ＰＥＴのような映像装備に応用されることができる。

また、本発明は、前記軽鎖可変領域またはこれを含む抗体またはこれの切片をコードするポリヌクレオチドを提供する。

前記「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、一本鎖または二本鎖形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびこれから転写されるＲＮＡ配列を包括して、特に言及しない限り天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。

前記ポリヌクレオチドは、前述した軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列だけでなく、その配列に相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。前記相補的な配列は完ぺきに相補的な配列だけでなく、実質的に相補的な配列も含む。これは当業界に公示された苛酷条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で、例えば、配列番号１〜３中いずれか一つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と混成化できる配列を意味する。

また、前記ポリヌクレオチドは変形されることができる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失または非保存的置換または保存的置換を含む。前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記ヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインメントして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインメントされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、最小９０％の相同性または最小９５％の相同性を示す配列であってもよい。

また、本発明の一様態は、前記生きている細胞の内部に浸透して細胞質に分布する完全型免疫グロブリン形態の抗体を利用して細胞質浸透を介して細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）腫瘍関連因子ＲＡＳに特異的結合および活性を阻害する完全型免疫グロブリン形態の抗体の製造方法を提供することができる。

前記一様態具体例において、活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳ特異的結合能を有している重鎖可変領域（ＶＨ）を利用した動物細胞の内部に浸透して細胞質に分布して細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳと特異的結合する完全型免疫グロブリン形態の抗体は下記のような方法で製造されることができる：
（１）活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳと特異的結合するヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれた核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｅｓ）をクローニングした重鎖発現ベクターを製造する工程；
（２）前記製造された重鎖発現ベクターと細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域を含む軽鎖発現ベクターをタンパク質発現用動物細胞に同時形質転換して生きている細胞の内部に浸透および細胞質分布して活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを特異的認知する完全型免疫グロブリン形態の抗体を発現する工程；および
（３）前記発現された活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを特異的認知する細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の抗体を精製、回収する工程。

本発明で使用する用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用できるベクターは、当業界でたびたび使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６Ｍ、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９等）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３等）またはウイルス（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０等）を操作して製作されることができる。

前記組換えベクターで本発明で提供する軽鎖可変領域、および軽鎖不変領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、プロモーターに作動的に連結されることができる。用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。従って、これによって前記調節配列は、前記他のヌクレオチド配列の転写および／または、解読を調節することができる。

前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されることができる。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公示された様々な方法を介して構築できる。

前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築されることができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターで、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。ベクターが、真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、ＣＭＶ複製原点およびＢＢＶ複製原点などを含むか、これに限定されない。また、ほ乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）またはほ乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

本発明のさらに他の様態は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供することができる。

宿主細胞は、当業界に公示されたいずれの宿主細胞も利用することができ、原核細胞では、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルス・サブチルスおよびバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンスおよび種々のシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあって、ベクターを真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株などが利用されることができる。

前記組換えベクターの宿主細胞内への挿入は、当業界に広く知られた挿入方法を使用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ_２方法または、電気穿孔方法などが使用でき、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を利用する場合、生産性は動物細胞などに比べて高い方であるが、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の問題によってインタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＩｇ形態の抗体生産には適さないが、ＦａｂおよびＦｖのような抗原結合断片の生産には使用されることができる。

前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を利用して、当業界に広く知られた方法により容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含まれた培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。

本発明で提供する完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の細胞質浸透能を有する抗体を利用して細胞内活性化されたＲＡＳを抑制する方法は、前記抗体が生きている細胞の内部に浸透して細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを特異的認知が可能な抗体によって達成され、これにより生きている細胞の内部細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを標的及びその活性を阻害することができる。
また、本発明で提供する前記抗体の軽鎖可変領域またはこれを含む抗体は、特別な外部タンパク質伝達システムなしに生きている細胞の内部にエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）およびエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）過程を介して浸透して細胞質に分布することができる。特に、本発明で提供する抗体の軽鎖可変領域は、様々なヒト重鎖可変領域（ＶＨ）との相互作用結合が容易でありかつ細胞質浸透を介して細胞質に残留可能な特性を有して、前記軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の単一クローン抗体は、細胞の内部浸透及び細胞質に分布して、細胞に非特異的細胞毒性を示さない。

本発明に係る抗体の重鎖可変領域、これを含む抗体は、既存の様々な腫瘍治療剤の主な薬物抵抗性関連因子であるＲＡＳ突然変異を選択的阻害が可能でかつ既存治療剤との並行治療を介して効果的な坑癌活性を期待することができる。本発明に係る細胞質浸透完全型免疫グロブリン形態の抗体を利用して、ヒト抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が有する抗原高特異性及び高親和度に影響を与えずに細胞の内部に浸透及び細胞質に残留する特性を付与できて、これにより現状の小分子薬物を利用した疾病治療に標的物質として分類されている細胞質内に存在しながら、タンパク質とタンパク質との間に広くて平たい表面を介して構造複合性相互作用をなしている腫瘍及び疾患関連因子に対する治療及び診断に高い効果を期待することができる。

細胞質浸透能だけ保有しているイムノグロブリン形態の抗体ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置き換えた細胞浸透及び細胞内分布するＧＴＰが結合されたＲａｓに特異的に結合する単一クローン抗体（抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ：ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ＆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を利用してＲａｓ突然変異細胞に対する特異的な細胞毒性を誘導する戦略に対する模式図。 細胞質浸透能だけ保有しているＣｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置換を介して抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ構築を説明した模式図。 ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄタンパク質に対してだけ特異的に高親和度を有するヒト化抗体の重鎖可変領域単一ドメインを得るためのライブラリー選別戦略を示した模式図。 前述されたＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的高親和度を得るための選別過程工程別ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ単独条件及びＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄとの競合条件での結合能をフローサイトメトリーで分析した資料。 マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインであるｍ３Ｄ８ ＶＬから、ヒト化抗体重鎖可変領域と安定した結合となるように改良した細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ３ ＶＬまでの改良過程に利用されたクローンを含む配列分析資料。 ｍ３Ｄ８ ＶＬとヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ０ ＶＬ、これの突然変異体ｈＴ２ ＶＬ、ｈＴ３ ＶＬのＷＡＭモデリングを利用したモデル構造を構造重なり（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｎｇ）方法を利用して比較した図。 軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透能を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果。 軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透メカニズムを検証するために、共焦点顕微鏡で観察した結果。 軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透メカニズムを検証するために、共焦点顕微鏡で観察した結果。 追加的にヒト抗体重鎖可変領域と最適化された結合を介して安定的ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のための可変領域間のインターフェース残基を分析した結果。 ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のために細胞浸透能がない軽鎖可変領域を細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域で置き換える方法に対する全般的な模式図。 細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域ｈＴ４ ＶＬで軽鎖可変領域が置き換えられたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質浸透能を検証するために、様々な細胞株で精製されたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ処理後、１〜２個の細胞に焦点を合わせて共焦点顕微鏡で観察した結果。 前記図９Ａの共焦点顕微鏡観察を介した細胞質浸透能検証実験で細胞浸透効率を確認するために、レンズ倍率を低くして多数の細胞に対する細胞質浸透能を確認した結果。 ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価してグラフで図式化したものである。 ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した写真を示したものである。 抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の精製後、還元性または非還元性の条件で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。 野生性ＫＲａｓ及びＫＲａｓ突然変異体ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓ Ｇ１３ＤのＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためのＥＬＩＳＡを行った結果。 ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用してＧＴＰが結合された形態のＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の親和度分析結果を示す。 抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の細胞質浸透能を確認するために共焦点顕微鏡で観察した結果。 ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３ ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ細胞株で抗−Ｒａｓで３、ＮＩＨ３Ｔ ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果。 ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ細胞株で非付着性細胞成長阻害を評価した結果。 抗−ＲａｓでＴ３ ＨＲａｓ ＲＴ４と細胞内活性化したＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果。 抗−ＲａｓでのＧ１２Ｖｓと細胞内ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果。 ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１細胞株でＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果。 ＨＣＴ１１６細胞株を異種移植したマウスでＲＧＤが融合された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の腫瘍成長抑制効果を確認した実験結果。 ＲＧＤが融合された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の非特異的副作用を確認するためにマウスの体重を測定したグラフ。 ＲＴ４の親和度を改良するためのヒト重鎖可変領域ライブラリー構築戦略を示した図面。 デザインされたライブラリーをＰＣＲ法を利用して構築及び制限酵素ＮｈｅＩ、ＡｐａＩ処理された重鎖単一鎖酵母表面発現ベクター（ｐＹＤＳ−Ｈ）相同接合方法を介して酵母細胞に形質転換する方法を示す模式図。 前述されたライブラリー選別過程を介してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を確認するため、各工程別ライブラリー発現酵母に対してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ及びＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄとの結合能をフローサイトメトリーで分析した資料。 前記３種のライブラリーを介して選別された個別クローン配列分析資料。 親和度が改良された抗−ＲＡＳ・ＧＴＰ ｉＭａｂは精製後、還元性または非還元性条件で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。 抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの重鎖可変領域を親和度が向上されたＲａｓ・ＧＴＰ特異的な重鎖可変領域に取り替えた後、細胞浸透能を有するか確認するために共焦点顕微鏡で観察した結果。 ＫＲａｓ Ｇ１２ＤのＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの親和度を測定するためのＥＬＩＳＡ実行結果。 前記ＥＬＩＳＡ基盤結合能分析を介して選定されたＲＴ１１を様々なＲａｓ突然変異に対してＧＴＰが結合されたＲａｓ高特異的結合能をＥＬＩＳＡを介して分析した。 ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用してＫＲａｓ Ｇ１２ＤにＧＴＰが結合形態に対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の親和度分析結果を示す。 最も高い濃度（１０００ｎＭ）のＧＴＰまたはＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに対するＲＴ１１の結合能をＳＰＲを利用して分析したｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ。 抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１が細胞内ＫＲａｓと結合する効果タンパク質（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるＲａｆとの結合を阻害できるのか競合的ＥＬＩＳＡを介して確認した結果。 親和度が向上された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの様々な腫瘍細胞に細胞浸透能を有するのか確認するために共焦点顕微鏡で観察した結果。 親和度が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質残留能を細胞膜非透過自己消光蛍光物質であるｃａｌｃｅｉｎ（ｓｉｇｍａ）を利用して共焦点顕微鏡で観察した結果。 様々なＲａｓ野生型及びＲａｓ突然変異細胞株で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果。 それぞれの細胞を偏光顕微鏡を介して細胞密度を確認した写真。 ＲＴ１１と細胞内活性化されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果。 ＲＴ１１と細胞内活性化されたＲＡＳとの結合の可否を免疫沈降法で確認した結果。 ＲＴ１１のＲａｓ・ＧＴＰと効果タンパク質との間の結合抑制の可否を免疫沈降法で確認した結果。 前記構築されたＲＧＤ１０ペプチドが融合された形態のＲＴ１１（ＲＧＤ１０−ＲＴ１１）のＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態の様々なＲａｓ突然変異に対する結合能を測定したＥＬＩＳＡ結果。 Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１細胞株でＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ１０−ＲＴ１１を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果。 ＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ１０−ＲＴ１１が細胞表面のｉｎｔｅｇｒｉｎ ανβ３に特異的に結合するのか確認した結果。 ＲＧＤ１０−ＲＴ１１と細胞内活性化されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。しかし、これらの実施例は例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されない。

実施例１．高多様性ヒトＶＨライブラリーを介したＧＴＰが結合されたＫＲａｓ特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）選別
図１は、細胞質浸透能だけ保有しているＩｇＧフォーマットｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置き換えた細胞浸透及び細胞内分布するＧＴＰが結合されたＲａｓに特異的に結合する単一クローン抗体（抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ：ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ＆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を利用して、Ｒａｓ突然変異細胞に対する特異的な細胞毒性を誘導する戦略に対する模式図である。
図２は、細胞質浸透能だけ保有している完全ＩｇＧフォーマットＣｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置換を介して抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ構築を説明した模式図である。
前記の項−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂに導入するためのＧＴＰが結合されたＫＲａｓ特異的に結合する安定したヒト化重鎖可変領域単一ドメイン（ＶＨ）抗体切片を選別するために以前の研究を介して構築された酵母発現ＶＨライブラリーを使用した（Ｂａｅｋ ａｎｄ Ｋｉｍ，２０１４）。

具体的に使用したライブラリーのＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）は、従来抗体で最も普遍的に使用されたＶ遺伝子であるＩＧＨＶ３−２３＊０４，Ｊ_Ｈ４を使用していて、ＣＤＲ３の長さは９個の残基を有するライブラリーを使用した。前記ライブラリーの構築および酵母表面発現方法は、すでに発表した論文で詳しく記述されている（Ｂａｅｋ ａｎｄ Ｋｉｍ，２０１４）。

実施例２．ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄタンパク質準備
ライブラリー選別および親和度分析のためのＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ抗原を準備するために、大腸菌で発現精製した過程は、すでに発表した論文で詳しく記述されている（Ｔａｎａｋａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

具体的には、野生性ＫＲａｓと突然変異頻度が高い順で三つの突然変異ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓ Ｇ１３ＤのＣＡＡＸモチーフを含む１番〜１８８番をコードするＤＮＡを大腸菌発現ベクターであるｐＧＥＸ−３Ｘベクターに制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを使用してクローニングした。この時、発現ベクターはＴ７プロモーター−ＧＳＴ−ＫＲａｓを有するようにデザインした。すべてのＫＲａｓ突然変異はｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ手法を利用して突然変異を誘導して、前記技術方法を使用して発現ベクターを構築して、ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＫＲａｓベクターを大腸菌に電気穿孔法を利用して形質転換して選択培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ培地で１００μｇ／ｍｌのアンピシリン抗生剤存在下に３７℃で６００ｎｍでの吸光度０．６まで培養後、タンパク質発現のために０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した後、３０℃で５時間をさらに培養した。以後、遠心分離機を利用して大腸菌を集めた後、超音波を利用して（ＳＯＮＩＣＳ）大腸菌を粉砕した。遠心分離機を使用して大腸菌粉砕物を除去した上澄み液のみを得てＧＳＴタグがあるタンパク質を特異的に精製するＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して精製した。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ樹脂を洗浄するために、洗浄バッファー（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ｐＨ７．４）（ＳＩＧＭＡ）で５０ｍｌ洗浄後、湧出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ還元されたｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）を利用してタンパク質を湧出した。湧出されたタンパク質は、透析法を利用して保存バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）でバッファーを変えた。精製されたタンパク質は、２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介して約９８％以上の純度を確認した。

以後、ＫＲａｓタンパク質にＧＴＰλＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＧＤＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）基質を結合させるために、ＫＲａｓと基質の分子比率を１：２０にして反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５ｍＭ ＥＤＴＡ）（ＳＩＧＭＡ）で３０℃で３０分反応させた後、反応を止めるために６０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した後−８０℃で保管する。

実施例３．ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的重鎖可変領域（ＶＨ）選別
図３は、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄタンパク質に対してだけ特異的に高親和度を有するヒト化抗体重鎖可変領域単一ドメインを得るためのライブラリー選別戦略を示した模式図である。

具体的には、実施例１４で精製したＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄをビオチン化させた後（ＥＺ−ＬＩＮＫ^ＴＭ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））酵母細胞表面に発現した重鎖可変領域ライブラリーと常温で１時間反応させた。ビオチン化されたＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄと反応した酵母細胞表面に重鎖可変領域ライブラリーをストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（ＥＺ−ＬＩＮＫ^ＴＭ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））と４℃で２０分間反応させた後、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用してＧＴＰが結合されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄに高親和度を有する重鎖可変領域を発現する酵母を浮遊化した（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）。選別されたライブラリーを発現する酵母を選択培地で培養およびＳＧ−ＣＡＡ＋ＵＲＡ（２０ｇ／Ｌ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ、６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、０．２ｍｇ／Ｌ Ｕｒａｃｉｌ）（ＳＩＧＭＡ）培地でタンパク質発現を誘導した後、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ単独またはＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄより１０倍高い濃度のビオチン化されずにＧＤＰと結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ抗原を競合的にライブラリーが発現した酵母と１時間常温で反応させた後、ＰＥが接合されたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＳＡ−ＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応して、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介して浮遊化を確認した。ＦＡＣＳ分析を介して次の選別条件選定以後、前記と同様の条件で浮遊化されたライブラリーを発現する酵母に抗原を結合させた後、ＦＡＣＳ ａｒｉａＩＩ機器を使用して浮遊化させた。１次ＭＡＣＳ、１次ＦＡＣＳ選別を介して浮遊化されたヒト化重鎖可変鎖ライブラリーは、細胞質浸透軽鎖単一鎖（ｈＴ４ ＶＬ）を分泌する酵母と酵母接合してＦａｂ形態で酵母表面に発現させた後、２次ＦＡＣＳ、３次ＦＡＣＳ選別過程を進めた。

具体的に重鎖可変領域（ＶＨ）ライブラリーと接合させる細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）を分泌する酵母を構築するために、軽鎖可変領域酵母分泌ベクターであるｐＹＤＳ−Ｋに細胞質浸透能があるｈＴ４ ＶＬをコードするＤＮＡを制限酵素ＮｈｅＩとＢｓｉＷＩを使用してクローニングしたｐＹＤＳ−Ｋ−ｈＴ４ ＶＬを電気穿孔法で接合αタイプ（ｍａｔｉｎｇ αｔｙｐｅ）の酵母接合菌株であるＹＶＨ１０菌株に形質転換して選択培地ＳＤ−ＣＡＡ＋Ｔｒｐ（２０ｇ／Ｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ、６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、０．４ｍｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）（ＳＩＧＭＡ）で選別培養した酵母と酵母接合した。

具体的に酵母接合の場合、６００ｎｍで吸光度が１である時、１Ｘ１０^７の酵母がある。培養された酵母中ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに選別された重鎖可変領域ライブラリーが発現した酵母とｈＴ４ ＶＬを含んでいる酵母をそれぞれ１．５Ｘ１０^７ずつ混ぜて、ＹＰＤ（２０ｇ／Ｌ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ、２０ｇ／Ｌ ｐｅｐｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１４．７ｇ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、４．２９ｇ／Ｌ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ、ｐＨ４．５）（ＳＩＧＭＡ）で３回洗浄後、ＹＰＤ １００μｌで再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）して、ＹＰＤプレート上に広がらないようにドロップした後、乾燥して６時間３０℃で培養する。以後、ＹＰＤ培地で乾燥された酵母塗抹部位を３回洗浄後、最終酵母濃度１×１０^６以下になるべく選択培地ＳＤ−ＣＡＡ培地で３０℃、２４時間培養して接合された酵母だけ選別する。選別された酵母に対してＳＧ−ＣＡＡ培地でヒト化抗体Ｆａｂ断片発現を誘導してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ １００ｎＭ濃度でＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ １００倍競合して２、３次ＦＡＣＳを介して浮遊化した。

図４は、前述されたＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的高親和度を得るための選別過程工程別ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ単独条件およびＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄとの競合条件での結合能をフローサイトメトリーで分析した資料である。これにより、重鎖可変領域（ＶＨ）依存的にＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的結合が可能なライブラリー選別が可能であることを確認した。

前記のような高速選別を介して、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄタンパク質に高親和度および特異性を有するライブラリーで個別クローン分析を介して最終的にＲＴ４クローンが選別された。

実施例４．細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメイン開発論理
図５は、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂと命名した細胞浸透を介して、細胞質に位置する完全ＩｇＧ形態の単一クローン抗体の概念を示した模式図であり、これを具現するために、ヒト化抗体軽鎖可変領域の細胞質浸透能を理解するために、既存マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインｍ３Ｄ８ ＶＬの細胞質浸透性と軽鎖可変領域断片に属するＣＤＲの相関に対する研究を参照した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

図５Ａは、マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインであるｍ３Ｄ８ ＶＬから、ヒト化抗体重鎖可変領域と安定した結合となるように改良した細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ３ ＶＬまでの改良過程に利用されたクローンを含む配列分析資料である。

具体的には、マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインであるｍ３Ｄ８ ＶＬとこれをＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ技術を利用してヒト化させたｈＴ０ ＶＬの細胞質浸透性を比較を介して、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１配列が保存されるにも関わらず細胞質浸透能を失った特性を確認した。

そこで、ヒト化抗体軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透能を復元するために、ＣＤＲ１の構造をｍ３Ｄ８ ＶＬの構造と類似するように改良するために、軽鎖可変領域ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）でＣＤＲ構造決定部位（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ）を比較分析した。その結果、２番、４番残基が、マウス由来細胞質浸透能を有するｍ３Ｄ８ ＶＬと差があることを確認した。特に２番、４番残基は、Ｖｅｒｎｉｚｅｒ ｚｏｎｅでありながらＣＤＲ１構造に大きい影響を及ぼすＵｐｐｅｒ ｃｏｒｅ役割をしているので、ｈＴ０ ＶＬに復帰突然変異を介してｍ３Ｄ８ ＶＬと類似するＣＤＲ１構造を誘導したｈＴ２ ＶＬを開発した（図５Ａ参照）。

以後、安定したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のために、様々なヒト抗体重鎖可変領域と相補的に安定した結合をなして、細胞質浸透能を保存する軽鎖可変領域を開発しようと安定した抗体中高い割合を占めているＶＨ３とＶκ１小グループ間の対を模写するために、ＶＨ３とＶκ１小グループを有していながら非常に安定したヒト化治療用単一クローン抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の軽鎖可変領域ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）とｈＴ２ ＶＬのＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を比較分析して差がある１４個の残基をＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の軽鎖可変領域ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）配列で突然変異させて、ｈＴ３ ＶＬを開発した（図５Ａ参照）。

図５Ｂは、ｍ３Ｄ８ ＶＬとヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ０ ＶＬ、これの突然変異体ｈＴ２ ＶＬ、ｈＴ３ ＶＬのＷＡＭモデリングを利用したモデル構造を構造重なり（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｎｇ）方法を利用して比較した図である。前述内容のように、ｈＴ０ ＶＬの２番、４番残基復帰突然変異を介して、ｍ３Ｄ８ ＶＬとのＣＤＲ１地域構造的差が減ることを確認した。

実施例５．細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメイン発現および精製
前記実施例４でデザインされたｈＴ２ＶＬ、ｈＴ３ＶＬの実際の細胞質浸透能を比較するために、ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメインを精製した。

具体的には、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域単一ドメインＮ−末端にＰｈｏ ＡシグナルペプチドとＣ−末端にｐｒｏｔｅｉｎ Ａタグが含まれたｐＩｇ２０ベクターでＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素を利用してクローニングして、タンパク質発現用大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＥに電気穿孔法を利用して形質転換した。１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンが含まれたＬＢＡ培地で１８０ｒｐｍ、３７℃条件で吸光度６００ｎｍで０．６〜０．８まで培養した後、終濃度０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｈｙβ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒｏｎｏｓｉｄｅ）処理後２３℃で２０時間発現した。発現後高速遠心分離機を利用して８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄み液を取った後、ＩｇＧセファロース樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と反応させた。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）５０ｍｌを利用して樹脂洗浄をした後、５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、ｐＨ５．０バッファー５ｍｌに追加的洗浄した。以後、０．１Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ３．０バッファーで樹脂でタンパク質を湧出して、透析方法を利用してＴＢＳ、ｐＨ７．４でバッファーを取り替えて、ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｐｉｅｒｃｅ））分析方法を介してタンパク質濃度測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを介してタンパク質の純度を確認した。

実施例６．細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメインの細胞質浸透能と細胞浸透機序検証
図６Ａは、軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透能を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果である。

具体的には、ｍ３Ｄ８ ＶＬ、ｈＴ０ ＶＬ、ｈＴ２ ＶＬ、ｈＴ３ ＶＬの細胞質浸透能を検証するために、２４ウェルプレートにカバースリップを入れて各ウェル当たり５ｘ１０^４個のＨｅＬａ細胞株を１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）が含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ_２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにｍ３Ｄ８ ＶＬ、ｈＴ０ ＶＬ、ｈＴ２ ＶＬまたはｈＴ３ ＶＬを１０μＭ処理して３７℃、５％ＣＯ_２条件で６時間培養した。以後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去して、ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジド化ナトリウム、１％ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。再びＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するために、ＰＢＳに２％ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。軽鎖可変領域単一ドメインのＰｒｏｔｅｉｎ Ａタグを認知するＲａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を処理して２５℃で２時間染色して、ＰＢＳで３回洗浄後、赤色蛍光（ＴＲＩＴＣ）が連結された抗Ｒａｂｂｉｔ抗体（ｓｉｇｍａ）を処理して２５℃で１時間反応させた。最後にＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。ｈＴ０ ＶＬを除いたｍ３Ｄ８ ＶＬ、ｈＴ２ ＶＬ、ｈＴ３ ＶＬ共に細胞質浸透能を確認した。

図６Ｂは、軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透メカニズムを検証するために、共焦点顕微鏡で観察した結果である。

具体的には、図６ＡのようにＨｅＬａ細胞株を準備して細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにｍ３Ｄ８ ＶＬ、ｈＴ２ ＶＬまたはｈＴ３ ＶＬ １０μＭと緑色蛍光を帯びるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＴＦ、緑色蛍光）、ＦＩＴＣ−ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ（Ｃｔｘ−Ｂ、緑色蛍光）またはＯｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ−ｄｅｘｔｒａｎ（Ｄｅｘｔｒａｎ、緑色蛍光）１０ｕｇ／ｍｌで希釈して２時間３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、軽鎖可変領域単一ドメイン染色方法は図６Ａのとおりである。図６Ｂに示された通り、軽鎖可変領域単一ドメイン共にｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ−Ｂと重なることによって、Ｃａｖｅｏｌａｅによって細胞質浸透することを確認した。

実施例７．ヒト抗体重鎖可変領域と相互作用結合が容易な細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメイン開発
図７Ａは、ｈＴ３ ＶＬの様々なヒト抗体重鎖可変領域に対して適用可能の有無を確認するために既存のヒト抗体Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）とヒト化抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）とアミノ酸配列を分析した結果である。

具体的には、重鎖、鎖可変領域間の結合による関与するインターフェース（ＶＨ−ＶＬ ｎｔｅｒｆａｃｅ）残基を分析した結果、ＶＬドメインのＣＤＲ３に位置している８９番目リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、９１番目セリン（Ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）がヒト抗体で８９番目グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）、９１番目チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｙ）で一致することを確認した。

前記残基に対する改良戦略を構築するために、インターフェース（ＶＨ−ＶＬ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）残基重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲに対する影響をさらに具体的に分析した。
図７Ｂは、追加的にヒト抗体重鎖可変領域と最適化された結合を介して安定的ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のための可変領域間のインターフェース残基を分析した結果である。
具体的には、既存文献を介してヒト抗体可変領域間のインターフェース残基位置および反対側可変領域に位置した特定インターフェース残基と結合頻度、インターフェース残基のヒト抗体での使用頻度を資料を根拠に、ｈＴ３ ＶＬとＦＤＡに承認された治療用抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）の重鎖、軽鎖可変領域間のインターフェースを分析した（Ｖａｒｇａｓ−Ｍａｄｒａｚｏ ａｎｄ Ｐａｚ−Ｇａｒｃｉａ，２００３）。分析結果、ｈＴ３ ＶＬのマウス由来ＣＤＲで可変領域間の結合に関与するＣＤＲ３に含まれた８９番、９１番残基がヒト抗体使用頻度が高い地域であり、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３の構造に影響を与え得ることを確認した。この二つの残基をヒト抗体で使用頻度が高いアミノ酸で突然変異してヒト抗体重鎖可変領域と最適化された結合ができるｈＴ４ ＶＬを開発した。

下記の表１と２は、デザインされた細胞質浸透能を有するヒト抗体軽鎖可変領域配列を示す。表１は、ヒト抗体軽鎖可変領域全体配列をＫａｂａｔナンバリングに合うように示した表であり、表２は、前記表１の抗体配列でＣＤＲ配列だけ別に表記した内容である。

実施例８．細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）置換を介したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ開発および発現精製
図８は、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のために細胞浸透能がない軽鎖可変領域を細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域を置き換える方法に対する全般的な模式図である。

具体的には、完全型免疫グロブリン形態の単一クローン抗体形態で生産するための重鎖発現ベクターを構築するために、５’末端に分泌シグノルペプチドをコードするＤＮＡが融合した種々の抗体の重鎖可変領域（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ＶＨ、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ ＶＨ、ヒト化ｈＴ０ ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。また、軽鎖を発現するベクターを構築するために、５’末端に分泌シグノルペプチドをコードするＤＮＡが融合した細胞質浸透軽鎖可変領域（ｈＴ４ ＶＬ）またはモデル抗体の軽鎖可変領域（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ＶＬ、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ ＶＬ）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。

前記軽鎖、重鎖発現ベクターを一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を利用してタンパク質を発現および精製して収率を比較した。振とうフラスコで、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浮遊成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプラスミドおよびポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物でトランスフェクションした。振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２００ｍＬトランスフェクション時、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２．０×１０^６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種して、１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ_２で培養した。それぞれの単一クローン抗体を生産するために、適する重鎖と軽鎖プラスミドを１０ｍｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇの計２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈して、ＰＥＩ ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合して室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を先の１００ｍｌで播種した細胞に入れて４時間１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ_２で培養後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地を追加して６日間培養した。標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上澄み液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に抗体を適用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン緩衝液を利用してｐＨ３．０で抗体を溶離したた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を利用してサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画は、透析方法を介してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液を取り替えて濃縮を進めた。精製されたタンパク質は、２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。

下記の表３は、精製されたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂおよび単一クローン抗体の培養体積１リッター当り生産されるタンパク質の収率を示す。３回行って得られた結果を統計処理して、±は標準偏差値を示す。得られたタンパク質の収率は、ヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と相互作用結合し易くするために改良されたｈＴ４ ＶＬを含んだｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの場合、野生型単一クローン抗体と大差はなかった。

これを介して、インターフェース残基を追加的に改良したヒト化軽鎖可変領域（ｈＴ４ ＶＬ）が、ヒト化抗体重鎖可変領域と最適化された結合を介して安定した発現および精製が可能であることを確認した。

実施例９．Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞毒性評価
図９Ａは、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域ｈＴ４ ＶＬで軽鎖可変領域が置き換えられたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質浸透能を検証するために、様々な細胞株で１〜２個の細胞に焦点を合わせて共焦点顕微鏡で観察した結果である。

具体的には、２４ウェルプレートに各ウェル当たり５ｘ１０^４個のＨｅＬａ、ＰＡＮＣ−１、ＨＴ２９、ＭＣＦ−７細胞を１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ_２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにＴＭａｂ４、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、ＨｕＴ４、ＡｖａＴ４ １μＭで希釈して６時間３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去した。ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。以後、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジド化ナトリウム、１％ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。再びＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するためにＰＢＳに２％ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。次に、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が結合されているヒトＦｃを特異的に認知する抗体（Ｓｉｇｍａ）で２５℃で１．５時間染色して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。細胞外部分泌タンパク質を標的するＩｇＧ形態の単一クローン抗体ＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂとは異なってＴＭａｂ４、ＨｕＴ４とＡｖａＴ４は、細胞の内部で緑色蛍光が観察された。

図９Ｂは、前記図９Ａの共焦点顕微鏡観察を介した細胞質浸透能検証実験で細胞浸透効率を確認するために、レンズ倍率を低くして多数の細胞に対する細胞質浸透能を確認した結果である。
細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域が導入されたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの場合、すべての細胞で細胞質浸透を介して細胞質に分布することを確認した。

実施例１０．Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞毒性評価
前記実施例９で細胞質浸透能を有しているｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂがＩｎ ｖｉｔｒｏ上で、細胞毒性を有するかを確認するために、ＨｅＬａ、ＰＡＮＣ−１細胞株にＴＭａｂ４、ＨｕＴ４、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＡｖａＴ４、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をＭＴＴ ａｓｓａｙ（ｓｉｇｍａ）を介して確認した。

具体的には、９６ウェルプレートにウェル当たり１ｘ１０^４個の細胞（ＨｅＬａ、ＰＡＮＣ−１）をそれぞれ１０％ＦＢＳが含まれた培地０．１ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、１μＭのＴＭａｂ４、ＨｕＴ４、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＡｖａＴ４、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂを２０時間または４４時間処理した後、ＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）２０ｕｌを添加して、さらに４時間培養した。形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を２００ｕｌのＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）で溶解させて、吸光度計で５９５ｎｍで吸光度を測定することによって細胞生存率を求めた。

図１０Ａは、ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価してグラフで図式化したものである。図１０Ｂは、ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した写真を示したものである。図１０Ａ、および図１０Ｂに示されたとおり、すべての抗体が細胞毒性を示さないことを確認した。

実施例１１．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ発現、精製及びＫＲａｓ突然変異との親和度分析
細胞浸透及び細胞質に位置する特性を有するｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）を前記実施例３で選別されたＲＴ４ ＶＨで置き換えて細胞浸透を介して細胞内ＧＴＰが結合されたＲａｓを特異的に標的が可能な抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ構築及び動物細胞で発現した。

具体的には、完全型免疫グロブリン形態の単一クローン抗体形態で生産するための重鎖発現ベクターを構築するために、５’末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合されたＲＴ１１重鎖可変領域（ＲＴ１１ ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。また、軽鎖を発現するベクターを構築するために、５’末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合された細胞質浸透軽鎖可変領域（ｈＴ４ ＶＬ）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。

前記軽鎖、重鎖発現ベクターを一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を利用して、タンパク質を発現及び精製して収率を比較した。振とうフラスコで、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浮遊成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプラスミド及びポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物でトランスフェクションした。振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２００ｍＬトランスフェクション時、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２．０×１０^６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種して、１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ_２で培養した。それぞれの単一クローン抗体を生産するために、適した重鎖と軽鎖プラスミドを１０ｍｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇの計２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈して、ＰＥＩ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合して室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を先に１００ｍｌで播種した細胞に入れて４時間１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ_２で培養後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地を追加して６日間培養した。標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上澄み液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に抗体を適用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン緩衝液を利用してｐＨ３．０で抗体を溶離した後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を利用してサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画は、透析方法を介してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液を取り替えて濃縮を進めた。精製されたタンパク質は、２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。
図１１は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の精製後、還元性または非還元性条件で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。

具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認して、還元性条件で重鎖５０ｋＤａの分子量および軽鎖２５ｋＤａの分子量が示された。これは、発現精製された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂが、非共有結合を除去した溶液状態で単一体で存在して、非自然的ジスルフィド結合を介して二重体またはオリゴマーを形成しないことを示している。

図１２は、野生性ＫＲａｓおよびＫＲａｓ突然変異体ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓ Ｇ１３ＤのＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためのＥＬＩＳＡを行った結果である。

具体的に標的分子ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ突然変異とＧＤＰが結合されたＫＲａｓ突然変異を９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間３回洗浄した。４％ＴＢＳＢ（４％ＢＳＡ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した。以後、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４（およびＲａｓ結合能がなく細胞質浸透能だけあるｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ ＴＭａｂ４）を４％ＴＢＳＢで希釈して１００ｎＭ濃度に結合させた後、０．１％ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。標識抗体でヤギ由来ＡＰが接合された抗−ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）で結合させる。ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）（ＳＩＧＭＡ）で反応させて４０５ｎｍ吸光度を定量した。

抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４のＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに対する結合力をさらに定量的に分析するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用した。

具体的には、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４を１０ｍＭ Ｎａ−アセテート緩衝液（ｐＨ４．０）に希釈してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１１００ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）固定化した。Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析して、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄを１０００ｎＭで６２．５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（１０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎの流速で１．５分間流して行われた。結合３分、解離３分で得られた各センソグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）および削減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。

図１３は、ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用してＫＲＡＳ Ｇ１２ＤにＧＴＰが結合形態に対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の親和度分析結果を示す。

実施例１２．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の細胞質浸透性確認
図１４は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の細胞質浸透能を確認するために、共焦点顕微鏡で観察した結果である。ＫＲａｓ突然変異を有する細胞株（ＰＡＮＣ−１、ＨＣＴ１１６）とＫＲａｓ野生型を種々の細胞株を（ＨＴ２９、ＨｅＬａ）で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の細胞浸透能を観察した。

具体的には、それぞれの細胞株を２４ウェルプレートに各ウェル当たり５ｘ１０^４個で１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ_２、３７℃の条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにＴＭａｂ４、ＲＴ４を１μＭで希釈して６時間３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去した。ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。以後、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジド化ナトリウム、１％ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。再びＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するためにＰＢＳに２％ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。次に、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が結合されているヒトＦｃを特異的に認知する抗体（Ｓｉｇｍａ）で２５℃で１．５時間染色して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂが、細胞内蛍光が観察されることから、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂでＧＴＰと結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域と置き換えた以後にも、細胞質浸透性を失わないことを確認した。

実施例１３．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の細胞毒性評価
（１）抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの付着性細胞成長抑制評価
図１５は、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３ ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ細胞株で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果である。

具体的には、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂがＩｎ ｖｉｔｒｏ上で、ＫＲａｓ突然変異依存的細胞株に特異的な毒性を有するのか確認するために、野生性ＫＲａｓであるマウス繊維細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３とＲａｓ突然変異を人為的に過発現させたＮＩＨ３Ｔ３ ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異細胞株、そしてＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ突然変異ヒトすい臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１にＴＭａｂ４、ＲＴ４ １μＭをそれぞれ処理して付着性細胞成長阻害程度を評価した。

具体的には、２４ウェルプレートにウェル当たり２ｘ１０^３個の細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＡＮＣ−１をそれぞれ１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、１μＭのＴＭａｂ４、ＲＴ４を７２時間ずつ２回処理して計１４４時間観察した後、生きている細胞の個数を計数して細胞の成長程度を比較した。

図１５に示された通り、ＴＭａｂ４では毒性を示さない反面、ＲＴ４はＫＲａｓ突然変異細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３ ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ）だけで細胞成長を抑制して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株では毒性を示さなかった。また、ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ突然変異であるＰＡＮＣ−１細胞株で細胞成長阻害を確認した結果として、ＴＭａｂ４は毒性がない反面、ＲＴ４は細胞成長抑制を示した。

（２）抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の非付着性細胞成長抑制評価
図１６は、ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ細胞株で非付着性細胞成長阻害を評価した結果である。

具体的には、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂがＫＲａｓ突然変異細胞株で非付着性細胞成長阻害を引き起こすのか確認するために、ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異細胞株でコロニー形成能を測定（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）をした。具体的に、まず２ｘ ＤＭＥＭ培地と０．５ｍｌと１％アガロース溶液０．５ｍｌを混ぜて１２ウェルプレートにプルーティングして０．５％アガロースゲルで固めた。以後２ｘ ＤＭＥＭ培地０．４ｍｌ、０．７％ａｇａｒｏｓｅ０．５ｍｌ、ＮＩＨ３Ｔ３ ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ細胞株１ｘ１０^３個０．０５ｍｌをＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＲＴ４、Ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ（２０μＭ）０．０５ｍｌと混ぜて０．５％アガロースゲル上にプレーティングして固めた。その後、３日間隔で計２１日間、１ｘ ＤＭＥＭ培地０．５ｍｌにＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＲＴ４、Ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ１μＭで０．３５％アガロースゲル上に処理した。２１日にＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ−ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）溶液で細胞を染色した後、コロニー数を計数した。

前記付着性細胞成長阻害実験結果と同様に、ＲＴ４はコロニー形成が抑制した反面、ＴＭａｂ４ではコロニー形成抑制を示さなかった。
前記結果から、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４は、細胞質にあるＲａｓ突然変異に特異的に結合して付着性および非付着性細胞成長を抑制することを確認した。

実施例１４．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の細胞内ＧＴＰが結合されたＫＲａｓと特異的結合確認
図１７は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４と細胞内活性化したＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果である。図１８は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂと細胞内ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果である。

具体的には、２４ウェルプレートにｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ｓｉｇｍａ）をコーティングした後、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖが発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株をそれぞれウェル当たり２ｘ１０^４個を０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した後、ＴＭａｂ４、ＲＴ４ ２μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。以後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去した。ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。以後、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジド化ナトリウム、１％ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。再びＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するためにＰＢＳに２％ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。次に、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が結合されているヒトＦｃを特異的に認知する抗体（Ｓｉｇｍａ）で２５℃で１．５時間染色して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。

図１７と１８に示されたとおり、赤色蛍光の活性化されたＲａｓが位置する細胞内膜の部分に緑色蛍光のＲＴ４が重なった反面、ＴＭａｂは重ならなかった。
前記実験結果により、細胞内のＧＴＰが結合されたＲａｓと抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４が特異的に結合することを確認した。

実施例１５．ＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の細胞毒性評価
Ｉｎ ｖｉｖｏ実験のためには、腫瘍組織特異性を与える必要がある。既存ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの場合、細胞表面にＨＳＰＧと結合して、その他のいかなる腫瘍組織特異性を有しないため、ｉｎ ｖｉｖｏ実験で腫瘍に対する特異的生長阻害ができない可能性が高い。これを改善するために、新生血管細胞および様々な腫瘍で過発現されるインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ３）に特異性を有するＲＧＤ４Ｃペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、配列番号４１）を軽鎖Ｎ−末端にＧＧＧＧＳ１個のリンカーを使用して遺伝工学的に融合した。ＲＧＤ４Ｃペプチドの場合、既存ＲＧＤペプチドよりも高い親和度を有していて、遺伝工学的融合が可能で、Ｎ−末端に融合時にもＲＧＤペプチドの特定構造を維持できる特徴がある（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

図１９は、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１細胞株でＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果である。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上で、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４自体が細胞毒性を有するのか確認するために、ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ突然変異を有しているヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６とＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ突然変異を有しているヒトすい臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１にＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４をそれぞれ処理して細胞成長阻害程度を評価した。

具体的には、２４ウェルプレートにウェル当たり５ｘ１０^３個の細胞ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１をそれぞれ１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、１μＭのＲＧＤ−ＴＭａｂ４、ＲＧＤ−ＲＴ４を７２時間ずつ２回処理して計１４４時間観察した後、生きている細胞の個数を計数して細胞の成長程度を比較した。

図１９に示されたとおり、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４は、ＨＣＴ１１６とＰＡＮＣ−１細胞株でそれぞれ約２０％、１５％ＲＧＤ−ＲＴ４はそれぞれ約４０％、５０％程度細胞成長を抑制した。既存研究でＲＧＤ４Ｃペプチドの場合、インテグリンαｖβ５に対してインテグリンαｖβ３と比較した時、約３倍程度親和度が低いが、インテグリンαｖβ３は、主に新生血管細胞に過発現して、インテグリンαｖβ５は、種々の腫瘍細胞で発現して、ＲＧＤ４Ｃペプチドは、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１細胞株のαｖβ５と結合して細胞付着を阻害する活性を示す（Ｃａｏ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

これにより、ＲＧＤ４Ｃペプチドが融合したＴＭａｂ４の場合、細胞毒性を示すとは確認し難い。追加的にＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４を比較した時、ＲＧＤペプチドが結合されていても、Ｒａｓ特異的細胞成長を抑制する可能性があることを間接的に確認した。

実施例１６．ＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの腫瘍成長阻害確認
図２０Ａは、ＨＣＴ１１６細胞株を異種移植したマウスでＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の腫瘍成長抑制効果を確認した実験結果である。図２０Ｂは、ＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の非特異的副作用を確認するためにマウスの体重を測定したグラフである。

具体的には、前記実施例１５のＩｎ ｖｉｔｒｏ結果を基に、Ｉｎ ｖｉｖｏ上でＲＧＤ−ＲＴ４の腫瘍成長阻害を確認するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６をマウス当たり５ｘ１０^６個の細胞を皮下注射で注入させて、約６日後腫瘍の体積が約５０ｍｍ^３程度になった時、それぞれＰＢＳ、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４、ＲＧＤ−ＲＴ４を２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。２日間隔で計９回静脈注射して、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を利用して１８日間腫瘍体積を測定した。

図２０Ａに示されたとおり、対照群であるＰＢＳに比べてＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４は、癌細胞の成長を抑制して、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４よりＲＧＤ−ＲＴ４の方がより効果的に腫瘍成長を抑制することを確認した。また、図２０Ｂに示されたとおり、ＲＧＤ−ＲＴ４実験群マウスの体重の変化がないことを確認して、これにより、他の毒性はないことを確認した。

実施例１７．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の親和度改良のためのライブラリー構築及び選別
抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ４の場合、Ｒａｓ特異的生物学的活性を示すが、ＳＰＲ分析を介して得た親和度が約１１０ｎＭ水準でＩｇＧフォーマット抗体であるにもかかわらず抗原に対する親和度が非常に低い。これを克服して低い濃度でも生物学的活性を向上させるために親和度改良が必要である。

図２１Ａは、ＲＴ４の親和度を改良するためのヒト重鎖可変領域ライブラリー構築戦略を示した図面である。親和度を改良するために、抗原結合に重要な役割をするＣＤＲ３（９５番〜１００ａ番）の長さを６個（ライブラリー６）、７個（ライブラリー７）、９個（ライブラリー９）と多様に付与して、すべてのアミノ酸をコードできる縮重コドン（ＮＮＫ）を使用した。また、親和度改良及びＲＴ４の抗原結合部位を保存するために、溶媒接近性が容易なＣＤＲ１（３１番〜３３番残基）とＣＤＲ２（５０番、５２番〜５６番残基）に対しては、既存ＲＴ４配列を５０％確率で保存できるｓｐｉｋｅｄオリゴマーを使用した。これは、それぞれ残基に対するアミノ酸をコードする３個のヌクレオチドでそれぞれ野生型ヌクレオチドを７９％維持して残りのヌクレオチド比率を７％でプライマーをデザインすることによってＰＣＲ過程で野生型アミノ酸が５０％が維持されるようにする技術である。

図２１Ｂは、デザインされたライブラリーをＰＣＲ法を利用して構築及び制限酵素ＮｈｅＩ、ＡｐａＩ処理された重鎖単一鎖酵母表面発現ベクター（ｐＹＤＳ−Ｈ）相同接合方法を介して酵母細胞に形質転換する方法を示す模式図である。
具体的に、デザインされたライブラリーコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法を利用して増幅後、エタノール沈殿法を使用して濃縮した。相同性接合（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のためのｐＹＤＳ−Ｈ重鎖単一鎖酵母表面発現ベクターは、ＮｈｅＩとＡｐａＩ制限酵素を処理して、及びアガロースゲル抽出法を利用して精製及びエタノール沈殿法を利用して濃縮した。それぞれライブラリーコードＤＮＡ１２μｇに対して制限酵素処理された５μｇベクターを酵母表面発現用接合Ａタイプ（Ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ Ａ）酵母ＪＡＲ２００に電気穿孔法で形質転換して（Ｂａｅｋ Ｄ．Ｓ ａｎｄ Ｋｉｍ Ｙ．Ｓ，２０１４；Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、階段式希薄（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を介して選択培地ＳＤ−ＣＡＡ＋ＵＲＡ（２０ｇ／Ｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ、６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ_４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／Ｌ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、０．２ｍｇ／Ｌ Ｕｒａｃｉｌ）で育ったコロニーの数を測定してライブラリーの大きさを確認した。

それぞれのライブラリー選別方法は、実施例３及び図４と同様の方法で重鎖可変領域単独発現酵母ライブラリーを利用してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに対して１００ｎＭの抗原濃度で１次ＭＡＣＳ以後、酵母接合を介してＦａｂ形態ライブラリーに対して１、２、３次ＦＡＣＳ選別時にはビオチン化されなかったＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄと競合結合を介してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ特異的クローンを選別した。

図２２は、前述されたライブラリー選別過程を介してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を確認するため、代表的にブラリー６（ＣＤＲ３長さが６個残基からなるライブラリー）の各工程別ライブラリー発現酵母に対してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ及びＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄとの結合能をフローサイトメトリーで分析した資料である。これにより選別されたライブラリーは、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的に結合して、鋳型として使用したＲＴ４より高い結合能を確認した。

図２３は、前記３種のライブラリーを介して選別された個別クローン配列分析資料であり、ライブラリーを介して突然変異を誘導したＣＤＲ領域の残基だけ突然変異になることを確認した。
下記の表４はＲＴ４を含みＲＴ４を鋳型にした親和度改良ライブラリーから選別された個別クローンのヒト抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）配列であり、下記の表５は前記選別されたＲａｓ・ＧＴＰ特異的重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、２及び３の配列である。

実施例１８．親和度改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの発現及び精製
前記実施例１１のようにライブラリー選別を介して、Ｒａｓ・ＧＴＰに向上した親和度を有する重鎖可変領域と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれた重鎖を動物発現ベクターにクローニングして、細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクターとＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂを発現して、前記実施例１１と同様に精製した。
図２４は、親和度が改良された抗−ＲＡＳ・ＧＴＰ ｉＭａｂは精製後、還元性または非還元性条件で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。

具体的には、実施例１１のように非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認して、還元性条件で重鎖５０ｋＤａの分子量及び軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは発現精製された抗−ＲＡＳ・ＧＴＰ ｉＭａｂが溶液状態で単一体で存在して、非自然的ジスルフィド結合を介して二重体またはオリゴマーを形成しないことを確認した。

実施例１９．親和度改良された抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞浸透能確認
図２５は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの重鎖可変領域を親和度が向上されたＲａｓ・ＧＴＰ特異的な重鎖可変領域に取り替えた後、細胞浸透能を有するか確認するために共焦点顕微鏡で観察した結果である。

具体的には、ＨｅＬａ細胞株を２４ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０^４個で１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ_２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにＴＭａｂ４、ＲＴ１１、ＲＴ１３、ＲＴ１４、ＲＴ１５、ＲＴ１６、そしてＲＴ１７をそれぞれ１：１７に希釈して６時間３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後の過程は、前記実施例１４のＲＴ４染色過程と同様に進めた。親和度向上された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１、ＲＴ１３、ＲＴ１４、ＲＴ１５、ＲＴ１６そしてＲＴ１７の細胞内蛍光が観察できることから、細胞浸透能を有することを確認した。

実施例２０．親和度改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＧＴＰが結合されたＲａｓ特異的結合能分析
図２６Ａは、ＫＲａｓ Ｇ１２ＤのＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの親和度を測定するためのＥＬＩＳＡ実行結果である。

具体的に、前記実施例１１と同様の方法で標的分子ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２ＤとＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間３回洗浄する。４％ＴＢＳＢ（４％ＢＳＡ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。以後、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂを４％ＴＢＳＢで希釈して濃度別に結合させた後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。標識抗体でヤギ由来ＨＲＰが接合された抗−ヒト抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）に結合させる。Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質混濁液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して反応させた後、４５０ｎｍ吸光度を定量した。

図２６Ａに示されたとおり、親和度改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの中からＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに特異的に高い親和度を示すクローンとしてＲＴ１１を選定した。
図２６Ｂは、前記ＥＬＩＳＡ基盤結合能分析を介して選定されたＲＴ１１を様々なＲａｓ突然変異に対してＧＴＰが結合されたＲａｓ高特異的結合能をＥＬＩＳＡを介して分析した。

具体的に、前記親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ結合能分析に使用した同様のＥＬＩＳＡ法を使用してＧＴＰまたはＧＤＰが結合された野生型ＫＲａｓ、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ、野生型ＨＲａｓ、ＨＲａｓ Ｇ１２Ｖに対する結合能を確認した。
図２６Ｂにしめされたとおり、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１は様々な突然変異Ｒａｓに対してＧＴＰが結合された形態だけで結合することを確認した。

実施例２１．ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１結合能定量分析
抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１のＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに対する定量的結合能を分析するため、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用した。
図２７Ａは、ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用してＫＲａｓ Ｇ１２ＤにＧＴＰが結合形態に対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の親和度分析結果を示す。
図２７Ｂは、最も高い濃度（１０００ｎＭ）のＧＴＰまたはＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに対するＲＴ１１の結合能をＳＰＲを利用して分析したｓｅｎｓｏｒｇｒａｍである。

具体的には、前記実施例１１と同様の方法で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１１００ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）固定化した。Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）を３００ｍＭ Ｔｒ流速で分析して、ＧＴＰまたはＧＤＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄを１０００ｎＭで６２．５ｎＭの濃度で分析した。
前記結果を介してＲＴ１１が高い親和度（１２．９ｎＭ）でＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｄに高特異的に結合することを確認した。

実施例２２．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１によるＧＴＰ結合ＫＲａｓとＲａｆ結合阻害能分析
図２８は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１が細胞内ＫＲａｓと結合する効果タンパク質（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるＲａｆとの結合を阻害できるのか競合的ＥＬＩＳＡを介して確認した結果である。

具体的には、効果タンパク質ｃＲａｆ（ＮＭ＿００２８８０．２）のＲａｓ結合部位（ＲＢＤ：１−１４９）断片を大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘに制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを使用してクローニングした後、前記実施例２と同様の方法で発現精製した。以後、精製されたｃＲａｆ−ＲＢＤを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプルート（ＣＯＳＴＡＲ Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間３回洗浄する。４％ＴＢＳＢ（４％ＢＳＡ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。以後、１μＭビオチン化されたＧＴＰ結合ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄと１μＭ〜５．６４ｐＭまでの様々な濃度の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１を４％ＴＢＳＢで希釈して濃度別に結合させた後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。標識抗体でヤギ由来ＡＰが接合された抗‐ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）に結合させる。ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）（ＳＩＧＭＡ）で反応させて４０５ｎｍ吸光度を定量した。
図２８に示されたとおり抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１は、効果タンパク質ｃＲａｆとの結合阻害能（ＩＣ５０＝３５ｎＭ）を示すことを確認した。

実施例２３．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の多様な腫瘍細胞浸透能確認
図２９は、親和度が向上された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの様々な腫瘍細胞に細胞浸透能を有するのか確認するために共焦点顕微鏡で観察した結果である。

多様な腫瘍細胞株としては、ヒト大腸癌細胞株であるＳＷ４８０（ＫＲａｓＧ１２Ｖ突然変異）、ＰＡＮＣ−１（ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ突然変異）、ＤＬＤ−１（ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ突然変異）、ＨＣＴ１１６（ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ突然変異）とヒト繊維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０（ＮＲａｓ Ｑ６１Ｌ突然変異）をＲａｓ突然変異細胞株で使用し、Ｒａｓ野生型細胞株としてヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ７、ヒト大腸癌細胞株であるＨＴ２９、ＣａＣｏ２、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞株を使用した。
具体的には、上述の多様なＲａｓ突然変異及びＲａｓ野生型細胞株を２４ウェルプレートに各ウェル当たり５ｘ１０^４個で１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ_２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにＴＭａｂ４、ＲＴ１１をそれぞれ２μＭで希釈して１２時間３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後の過程は、前記実施例１４のＲＴ４染色過程と同様に行われた。親和度向上された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１は、多様な腫瘍細胞内蛍光が観察できることから、ＴＭａｂ４と同様に多様な腫瘍細胞株に細胞浸透能を有することを確認した。

実施例２４．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の細胞質残留能確認
図３０は、親和度が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質残留能を細胞膜非透過自己消光蛍光物質であるｃａｌｃｅｉｎ（ｓｉｇｍａ）を利用して共焦点顕微鏡で観察した結果である。

具体的には、ＨＣＴ１１６細胞株を２４ウェルプレートにウェル当たり５ｘ１０^４個で１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、１μＭのＴＭａｂ４とＲＴ４を４時間処理した後、Ｃａｌｃｅｉｎ １００μＭと共に２時間さらに処理した。以後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．５）で細胞表面に付いたｃａｌｃｅｉｎを除去した。ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。以後、ＰＢＳで洗浄して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。図３０に示されたとおおり、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１とｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂであるＴＭａｂ４二つとも、細胞質全体にｃａｌｃｅｉｎ蛍光が観察できることを確認した。一方、ＰＢＳでは小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）状の蛍光だけ観察された。前記結果により、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１が細胞質に残留することを確認した。

実施例２５．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の細胞毒性評価
図３１は、様々なＲａｓ野生型及びＲａｓ突然変異細胞株で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果であり、図３２は、それぞれの細胞を偏光顕微鏡を介して細胞密度を確認した写真である。

具体的には、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１がＩｎ ｖｉｔｒｏ上で、Ｒａｓ突然変異依存的細胞株に特異的な毒性を有するのか確認するために、Ｒａｓ野生型細胞株でマウス繊維細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３とヒト大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＤＭを利用して、マウスＮＩＨ３Ｔ３ ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異細胞株、ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６（ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ）、ＳＷ４８０（ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ）、ＤＬＤ−１（ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ）、ヒトすい臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１（ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ）を利用して、細胞成長阻害程度を評価した。

具体的には、前記細胞株を２４ウェルプレートにウェル当たり２〜５ｘ１０^３個で１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、各ウェルをＴＭａｂ４及びＲＴ１１で各々７２時間ずつ２回処理して計１４４時間観察した後、生きている細胞の個数を計数して細胞の成長程度を比較した。

図３１、３２に示された通り、ＴＭａｂ４では毒性を示さない反面、ＲＴ１１はＲａｓ突然変異細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３ ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１）でだけ細胞成長を抑制して、Ｒａｓ野生型細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ）では毒性を示さなかった。

実施例２６．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の細胞内の活性化されたＲＡＳと特異的結合及び効果タンパク質結合抑制陵確認
（１）抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の細胞内のＲａｓ・ＧＴＰと特異的結合確認
図３３は、ＲＴ１１と細胞内活性化されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果である。

具体的には、２４ウェルプレートにｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ｓｉｇｍａ）をコーティングした後、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖが発現されるＮＩＨ３Ｔ３細胞株をそれぞれウェル当たり２×１０^２個を０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した後、ＴＭａｂ４とＲＴ１１それぞれ２μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。以後、前記実施例１４と同様の条件で染色して共焦点顕微鏡で観察した。

図３３に示されたとおり、赤色蛍光の活性化されたＲＡＳが位置する細胞内膜の部分に緑色蛍光のＲＴ１１が重なった反面、ＴＭａｂは重ならなかった。
図３４は、ＲＴ１１と細胞内活性化されたＲＡＳとの結合の可否を免疫沈降法で確認した結果である。

具体的には、１００ｍｍ^３プレートにＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異が発現されるＮＩＨ３Ｔ３細胞株とＨＣＴ１１６細胞株をそれぞれウェル当たり２×１０^６個を１０ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した後、ＴＭａｂ４とＲＴ１１それぞれ２μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。以後、細胞溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）を利用して細胞を溶解させた後、細胞残骸物を沈殿させて除去する。以後、細胞溶解物にＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇアガロースを添加して２時間反応させた後、抗体を沈降させる。以後、抗ＫＲａｓ抗体（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）とＨｕｍａｎ Ｆｃ抗体（ｓｉｇｍａ）を利用してウェスタンブロットを行った。
図３４に示されたとおり、ＲＴ１１でだけＫＲａｓが観察された反面、ＴＭａｂ４とＰＢＳでは観察されなかった。
前記実験結果から細胞内の活性化されたＲＡＳとＲＴ１１が特異的に結合することを確認した。

（２）抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１のＲａｓ・ＧＴＰと効果タンパク質（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）間結合抑制確認
図３５Ａ及び図３５Ｂは、ＲＴ１１のＲａｓ・ＧＴＰと効果タンパク質との間の結合抑制の可否を免疫沈降法で確認した結果である。

具体的には、１００ｍｍ^３プレートにＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異が発現されるＮＩＨ３Ｔ３細胞株とＨＣＴ１１６細胞株をそれぞれウェル当たり２ｘ１０^６個を１０ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した後、ＴＭａｂ４とＲＴ１１それぞれ２μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。以後、細胞溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０％ＧＬＹＣＥＲＯＬ、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）を利用して細胞を溶解させた後、細胞残骸物を沈殿させて除去する。以後、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異細胞溶解物には抗ＨＡ抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を２時間反応させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ａｇａｒｏｓｅを利用して抗ＨＡ抗体を沈降させる。ＨＣＴ１１６細胞溶解物にはＲａｆ−１ ＲＢＤ ａｇａｒｏｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加して２時間反応させた後沈降させる。以後、抗Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＰＩ３Ｋ、ＫＲａｓ抗体（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）とＨｕｍａｎ Ｆｃ抗体（ｓｉｇｍａ）を利用してウェスタンブロットを行った。

図３５Ａに示されたとおり、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１でだけ効果タンパク質であるＢ−Ｒａｆ、Ｃ−ＲａｆとＲａｓ・ＧＴＰ間の結合が抑制されたことを確認した反面、ＴＭａｂ４では結合が抑制されないことを確認した。図３５Ｂにも同様に抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１でだけ効果タンパク質であるＣ−ＲａｆとＲａｓ・ＧＴＰ間の結合が抑制されたことを確認した反面、ＴＭａｂ４では結合が抑制されないことを確認した。
前記実験結果からＲＴ１１が細胞内のＲａｓ・ＧＴＰと特異的に結合して効果タンパク質であるＢ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆとの結合を抑制することを確認した。

実施例２７．ＲＧＤ１０ペプチドが融合された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１構築及びＲａｓ・ＧＴＰと結合能分析
前記実施例１５のように抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１は細胞表面のＨＳＰＧと結合を介して細胞質浸透が行われるため、ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために組織特異性を付与する必要があって、これのために新生血管細胞及び多様な腫瘍から過発現されるインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ３）に特異性を有するＲＧＤ１０ペプチド（ＤＧＡＲＹＣＲＧＤＣＦＤＧ、配列番号４２）を軽鎖Ｎ−末端にＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ計１０個の残基からなるリンカーを使用して遺伝工学的に融合した。ＲＧＤ１０ペプチドの場合、既存ＲＴ４と融合したＲＧＤ４Ｃペプチドと比較してインテグリンに対する親和度が類似して、ペプチド内のジスルフィド結合が１個であり、抗体Ｎ−末端に融合がＲＧＤ４Ｃより容易であると予想され抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１に遺伝工学的に融合した。

図３６は、前記構築されたＲＧＤ１０ペプチドが融合された形態のＲＴ１１（ＲＧＤ１０−ＲＴ１１）のＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態の様々なＲａｓ突然変異に対する結合能を測定したＥＬＩＳＡ結果である。

具体的に、前記実施例１１と同様の方法で標的分子ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ Ｇ１２ＤとＧＤＰが結合されたＲａｓを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間３回洗浄する。４％ＴＢＳＢ（４％ＢＳＡ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。以後、ｉＭａｂを４％ＴＢＳＢで希釈して１０ｎＭ濃度で結合させた後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。標識抗体でヤギ由来ＨＲＰが接合された抗‐ヒト抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）に結合させる。Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質混濁液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して反応させた後、４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図３６に示されたとおり、ＲＴ１１とＲＧＤ１０ペプチドが融合されたＲＧＤ１０−ＲＴ１１がＧＴＰが結合されたＲａｓ突然変異に対して同様の結合力を示すことを確認した。

実施例２８．ＲＧＤ１０が融合された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の細胞毒性評価
図３７及び図３８は、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１細胞株でＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ１０−ＲＴ１１を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果である。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上で、ＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ１１自体が細胞毒性を有するのか確認するために、Ｒａｓ野生型細胞株でヒト大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＤＭを利用して、ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６（ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ）、ＳＷ４８０（ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ）、ＤＬＤ−１（ＫＲａｓ Ｇ１３Ｄ）、ヒトすい臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１（ＫＲａｓ Ｇ１２Ｄ）を利用して細胞成長阻害程度を評価した。

具体的には、２４ウェルプレートにウェル当たり５×１０^３個の細胞をそれぞれ１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。以後、１μＭのＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４、ＲＧＤ１０−ＲＴ１１を７２時間ずつ二回処理して計１４４時間観察した後、生きている細胞の個数を計数して細胞の成長程度を比較した。

図３７に示されたとおり、ＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ１０−ＲＴ１１を比較した時、ＫＲａｓ突然変異細胞株（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１、ＰＡＮＣ−１）で８〜１２％程度の細胞成長差を示す反面、Ｒａｓ野生型細胞株では細胞成長差を示さなかった。従って、ＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ１０−ＲＴ１１を比較した時、ＲＧＤ１０ペプチドが結合されていても、Ｒａｓ特異的細胞成長を抑制する可能性があることを確認した。

実施例２９．ＲＧＤ１０が融合された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１のｉｎｔｅｇｒｉｎ ανβ３特異的結合確認
図３９は、ＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ１０−ＲＴ１１が細胞表面のｉｎｔｅｇｒｉｎ ανβ３に特異的に結合するのか確認した結果である。

具体的には、Ｋ５６２細胞株とＫ５６２ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ανβ３過発現細胞株２×１０^５個を１．５ｍｌに移した後、洗浄バッファー（ｐＨ７．４ ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で２回洗浄する。ＴＭａｂ４、ＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４、ＲＧＤ１０−ＲＴ１１ １００ｎＭとＨｅｐａｒｉｎ ３００ＩＵ／ｍｌ（ｓｉｇｍａ）を混ぜた後、４℃で１時間細胞と反応させる。洗浄バッファーで２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が結合されているヒトＩｇＧを特異的に認知する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４℃で１時間染色して洗浄バッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳを利用して分析した。
図３９に示されたとおり、ＴＭａｂ４とは異なってＲＧＤ１０−ＴＭＡｂ４、ＲＧＤ１０−ＲＴ１１はＫ５６２ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ανβ３細胞に特異的に結合することを確認した。これにより、ＲＧＤ１０ペプチドがｉｎｔｅｇｒｉｎ ανβ３に特異的に結合することを確認した。

実施例３０．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の細胞内のＲａｓ・ＧＴＰと特異的結合確認
図４０は、ＲＧＤ１０−ＲＴ１１と細胞内活性化されたＫＲａｓ Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果である。

具体的には、２４ウェルプレートにｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ｓｉｇｍａ）をコーティングした後、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）ＫＲａｓ Ｇ１２Ｖが発現されるＮＩＨ３Ｔ３細胞株をそれぞれウェル当たり２×１０^２個を０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した後、ＲＧＤ１０−ＴＭａｂ４とＲＧＤ１０−ＲＴ１１それぞれ１μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。以後、前記実施例１４と同様の条件で染色して共焦点顕微鏡で観察した。

図４０に示されたとおり、赤色蛍光の活性化されたＲＡＳが位置する細胞内膜の部分に緑色蛍光のＲＧＤ１０−ＲＴ１１が重なる一方、ＲＧＤ１０−ＴＭａｂは重ならなかった。前記実験結果から細胞内の活性化されたＲＡＳとＲＧＤ１０−ＲＴ１１が特異的に結合することを確認した。

Claims (8)

1. 細胞を透過しそして細胞質に位置する能力及び細胞質内で特異的に活性化ＲＡＳに結合する能力を有する完全型免疫グロブリンタイプの抗体であって、
   前記抗体は、細胞質内で特異的に活性化ＲＡＳに結合する重鎖可変領域（ＶＨ）、及び生細胞を透過し、細胞質に位置する能力を有する軽鎖可変領域を（ＶＬ）を含み、
   前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、
   配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
   配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
   配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
   配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
   配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
   配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
   配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；を含み、
   そして前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
   配列番号２９、３０、及び３１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、
   前記抗体。
2. 前記抗体は、生細胞に能動的に浸透して細胞質で活性化ＲＡＳに特異的に結合する請求項１に記載の抗体。
3. 前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、エンドサイトーシスを受け、そしてその後にエンドソームを脱出することによって、生細胞を透過しそして細胞質に位置する、請求項１に記載の抗体。
4. 前記重鎖可変領域は、配列番号１〜７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体。
5. 前記抗体が、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子及びリポソームからなる群から選択された生体活性分子に融合した、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
6. 前記ペプチドが、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含むＲＧＤ４Ｃ、又は配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含むＲＧＤ１０である、請求項５に記載の抗体。
7. 癌又は腫瘍の治療又は予防方法に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
8. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。