JP6785509B2 - ロイコノストック メセンテロイデスが産生する菌体外多糖を有効成分として含む代謝異常の予防または治療用組成物 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は下記のとおりである:
[1]ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、代謝異常の予防または治療用組成物。
[2]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[1]に記載の組成物。
[3]代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも1種である、[1]または[2]に記載の組成物。
[4]ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物。
[5]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[4]に記載の組成物。
[6]短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[4]または[5]に記載の組成物。
[7]ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物。
[8]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[7]に記載の組成物。
[9]食品または食品添加物である、[1]−[8]のいずれか1項に記載の組成物。
[10]医薬品である、[1]−[8]のいずれか1項に記載の組成物。
[11]飼料または飼料添加物である、[1]−[8]のいずれか1項に記載の組成物。
[12]ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、代謝異常の予防または治療方法。
[13]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[12]に記載の方法。
[14]代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも1種である、[12]または[13]に記載の方法。
[15]ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅方法。
[16]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[15]に記載の方法。
[17]短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[15]または[16]に記載の方法。
[18]ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドの有効量を対象に投与することを含む、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下方法。
[19]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[18]に記載の方法。
[20]代謝異常の予防または治療における使用のための、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライド。
[21]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[20]に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
[22]代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも1種である、[20]または[21]に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
[23]腸管における短鎖脂肪酸量の増幅における使用のための、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライド。
[24]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[23]に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
[25]短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[23]または[24]に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
[26]腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下における使用のための、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライド。
[27]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[26]に記載の使用のためのエキソポリサッカライド。
[28]代謝異常の予防または治療用組成物を製造するための、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドの使用。
[29]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[28]に記載の使用。
[30]代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも1種である、[28]または[29]に記載の使用。
[31]腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物の製造のための、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドの使用。
[32]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である、[31]に記載の使用。
[33]短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも1種である、[31]または[32]に記載の使用。
[34]腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物の製造のための、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)が産生するエキソポリサッカライドの使用。
[35]ロイコノストック メセンテロイデスが、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデスNTM048株又はその変異株である[34]に記載の使用。
脂質代謝の異常とは、体組織、血中、又はリンパ組織中に存在する脂質の分解が過度に抑制される状態、脂質の合成が過度に促進される状態、および該脂質分解抑制と脂質合成促進の結果、脂肪組織等の体組織へ脂質が過度に蓄積される状態をいう。ここで「脂質」とは、中性脂肪(トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド)、コレステロール(特に、LDLコレステロール)をいう。
糖代謝の異常とは、空腹時血糖値が過度に上昇する状態、食事後の糖代謝が過度に抑制される状態をいう。さらに、糖代謝の異常には、耐糖能異常も含まれる。ここで「糖」とは、単糖、二糖または多糖をいう。
エネルギーの代謝異常とは、摂取エネルギー量及び放出エネルギー量のバランスが、異常である状態又は正常に調節できない状態をいう。
腸内細菌叢の大部分を構成するフィルミクテス門に属する細菌及びバクテロイデーテス門に属する細菌は肥満との関連性があり、肥満の個体ではフィルミクテス門に属する細菌が多く、バクテロイデーテス門に属する細菌が少ないことが知られている。従って、腸内細菌叢を解析して求められるFirmicutes/Bacteroidetesは、代謝異常の程度や治療効果を評価することができる。より具体的には、腸管におけるバクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合が代謝異常の治療前より低下している場合、代謝異常が改善していると判断することができる。
培地: MRS培地(Difco社製)
菌株:NTM048株[えんどう豆から単離した(受託番号:NITE BP-1519、寄託日:2013年1月25日)]、JCM6124株(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)[独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室(JCM)より購入した。]
EPSの抽出はthe production and purification method for EPS of L. mesenteroides strain(Sarwat,Ul Qader,Aman,&Ahmed,2008)に従い行った。
一晩培養したロイコノストック メセンテロイデス培養液500μLをEPS産生用培地50mL(組成:15% sucrose、0.5%bacto-peptone、0.5% yeast extract、1.5% K2HPO4、0.001% MnCl2・H2O、0.001% NaCl、 0.005% CaCl2)に添加し、30℃で24時間培養した後、遠心分離して菌体を取り除いた。上清と同量の冷エタノールを添加して沈殿させ、激しく振とうした後、10,000rpmで15分間遠心分離し上清を取り除いた。この工程を2回繰り返した。沈殿したEPSは12時間、塩化カルシウム上で乾燥させた。不純物を取り除くために、蒸留水にEPSの沈殿物を溶かし、再びその懸濁液と同量の冷エタノールを添加して沈殿させた。この工程を2回繰り返し、沈殿したEPSは12時間、塩化カルシウム上で乾燥させた。このEPSを高脂肪食マウスにおける効果の測定に使用した。NTM048株より産生したEPSを「NTM048-EPS」、JCM6124T株より産生したEPSを「JCM6124T-EPS」と示す。
高脂肪食を与えたマウスにおけるロイコノストック メセンテロイデス由来EPSの体重、脂肪組織および血糖値に対する効果を評価した。C57BL/6Jマウス(オス、6週齢で日本クレアから購入し、個別飼育した)を、市販の普通飼育飼料(ND)で2週間予備飼育した後、3群に分け、それぞれに、高脂肪飼料(HFD)を基本飼料として、基本飼料にCelluloseが10%になるように配合した飼料(Control群用)、基本飼料にNTM048-EPSが5%及びCelluloseが5%になるように配合した飼料(NTM048群用)、基本飼料にJCM6124T-EPSが5%及びCelluloseが5%になるように配合した飼料(JCM6124T群用)を17日間投与し、飼育した。各群のC57BL/6Jマウスの体重の推移を図1に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも体重増加の抑制が認められた。また、飼育17日目に血糖値を測定し、各群のC57BL/6Jマウスを解剖後、皮下脂肪組織、精巣周囲脂肪組織、腎臓周囲脂肪組織をそれぞれ測定した。各群のC57BL/6Jマウスの血糖値を図2に示す。NTM048群においてControl群よりも血糖値の有意な低下が認められた。また、JCM6124T群においても、Control群に比べて血糖値の低下傾向が認められた。また、皮下脂肪組織重量(図3)及び精巣周囲脂肪組織重量(図4)においても、NTM048群においてControl群よりも有意な低下が認められ、JCM6124T群においても、Control群に比べて低下傾向が認められた。腎周囲脂肪組織重量(図5)ではNTM048群とJCM6124T群のいずれもControl群よりも有意に低い結果が得られた。
ロイコノストック メセンテロイデス由来EPSおよび高脂肪食を与えたマウスの糞便中に産生された短鎖脂肪酸を測定した。実施例1と同様に、C57BL/6Jマウスを、市販の普通飼育飼料(ND)で2週間予備飼育した後、3群に分け、それぞれに、高脂肪飼料(HFD)を基本飼料として、基本飼料にCelluloseが10%になるように配合した飼料(Control群用)、基本飼料にNTM048-EPSが10%になるように配合した飼料(NTM048群用)、基本飼料にJCM6124T-EPSが10%になるように配合した飼料(JCM6124T群用)を投与し17日間飼育した。飼育17日目の糞便を採取し、短鎖脂肪酸(SCFAs:乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸)を測定した。C57BL/6Jマウスの糞便中の短鎖脂肪酸(SCFAs)はYMC社製「高速液体クロマトグラフィー用長鎖・短鎖脂肪酸分析用ラベル化試薬」を用いて測定した。採取したマウス糞便0.1gに対し、蒸留水0.2mL、12%過塩素酸0.03mLを添加し懸濁後、遠心分離し (14000 rpm, 1min)、上層100μL を採取した。1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (1-EDC/HCL)存在下、これに2-nitrophenyl-hydrazine hydrochloride(2-NPH/HCL)を反応させ、ヘキサンおよびエーテルにて抽出し、得られたサンプルをHigh-performance liquid chromatography (HPLC) 装置にて測定した。HPLC条件は以下の通りである。
HPLC条件
・測定装置:SCL-10Av および SPD-20A (Shimadzu Seisakusho, Kyoto, Japan)
・カラム:YMC-Pack FA(脂肪酸分析専用カラム)
・アセトニトリル:メタノール:水=22:8:70
・流速:1.0ml/min
・分析時間:30分
・検出感度:UV at 400nm
・温度:50℃
C57BL/6Jマウスの糞便について短鎖脂肪酸(SCFAs:乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸)の測定結果を図6に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも短鎖脂肪酸量が多いことが認められた。
ロイコノストック メセンテロイデス由来EPSの食後高血糖に対する効果を評価した。C57BL/6Jマウス(オス、6週齢で日本クレアから購入し、個別飼育した)を、市販の普通飼育飼料(ND)で予備飼育した後、3群に分け、24時間絶食させた後、それぞれに、Celluloseを含まない飼料を基本飼料として、基本飼料0.1g(Control群用)、基本飼料0.1gにCellulose 0.1gを配合した飼料0.2g(Cellulose群用)、基本飼料0.1gにNTM048-EPS 0.1gを配合した飼料0.2g(NTM048群用)を与えた。その後、グルコース溶液(300mg/mL)を100μL/20g体重で経口投与し、経時的(グルコース負荷後0, 15, 30, 60, 120分後)に血糖値を測定した。各群のC57BL/6Jマウスの血糖値の推移を図7に示す。NTM048群において、グルコース投与後15分および60分でCellulose群よりも血糖値が低い結果が得られた。
C57BL/6Jマウス(オス、6週齢で日本クレアから購入し、個別飼育した)を、市販の普通飼育飼料(ND)で2週間予備飼育した後、3群に分け、高脂肪飼料(HFD)を基本飼料として、基本飼料にCelluloseが10%になるように配合した飼料(Control群用)、基本飼料にNTM048-EPSが10%になるように配合した飼料(NTM048群用)、基本飼料にJCM6124T-EPSが10%になるように配合した飼料(JCM6124T群用)を、それぞれ16週間投与し飼育した。実施例1と同様に、各群のC57BL/6Jマウスの体重の推移を図8に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも体重増加の抑制が認められた。
また、飼育16週目の糞便を採取し、実施例2と同様に、短鎖脂肪酸(SCFAs:酢酸、プロピオン酸、酪酸)を測定した。C57BL/6Jマウスの糞便について短鎖脂肪酸(SCFAs:酢酸、プロピオン酸、酪酸)の測定結果を図9に示す。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりも短鎖脂肪酸量が多いことが認められた。
さらに、同じく飼育16週目に採取した糞便の菌叢を解析した。糞便からDNAを抽出及び精製し、バクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌の測定には5´-CRAACAGGATTAGATACCCT-3´(配列番号:1)及び5´-GGTAAGGTTCCTCGCGTAT-3´(配列番号:2)を共通のプライマーとして用いて、フィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の測定には5´-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3´(配列番号:3)及び5´-AGCTGACGACAACCATGCAC-3´(配列番号:4)を共通のプライマーとして用いてリアルタイムPCRを実施し、バクテロイデーテス門に属する細菌に対するフィルミクテス門に属する細菌の割合(Firmicutes/Bacteroidetes)を測定した(図10)。NTM048群及びJCM6124T群において、Control群よりもFirmicutes/Bacteroidetesが低下した。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願2016−032889(出願日:平成28年2月24日)および特願2016−134997(出願日:平成28年7月7日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (13)
- 受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、代謝異常の予防または治療用組成物。
- 代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の組成物。
- 受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物。
- 短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項3に記載の組成物。
- 受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株が産生するエキソポリサッカライドを有効成分として含む、腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物。
- 食品または食品添加物である、請求項1−5のいずれか1項に記載の組成物。
- 医薬品である、請求項1−5のいずれか1項に記載の組成物。
- 飼料または飼料添加物である、請求項1−5のいずれか1項に記載の組成物。
- 代謝異常の予防または治療用組成物を製造するための、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株が産生するエキソポリサッカライドの使用。
- 代謝異常が、肥満、糖尿病、耐糖能異常、高インスリン血症、脂質異常症、脂肪組織の増加及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項9に記載の使用。
- 腸管における短鎖脂肪酸量の増幅用組成物の製造のための、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株が産生するエキソポリサッカライドの使用。
- 短鎖脂肪酸が、乳酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項11に記載の使用。
- 腸管におけるバクテロイデーテス門(Bacteroidetes)に属する細菌に対するフィルミクテス門(Firmicutes)に属する細菌の割合の低下用組成物の製造のための、受託番号NITE BP-1519で寄託されているロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)NTM048株又はその変異株が産生するエキソポリサッカライドの使用。
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