JP6714508B2 - 試料内の複数の点物体を局在化するための局在顕微鏡検査の光学顕微鏡的方法、並びに試料内の複数の点物体を局在化するための光学顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料内の複数の点物体を局在化するための光学顕微鏡的方法に関し、該方法においては、物体空間内に配置された試料が、物体空間内で自身の光軸線に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさの被写界深度範囲を有する結像光学系を用い、検知器へ結像され、そして試料内に含まれる点物体が、検知器において試料の結像により生成される試料画像に基づき、光軸線に対して直角の方向における点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、被写界深度範囲内において局在化される。

近年、個々のマーカ、特に複数の蛍光分子の順次的で確率的な局在化に基づき、典型的な光学顕微鏡の回折に起因する分解能限界よりも小さい試料構造体を描写させる光学顕微鏡的結像方法が開発されている。そのような方法は、例えば、下記特許文献１〜６、下記非特許文献１、２において説明されている。顕微鏡検査のこの新たな形式は、局在顕微鏡検査（Lokalisierungsmikroskopie）とも称される。そこで適用される方法は、それらの文献において、例えば、(F)PALM（(Fluorescence) Photoactivation Localization Microscopy）、PALMIRA（PALM with Independently Running Acquisition）、GSD(IM)（Ground State Depletion (Individual Molecule Return) Microscopy）、或いは、(F)STORM（(Fluorescence) Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）との名称で知られている。

これらの新たな方法は、結像すべき試料構造体が、２つの区別可能な状態、即ち「明」状態と「暗」状態を有する点物体、所謂マーカを用いて調製されるということにより共通している。例えば蛍光色素がマーカとして使用される場合には、明状態が蛍光可能状態であり、暗状態が蛍光不能状態である。有利な実施形態においては、例えば下記特許文献６及び下記特許文献１におけるように、光切替可能又は光活性化可能な蛍光分子が使用される。また選択的に例えば下記特許文献２におけるように、標準的な蛍光分子の固有の暗状態を利用することが可能である。

結像光学系の典型的な分解能限界よりも高い分解能を用いて試料構造体を結像させるために、マーカの少数の一部分が反復して明状態へと移される。この際、最も簡単な場合、これらのアクティブな一部分を構成するマーカの密度は、隣接するマーカ同士の平均的な間隔が、明状態において、従って光学顕微鏡的に結像可能な状態において、結像光学系の分解能限界よりも大きいように選択することができる。アクティブな一部分を構成するマーカは、空間分解能を有する光検知器、例えばＣＣＤカメラへ結像され、それにより点状の各マーカから、光点のかたちの１つの光分布が検知され、この際、光点の大きさは、光学系の分解能限界により決定されている。

このようにして多数の生データ個別画像が記録され、これらの生データ個別画像の夫々には、異なった他のアクティブな一部分が結像されている。そして画像評価プロセスにより、各生データ個別画像において、明状態にある点状のマーカを表わす光分布の重心位置が決定される。そして生データ個別画像から検出された光分布の重心位置は、全体画像データセットの形式の全体描写において総和とされる。この全体描写により得られる高解像度の全体画像は、マーカの分布を反映している。

結像すべき試料構造体の描写的に忠実な再現のためには、十分に多くのマーカ信号が検知されなくてはならない。しかしその都度アクティブな一部分において評価可能なマーカの数は限られているので、試料構造体を完全に結像するためには、極めて多くの生データ個別画像が記録されなくてはならない。典型的に生データ個別画像の数は、数万枚の範囲にあり、この際、複雑な構造体についてそれらの構造体を解像可能とするためには、比較的単純な構造体よりも更に多くの画像を記録する必要があるので、その範囲は、大きく変化する。

物体面（以下「ｘｙ面」とも称される）内におけるマーカの上述の横方向（光軸線を縦方向としたときの横方向）の位置決定の他、軸方向（以下「ｚ方向」とも称される）の位置決定を行うことも可能である。この際、軸方向は、結像光学系の光軸線に沿った方向、即ち光の主伝播方向を意味している。

３次元的な局在化は、下記非特許文献３〜５において記載されているように、所謂「パーティクル・トラッキング」エクスペリメントから知られている。それらは、個別分子の上述の切替（Schalten）及び局在化を基礎とする画像提供方法において既に適用もされている。それに関しては、下記非特許文献６、７が参照される。従来技術には、更に下記非特許文献８が参照される。

ｚ方向における点状の物体の局在化は、基本的にカメラの検知面において検知された光点の変化を評価することにより行われ、この変化は、その検知面に対して光学的に共役の焦点面又は焦平面から点物体が外れたときに目で見ることができる。この際、以下、点物体としては、結像光学系、特に検知用対物レンズの回折に起因する分解能限界よりも寸法が小さい物体として理解される。この場合、検知用対物レンズは、そのような物体を３次元の焦点光分布のかたちで画像空間へ結像する。焦点光分布は、カメラの検知面において所謂「ポイント・スプレッド・ファンクション（Point-Spread-Function）」即ち点像分布関数又は略語としてＰＳＦにより特徴付けられている光点を発生させる。点物体がｚ方向において焦点を超えて移動されると、即ち点物体が焦点面に対して直角方向に移動されると、ＰＳＦの大きさと形状は変化する。つまり検知された光点に対応する検知信号を、ＰＳＦの大きさと形状に関して分析すると、それにより物体の実際のｚ位置の推定位置を得ることが可能である。

点物体が焦点面から離れすぎている場合には、カメラの検知面において発生された光点は、それに対応する測定信号が通常の測定ノイズ内ではもはや検知不能であるほど、ぼやけている。つまり物体空間（物体の存在する空間）内には、ｚ方向において中央の焦点面又は焦平面をまたぐ範囲であって、該範囲内では、ｚ方向における点物体の局在化にとって評価可能であるために点物体がまだ十分に鮮明な光点を検知面において発生させることのできる範囲が存在する。ｚ方向において焦点面を含むこの範囲は、以下「被写界深度範囲（Schaerfentiefenbereich）」と称される。

WO 2006/127692 A2 DE 10 2006 021 317 B3 WO 2007/128434 A1 US 2009/0134342 A1 DE 10 2008 024 568 A1 WO 2008/091296 A2

"Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)", Nature Methods 3, 793-796 (2006), M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang "Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching", Geisler C. et al, Appl. Phys. A, 88, 223-226 (2007) "Tracking of Single Fluorescent Particles in Three Dimensions: Use of Cylindrical Optics to Encode Particle Position", Kao et. al., 1994, Biophysical Journal, 67 "Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells", Holtzer et. al., 2007, Applied Physics Letters, 90 "Three-Dimensional Particle Tracking via Bifocal Imaging", Toprak et al., 2007, Nano Letters, 7(7) "Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy", Huang et al., 2008, Science, 319 "Three-dimensional sub-100nm resolution fluorescence microscopy of thick samples", Juette et al., 2008, Nature Methods "Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function", Pavani et al., 2009, PNAS, 106

しかし３次元の局在化には、１つの点物体に由来するＰＳＦが検知面に関して対称性であるという基本的な問題（３次元から２次元にするときの問題）がある。このことは、確かに点物体が焦点面から外れるとＰＳＦは変化し、それにより焦点面に対する点物体の間隔を決定できることを意味している。しかしＰＳＦの変化は、焦点面の両側に対して対称性であり、従って焦点面のどちら側において点物体が被写界深度範囲内にあるのかを決定することはできない。

上述の問題をいかに回避可能とするかについて様々な方法が知られている。例えば当業者の間では「非点収差方法（Astigmatismusverfahren）」（上記非特許文献３、４、６）や「バイプレーン方法（Bi-Plane-Verfahren）」（上記非特許文献５、７）や「二重螺旋方法（Doppelhelixverfahren）」（上記非特許文献８）と称される方法である。これらの方法は、ｚ方向における点物体の局在化のために、検知器において発生された光点が所定の特性値（特性パラメータ）を決定するために分析され、この特性値に対して点物体のｚ位置が対応されることにおいて共通している。この対応（割り当て）は、特性値を点物体のｚ位置と関連付ける先立って決定された対応情報に基づいて行われる。特性値としては、例えば非点収差方法におけるように、光点の形状を特徴付ける値か、或いはバイプレーン方法の場合のように、２つの光点の大きさを互いに関連付ける値が考慮され、この際、前記２つの光点は、１つの同じ光点に由来し、複数の検知面において発生され、これらの検知面の対応の焦点面は、物体空間内ではｚ方向において互いにずらされている。

また１００ｎｍを遥かに下回り、部分的には数ｎｍの領域に至るまでの分解能が達成される局在顕微鏡においては、各結像光学系により必然的に発生する光学的な結像誤差が重大な問題を呈する。物体空間内で測定される分解能がほぼ２５０ｎｍの領域で達成されるという回折限界をもつ古典的な顕微鏡において、結像誤差は、正確なレンズ製造か又は補助的な補正要素により十分に低減可能であるが、このことは、今日まで局在顕微鏡において容易に可能であるというわけではない。局在顕微鏡において分解能は極めて高く、残存する結像誤差は、重要な意味をもつことになる。そのような結像誤差の例は、色収差や、球面収差や、画像域の横方向の歪み、即ち光軸線に対して直角の面内におけるＰＳＦの歪みをもたらす結像誤差などである。画像域の横方向の歪みの一例は、コマ収差である。

本発明の課題は、画像域の横方向の歪みができるだけ少ない技術的な手間で信頼性をもって修正される、冒頭に記載した形式の点物体を局在化するための光学顕微鏡的方法を構成することである。

本発明は、前記課題を、本発明の第１の視点により、点物体が局在化される被写界深度範囲が、物体空間内で光軸線に沿って試料に対して相対的に、少なくとも一回、被写界深度範囲の軸方向の大きさよりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離分だけ移動され、軸方向に移動された被写界深度範囲において、試料が結像光学系を用いて新たに検知器へ結像されて１つの更なる試料画像が生成され、この更なる試料画像に基づき、新たに点物体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、異なる試料画像（複数）に基づいて検出された夫々同じ点物体の横方向のｘ／ｙ位置（複数）の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれ（複数）が検出され、そして検出された横方向のｘ／ｙ位置ずれに依存し、所定の修正情報が作成され、該修正情報に基づき、異なる試料画像のうち少なくとも１つの試料画像に基づいて検出された点物体の横方向のｘ／ｙ位置が修正されることにより解決する。
より詳しくは、前記本発明の第１の視点において、試料内の複数の点物体を局在化するための局在顕微鏡検査の光学顕微鏡的方法であって、
物体空間内に配置された前記試料は、前記物体空間内で自身の光軸線に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさの被写界深度範囲を有する結像光学系を用い、検知器へ結像され、そして
前記試料内に含まれる前記点物体は、前記検知器において前記試料の結像により生成される試料画像に基づき、前記光軸線に対して直角の方向における前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、前記被写界深度範囲内において局在化されるという形式の方法であり、
前記点物体が局在化される前記被写界深度範囲は、前記物体空間内で前記光軸線に沿って前記試料に対して相対的に、少なくとも一回、前記被写界深度範囲の軸方向の前記大きさよりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離分だけ移動され、軸方向に移動された前記被写界深度範囲において、前記試料は、前記結像光学系を用いて新たに前記検知器へ結像されて１つの更なる試料画像が生成され、
この更なる試料画像に基づき、新たに前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
異なる前記試料画像に基づいて検出された夫々同じ前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが検出され、そして
検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれから、所定の修正情報が生成され、該修正情報は、前記被写界深度範囲内の所定の基準面から前記点物体までの間隔の関数であり、該修正情報を用いて横方向の画像歪みが修正されること、及び、
前記被写界深度範囲内において、前記光軸線に対して直角に位置する少なくとも１つの基準面であって、前記被写界深度範囲の移動時には、前記被写界深度範囲に対して相対的に定置に留まる基準面が定義され、
前記試料画像の１つが、基準画像として確定され、該基準画像に基づき、１つの比較構造体であって、前記基準画像の記録時に前記被写界深度範囲の前記基準面内に配置されている前記点物体の少なくとも１つを表わす比較構造体が定義され、
前記比較構造体は、少なくとも１つの他の前記試料画像において特定され、
異なる前記試料画像に基づき、夫々、前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
異なる前記試料画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが決定され、そして
前記修正情報は、前記比較構造体に対して検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれに依存して作成されることを特徴とする。
更に本発明の第２の視点により、試料内の複数の点物体を局在化するための光学顕微鏡装置であって、
物体空間内で自身の光軸線に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさの被写界深度範囲を有する結像光学系と、
前記物体空間内に配置された試料が前記結像光学系により結像される検知器と、
前記結像光学系が前記検知器において生成させる試料画像に基づき、前記光軸線に対して直角の方向における前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、前記被写界深度範囲内において、前記試料内に含まれる前記点物体を局在化する制御ユニットとを有するという形式の光学顕微鏡装置であり、
前記制御ユニットにより制御される位置調節ユニットが、前記点物体が局在化される前記被写界深度範囲を、前記物体空間内で前記光軸線に沿って前記試料に対して相対的に、少なくとも一回、前記被写界深度範囲の軸方向の前記大きさよりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離分だけ移動させ、前記結像光学系は、軸方向に移動された前記被写界深度範囲において、前記試料を新たに前記検知器へ結像し、１つの更なる試料画像を生成させ、
前記制御ユニットは、更なる前記試料画像に基づき、新たに前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出し、
前記制御ユニットは、異なる前記試料画像に基づいて検出された夫々同じ前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれを検出し、そして
前記制御ユニットは、検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれから、所定の修正情報を作成し、該修正情報は、前記被写界深度範囲内の所定の基準面から前記点物体までの間隔の関数であり、前記制御ユニットは、該修正情報を用いて横方向の画像歪みを修正すること
を特徴とする光学顕微鏡装置が提供される。
より詳しくは、試料内の複数の点物体を局在化するための光学顕微鏡装置であって、
物体空間内で自身の光軸線に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさの被写界深度範囲を有する結像光学系と、
前記物体空間内に配置された試料が前記結像光学系により結像される検知器と、
前記結像光学系が前記検知器において生成させる試料画像に基づき、前記光軸線に対して直角の方向における前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、前記被写界深度範囲内において、前記試料内に含まれる前記点物体を局在化する制御ユニットとを有するという形式の光学顕微鏡装置であり、
前記制御ユニットにより制御される位置調節ユニットが、前記点物体が局在化される前記被写界深度範囲を、前記物体空間内で前記光軸線に沿って前記試料に対して相対的に、少なくとも一回、前記被写界深度範囲の軸方向の前記大きさよりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離分だけ移動させ、前記結像光学系は、軸方向に移動された前記被写界深度範囲において、前記試料を新たに前記検知器へ結像し、１つの更なる試料画像を生成させ、
前記制御ユニットは、更なる前記試料画像に基づき、新たに前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出し、
前記制御ユニットは、異なる前記試料画像に基づいて検出された夫々同じ前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれを検出し、そして
前記制御ユニットは、検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれから、所定の修正情報を作成し、該修正情報は、前記被写界深度範囲内の所定の基準面から前記点物体までの間隔の関数であり、前記制御ユニットは、該修正情報を用いて横方向の画像歪みを修正すること、但し、
前記被写界深度範囲内において、前記光軸線に対して直角に位置する少なくとも１つの基準面であって、前記被写界深度範囲の移動時には、前記被写界深度範囲に対して相対的に定置に留まる基準面が定義され、
前記試料画像の１つが、基準画像として確定され、該基準画像に基づき、１つの比較構造体であって、前記基準画像の記録時に前記被写界深度範囲の前記基準面内に配置されている前記点物体の少なくとも１つを表わす比較構造体が定義され、
前記比較構造体は、少なくとも１つの他の前記試料画像において特定され、
異なる前記試料画像に基づき、夫々、前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
異なる前記試料画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが決定され、そして
前記修正情報は、前記比較構造体に対して検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれに依存して作成されることを特徴とする。
尚、本願の特許請求の範囲に付記されている図面参照符号は、専ら本発明の理解の容易化のためのものであり、図示の形態への限定を意図するものではないことを付言する。

本発明において、以下の形態が可能である。
（形態１）試料内の複数の点物体を局在化するための局在顕微鏡検査の光学顕微鏡的方法であって、
物体空間内に配置された前記試料は、前記物体空間内で自身の光軸線に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさの被写界深度範囲を有する結像光学系を用い、検知器へ結像され、そして
前記試料内に含まれる前記点物体は、前記検知器において前記試料の結像により生成される試料画像に基づき、前記光軸線に対して直角の方向における前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、前記被写界深度範囲内において局在化されるという形式の方法であり、
前記点物体が局在化される前記被写界深度範囲は、前記物体空間内で前記光軸線に沿って前記試料に対して相対的に、少なくとも一回、前記被写界深度範囲の軸方向の前記大きさよりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離分だけ移動され、軸方向に移動された前記被写界深度範囲において、前記試料は、前記結像光学系を用いて新たに前記検知器へ結像されて１つの更なる試料画像が生成され、
この更なる試料画像に基づき、新たに前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
異なる前記試料画像に基づいて検出された夫々同じ前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが検出され、そして
検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれに依存し、所定の修正情報が作成され、該修正情報に基づき、異なる前記試料画像のうち少なくとも１つの試料画像に基づいて検出された前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置が修正されること。
（形態２）前記方法において、前記被写界深度範囲内において、前記光軸線に対して直角に位置する少なくとも１つの基準面であって、前記被写界深度範囲の移動時には、前記被写界深度範囲に対して相対的に定置に留まる基準面が定義され、
前記試料画像の１つが、基準画像として確定され、該基準画像に基づき、１つの比較構造体であって、前記基準画像の記録時に前記被写界深度範囲の前記基準面内に配置されている前記点物体の少なくとも１つを表わす比較構造体が定義され、
前記比較構造体は、少なくとも１つの他の前記試料画像において特定され、
異なる前記試料画像に基づき、夫々、前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
異なる前記試料画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが決定され、そして
前記修正情報は、前記比較構造体に対して検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれに依存して作成されることが好ましい。
（形態３）前記方法において、前記被写界深度範囲は、複数のステップにおいて軸方向に移動され、
これらのステップの各ステップにおいて、前記基準画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置に対し、対応の前記試料画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置ずれが検出され、そして
前記修正情報として所定の対応関数が作成され、該対応関数の関数値は、夫々、各々のステップにおいて検出された対応の前記比較構造体の横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれを、前記光軸線に沿ったそれらの軸方向のｚ位置に依存して表わしていることが好ましい。
（形態４）前記方法において、前記被写界深度範囲のステップごとの移動により検出された複数の関数値の間に位置する前記対応関数の値は、補間法により決定されることが好ましい。
（形態５）前記方法において、前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置は、画像処理により、対応の前記試料画像において直接的に修正されることが好ましい。
（形態６）前記方法において、前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置は、対応の前記試料画像から取得されたデータセットにおいて修正され、この修正されたデータセットに基づき、修正された試料画像が生成されることが好ましい。
（形態７）前記方法において、前記比較構造体は、少なくとも１つの他の前記試料画像において、前記検知器により検知された画像輝度に依存して特定されることが好ましい。
（形態８）前記方法において、横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれは、相関分析法により検出されることが好ましい。
（形態９）前記方法において、軸方向の個々の前記ｚ変位距離の合計は、実質的に前記被写界深度範囲のｚ方向の軸方向の前記大きさと同じであることが好ましい。
（形態１０）前記方法において、軸方向の前記ｚ変位距離は、センサを用いて検知されることが好ましい。
（形態１１）前記方法において、前記被写界深度範囲は、前記光軸線に沿って前記試料が前記結像光学系に対して相対的に移動されるか又は前記光軸線に沿って前記結像光学系が前記試料に対して相対的に移動されることにより、軸方向の前記ｚ変位距離分だけ、前記物体空間内において前記光軸線に沿って前記試料に対して相対的に移動されることが好ましい。
（形態１２）前記方法において、前記光軸線に沿った各々の前記点物体のｚ位置は、各々の前記試料画像において前記点物体を描写する光点の特性値を検出し、この特性値に対し、予め定められた対応情報に基づいてｚ位置を対応させることにより検出されることが好ましい。
（形態１３）前記方法において、前記試料画像において検出された前記点物体のｚ位置は、予め定められた軸方向の前記ｚ変位距離に依存して他の前記試料画像において検出された同じ前記点物体のｚ位置と比較され、そして
この比較に依存し、所定のｚ修正情報が作成され、該ｚ修正情報に基づき、前記対応情報に依存して検出された前記点物体のｚ位置が修正されることが好ましい。
（形態１４）試料内の複数の点物体を局在化するための光学顕微鏡装置であって、
物体空間内で自身の光軸線に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさの被写界深度範囲を有する結像光学系と、
前記物体空間内に配置された試料が前記結像光学系により結像される検知器と、
前記結像光学系が前記検知器において生成させる試料画像に基づき、前記光軸線に対して直角の方向における前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、前記被写界深度範囲内において、前記試料内に含まれる前記点物体を局在化する制御ユニットとを有するという形式の光学顕微鏡装置であり、
前記制御ユニットにより制御される位置調節ユニットが、前記点物体が局在化される前記被写界深度範囲を、前記物体空間内で前記光軸線に沿って前記試料に対して相対的に、少なくとも一回、前記被写界深度範囲の軸方向の前記大きさよりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離分だけ移動させ、前記結像光学系は、軸方向に移動された前記被写界深度範囲において、前記試料を新たに前記検知器へ結像し、１つの更なる試料画像を生成させ、
前記制御ユニットは、更なる前記試料画像に基づき、新たに前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を検出し、
前記制御ユニットは、異なる前記試料画像に基づいて検出された夫々同じ前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれを検出し、そして
前記制御ユニットは、検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれに依存し、所定の修正情報を作成し、該修正情報に基づき、前記制御ユニットは、異なる前記試料画像のうち少なくとも１つの試料画像に基づいて検出された前記点物体の横方向のｘ／ｙ位置を修正すること。
（形態１５）前記光学顕微鏡装置において、前記被写界深度範囲の軸方向の前記ｚ変位距離を検知するためのセンサが設けられていることが好ましい。

結像誤差を、機器による措置によってのみ、特に結像光学系に使用される光学要素のできるだけ誤差のない製造によってのみ修正することが試みられる従来の解決策と比べ、本発明は、結像誤差の修正が局在化された位置の分析からのみ行われるという方式を選択している。また追加的な校正処理や、専ら光学誤差の決定のために意図される測定処理は不必要であり、それにより技術的な手間が多大に減少される。

本発明による解決策は、物体空間内で元の被写界深度範囲と移動された被写界深度範囲との間に光軸線に沿った所定の重なり合い（オーバーラップ）があるような、結像光学系の光軸線に沿った被写界深度範囲の移動を考慮している。この重なり合いは、光軸線に沿って被写界深度範囲を移動させる分の軸方向のｚ変位距離が被写界深度範囲のｚ方向の軸方向の大きさよりも小さいことにより達成される。この際、ｚ変位距離は、例えば、被写界深度範囲のｚ方向の軸方向の大きさの、５〜９０％、１０〜８０％、１５〜７０％、２０〜６０％、又は２５〜５０％の範囲内にある。勿論これらの値範囲は、例示としてのみ理解されるべきである。

従って本発明により、被写界深度範囲の軸方向の大きさよりも小さい軸方向のｚ変位距離分だけ被写界深度範囲を移動させることは、観察された両方の被写界深度範囲、即ち元の被写界深度範囲と移動された被写界深度範囲が、光軸線に沿って上述の重なり合いを有することとして理解すべきである。このことは、本発明が被写界深度範囲の複数回の移動による以下の一連のステップをもカバーしていることを意味し、即ちこの一連のステップにおいては、この一連のステップが、観察される複数の被写界深度範囲の間において最終的に所望の軸方向の重なり合いが実現されていることを全体としてもたらす限り、個々のステップにおいて被写界深度範囲は、被写界深度範囲の大きさよりも大きな変位距離分だけ移動されてよいということである。

また本発明は、複数の点物体により提供される３次元構造体から、唯一の試料画像だけを記録するのではなく、光軸線に沿って移動された被写界深度範囲を用い、少なくとも１つの更なる試料画像を記録することを考慮しており、それにより同じ複数の点物体が被写界深度範囲において異なるｚ位置に結像される。

本発明により修正すべき画像域の横方向の歪みにより、両方の試料画像内の前記点物体は、それらの夫々のｚ位置に依存し、それらの横方向のｘ／ｙ位置について位置ずれを有する。これらの横方向のｘ／ｙ位置ずれから修正情報を作成することができ、該修正情報は、画像域の横方向の歪みに関する尺度である。そしてこの修正情報は、結像誤差を伴う点物体の横方向のｘ／ｙ位置を修正するために利用することが可能である。

既に冒頭で述べたように、本発明による物体空間内の被写界深度範囲としては、当該範囲内では１つの点物体が検知器において１つの光点を発生させ、該光点が、該点物体の局在化のために評価可能であるためにまだ十分に鮮明であるという、中央の焦平面又は焦点面をまたぐｚ方向の範囲として理解される。この際、この最大可能な被写界深度範囲を完全に利用し尽くすことは必要ではない。つまり所望の局在化精度に依存して被写界深度範囲を意図的に小さくすること、従って既にかなりぼけているがまだ評価可能である光点を評価から除外することは有意義であると言える。横方向のｘ／ｙ位置の決定のために、検知器において発生した光点は、必ずしも空間的に厳密に互いに離れている必要はない。例えば上記文献からマルチフィット方法（multi-fit-Verfahren）や最尤方法（maximum-likelihood-Verfahren）として知られているような適切なアルゴリズム方法を介し、重なり合う光分布を、それらの点物体の位置が決定可能であるように分析することができる。

本発明による方法は、結像光学系の光学要素に起因する結像誤差を修正することだけに適しているわけではない。つまり本発明は、試料自体に起因する光学ノイズを修正することも可能にする。そのような光学ノイズは、多くの場合、試料内で光学ノイズが発生する箇所、又は周辺温度に依存する。従ってこれらの光学ノイズは、例えば多大な技術的な手間をもって光学的な修正要素を適切に制御しようとする従来の方法では、管理が困難である。この管理の困難さは、これらの従来の方法が通常は結像誤差の反復修正を考慮しており、該反復修正では試料が反復して記録され、従って変化してはならないので、尚一層のことである。それに対し、局在顕微鏡において検知器により検知される信号は、点滅する個別分子により常に変化し、従って通常は一試料画像が正確に他の試料画像と同じになることはない。

１つの点物体の横方向のｘ／ｙ位置としては、以下、ｚ軸が結像光学系の光軸線と平行に位置する直交座標系（デカルト座標系）と関連し、ｘ軸の方向及び／又はｙ軸の方向において測定される位置（ポジション）として理解することができ、この際、ｘ軸とｙ軸は、ｚ軸に対して直角に配設されている。

好ましくは、被写界深度範囲内において、光軸線に対して直角に位置する少なくとも１つの基準面が定義され、該基準面は、被写界深度範囲の移動時には、被写界深度範囲に対して相対的に定置に留まる。この際、試料画像の１つが、基準画像として確定され、この際、この基準画像に基づき、１つの比較構造体が定義され、該比較構造体は、基準画像の記録時に被写界深度範囲の基準面内に配置されている点物体の少なくとも１つを表わしている。そして比較構造体が少なくとも１つの他の試料画像において特定される。異なる複数の試料画像に基づき、夫々、比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置が検出される。引き続き、異なる試料画像に基づいて検出された比較構造体（基準構造体）の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが決定される。そして最後に所定の修正情報が、比較構造体に対して検出された横方向のｘ／ｙ位置ずれに依存して作成される。

基準面は、例えば被写界深度範囲内の中央の焦平面又は焦点面である。この基準面は、光軸線に沿った被写界深度範囲の移動と共に移動され、それによりいわば物体空間を走査する。基準画像として確定される試料画像の１つに基づき、比較構造体が定義され、該比較構造体は、他の試料画像内にもあるが、そこでは異なったｚ位置にあり、従って画像域の横方向の歪みに起因し、対応の被写界深度範囲内において他のｘ／ｙ位置にあることにもなる。つまり比較構造体を用いることにより、横方向のｘ／ｙ位置ずれをｚ位置に依存して信頼性をもって検出することができる。

好ましくは、被写界深度範囲は、複数のステップにおいて軸方向に移動される。これらのステップの各ステップにおいて、基準画像に基づいて検出された比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置に対し、対応の試料画像に基づいて検出された比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置ずれが検出される。修正情報として所定の対応関数（Zuordnungsfunktion）が作成され、該対応関数の関数値は、夫々、各々のステップにおいて検出された対応の比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置ずれを、光軸線に沿ったそれらの軸方向のｚ位置に依存して表わしている。この対応関数は、所謂修正規則を表わし、該修正規則は、基準面から点物体までの間隔に依存し、横方向のｘ／ｙ位置の修正を行い、該修正は、画像域の横方向の歪みにより発生するこの点物体の誤り局在化を補償ないし相殺する。

被写界深度範囲のステップごとの移動により検出された複数の関数値の間に位置する対応関数の値は、例えば補間法により決定することが可能である。従って被写界深度範囲のステップごとの移動では、離散的に検出された幾つかの関数値だけが存在するにもかかわらず、連続的な対応関数を検出することが可能である。

可能な一実施形態において、点物体の横方向のｘ／ｙ位置は、画像処理により、対応の試料画像において直接的に修正される。このことは、予め記憶された位置を修正し、修正された位置に基づいて新たに試料画像を生成するという回りくどい方法を行うことなく、ユーザに対し、点物体の修正された位置が直接的に表示されるという利点を有する。（また点物体の横方向のｘ／ｙ位置は、対応の試料画像から取得されたデータセットにおいて修正され、この修正されたデータセットに基づき、修正された試料画像が生成されることも考慮される。）

好ましくは、比較構造体は、少なくとも１つの他の試料画像において、検知器により検知された画像輝度に依存して特定され、即ち検知器において発生され、この構造体に寄与する光点の総数を考慮して特定される。この実施形態は、移動された被写界深度範囲において検出されたｘ／ｙ位置が、それまで結像誤差を伴っていた位置を修正するためだけに利用されるのではなく、同時に高解像度の全局在画像を生成させるために援用されると特に有利である。それにより全局在画像において、好ましくない輝度差を回避することが可能である。（因みに横方向のｘ／ｙ位置ずれは、相関分析法により検出することが可能である。）

軸方向の個々のｚ変位距離の合計は、実質的に被写界深度範囲のｚ方向の軸方向の大きさと同じである。しかし全体として被写界深度範囲をｚ方向において、被写界深度範囲の大きさよりも大きな区間分、変位させることも同様に可能である。つまりこの場合、個々のステップにおいて生成された試料画像を点物体の位置の修正後に１つの全局在画像にまとめると、この全局在画像は、ｚ方向において、被写界深度範囲よりも大きな範囲をカバーすることになる。従って特に複雑な３次元構造体を高解像度で結像させることができる。

好ましくは、軸方向のｚ変位距離は、センサを用いて検知される。それにより点物体の横方向のｘ／ｙ位置の修正のために入力される軸方向のｚ変位距離が常に正確に分かっていることが保証されている。

試料に対して相対的な被写界深度範囲の移動は、光軸線に沿って試料が結像光学系に対して相対的に移動されるか又は光軸線に沿って結像光学系が試料に対して相対的に移動されることにより行うことが可能である。しかし本発明は、このことに限定されているわけではない。つまり例えば、結像光学系の光軸線に沿って物体空間内で被写界深度範囲を移動させるために、変形可能レンズや、変形可能ミラーや、空間的な光変調器などを使用することも同様に可能である。原理的には、任意の方式で被写界深度範囲を移動させることが可能である。

特に有利な一実施形態において、光軸線に沿った夫々の点物体のｚ位置は、夫々の試料画像において点物体を描写する光点の特性値（特性パラメータ）を検出し、この特性値に対し、予め定められた対応情報に基づいてｚ位置を対応させることにより検出される。特性値としては、例えば冒頭に記載した非点収差方法におけるように、点物体を表わす光点の形状を特徴付ける値が考慮される。選択的には、既知のバイプレーン方法の場合のように、２つの光点の大きさを互いに関連付ける特性値を利用することも可能であり、この際、前記２つの光点は、１つの同じ光点に由来し、複数の検知面において発生され、これらの検知面の対応の焦点面は、物体空間内ではｚ方向において互いにずらされている。

好ましくは、所定の試料画像において検出された点物体のｚ位置は、予め定められた軸方向のｚ変位距離に依存して他の試料画像において検出された同じ点物体のｚ位置と比較される。そしてこの比較に依存し、所定のｚ修正情報が作成され、該ｚ修正情報に基づき、上記の対応情報に依存して検出された点物体のｚ位置が修正される。この実施形態は、実際の光学顕微鏡的測定に先立って決定されており且つ当該測定において検出された特性値と点物体の軸方向のｚ位置との間の対応を可能とする対応情報が、多くの場合は不正確であり、従ってｚ位置の精密な決定が困難であるという問題を排除してくれる。この場合、ｚ修正情報に基づき（最初から不正確な）対応情報を修正することが可能である。

本発明の更なる一視点により、請求項１４に記載した、点物体を局在化するための光学顕微鏡装置が提供される。

以下、図面を用いて本発明の実施例を詳細に説明する。

本発明の一実施例による光学顕微鏡装置を模式的に示す図である。 一方の断面図は、物体空間内で歪みのないＰＳＦを示し、他方の断面図は、物体空間内でコマ収差により歪んだＰＳＦを示す、２つの模式的な断面図である。 コマ収差のない３次元のパイプ状の構造体を示す、２つの模式的な図である。 コマ収差のあるパイプ状の構造体を示す、図３に対応する２つの模式的な図である。 Ｘ字形の構造体を、被写界深度範囲と該Ｘ字形の構造体の画像と共に示す、模式的な図である。 Ｘ字形の構造体と該Ｘ字形の構造体の画像を、本発明による一例の方法の第１ステップにおいて示す、模式的な図である。 Ｘ字形の構造体と該Ｘ字形の構造体の画像を、該方法の第２ステップにおいて示す、模式的な図である。 Ｘ字形の構造体と該Ｘ字形の構造体の画像を、該方法の第３ステップにおいて示す、模式的な図である。 Ｘ字形の構造体と該Ｘ字形の構造体の画像を、該方法の第４ステップにおいて示す、模式的な図である。 Ｘ字形の構造体と該Ｘ字形の構造体の画像を、該方法の第５ステップにおいて示す、模式的な図である。 図６〜図１０に示されたステップによる比較構造体の横方向のｘ位置を示すグラフである。 本発明による対応関数を示すグラフであり、該対応関数の関数値は、ｚ位置に依存する横方向のｘ位置ずれを示している。

図１は、試料１４を検知器１６へ結像する結像光学系１２を備えた光学顕微鏡装置１０を純粋に模式的な図として示している。この際、試料１４は、試料支持体２８上に配置されている。

結像光学系１２は、被写界深度範囲（Schaerfentiefenbereich）１８を有し、該被写界深度範囲１８は、光軸線Ｏに沿って軸方向の大きさｔを有する。以下、光軸線Ｏは、直交座標系（デカルト座標系）のｚ軸と平行であり、該直交座標系の他のｘ軸とｙ軸は光軸線Ｏに対して直角に配設されていることが前提とされる。

光学顕微鏡装置１０は、更に制御ユニット２０を含んでおり、該制御ユニット２０は、光学顕微鏡装置１０の全稼働を制御する。特に制御ユニット２０は、局在化（位置を特定すること Lokalisierung）のために必要な計算と評価を行う計算手段を有する。更に制御ユニット２０は、ピエゾアクチュエータ（圧電駆動器）２２を制御し、該ピエゾアクチュエータ２２を用い、結像光学系１２は、被写界深度範囲１８を光軸線Ｏに沿って即ちｚ方向において移動させるために、光学軸線Ｏに沿って移動される。制御ユニット２０と接続されたセンサ２４は、結像光学系１２及びそれと共に被写界深度範囲１８が物体空間内で移動するｚ変位距離を検知する。

試料１４は、多数の点物体２６を含んでおり、これらの点物体２６は、結像すべき構造体（観察対象）に付着する蛍光マーカにより構成されている。顕微鏡的記録中、点物体２６は、個々に光点として検知器１６へ結像される。そのように発生された光点は、点物体２６の局在化のために制御ユニット２０において評価される。

図１による光学顕微鏡装置１０は、試料１４に含まれる点物体２６を物体空間内で局在化するために用いられる。そのために光学顕微鏡装置１０の制御ユニット２０は、光軸線Ｏに沿った夫々の点物体２６のｚ位置、並びに光軸線Ｏに対して直角に位置する平面内における横方向（ラテラル）のｘ／ｙ位置を検出する。

以下、例えばコマ収差により発生する画像域の横方向の歪みが本発明によりどのように修正されるかについて説明する。

この際、先ず図２〜図４に関連し、横方向の画像歪みが、横方向において点物体２６を局在化するときの精度に対してどのように影響するのかについて具体的に説明する。

図２には、コマ収差が３次元空間内で夫々の点物体に対応するＰＳＦの歪みをどのようにもたらすかについて具体的に示されている。この際、図２の左側の部分図には、先ず誤差のない１つのＰＳＦ（点像分布関数）３０の理想の場合が示されており、このＰＳＦ３０は、図２においてｚ’で記されたこのＰＳＦ３０の縦軸線に沿って放射状に対称性を有している。この際、ＰＳＦ３０の縦軸線ｚ’は、光軸線Ｏと平行であり、従って図２において示された座標系のｚ軸と平行に位置している。

コマ収差は、ＰＳＦ３０の歪みをもたらし、この歪みにより、図２の右側の部分図に示されているように、ＰＳＦ３０の放射状の対称性が破壊される。放射状の対称性のこの破壊は、ｘｙ面内のＰＳＦ３０の重心の横方向の移動をもたらす。図２から直接的に見て取れるように、横方向の重心移動は、ｚ位置に依存している。

つまりコマ収差は、様々なｚ位置において、個々の点物体に対応するＰＳＦの重心が、もはや同じｘｙ位置には存在しないということをもたらす。またコマ収差に代わり、空間内でＰＳＦの傾きが観察される場合にも、対応する現象が得られる。

つまり重心移動という上述の現象を結果として伴う結像誤差がある場合、このことは、図３と図４の比較が示しているように、高解像度の試料画像において画像誤差をもたらすことになる。この際、図３は、３次元のパイプ状の構造体３２の画像を示しており、該構造体３２は、ｚ軸に沿って延在している。この構造体３２は、例えば適切な色素で着色されているべきであり、その色素の複数の分子が冒頭に説明した方式で局在化される。その後、検出されて保存された複数の位置情報から、１つの高解像画像が作り上げられる。このことは、図３の右側の部分図において、３次元空間内で局在化された全ての点物体に基づく一例の２次元投影図として具体的に示されている。この２次元投影図では、観察された構造体は、円形で描写されている。

図３が誤差のない場合を示しているのに対し、図４は、画像域の横方向の歪みの影響を具体的に示している。それによると画像域の横方向の歪みは、図４の左側の部分図が示しているように、ｚ位置は確かに異なるがｘ／ｙ位置は同じとなる分子位置が誤って様々なｘ／ｙ位置へ移されてしまうということをもたらす。従ってその２次元投射図では、図４の右側の部分図が示しているように、本来の円形からのずれが見られる。

以下、図５〜図１２に関連し、上述した画像域の横方向の歪みが本発明によりどのように修正されるかについて、例を用いて説明する。

図５は、左側の図部分において、Ｘ字形の構造体３２を示しており、該構造体３２は、例としてｘｚ面内に延在している。ｘ字形の構造体３２は、適切な色素で着色されているべきであり、それらの色素が局在化すべき点物体２６（図１参照）を構成している。これらの色素の局在化のためにそれらの位置が、図５で矩形面として示された被写界深度範囲１８内において検出される。それから生成される高解像画像が図５の右側の図部分に描写されている。従ってこの右側の図部分は、左側の図部分に示された物体空間に対して光学的に共役とされている画像空間を示している。

以下、説明を簡単にするために、結像光学系１２がｘ方向においてのみ画像域の歪みを引き起こすものと想定する。結果としてｘ方向において歪んだ画像は、連続線（太線）を用いて示されている。それに対し、画像域の歪みを伴わない理想的な結像の場合に生成されるであろう画像は、鎖線で示されている。

更に図５では、被写界深度範囲１８の（ｚ方向で見て）中央の焦点面又は焦平面が符号３４で示されている。この際、図５の左側の図部分においても、図５の右側の図部分においても（そして更なる図６〜図１０においても）、左側の図部分は、物体空間を示し、右側の図部分は、それに対する光学的に共役な画像空間を示しているが、同じ符号が付けられていることを指摘しておく。

図６〜図１０には、複数の点物体２６の横方向のｘ／ｙ位置について本発明による修正を行うために、どのように被写界深度範囲１８が、複数のステップの夫々において、光軸線Ｏに沿って物体空間内でｚ変位距離Δｚ分だけ移動されるかについて示されている。

図６〜図１０に示された方法は、以下の考察に基づいている。ｘ方向における画像域の横方向の歪みの結果、被写界深度範囲１８内においてｘ位置は確かに同じであるがｚが異なる複数の点物体は、結像光学系１２により生成される画像内では、異なるｘ位置において描写される。しかし物体空間と画像空間との間のｘ位置対応が定義に従い正しいとされる被写界深度範囲１８内のｚ位置を定義することが可能である。従って被写界深度範囲１８内のこのｚ位置は、基準位置（Referenzposition）を構成する。それに対応し、物体空間内でこのｚ位置にあるｘｙ面は、基準面を定義する。この実施例において被写界深度範囲１８の中央の焦点面３４は、そのような基準面として援用される。（実際のケースないし本出願の文脈において、コマ収差（画像域の横方向の歪み）は、特に被写界深度範囲内の（異なるｚ位置における）２つの異なるｘｙ面が横方向（即ちｘｙ方向）において互いにずれていることを意味する。１つの面は、それ自体で見ると画像域の横方向の歪みを含むものではない。画像域の横方向の歪みは、あくまでも、複数の異なる面の横方向のずれに基づくものであり、それにより全３Ｄ画像の画像域の横方向の歪みが発生する。上記基準面として焦点面３４とは異なる面を選択することも可能である。例えば被写界深度範囲の最下部の面、即ち図５においてｘ軸の位置する面や、或いは被写界深度範囲の最上部の面を選択することも可能であろう。）図６〜図１０において示された一連のステップは、所定の対応関数を修正情報として作成することを目的としており、該対応関数は、基準面３４から１つの点物体までの間隔に依存してｘ位置の修正を考慮しており、該修正は、画像域の横方向の歪みにより発生したｘ方向の誤り局在化を正に補償ないし相殺する。

本実施例において前記対応関数は、Ｘ字形の構造体３２の１つの画像だけでなく、夫々Δｚ分だけずらされた被写界深度範囲１８を有する全部で５つの画像が生成されることにより作成される。

本実施例の修正方法は、図６によるステップ１において開始し、該ステップ１において、基準面として機能する被写界深度範囲１８の焦点面３４は、物体空間内で光軸線Ｏに沿ってポジションｚ_１に位置している。図６の右側の図部分は、この配置構成から結果として得られる１つの高解像画像を示している。

引き続き、図７によるステップ２において、結像光学系１２とその被写界深度範囲１８は、既知のｚ変位距離Δｚ（＝ｚ_２−ｚ_１）分だけ光軸線Ｏに沿って移動され、それにより基準面として機能する焦点面３４は、ポジションｚ_２に到達する。再びこの配置構成において１つの高解像画像が生成され、この際、結果として得られる画像を、先行のステップ１において生成された画像と比較してΔｚ分だけ移動させてしまうことのないように（即ち互いの画像間のΔｚ分のずれをなくすために）ｚ方向において局在化された位置が、対応して大きさΔｚ分だけ修正される。そのようにして生成された画像においてＸ字形の構造体３２は、ｚ方向のｚ_２以外の全てのｚ位置において歪んで描写されており、このことは、再び鎖線で示された理想構造体と比べて見ることができる。図６と図７の比較が示すように、高解像画像内の歪みは、被写界深度範囲１８の移動と共に変化しており、これは、Ｘ字形の構造体３２が被写界深度範囲１８内において自身の位置を変化させるからである。

図８〜図１０において示されているように、引き続き更なるステップ３、４、５において、被写界深度範囲１８は、相次いで、夫々、予め定められたｚ変位距離Δｚ分だけ光軸線Ｏに沿って移動される。それにより基準面３４は、言わばＸ字形の構造体３２を物体空間内で光軸線Ｏに沿って走査することになる。

５つの高解像画像の生成後、例えば、ステップ３において基準面３４内にあるＸ字形の構造体３２の部分が比較構造体（Vergleichsstruktur）として選択される。この比較構造体は、引き続き、ステップ１、２、４、５において生成された他の画像においても特定される。そして比較構造体の横方向のｘ位置が、異なるステップにおいて生成された個々の画像に基づいて検出される。比較構造体は、個々の画像の記録時には、被写界深度範囲１８に対して相対的に異なるｚ位置にあったので、ｘ方向における画像域の歪みの結果、画像ごとに異なるｘ位置が得られることになる。これらのｘ位置は、図１１によるグラフにおいて個々のステップ１〜５に対するものとして示されている。

最終的に所望の対応関数は、ステップ３（図８）において検出された比較構造体のｘ位置（ｘ_３）に対する、ステップ１、２、４、５において検出された比較構造体の横方向のｘ位置ずれを、対応するｚ位置（ｚ_１，ｚ_２，ｚ_４，ｚ_５）に対してプロットすることにより得られる。このことが図１２によるグラフに示されている。そしてステップ１〜５に対応する、対応関数（割当て関数 Zuordnungsfunktion）の５つの関数値を、最終的に連続的な対応関数を取得するために、例えば補間法の方式において中間値を作成するためのノード（節点）として利用することが可能である。歪みのない高解像画像を生成させるために、そのような対応関数を用いることにより、全てのｚ位置に対して横方向の位置ずれを表わすことが可能である。

１０ 光学顕微鏡装置
１２ 結像光学系
１４ 試料
１６ 検知器
１８ 被写界深度範囲
２０ 制御ユニット
２２ 位置調節ユニット（ピエゾアクチュエータ）
２４ センサ
２６ 点物体
２８ 試料支持体
３０ ＰＳＦ（点像分布関数）
３２ パイプ状の構造体
３２ Ｘ字形の構造体
３４ 基準面（被写界深度範囲の焦点面）

Claims (10)

1. 試料（１４）内の複数の点物体（２６）を局在化するための局在顕微鏡検査の光学顕微鏡的方法であって、
   物体空間内に配置された前記試料（１４）は、前記物体空間内で自身の光軸線（Ｏ）に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさ（ｔ）の被写界深度範囲（１８）を有する結像光学系（１２）を用い、検知器（１６）へ結像され、そして
   前記試料（１４）内に含まれる前記点物体（２６）は、前記検知器（１６）において前記試料（１４）の結像により生成される試料画像に基づき、前記光軸線（Ｏ）に対して直角の方向における前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、前記被写界深度範囲（１８）内において局在化されるという形式の方法であり、
   前記点物体（２６）が局在化される前記被写界深度範囲（１８）は、前記物体空間内で前記光軸線（Ｏ）に沿って前記試料（１４）に対して相対的に、少なくとも一回、前記被写界深度範囲（１８）の軸方向の前記大きさ（ｔ）よりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離（Δｚ）分だけ移動され、軸方向に移動された前記被写界深度範囲（１８）において、前記試料（１４）は、前記結像光学系（１２）を用いて新たに前記検知器（１６）へ結像されて１つの更なる試料画像が生成され、
   この更なる試料画像に基づき、新たに前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
   異なる前記試料画像に基づいて検出された夫々同じ前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが検出され、そして
   検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれから、所定の修正情報が生成され、該修正情報は、前記被写界深度範囲（１８）内の所定の基準面（３４）から前記点物体（２６）までの間隔の関数であり、該修正情報を用いて横方向の画像歪みが修正されること、及び、
   前記被写界深度範囲（１８）内において、前記光軸線（Ｏ）に対して直角に位置する少なくとも１つの基準面（３４）であって、前記被写界深度範囲（１８）の移動時には、前記被写界深度範囲（１８）に対して相対的に定置に留まる基準面（３４）が定義され、
   前記試料画像の１つが、基準画像として確定され、該基準画像に基づき、１つの比較構造体であって、前記基準画像の記録時に前記被写界深度範囲（１８）の前記基準面（３４）内に配置されている前記点物体（２６）の少なくとも１つを表わす比較構造体が定義され、
   前記比較構造体は、少なくとも１つの他の前記試料画像において特定され、
   異なる前記試料画像に基づき、夫々、前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
   異なる前記試料画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが決定され、そして
   前記修正情報は、前記比較構造体に対して検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれに依存して作成されること
   を特徴とする方法。
2. 前記被写界深度範囲（１８）は、複数のステップにおいて軸方向に移動され、
   これらのステップの各ステップにおいて、前記基準画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置に対し、対応の前記試料画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置ずれが検出され、そして
   前記修正情報として所定の対応関数が作成され、該対応関数の関数値は、夫々、各々のステップにおいて検出された対応の前記比較構造体の横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれを、前記光軸線（Ｏ）に沿ったそれらの軸方向のｚ位置に依存して表わしていること
   を特徴とする、請求項１に記載の光学顕微鏡的方法。
3. 前記被写界深度範囲（１８）のステップごとの移動により検出された複数の関数値の間に位置する前記対応関数の値は、補間法により決定されること
   を特徴とする、請求項２に記載の光学顕微鏡的方法。
4. 前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置は、画像処理により、対応の前記試料画像において直接的に修正されること
   を特徴とする、請求項２又は３に記載の光学顕微鏡的方法。
5. 前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置は、対応の前記試料画像から取得されたデータセットにおいて修正され、この修正されたデータセットに基づき、修正された試料画像が生成されること
   を特徴とする、請求項２又は３に記載の光学顕微鏡的方法。
6. 軸方向の個々の前記ｚ変位距離（Δｚ）の合計は、実質的に前記被写界深度範囲（１８）のｚ方向の軸方向の前記大きさ（ｔ）と同じであること
   を特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の光学顕微鏡的方法。
7. 軸方向の前記ｚ変位距離（Δｚ）は、センサ（２４）を用いて検知されること
   を特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の光学顕微鏡的方法。
8. 前記被写界深度範囲（１８）は、前記光軸線（Ｏ）に沿って前記試料（１４）が前記結像光学系（１２）に対して相対的に移動されるか又は前記光軸線（Ｏ）に沿って前記結像光学系（１２）が前記試料（１４）に対して相対的に移動されることにより、軸方向の前記ｚ変位距離（Δｚ）分だけ、前記物体空間内において前記光軸線（Ｏ）に沿って前記試料（１４）に対して相対的に移動されること
   を特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の光学顕微鏡的方法。
9. 試料内の複数の点物体（２６）を局在化するための光学顕微鏡装置（１０）であって、
   物体空間内で自身の光軸線（Ｏ）に沿って予め定められたｚ方向の軸方向の大きさ（ｔ）の被写界深度範囲（１８）を有する結像光学系（１２）と、
   前記物体空間内に配置された試料（１４）が前記結像光学系（１２）により結像される検知器（１６）と、
   前記結像光学系（１２）が前記検知器（１６）において生成させる試料画像に基づき、前記光軸線（Ｏ）に対して直角の方向における前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置を検出することにより、前記被写界深度範囲（１８）内において、前記試料（１４）内に含まれる前記点物体（２６）を局在化する制御ユニット（２０）とを有するという形式の光学顕微鏡装置であり、
   前記制御ユニット（２０）により制御される位置調節ユニット（２２）が、前記点物体（２６）が局在化される前記被写界深度範囲（１８）を、前記物体空間内で前記光軸線（Ｏ）に沿って前記試料（１４）に対して相対的に、少なくとも一回、前記被写界深度範囲（１８）の軸方向の前記大きさ（ｔ）よりも小さい予め定められた軸方向のｚ変位距離（Δｚ）分だけ移動させ、前記結像光学系（１２）は、軸方向に移動された前記被写界深度範囲（１８）において、前記試料（１４）を新たに前記検知器（１６）へ結像し、１つの更なる試料画像を生成させ、
   前記制御ユニット（２０）は、更なる前記試料画像に基づき、新たに前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置を検出し、
   前記制御ユニット（２０）は、異なる前記試料画像に基づいて検出された夫々同じ前記点物体（２６）の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれを検出し、そして
   前記制御ユニット（２０）は、検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれから、所定の修正情報を作成し、該修正情報は、前記被写界深度範囲（１８）内の所定の基準面（３４）から前記点物体（２６）までの間隔の関数であり、前記制御ユニット（２０）は、該修正情報を用いて横方向の画像歪みを修正すること、但し、
   前記被写界深度範囲（１８）内において、前記光軸線（Ｏ）に対して直角に位置する少なくとも１つの基準面（３４）であって、前記被写界深度範囲（１８）の移動時には、前記被写界深度範囲（１８）に対して相対的に定置に留まる基準面（３４）が定義され、
   前記試料画像の１つが、基準画像として確定され、該基準画像に基づき、１つの比較構造体であって、前記基準画像の記録時に前記被写界深度範囲（１８）の前記基準面（３４）内に配置されている前記点物体（２６）の少なくとも１つを表わす比較構造体が定義され、
   前記比較構造体は、少なくとも１つの他の前記試料画像において特定され、
   異なる前記試料画像に基づき、夫々、前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置が検出され、
   異なる前記試料画像に基づいて検出された前記比較構造体の横方向のｘ／ｙ位置の間における横方向のｘ／ｙ位置ずれが決定され、そして
   前記修正情報は、前記比較構造体に対して検出された横方向の前記ｘ／ｙ位置ずれに依存して作成されること
   を特徴とする光学顕微鏡装置。
10. 前記被写界深度範囲（１８）の軸方向の前記ｚ変位距離を検知するためのセンサ（２４）が設けられていること
    を特徴とする、請求項９に記載の光学顕微鏡装置。

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