JP6762027B2 - シアロオリゴ糖の製造方法とその利用 - Google Patents

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Description

本発明は、シアロ糖タンパク質を含むから原料からシアロオリゴ糖を製造する方法、該方法で製造されたシアロオリゴ糖、ならびに該シアロオリゴ糖を含む発毛促進剤および骨格筋形成促進剤に関する。
シアル酸は自然界に広く分布している事が知られており、生理的に機能する重要な物質である。
シアル酸は細胞間識別機能、感染防御活性、免疫機能制御機能、ミオバチー(Myopathy)改善機能、発毛・育毛機能等を有することが報告されている(非特許文献1〜3)。
また、シアル酸はインスリン様成長因子−1(IGF−1)の産生を促すことが知られている(非特許文献3)。そして、IGF−1は育毛効果(非特許文献4)や肌の弾力性を高める(非特許文献5)作用を有することが知られている。
一方、経口投与の場合、シアル酸の薬理/生物活性はフリー体のシアル酸よりもシアル酸を含有する糖鎖であるシアロオリゴ糖の方が、活性が高い事が知られている(非特許文献1および2、ならびに特許文献1)。
このようなシアロオリゴ糖の製造法としては、脂質およびタンパク質を除去した乳から、有機溶媒抽出および活性炭カラムクロマトグラフィーにより精製する方法(特許文献2)、脂質およびタンパク質を除去した乳、乳製品から、限外ろ過およびゲルろ過クロマトグラフィーにより精製する方法(特許文献3)、脂質およびタンパク質を含まないホエイから、イオン交換樹脂により精製する方法(特許文献4)、鳥類卵脱脂卵黄から水もしくは塩溶液で抽出、限外ろ過、または水もしくは塩溶液で抽出して得られる溶液を酵素消化することにより製造する方法(特許文献5)、シアル酸転移酵素およびホスファターゼの存在下にシチジン1リン酸−シアル酸を糖鎖と反応させ、糖鎖の非還元末端にシアル酸を転移させる方法(特許文献6)などの報告がある。
特開2002−128797号公報 特開2005−8584号公報 特開2009−23926号公報 特表2011−513482号公報 特開平8−99988号公報 国際公開第2012/121041号
Malicdan, MC et al., Nat. Med., 15, 690-695 (2009) 野口悟, 生化学,83(4),316-320 (2012) 岡嶋研二,Fragrance J., 37(10), 43-47 (2009) Su, H. Y. et al., Dermatol. Online J., 5, 1 (1999) Tavakkol, A. et al., Arch. Dermatol. Res., 291, 643-651 (1999)
上記のシアロオリゴ糖を製造する方法はいずれも煩雑で高コストであり、収率が良いとはいえない。また、タンパク質を除去した原料から精製する場合には、シアル酸を含有する糖タンパク質(シアロ糖タンパク質)は除去されてしまっている。
したがって、本発明は、シアロ糖タンパク質を含むから原料から、簡便、低コスト、かつ高収率でシアロオリゴ糖を製造する方法、該方法で製造されたシアロオリゴ糖、ならびに該シアロオリゴ糖を含む発毛促進剤および骨格筋形成促進剤を提供することを目的とする。
本発明者は、ムチン型のシアロ糖タンパク質を含む原料を用いて、簡便、低コスト、かつ高収率でシアロオリゴ糖を製造する方法について鋭意検討したところ、アナツバメの巣をアルカリ溶液で加水分解して、加水分解物を精製することにより、シアロオリゴ糖が簡便、低コスト、かつ高収率で製造できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本明細書は以下の発明の開示を包含する。
[1](1)シアロ糖タンパク質をアルカリ性水溶液中で70〜90℃に加温することにより加水分解する工程;および
(2)加水分解物を精製してシアロオリゴ糖を得る工程;
を含む、含有するシアル酸/ヘキソースの重量比が0.5〜0.9であるシアロオリゴ糖の製造方法。
[2]シアロ糖タンパク質がムチン型糖タンパク質である、[1]に記載の製造方法。
[3]シアロ糖タンパク質がアナツバメ族の巣に含まれるムチン型糖タンパク質である、[1]または[2]に記載の製造方法。
[4]アルカリ性水溶液が水酸化カリウム水溶液である、[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5]精製が逆浸透膜濾過または電気透析により行われる、[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6](1)シアロ糖タンパク質をアルカリ性水溶液中で70〜90℃に加温することにより加水分解する工程;および
(2)加水分解物を精製してシアロオリゴ糖を得る工程;
を含む製造方法によって製造される、含有するシアル酸/ヘキソースの重量比が0.5〜0.9であるシアロオリゴ糖。
[7][6]に記載のシアロオリゴ糖を含む、発毛促進剤。
[8][6]に記載のシアロオリゴ糖を含む、骨格筋形成促進剤。
本発明のシアロオリゴ糖の製造方法によれば、シアロ糖タンパク質を含む原料から、簡便、低コスト、かつ高収率でシアロオリゴ糖を製造することができる。シアル酸は乳や唾液等から抽出される希少性の高い成分で、非常に高価である。そのため、生体に影響する薬理的作用は十分に理解されているにも関わらず、一般的には生理的濃度(20mg/kg体重)では使用されていない。本発明の製造方法により、商業的に生理的濃度で使用可能なコストによるシアロオリゴ糖の製造が実現された。
265nmおよび480nmの波長の紫外光の吸収により検出した、被験物質のゲル濾過クロマトグラフィーによる分離における溶出パターンを示す図である。(1)は被験物質2(塩酸処理)、(2)は被験物質1(水酸化カリウム処理)での溶出パターンである。縦軸は吸光度、横軸は分取したチューブの番号である。 被験物質1を含むローションの使用による肌の水分量の変化を示す図である。頬(左)および額(右)について、使用前および1カ月使用後の水分量(重量%)をそれぞれ示す。
本明細書において、「シアロ糖タンパク質」とは、シアル酸を主に糖鎖の非還元末端に含有する糖タンパク質である。
本明細書において、「シアル酸」とは、ノイラミン酸のアミノ基やヒドロキシ基が置換された物質を総称するファミリー名である。
本明細書において、「ヘキソース」とは、6個の炭素原子を有する単糖である。例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、キノボース、ラムノース、フコース、フクロースなどを含み、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、フルクトサミンなどのヘキソサミンも含む。
本明細書において、「シアロオリゴ糖」とは、シアル酸を含むオリゴ糖である。本発明におけるシアロオリゴ糖は、構成するヘキソースとシアル酸の単糖単位の数がそれぞれ5〜10個であればよく、好ましくは4〜9個である。また、シアロオリゴ糖中のシアル酸/ヘキソースの重量比は、例えば0.5〜0.9であり、好ましくは0.6〜0.8である。
一般に、動物のシアロ糖タンパク質はアスパラギン型、ムチン型、プロテオグリカン型等が知られている。本発明のシアロオリゴ糖の製造方法に用いるシアロ糖タンパク質はいずれの型であってもよい。
本明細書において「ムチン」とは、主に動物の上皮細胞などから分泌される粘液に含まれる、糖を多量に含む糖タンパク質(粘液糖タンパク質)の混合物である。
本明細書において「ムチン型」とは、ムチンの糖タンパク質にみられる糖鎖とタンパク質の結合様式である。主にセリンまたはトレオニンの水酸基に対し、糖鎖の還元末端のN−アセチルガラクトサミンがα−O−グリコシド結合(ムチン型結合)により高頻度で結合している。
本発明のシアロオリゴ糖の製造方法は、少なくとも以下の工程を含む。
(1)シアロ糖タンパク質をアルカリ性水溶液中で加温することにより加水分解する工程;および
(2)加水分解物を精製してシアロオリゴ糖を得る工程
本発明のシアロオリゴ糖の製造に用いるシアロ糖タンパク質は単離されたものであってもよく、他の成分を含むものであってもよい。好ましくは、ムチン型のシアロ糖タンパク質を含むムチンである。
本発明により製造されたシアロオリゴ糖は、シアロオリゴ糖以外の成分を含むものであってもよい。
アルカリ水溶液に用いるアルカリとしては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
アルカリ水溶液の濃度は、例えば0.01〜1.0重量%、好ましくは0.2〜0.5重量%、より好ましくは0.25〜0.5重量%である。
加温は、例えば50〜105℃、好ましくは70〜90℃、より好ましくは75〜85℃で、例えば30分〜3時間、好ましくは30分〜2時間、より好ましくは1〜2時間行う。
本発明において、加水分解物の精製法は、特には限定されない。
加水分解物の精製は、例えば逆浸透膜濾過、透析、電気透析、限外濾過、好ましくは逆浸透膜濾過、透析、または電気透析、より好ましくは逆浸透膜濾過または電気透析により行うことができる。
また、加水分解物の精製は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー(ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィーなど)、逆相クロマトグラフィーなど、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィー、より好ましくはゲル濾過クロマトグラフィーで分離して分取することにより行うこともできる。
さらに、これらの手法を組み合わせて、加水分解物の精製を行うこともできる。また、上記の精製により、例えば、塩および不純物を除去することができる。
特に、原料に含まれうる重金属やヒ素の除去の観点から、一態様として、加水分解物を電気透析により精製するのが好ましい。
また、加水分解物の精製は、例えば遠心分離、濾過などの合目的な方法で不溶物を除去した後に行うことができる。
本発明の製造方法で原料として使用されるシアロ糖タンパク質の例としては、シアロ糖タンパク質を含有する物質、例えば、アナツバメ族の鳥の巣、牛乳などの動物の乳、鶏卵などの動物の卵、家畜などの動物の唾液・消化液、ナマコなどの棘皮動物、クラゲなどの刺胞動物などの天然由来の物質、好ましくはムチンを含有する物質が挙げられる。
アナツバメ族の鳥の巣は中華料理などで、高級薬膳料理として古来より食されている。近年の健康増進のブームから、手軽に食せる商品や抽出物等が市販されている。しかし、充分な品質管理は成されておらず、高濃度の重金属やヒ素を含有している商品も流通している。本発明の好ましい態様において、原料由来の重金属やヒ素が精製により検出下限以下まで除去されたシアロオリゴ糖が製造される。
アナツバメ族の鳥の巣に含まれているシアロ糖タンパク質はムチン型である。
アナツバメ族の鳥の巣のムチンに含まれるシアロ糖タンパク質からシアロオリゴ糖を得る場合、酸性条件下ではシアル酸がオリゴ糖から脱離してしまうため、希アルカリ性のマイルドな条件下で加水分解を行う。他のムチン型シアロ糖タンパク質からシアロオリゴ糖を得る場合も、本発明の方法を適用できる。したがって、シアロオリゴ糖の原料をアナツバメ族の鳥の巣に限定するものではない。
本発明により製造されるシアロオリゴ糖は、医薬品、医薬部外品、健康食品、化粧品などとして使用することができる。例えば、錠剤、カプセル剤(軟カプセル剤、硬カプセル剤)、顆粒剤(ドライシロップを含む)、散剤(粉末剤)、細粒剤、丸剤などの固形製剤、水性または非水性の内服用液(液剤、懸濁剤、シロップ剤などを含む)、ならびに軟膏、パップ、リニメント、ローション、外用液剤、散布剤、クリーム、ジェル、乳液、ヘアトニック、ヘアスプレーなどの外用製剤として使用することができる。
上記の各種製剤は、本発明により製造されるシアロオリゴ糖と、医薬品、医薬部外品、健康食品、化粧品などで通常許容され得る添加剤を混和して、周知の方法で製造することができる。そのような添加剤としては、例えば、賦形剤、滑沢剤(コーティング剤)、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、基剤、分散剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、経皮吸収促進剤、pH調整剤、保存剤、着色剤、油分(油脂、鉱物油など)、保湿剤、アルコール、増粘剤、ポリマー、皮膜形成剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、酸化防止剤、防腐剤、清涼剤、消臭剤、顔料、染料、香料、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、有機酸、有機アミン、植物抽出物などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
実施例1 シアロオリゴ糖含有加水分解物の製造
希アルカリ処理による方法
市販のアナツバメ(学名:Aerodramus fuciphagus germani)の巣(10g、インドネシアの中国食材店より入手)を1000mlの0.25重量%水酸化カリウム水溶液に加え、ミキサーで粉砕した。80℃に加温し、40分保持した。4℃に冷却した後、遠心分離および濾過により不溶物を除去した。その後、電気透析で塩および不純物を除去し、乾燥させて3.33gを回収し、被験物質1とした。
酸処理による方法
従来から糖タンパク質から糖を遊離させるのに用いられている酸加水分解の手法を、対比として行った。
前記と同量のアナツバメの巣を1000mlの0.5M塩酸に加え、ミキサーで粉砕した。80℃に加温し40分保持した。その後前記と同様の手順に従って0.81gの乾燥産物を得て、被験物質2とした。
ゲル濾過クロマトグラフィーによる分析
被験物質1および2のそれぞれを、1mg/mlの濃度で0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)に溶解させ、ゲル濾過クロマトグラフィー(GFC)を用いて分離分析した。
GFC条件
樹脂:トヨパールHW40S(東ソー社製)(排除限界分子量:〜10,000Da)
カラム:内径20mm×カラム長950mm(山善社製MMカラム(内径20mm×長さ1,000mm)に上記樹脂を950mmの長さで充填して作製)
移動相:0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)
インジェクション:1ml(負荷量:1mg)(ATTO社製インジェクタを使用)
流速:0.3ml/分(Lab−Quatec社製ポンプ、型番:WORK−21,LP6300を使用)
分取:2ml/チューブ(Gilson社製フラクションコレクター、型番:FC203Bを使用)
検出波長:265nmおよび480nm
GFC溶出パターンを図1に示す。
各チューブ内の分取された試料について265nmの紫外光吸収を測定するとともに、ヘキソースをフェノール硫酸法(吸収波長480nm)で測定したところ、塩酸処理により得られた被験物質2では265nmの吸収の測定で複数の分取試料にわたる多峯性の吸収がみられ、またヘキソースの測定では吸収がみられなかったことから、糖鎖中のヘキソースがバラバラに分解されたと考えられた。一方、水酸化カリウム処理により得られた被験物質1では、40〜42本目のチューブに分取された試料にヘキソースの測定で吸収がみられ、シングルピーク(ピークトップ分子量:約2kDa)として現れた。このことから、本実施例で水酸化カリウム処理により得られた被験物質1は、推定分子量が1.7〜2.3kDaのオリゴ糖を含有することが示唆された。
被験物質中のシアル酸量およびヘキソース量の測定
被験物質1が含有するオリゴ糖がシアロオリゴ糖であること、被験物質2にヘキソースが含まれていないことを確認するため、被験物質中のシアル酸量およびヘキソース量の測定を行った。
シアル酸は直接エールリッヒ反応(生化学実験講座4 糖質の化学(下)、p.p.381、日本生化学会編集、東京化学同人、1976年)で測定した。
すなわち、1mlの試料溶液にp‐ジメチルアミノベンズアルデヒド(5g)を塩酸と水の等容量混合液100mlに溶解した試薬を200μl加え、沸騰水浴中で30分間加熱した後、流水で室温まで冷やした。その後、565nmの吸光度を測定した。
ヘキソースはフェノール硫酸反応(生化学実験講座4 糖質の化学(下)、p.p.370、日本生化学会編集、東京化学同人、1976年)で測定した。
すなわち、100μlの試料溶液に5体積%フェノール試薬を100μl加え、よく攪拌した。これに硫酸を1ml加えよく振り混ぜた後、480nmの吸光度を測定した。
各被験物質についての、回収率、GFC溶出パターン、シアル酸量およびヘキソース量の測定結果、ならびにシアル酸標準品(和光純薬工業社製、N−アセチルノイラミン酸、製品番号011−26173)についての、GFC溶出パターン、シアル酸量およびヘキソース量の測定結果を表1にまとめて示す。
被験物質1はシアル酸を36重量%、ヘキソースを51重量%含有することが示され、被験物質1が含有するオリゴ糖がシアロオリゴ糖であることが確認された。また、シアル酸/ヘキソース重量比は0.7と算出された。
一方、被験物質2はシアル酸を0.5重量%含有することが示されたものの、ヘキソースをトレース量しか含有しないことが示され、ヘキソースが含まれていないことが確認された。
実施例2 被験物質のインスリン様増殖因子−1(IGF−1)産生促進能評価試験
実施例1で製造した被験物質およびシアル酸標準品(和光純薬工業社製、N−アセチルノイラミン酸、製品番号011−26173)を飲料水に溶かして濃度を調整してマウス(n=5)に与え、5mg/kg体重/日で被験物質を投与した。3週間飼育した後、末梢血中のIGF−1濃度をELISA法で調べた。結果を表2に示す。
水酸化カリウム処理で得られた被験物質1のシアロオリゴ糖含有加水分解物はシアル酸標準品と同様に、マウスにおいて経口投与でIGF−1の産生を促進した。シアル酸標準品と被験物質1のIGF−1産生促進能を比較したところ、表2に示す様に、シアル酸標準品の投与ではIGF−1濃度が4.4μg/mlであったのに対し、被験物質1の投与ではIGF−1濃度が6.3μg/mlであったことから、被験物質1のIGF−1産生促進能の方が約43%も高かった。
実施例3 被験物質1の細胞増殖活性評価試験
NIH3T3細胞を96穴マイクロプレートに10細胞/ウェルになるように培養し、濃度を調整した被験物質1およびシアル酸標準品(和光純薬工業社製、N−アセチルノイラミン酸、製品番号011−26173)を10μl加え、24時間、COインキュベーターで培養を行った(37℃、4.5%CO)。細胞増殖は、キット(同仁化学社製、Cell Counting Kit−8、製品番号347−07621)を用いたMTTアッセイ法にて測定した。結果を表3に示す。
被験物質1無添加(0mg/ml)を100として被験物質1の各添加濃度による細胞の増殖率を算出した。
シアル酸標準品無添加(0mg/ml)を100としてシアル酸標準品の各添加濃度による細胞の増殖率を算出した。
シアル酸標準品は10.0mg/mlの濃度を添加しても増殖率には変化が認められなかったが、被験物質1は表3に示したように濃度依存的に細胞の増殖率が増大し、被験物質1の添加濃度が5.0mg/ml以上でプラトーに達した。
実施例4 ボランティアの被験者による被験物質1の効果の評価試験
1.スキンケア効果
被験物質1を0.5重量%になるように脱イオン水に溶解したローションを作成し、50歳以上の10名(男性5名、女性5名)の被験者に使用させ、その効果を評価した。肌の水分量を、朝の洗顔前の頬と額の水分量をデジタルモイスチャーチェッカー1175(ワールドジェイビー社製)で測定した。結果を図2に示す。
被験物質1を含むローションを1ヶ月間使用することで頬の水分量は22.9重量%から29.3重量%に、額の水分量は24.1重量%から29.5重量%にそれぞれ上昇していた。
また、上記ローションの肌の状態に対する効果を各自の主観により評価した。結果を表4に示す。
全10名中、男性4名、女性4名の合計8名(全体の80%)の被験者が、被験物質1を含むローションの使用により、肌の状態が良くなったまたは非常に良くなったと回答した。また、良くなったまたは非常に良くなったと回答した8名に肌の状態の変化について具体的な改善点を質問したところ、「しっとり感」が8名中4名、「スベスベ感」が8名中4名であった。
2.サルコペニア改善効果
被験食品として、乳清タンパク質(協同乳業社製、WPC; Whey Protein Concentration)に被験物質1を0.5重量%配合した食品を試作し、60〜80歳代の男性および女性合わせて30名の、つまずきやすくなり若干歩行困難な方、膝・肩・腰等に軽〜中度の障害がある方、原因不明の手腕や下肢の末梢の痺れが治らない方(いずれも自己申告)をサルコペニアの症状を示す被験者として、1ヶ月間、1日当たり本被験食品5g(1包)を摂取してもらった。摂取方法や摂取時間には何ら制限をかけず、本被験食品の作用機序や目的も一切知らせなかった。これはプラセボ効果を最小限にするための処置である。1ヵ月後の変化を4段階で評価した。結果を表5に示す。
全30名中、男性15名、女性12名の合計27名(全体の90%)の被験者が、サルコペニアの症状が良くなったまたは非常に良くなったと回答した。
良くなったまたは非常に良くなったと回答した27名(男性15名、女性12名)に多かったコメント(複数回答)を表6に示す。
3.薄毛・抜け毛などの改善効果
7名の男性被験者(薄毛や抜け毛が増えている)に、被験溶液として被験物質1を0.05重量%、硫酸多糖の一種であるフコイダンを0.01重量%含む水溶液を、夜の洗髪後に適当量塗布させた。1ヵ月後の変化を4段階で評価した。結果を表7に示す。
全7名中6名(全体の85%以上)の被験者が良くなったまたは非常に良くなったと回答した。
良くなったまたは非常に良くなったと感じている6名に多かったコメント(複数回答)を表8に示す。

Claims (6)

  1. (1)シアロ糖タンパク質をアルカリ性水溶液中で70〜90℃に加温することによりアルカリ加水分解する工程、ここでアルカリ性水溶液に含まれるアルカリはシアロオリゴ糖のアルカリ加水分解のためのものである;および
    (2)加水分解物を精製してシアロオリゴ糖を得る工程;
    を含む、含有するシアル酸/ヘキソースの重量比が0.5〜0.9であるシアロオリゴ糖の製造方法。
  2. シアロ糖タンパク質がムチン型糖タンパク質である、請求項1に記載の製造方法。
  3. シアロ糖タンパク質がアナツバメ族の巣に含まれるムチン型糖タンパク質である、請求項1または2に記載の製造方法。
  4. アルカリ性水溶液が水酸化カリウム水溶液である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 精製が逆浸透膜濾過または電気透析により行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. アルカリ性水溶液の濃度が0.2〜0.5重量%である、請求項1に記載の製造方法。
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