JP6706210B2 - 脳および脊髄に標的化遺伝子移入するためのウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明は、脳および／または脊髄の細胞に特異的に結合する新規ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関する。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ウイルスカプシドの一部であり得て、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、対象に全身投与後、脳および／または脊髄に組み換え型ウイルスベクターを選択的に誘導するために使用することができ、脳および／または脊髄において組み換え型ウイルスベクターが１つまたは複数のトランスジーンの組織特異的発現を提供する。それゆえ、本発明は、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の少なくとも１つを含有するカプシドと、カプシド内にパッケージングされた少なくとも１つのトランスジーンとを含む組み換え型ウイルスベクター、好ましくはＡＡＶウイルスベクターにも関する。ウイルスベクターは、脳および／または脊髄の疾患または機能的障害の治療的処置にとって特に好適である。本発明はさらに、本発明のウイルスベクターを含む細胞および医薬組成物に関する。

ウイルスベクターの使用による遺伝子治療処置は、従来の処置に応答しない、または十分に応答しない疾患の有望な処置選択肢である。このアプローチは、ゲノムにそれぞれの遺伝子の配列を含むように改変されているウイルスを使用して、処置される生物に治療遺伝子を導入することに基づく。遺伝子治療アプローチにおいて遺伝子治療のために使用されているウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの骨格を有する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的安全であると考えられていることから、臨床での実践に使用するための有望な候補体である。ＡＡＶベクターは、組織にトランスジーンを導入することができ、トランスジーンを安定かつ効率よく発現させることができる。同時に、これらのベクターは、いかなる公知の病原性機構も有しない［１］。血清型２のＡＡＶベクター（ＡＡＶ２）は、臨床で使用するために特に重要であり、これらのベクターは、特に十分に調べられている。ＡＡＶベクターによる導入後、トランスジーンは、トランスフェクトした細胞内で様々な型、例えばエピソーム、一本鎖または二本鎖ＤＮＡとして存在することができる。ＤＮＡのコンカテマー型も同様に形質導入細胞において見出された。

ＡＡＶ２のゲノムは、長さが約４７００ヌクレオチドの直線状の一本鎖ＤＮＡ分子であり、両方の末端に末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。ゲノムはさらに、複製領域（ｒｅｐ）およびカプシド領域（ｃａｐ）と呼ばれる２つの大きいオープンリーディングフレームを含む。複製領域は、ウイルス複製に関連して必要なタンパク質をコードする。これに対し、カプシド領域は、ウイルスの正二十面体カプシドを構成する構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。

遺伝子治療において使用することができ、技術水準において公知の多くのベクターと同様に、野生型のＡＡＶベクター、例えば開示されたＡＡＶ２ベクターは、特異的組織に対して十分な特異性を有しない代わりに広く多様な細胞タイプに感染する。これらの野生型ベクターの全身投与後では、標的組織の形質導入は不十分で、他の組織の望ましくない形質導入により、処置された患者に重度の免疫反応が起こることを予想しなければならない。ベクターを特異的臓器に誘導することができるペプチドリガンドを使用することによって、特定の臓器に対する特異性が増加したウイルスベクターの開発が進んでいる［２〜３］。特異的ペプチドリガンドは、脳などの異なる臓器への「ホーミング」を提供することを示すことができた。

参考文献［４］は、ランダム化ペプチドライブラリにおいて指向性が改変されたＡＡＶ２のカプシドのスクリーニングを可能にする方法を記述している。これらのライブラリから、インビトロで所望の細胞タイプに特異的に形質導入するベクターを単離することができる。しかし、このようにして選択したカプシドはしばしば、必要な特異性が動物モデルにおいて失われていることから、インビボで使用するためには適していないことが見出されている［５］。

臨床的観点から、脳は、多様な神経疾患の出発点であることから、きわめて適切な臓器である。この臓器を遺伝子治療介入にとって到達可能にするために相当な努力が行われている［６〜１２］。しかし、上皮細胞、周皮細胞、星状細胞で構成され、循環中の粒子、毒素、およびシグナル化合物から脳を封止する血液脳関門は、通常のベクター系が通過することができない障壁を表す。静脈内適用後に十分な効率で脳に形質導入する好適なベクター系は、これまでのところ利用できないことから、現行の遺伝子治療ベクターは通常、脳に直接注射され［１３］、このことは患者のより高いリスクに関連する。例えば、超音波［１４］または化学的薬剤［７］によって血液脳関門を短時間、透過性にする可能性は、非常にリスクが高いと考えられている。

したがって、ウイルスベクターの指向性を調節することができ、それによって脳または脊髄の組織へのウイルスベクターの標的化輸送を可能にする十分な細胞または組織特異性を提供する作用剤が非常に求められている。そのようなベクターは、これらの組織において治療遺伝子の特異的発現をもたらすことができ、それによって脳および脊髄における疾患および／または機能障害を有効に処置することができる。

本発明は、脳および脊髄への標的化遺伝子移入のためのウイルスベクターを提供する。本発明のウイルスベクターは、脳のニューロン上ならびに脳および脊髄の血管の内皮細胞上の受容体によってインビボで特異的に認識されるこれまで未知のアミノ酸配列をそのカプシド表面に発現する。このようにして、本発明のウイルスベクターは、対象に全身投与後、脳および脊髄の組織に特異的に形質導入する。

本発明のウイルスベクターはさらに、脳のニューロンならびに脳および脊髄の血管の内皮細胞におけるトランスジーンの強力かつ持続的な発現を可能にする。それゆえ、ベクターは、脳および脊髄の定義された疾患または状態の遺伝子治療処置にとって特に適している。さらに、ＡＡＶベクターを宿主にトランスフェクション後、ＡＡＶベクターがもたらす免疫反応はごく軽微であることが見出されており、それゆえ、ＡＡＶベクターは、遺伝子治療にとって特に適している。

発明の詳細な説明

本発明において、ＡＡＶ２のランダム化７量体ペプチドライブラリでの選択によって、中枢神経系、すなわち脳および脊髄に対して特異的である様々な配列を同定した。脳に対して特定の特異性を有する７量体は、ペプチドＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号１）であった。この配列に基づいて、カプシドタンパク質ＶＰ１の部分配列としてペプチド配列ＮＲＧＴＥＷＤを発現する組み換え型ウイルスベクターｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤを産生した。次に、ベクターｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤをマウスに静脈内投与すると、中枢神経系に対するベクターの明確な特異性をインビトロおよびインビボの両方で観察することができた。脳のニューロンならびに脳および脊髄の血管の内皮細胞の両方がベクターによってトランスフェクトされた。特異性を、本発明の実施例に記述されるようにＣＤ３１による染色によって確認した。

また脳および脊髄に対して特異性を示したペプチドのさらなる群は、ペプチドＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号２）、ＤＤＧＶＳＷＫ（配列番号３）、ＳＤＧＬＴＷＳ（配列番号４）、およびＳＤＧＬＡＷＶ（配列番号５）を包含した。これらのペプチドは、一般的なモチーフＸＤＧＸＸＷＸ（配列番号６）を含有した。

本発明は、それゆえ、脳および脊髄に対して特異的で、処置される対象の脳または脊髄にそれぞれウイルスベクターなどの治療剤を誘導するために特に好適な異なるペプチド配列を提供する。

第一の態様において、それゆえ、本発明は、配列番号１またはそのバリアントのアミノ酸配列を含み、該バリアントが最大で１つのアミノ酸の改変によって配列番号１のアミノ酸配列とは異なる、脳および／または脊髄の細胞に特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関する。本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、好ましくは脳または脊髄の内皮細胞および／またはニューロンに結合する。

第二の態様において、本発明は、配列番号６の一般的なアミノ酸配列を含む、脳および／または脊髄の細胞に特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関する。特に好ましい実施形態において、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号２）、ＤＤＧＶＳＷＫ（配列番号３）、ＳＤＧＬＴＷＳ（配列番号４）、またはＳＤＧＬＡＷＶ（配列番号５）またはそのバリアントの配列の１つを含み、該バリアントは最大で１つのアミノ酸の改変によって配列番号２〜５のそれぞれのアミノ酸配列とは異なる。本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、好ましくは脳または脊髄の内皮細胞および／またはニューロンに結合する。

本開示の文脈において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合で互いに接続された２〜１０個のアミノ酸の連結を意味する。用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに接続された１１〜１００個のアミノ酸の連結を意味する。１００個を超えるアミノ酸を有するポリペプチドは、本明細書において「タンパク質」と呼ばれる。

本発明に従う特に好ましい実施形態において、配列番号１もしくはそのバリアント、または配列番号２〜６もしくはそのバリアントのペプチド配列は、脳および脊髄に対して特異的であり、ウイルスのカプシドタンパク質の一部である。このことは、脳および脊髄に対して特異的である配列が、ウイルスのカプシドタンパク質の一部として存在することを意味する。そのようなカプシドタンパク質を産生するために、ペプチドをコードする対応するヌクレオチド配列を、ウイルスのカプシドタンパク質をコードするウイルスゲノムの領域にクローニングする。脳および脊髄に対してそれぞれ特異的である配列が、カプシドタンパク質の一部として発現されると、該配列は、ウイルスベクターの表面全体に多数のコピーで存在することができる。

カプシドタンパク質は、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するタンパク質である。ＡＡＶは、従来技術において記述される任意の血清型のウイルスであり得、カプシドタンパク質は、好ましくは血清型２、４、６、８、および９の１つのＡＡＶに由来する。血清型２のＡＡＶのカプシドタンパク質が特に好ましい。

ＡＡＶ野生型のカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３で構成され、これらは重なり合うｃａｐ領域によってコードされる。３つすべてのタンパク質は、同じＣ−末端領域を有する。ＡＡＶのカプシドは、１：１：８の比率で発現されるタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を約６０コピー含む。脳および脊髄に対してそれぞれ特異的であり、本明細書において記述されるペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列を、Ｃ−末端でＶＰ１のリーディングフレーム（すなわち、３つすべてのタンパク質において同一である領域）にクローニングすると、理論的に６０個の特異的ペプチドがカプシド表面上に見出され得ると予想することができる。

本発明の文脈においてＡＡＶベクターが改変されている場合、脳に対して特異的であるペプチドをコードするヌクレオチド配列を、次にゲノムの３‘末端でｃａｐ領域にクローニングする。脳および脊髄に対してそれぞれ特異的であるペプチドをコードする配列を、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３の１つのゲノム配列にクローニングすることができる。ＡＡＶ２のカプシドタンパク質は、例として配列番号７（ＶＰ）、配列番号８（ＮＰ２）、および配列番号９（ＶＰ３）によって説明される。

本発明に従う１つの特に好ましい実施形態において、脳および脊髄に対してそれぞれ特異的であるペプチドをコードする配列は、ＶＰ１遺伝子、好ましくは配列番号７に示されるＡＡＶ２のＶＰ１遺伝子のリーディングフレームにクローニングされる。この場合、クローニングされた配列を挿入しても、リーディングフレームのいかなる変化も起こらないこと、または翻訳の中途終止が起こらないことに留意すべきである。上記に必要な方法は、当業者に容易に明らかとなるであろう。

ＡＡＶの３つすべてのカプシドタンパク質において、ホーミング機能のためにペプチド配列を挿入することができる部位が同定されている［１５〜２０］。中でも、具体的には、ＡＡＶ２のＶＰ１の５８８位に存在するアルギニン（Ｒ５８８）が、ペプチドリガンドの挿入に関して提案されている［２１〜２２］。ウイルスカプシドのこのアミノ酸位置は、ＡＡＶ２のその天然の受容体に対する結合に明白に関係している。Ｒ５８８は、ＡＡＶ２のその天然の受容体に対する結合を媒介する４つのアルギニン残基の１つであることが示唆されている［２３〜２４］。カプシドのこの領域の改変は、ＡＡＶ２の天然の指向性を弱めるか、または完全に消失させる。

したがって、配列番号１もしくはそのバリアント、または配列番号２〜６もしくはそのバリアントのペプチド配列は、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質、特に配列番号７のＶＰ１タンパク質の５５０〜６００位のアミノ酸の領域に挿入型で存在することが、本発明に従って特に好ましい。さらにより好ましくは、ペプチド配列は、ＶＰ１タンパク質の５６０〜６００、５７０〜６００、５６０〜５９０、５７０〜５９０位のアミノ酸の領域に挿入型で存在する。

このように、配列番号１もしくはそのバリアント、または配列番号２〜６もしくはそのバリアントのペプチド配列は、例として、ＶＰ１タンパク質、特に配列番号７のタンパク質の以下のアミノ酸の１つの直後に結合させることができる：５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、または６００位。

配列番号１もしくはそのバリアントまたは配列番号２〜６もしくはそのバリアントのアミノ酸配列は、実施例に示されるように配列番号７のＶＰ１タンパク質の５８８位のアミノ酸の後に続くことが特に好ましい。この場合、クローニングの結果である１つまたは複数、特に５個まで（すなわち、１、２、３、４または５個）のアミノ酸が５８８位のアルギニン残基と本発明のペプチドまたはそのバリアントの最初のアミノ酸との間に存在することが可能である。同様に、１つまたは複数、特に５個まで（すなわち、１、２、３、４または５個）のアミノ酸が、本発明のペプチドまたはそのバリアントの最後のアミノ酸の後に存在することができる。

ＶＰ１に関して上記のカプシドタンパク質のアミノ酸配列における部位および領域は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ２およびＶＰ３にも同様に当てはまる。ＡＡＶ２の３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、Ｎ−末端配列の長さのみが異なり、従って同一のＣ−末端を有することから、当業者は、ＶＰ１およびＶＰ２のアミノ酸配列においてペプチドリガンドを挿入するための上記の部位を同定するために配列比較を難なく行うであろう。そのため、ＶＰ１における５８８位のアミノ酸は、ＶＰ２（配列番号８）のＲ４５１位およびＶＰ３（配列番号９）のＲ３８６位にそれぞれ対応する。

配列番号１０は、配列番号１のペプチド配列を導入後のＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質の配列の例を示す。クローニングにより、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質の本来の配列には存在しない２つの追加のアミノ酸を有する。そのため、配列番号１のペプチド配列は、そのＮ−末端の５８９位でグリシンに隣接し、そのＣ−末端の５９７位でアラニンに隣接する。加えて、本来の配列の５８７位のアスパラギンは、グルタミンに置換されている。

１つの特定の実施形態において、それゆえ、本発明はまた、以下を含むまたは以下からなるカプシドタンパク質にも関する：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０、９５、または９９％同一であり、およびさらに（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または（ｉｉ）１つのアミノ酸の改変により配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）において定義されたアミノ酸配列の１つの断片。

さらなる態様において、本発明は、脳または脊髄の細胞にそれぞれ特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含み、配列番号１もしくはそのバリアント、または配列番号２〜６もしくはそのバリアントのアミノ酸配列を含むウイルスカプシドに関する。

さらに、本発明はまた、上記のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸も提供する。上記の本発明に従うペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むカプシドタンパク質をコードする核酸も同様に提供される。好ましくは、カプシドタンパク質をコードする核酸は、配列番号１１のヌクレオチド配列、または配列番号１１のヌクレオチド配列に由来する少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。そのような核酸を含むプラスミドもまた提供される。

なお別の態様において、本発明は、カプシドとその中にパッケージングされた少なくとも１つのトランスジーンとを有する、組み換え型、すなわち遺伝子工学技術によって産生されたウイルスベクターに関し、上記カプシドは、配列番号１もしくはそのバリアントまたは配列番号２〜６もしくはそのバリアントのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む。組み換え型ウイルスベクターは、例えば血清型２、４、６、８、９の組み換え型ＡＡＶベクターであり得る。血清型２のＡＡＶベクターは特に好ましい。

異なるＡＡＶ血清型は、その天然の指向性が主に異なる。そのため、野生型ＡＡＶ２は、肺胞細胞に対しより容易に結合するが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９は、上皮細胞に主に感染する。当業者は、本発明に従うペプチドによって媒介される特定の細胞または組織に関する特異性をさらに増強するために、細胞の特異性のこれら天然の差を利用することができる。核酸レベルでは、様々なＡＡＶ血清型は非常に相同である。例えば、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、およびＡＡＶ６は、核酸レベルで８２％同一である［２５］。

本発明に従うウイルスベクターのカプシドは、１つまたは複数のトランスジーンを含む。遺伝子工学によってベクターのゲノムに導入されている遺伝子は、トランスジーンと呼ばれる。トランスジーン（または複数のトランスジーン）は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、トランスジーンは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡなどの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である。好ましくは、本発明に従う組み換え型ウイルスベクターを用いて輸送されるトランスジーンはヒト遺伝子である。好適なトランスジーンには、例えば患者の機能障害遺伝子を置換するための治療遺伝子が挙げられる。トランスジーンはまた、対応する標的組織において発現されていない、または不十分な程度にのみ発現される遺伝子でもあり得る。１つの好ましい実施形態において、本発明に従うウイルスベクターから発現されるトランスジーンは、ａである。

本発明のベクターは、中でも、多発性硬化症（ＭＳ）の処置のために使用することができる。この場合、トランスジーンは、例えばクローディンおよびオクルディンなどの膜タンパク質または密着結合タンパク質をコードする遺伝子であり得る。好ましくは、トランスジーンは、クローディンファミリーの遺伝子、例えばクローディン１をコードする遺伝子である。そのような遺伝子の１つの過剰発現は、疾患によって損傷を受けた血液脳関門を「封止」するために有用であり得る。

加えて、ケモカインアンタゴニストをコードする遺伝子をＭＳの処置のために使用することができる。例えば、「ＣＣＬ２−７ＮＤ」と呼ばれるケモカインＣＣＬ２（ａｋａ ＭＣＰ１）のドミナントネガティブ変異体を発現させることができる。ＣＣＬ２は、炎症部位への免疫細胞の誘引をもたらし、ＭＳの症例では、それによってニューロンのミエリン鞘の炎症性の分解が起こる。これに対し、ドミナントネガティブバリアント「ＣＣＬ２−７ＮＤ」は、二量体を形成して、受容体ＣＣＬ２を遮断し、それによって免疫細胞がもはやニューロンによって誘引されないようにシグナルカスケードを妨害する。

アルツハイマー病の処置に関して、例えばノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）、ネプリライシン、またはコレステロール２４ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を過剰発現させることができ、それによってアミロイドβプラークの分解が起こり、それゆえ、疾患の状態の改善に寄与することができる。

パーキンソン病は、例えば、グリア細胞の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、またはＧＴＰシクロヒドロラーゼ１をベクターの媒介により過剰発現させることによって処置することができ、ここでドーパミン作動性神経系に対する正の影響を予測することができる。脊髄筋萎縮症の処置は、例えば、タンパク質ＳＭＮ（生存運動ニューロン）の発現によって達成することができる。

ライソゾーム蓄積病の治療に関して、本発明のベクターを使用することによるトランスジーンとしてのグルクロニダーゼ、例えば、β−グルクロニダーゼの発現は、有望であろう。

さらなる実施形態において、トランスジーンは、放射線防護酵素などの放射線防護タンパク質をコードする。がんの処置における放射線療法の主要な制約は、放射線による正常組織の損傷であり、これによりしばしば放射線量の低減、処置計画の中断、またはこの型の治療の完全な放棄が必要となる。脳は、特に放射線感受性の高い器官であり、このことは、脳の原発腫瘍がしばしば放射線治療によって限定された程度にしか処置できない理由であり、びまん性の腫瘍増殖を通常、放射線療法によって全く処置することができない理由である。本発明のベクターを用いて、悪性組織周辺の健康な組織を、放射線防護タンパク質の標的化発現により保護することができる。１つの好ましい実施形態において、健康な脳組織に導入されるトランスジーンは、放射線誘発毒性の重要な要因の１つであるスーパーオキシドアニオンの過酸化水素への変換を触媒するマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）である。本明細書において提案されるさらなる実施形態は、放射線によって引き起こされるＤＮＡ損傷の修復に寄与する、毛細血管拡張性運動失調症変異体（ＡＴＭ）遺伝子のキナーゼドメインを必要とする。さらに好ましい実施形態において、処置を受けている患者に、本明細書において記述されるベクターによって両方の遺伝子を導入する。

本発明のウイルスベクターは、脳および／または脊髄の疾患の治療的処置の方法において使用するために特に適している。脳および脊髄の疾患はそれぞれ、本発明の意味において、副腎白質ジストロフィー、カナンバン（Ｃａｎａｎｖａｎ）病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハー病、およびアレキサンダー病などの、遺伝的に引き起こされた白質ジストロフィー；筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、およびピック病などの神経変性疾患；多発性硬化症およびギラン・バレー症候群などの中枢神経系の慢性炎症疾患；ならびにセロイド・リポフスチン症およびファブリー病などのライソゾーム蓄積病を含む。特に好ましい実施形態において、本発明のウイルスベクターは、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病などの神経変性疾患の治療的処置のためである。

なお別の実施形態において、トランスジーンは、腫瘍抑制性タンパク質などの抗腫瘍剤、またはサイトカイン（例えば、インターロイキン１〜４、γ−インターフェロン、ｐ５３）などの免疫調節剤をコードし、これは患者の脳腫瘍または脊髄の腫瘍に選択的に輸送されることが意図される。

ベクターはまた、アンチセンス−ＲＮＡ、リボザイムなどを、脳または脊髄の細胞または組織に輸送するために使用することができる。さらに、本発明に従うベクターはまた、脳または脊髄の微小血管に放出されることが意図される分泌タンパク質をコードするトランスジーンを含む。そのような分泌タンパク質は、例えば抗炎症剤として有効であり得る。

本明細書において使用される用語「対象」は、ＡＡＶベクターが感染することができるあらゆるヒトまたは動物生物を示す。好ましくは、処置される対象は、ヒト、霊長類、マウス、またはラットなどの哺乳動物である。１つの好ましい実施形態において、処置される対象はヒトである。対象にトランスフェクション後、ベクターは、脳または脊髄の細胞においてトランスジーンの部位特異的発現をもたらす。

トランスジーンは、発現されるトランスジーンの配列に加えて、適切な細胞の感染後にトランスジーンの発現を制御する好適なプロモーターなどの発現に必要なエレメントをさらに含む、発現カセットの形でウイルスベクターに存在し得る。好適なプロモーターには、ＡＡＶプロモーターに加えて、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはニワトリβアクチン／サイトメガロウイルスハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）、ＶＥ−カドヘリンプロモーターなどの内皮細胞特異的プロモーター、ならびにステロイドプロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが挙げられる。１つの特に好ましい実施形態において、本発明に従うベクターに使用されるプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。１つの特に好ましい実施形態において、本発明に従うトランスジーンは、発現されるトランスジーンに機能的に連結された脳特異的プロモーターを含む。このようにして、本発明に従うベクターの脳に対する特異性を、さらに増加させることができる。本明細書において使用されるように、脳特異的プロモーターは、脳組織におけるその活性が、脳細胞ではない細胞より少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高いプロモーターである。好ましくは、このプロモーターは、ヒトプロモーターである。発現カセットはまた、発現させる外因性のタンパク質の発現レベルを増加させるためにエンハンサーエレメントを含むことができる。さらに、発現カセットは、ＳＶ４０ポリアデニル化配列またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列などのポリアデニル化配列を含むことができる。

本発明に従うウイルスベクターは、好ましくは、そのカプシドタンパク質の１つの一部として、配列番号１〜５のいずれかのペプチド配列を含み得る。あるいは、配列番号１〜５のアミノ酸配列のバリアントを使用することができ、このバリアントは１つのアミノ酸の改変によって配列番号１〜５のアミノ酸配列とは異なる。改変は、バリアントが、カプシドの一部として、脳および／または脊髄の細胞の受容体構造に対するベクターの特異的結合の媒介能を保持する限り、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であり得る。したがって、本発明は、Ｃ−末端またはＮ−末端アミノ酸が変化している配列番号１〜５の配列のバリアントにも及ぶ。これらのバリアントは、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴを使用して配列を比較した場合に、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列と８５％超の配列同一性を有する。アミノ酸配列同一性を決定するためのこれらのコンピュータープログラムは、当技術分野において十分に公知である。

配列番号１〜５の配列のバリアントは、１つのアミノ酸の置換に基づくことができ、すなわち、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換することができる。好ましくは、バリアントが、配列番号１〜５のアミノ酸配列の１つと異なる置換は、保存的置換、すなわち、ペプチドに類似の機能的特性を与える、１つのアミノ酸と、類似の極性を有するアミノ酸との置換である。好ましくは、置換されたアミノ酸は、置換のために使用されるアミノ酸と同じ群のアミノ酸に由来する。例えば、疎水性残基を、別の疎水性残基に置換することができ、または極性残基を別の極性残基に置換することができる。保存的置換によって相互に交換することができる機能的に類似のアミノ酸には、例えばグリシン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンなどの非極性アミノ酸が挙げられる。非荷電極性アミノ酸の例は、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、およびシステインである。荷電極性（酸性）アミノ酸の例には、ヒスチジン、アルギニン、およびリジンが挙げられる。荷電極性（塩基性）アミノ酸の例には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。

アミノ酸が挿入されているアミノ酸配列もまた、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列のバリアントであると考えられる。原則的に、得られたバリアントが、脳または脊髄の細胞に対するその特異的結合能を保持する限り、そのような挿入を行うことができる。加えて、本発明の文脈において、配列番号２の２つのＮ−末端アミノ酸の１つが欠失しているタンパク質は、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列のバリアントであると考えられる。このように考えられるためには、次に、対応する欠失バリアントが脳または脊髄の細胞に特異的に結合することが必要である。

例えば改変されたアミノ酸を導入することによって１つのアミノ酸で構造的に修飾された、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列の特異的バリアントも同様に本発明に包含される。本発明に従って、これらの修飾されたアミノ酸は、ビオチニル化、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、分岐化および／または環状化によって修飾されているアミノ酸であり得る。

本発明に従うペプチド配列の１つを含むカプシドを有するウイルスベクター、または上記で定義したそのバリアントは、脳および／または脊髄の細胞に特異的に結合する。本明細書において使用される、本発明に従うベクターの「特異的」結合は、全身投与後に、ベクターが主に脳および／または脊髄の細胞上または細胞内に蓄積することを意味する。このことは、当初投与されたベクターゲノムの５０％超が、脳および／または脊髄の細胞の領域に蓄積するが、５０％未満が他の細胞または組織（脾臓または肝臓など）またはその領域に蓄積することを意味する。当初投与されたベクターゲノムの６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超またはさらに９９％超が脳および／または脊髄の細胞内または細胞の領域内に蓄積することが好ましい。ベクターの特異的結合もまた、トランスジーンの発現によって決定することができる。脳および／または脊髄の細胞に特異的に結合するウイルスベクターの場合、トランスジーンの総発現の５０％超が脳および／または脊髄内またはその領域内に存在するが、発現の５０％未満が他の組織内またはその領域内で観察され得る。しかし、測定されたトランスジーンの総発現の６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超または９９％超が、脳および／または脊髄内またはその領域内に存在することが好ましい。

当業者は、脳および／または脊髄の細胞に対する本発明に従うベクターの特異的結合、およびベクターを使用して導入されたトランスジーンンの発現を容易に決定することができるであろう。この目的にとって好適な形質導入および発現の特異性を測定する方法を、以下の実施例に示す。

カプシドが配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列のバリアントを含むベクターは、カプシドが配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有する対応するウイルスベクターの結合活性の少なくとも約５０％を有することもまた、本発明に従って好ましい。バリアントが、カプシドが配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有する対応するウイルスベクターの結合活性の約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有することはさらにより好ましい。ベクターの結合活性は、本明細書に含まれる実施例に記載されるように、インビトロアッセイを用いて測定することができる。

好ましくは、本発明に従うベクターの結合活性は、脳および／または脊髄の細胞に関するウイルスゲノムの分布またはトランスジーンの発現によって決定することができるように、脳または脊髄の細胞ではない対照細胞（脾臓または肝臓の細胞など）に関する結合活性より、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、または１０，０００倍高い。

本発明はまた、本発明に従うペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、それらをコードする核酸、そのような核酸を含むプラスミド、または上記の組み換え型ＡＡＶベクターを含む細胞にも関する。細胞は、好ましくはヒト細胞または細胞株である。

１つの実施形態において、細胞は、例えば、生検によってヒト対象から得られており、その後、エクスビボ手法でウイルスベクターをトランスフェクトされている。次に、細胞を対象に再度植え込むか、または他の様式で、例えば、移植または注入によって、対象に供給することができる。細胞が由来する対象が、細胞が投与される対象と遺伝的に類似である場合、移植された細胞が拒絶される可能性は低い。それゆえ、好ましくは、トランスフェクトされた細胞が供給される対象は、以前に細胞が得られた同じ対象である。細胞は、好ましくは、ヒトの脳または脊髄の細胞、好ましくはニューロン細胞、血管の内皮細胞である。トランスフェクトされる細胞はまた、ヒト成人幹細胞などの幹細胞でもあり得る。トランスフェクトされる細胞は、本発明に従うウイルスベクター、例えば上記の組み換え型ＡＡＶ２ベクターをエクスビボでトランスフェクトされている自己細胞であることが、本発明に従って特に好ましい。細胞は、好ましくは、対象における脳および／または脊髄の障害または疾患を処置する方法において使用される。

別の態様において、本発明は、カプシドタンパク質をコードし、配列番号１またはそのバリアントのアミノ酸配列を含むプラスミドを使用するＡＡＶベクターを産生する方法に関する。あるいは、ベクターはまた、配列番号６のアミノ酸配列、特に配列番号２〜５またはそのバリアントのアミノ酸配列の１つを含み得る。発現されるトランスジーンを含む組み換え型ＡＡＶベクターを産生する基本的な方法は、従来技術に十分に記載されている［２８］。ＨＥＫ ２９３−Ｔ細胞に３つのプラスミドをトランスフェクトさせる。第一のプラスミドは、ＡＡＶゲノムのｃａｐおよびｒｅｐ領域を含むが、天然に存在する末端逆位配列（ＩＴＲ）が欠失している。このプラスミドのｃａｐ領域は、少なくとも１つの改変されたカプシドタンパク質をコードする遺伝子、すなわち本発明に従うペプチド配列を含む遺伝子を含む。第二のプラスミドは、パッケージングシグナルを構成する、対応するＩＴＲが隣接するトランスジーン発現カセットを含む。それゆえ、発現カセットは、ウイルス粒子のアセンブリの過程でカプシドにパッケージングされる。第三のプラスミドは、ＨＥＫ ２９３−Ｔ細胞においてＡＡＶの複製に必要なヘルパータンパク質Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４−ｏｒｆ６、ＶＡをコードするアデノウイルスヘルパープラスミドである。あるいは、昆虫細胞において本発明のＡＡＶベクターを産生することも可能である。対応するプロトコールを、以下の実施例６に一例として提供する。

組み換え型ベクターの産生が、それらの特異性に影響を及ぼし得ることが意外にも見出された。本発明の過程において、実施例２のプロトコールを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生されているベクターは、脳および脊髄の血管の内皮細胞に主にトランスフェクトして、脳または脊髄のニューロンにトランスフェクトするのはごく一部であることが観察された。一方、実施例６のプロトコールを使用してＳｆ−９細胞において産生されている組み換え型ベクターは、主にニューロンにトランスフェクトして、内皮細胞にトランスフェクトするのはかなり少ない程度である。この知見は、トランスフェクションの特異性をさらに増加させるために使用することができる。

本発明に従う組み換え型ベクターの蓄積および精製を可能にする条件は、当技術分野で公知である。本発明に従うベクターを、例えばゲル濾過プロセスによって、例えばセファロースマトリクスを使用して精製し、脱塩して、その後濾過によって精製することができる。他の精製法は、塩化セシウムまたはイオジキサノール勾配超遠心分離プロセスをさらに含み得る。精製により、アデノ随伴ウイルスベクターが投与される対象において、可能性がある有害な効果が低減する。投与されたウイルスは、野生型ウイルスおよび複製コンピテントウイルスを実質的に含まない。ウイルスの純度は、ＰＣＲ増幅などの好適な方法によってチェックすることができる。

さらなる態様において、本発明は、本発明のウイルスベクター、特にＡＡＶベクターを含む医薬組成物を提供する。この場合のウイルスベクターは、患者に治療的有効量、すなわち、処置される脳および／または脊髄の機能障害または疾患の少なくとも１つの症状を相当に改善するために、または疾患の進行を予防するために十分な量で投与される。本発明のウイルスベクターの治療的有効量は、前記症状の１つの正の変化、すなわち罹患対象の表現型を、脳および／または脊髄の疾患に罹患していない健康な対象の表現型に、より類似にする変化を引き起こす。

本発明に従う１つの好ましい実施形態において、ウイルスベクターの投与は、脳および／または脊髄の機能障害または疾患の完全または実質的に完全な治癒が得られる量で行われる。したがって、医薬組成物は、本発明に従うベクターの治療的有効量を含む。治療的有効量は、一般的に、処置を受ける対象にとって非毒性であろう。

治療効果を達成するために投与しなければならないウイルスベクターの正確な量は、いくつかのパラメータに依存する。投与されるウイルスベクターの量に関連する要因は、例えば、ウイルスベクターの投与経路、疾患の性質および重症度、処置される患者の既往、ならびに処置される患者の年齢、体重、身長、および健康状態である。さらに、治療効果を達成するために必要なトランスジーンの発現レベル、患者の免疫応答、ならびに遺伝子産物の安定性は、投与される量に関連する。ウイルスベクターの治療的有効量は、一般的知識および本開示に基づいて当業者が決定することができる。

ウイルスベクターは好ましくは、１．０×１０¹⁰〜１．０×１０¹⁴ｖｇ／ｋｇ（ウイルスゲノム／ｋｇ体重）の範囲のウイルスの用量に対応する量で投与されるが、１．０×１０¹¹〜１．０×１０¹³ｖｇ／ｋｇの範囲がより好ましく、５．０×１０¹¹〜５．０×１０¹²ｖｇ／ｋｇの範囲はさらにより好ましく、１．０×１０¹²〜５．０×１０¹²の範囲はさらにより好ましい。およそ２．５×１０¹²ｖｇ／ｋｇのウイルス用量は最も好ましい。例えば、本発明に従うＡＡＶ２ベクターなどの投与されるウイルスベクターの量は、１つまたは複数のトランスジーンの発現の強度に従って調節することができる。

本発明に従う好ましいＡＡＶ２ベクターなどの本発明のウイルスベクターは、例えば、様々な投与経路、例えばカプセル剤、液剤などとしての経口投与のために処方することができる。しかし、ウイルスベクターは非経口的に、好ましくは静脈内注射または静脈内注入によって投与することが好ましい。投与は、例えば静脈内注入、例えば６０分以内、３０分以内、または１５分以内の静脈内注入であり得る。ウイルスベクターは、手術時に脳および／または脊髄への注射によって局所投与することがさらに好ましい。注射および／または注入による投与にとって好適な組成物には、典型的に、液剤および分散剤、ならびに対応する溶液および分散液を調製することができる散剤が挙げられる。そのような組成物は、ウイルスベクターと少なくとも１つの好適な薬学的に許容され得る担体とを含むであろう。静脈内投与のために好適な薬学的に許容され得る担体には、静菌水、リンゲル液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）が挙げられる。注射および／または注入のための滅菌組成物は、必要量のウイルスベクターを適切な担体に導入した後、濾過滅菌することにより調製することができる。注射または注入による投与のための組成物は、その調製後長期間にわたって保存条件で安定であり続けなければならない。組成物は、この目的のために保存剤を含有することができる。好適な保存剤には、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールが挙げられる。対応する製剤および好適なアジュバントの調製は、例えば、“Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ
ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）に記述されている。

さらなる態様において、本発明は、脳および／または脊髄の障害または疾患の治療的処置のための方法に関し、ここで本発明に従うウイルスベクター、好ましくは上記のＡＡＶベクターが対象に投与される。ベクターは、配列番号１またはそのバリアントのアミノ酸配列を含有する少なくとも１つのカプシドタンパク質を有するカプシドを含む。あるいは、ベクターは、配列番号６のアミノ酸配列、特に配列番号２〜５もしくはそのバリアントのアミノ酸配列を含み得る。ウイルスベクターは、脳および／または脊髄の障害または疾患の処置にとって有用であるトランスジーン、例えば治療遺伝子をさらに含む。処置される対象に投与後、好ましくは例えば静脈内注射または注入などの全身投与による投与後、ベクターは、脳および／または脊髄の細胞に遺伝子の特異的発現をもたらす。

図１は、本発明に従って使用されるＡＡＶペプチドライブラリのインビボ選択法を示す。１：およそ１×１０⁸個の異なるカプシドバリアントを有するランダム化ＡＡＶペプチドライブラリ；２：注射後８日目に標的臓器の摘出；３：ＤＮＡの単離およびリアルタイムＰＣＲによるウイルスＤＮＡ断片の増幅；４：シークエンシングのためのペプチドライブラリプラスミドへのクローニングおよび二次ペプチドライブラリの産生；５：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクション；二次ペプチドライブラリの産生；６：あらかじめ選択したカプシドバリアントを含有する、さらなる選択ラウンドのための二次ＡＡＶペプチドライブラリ；７：ペプチドライブラリのマウスへの静脈内注射 図２は、選択法によって同定された脳特異的ペプチドの配列を示す。配列番号１に示される配列を有するペプチドは、４回目の選択ラウンドで同定された。 図３は、組み換え型ＡＡＶベクターを生きているマウスに静脈内注射後の遺伝子発現を示す。ベクターゲノム５×１０¹⁰個の全身注射後１４日目に、ＩＶＩＳ（登録商標）２００イメージングシステムを使用してルシフェラーゼ発現を測定した。Ａ：非改変ＡＡＶ２野生型カプシド骨格のベクターは、主に肝臓に遺伝子発現を示す。脳には測定可能な遺伝子発現は存在しない。これに対し、組み換え型ＡＡＶベクターｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤは、脳において強く特異的な遺伝子発現を誘導する。 図４は、組み換え型ｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤベクターの全身投与後のマウスにおける長期間の発現分析を示す。ＩＶＩＳ（登録商標）２００イメージングシステムを使用した繰り返し測定により、１６８日間にわたって脳における安定な遺伝子発現が示される（ｎ＝２）。 図５は、組み換え型ＡＡＶベクターｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤのベクターゲノム５×１０１０個の静脈内注射後１４日目での発光およびベクターの定量結果を示す。Ａ：マウスの異なる臓器の溶解物中で遺伝子発現を生物発光として測定すると、脳に対するベクターの高い特異性が示された。Ｂ：溶解物中でベクターゲノム分布を測定すると、脳にベクターが有意に蓄積することが示された。平均値＋標準偏差。統計値を一元配置ＡＮＯＶＡによって算出した。ｐ＜０．０５＝^*；ｐ＜０．０１＝^**；ｐ＜０．００１＝^***、ｎ＝３。

データはすべて、平均値＋標準偏差（ＳＤ）として決定した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を使用して実施した。データは一元配置ＡＮＯＶＡの後にボンフェローニの多重比較検定によって分析した。Ｐ値＞０．０５は有意であると考えられた。

実施例１：ＡＡＶ２ペプチドライブラリの選択
組織特異的ＡＡＶ２カプシドを選択するために、ランダムペプチドライブラリを調製して５ラウンドで選択した。個々に存在するクローン１×１０⁸個の理論的多様性を有するランダムＸ₇−ＡＡＶペプチドライブラリを、以前に記述された二段階プロトコール［２６〜２７］を使用して調製した。ＶＰ１のアミノ酸Ｒ５８８位に対応するＡＡＶゲノムの３９６７位のヌクレオチドで７個のランダム化アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドを最初に産生した。オリゴヌクレオチドは、配列：５’−ＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＡ
ＧＡＧＧＣ（ＮＮＫ）₇ＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧ−３’（配列番号１２）
を有した。シーケナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および配列５’−ＣＴＣＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１３）を有するプラ
イマーを使用して第二の鎖を産生した。二本鎖インサートをＢｇｌＩによって切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製し、ＳｆｉＩによって消化済のライブラリプラスミドｐＭＴ１８７−０−３にライゲートした［２６］。プラスミドライブラリの多様性は、１５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含有する寒天上で、形質転換されたエレクトロコンピテントＤＨ５α細菌の代表的なアリコートから生育させたクローン数によって決定した。ライブラリプラスミドを採取して、Ｑｉａｇｅｎのプラスミド調製キットを使用して精製した。細胞培養皿（１５ｃｍ）１０枚において２９３Ｔ細胞２×１０⁸個に、プラスミドｐＶＰ３ｃｍ（末端逆位配列を有しない改変コドン使用を有する野生型ｃａｐ遺伝子を含有する）［２７］、ライブラリプラスミド、およびｐＸＸ６ヘルパープラスミド［２８］を、プラスミド間の比率１：１；２でトランスフェクトさせることによって、ＡＡＶライブラリゲノムを、キメラ野生型およびライブラリＡＡＶカプシド（ＡＡＶ移行シャトル）にパッケージングした。得られたＡＡＶライブラリ移行シャトルを使用して、細胞培養皿（１５ｃｍ）において２９３Ｔ細胞２×１０⁸個にＭＯＩ ０．５複製単位／細胞で感染させた。細胞に、Ａｄ５（ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅ Ｇeｎｉｑｕｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を、ＭＯＩ ５プラーク形成単位（ｐｆｕ／細胞）で重複感染させた。最終的なＡＡＶディスプレイライブラリを４８時間後に上清から採取した。上清をＶｉｖａＳｐｉｎカラム（Ｖｉｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して濃縮し、以前に記述されたように［２９］イオジキサノール密度勾配超遠心分離によって精製し、ｃａｐ特異的プライマー５’−ＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＣＣ
ＡＡＣＣ−３’（配列番号１４）および５’−ＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴ
ＧＴＧ−３’（配列番号１５）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によるリアルタイムＰＣＲによって力価を測定した。

インビボ選択の場合、ゲノムライブラリの粒子１×１０¹¹個を、ＦＶＢ／Ｎマウスの尾静脈に注射した。標的細胞の分布および感染のために粒子を８日間投与した。８日後、マウスを屠殺して、脳を摘出した。組織の総ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ライブラリのＡＡＶ粒子に含まれ、関心対象の組織に蓄積しているランダムオリゴヌクレオチドを、第一のＰＣＲに関してプライマー５’−ＡＴＧＧ
ＣＡＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＧＴＧＧ
ＡＧＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１７）を使用し、ならびに第二の
ＰＣＲに関してプライマー５’−ＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＡＡＧ−３
’（配列番号１８）および５−ＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧ−３’（配
列番号１９）を使用するネステッドＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅されたオリゴヌクレオチドを使用して、さらに３ラウンドの選択のために二次ライブラリを調製した。二次ライブラリは、一次ライブラリ（上記を参照）と同様に生成したが、移行シャトルを産生する追加の工程を行わなかった。二次プラスミドライブラリを使用して、細胞培養皿（１５ｃｍ）においてトランスフェクション試薬Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ライブラリプラスミド２５個／細胞の比率で２９３Ｔ細胞２×１０⁸個にトランスフェクトさせた。各ラウンドの選択後、いくつかのクローンをシークエンシングした。適用した選択法を図１に示す。

結果：５ラウンドの選択後、いくつかの脳結合カプシドを選択した。ペプチド配列ＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号１）を含むカプシドは、脳および脊髄の細胞に特に強く結合することが見出された（以下を参照されたい）。脳および脊髄に対して同様に特異性を示したさらなる群のペプチドは、ペプチドＡＤＧＶＱＷＴ（配列番号２）、ＤＤＧＶＳＷＫ（配列番号３）、ＳＤＧＬＴＷＳ（配列番号４）、およびＳＤＧＬＡＷＶ（配列番号５）を含んだ。これらのペプチドは、一般的なモチーフＸＤＧＸＸＷＸ（配列番号６）を含んだ。様々な選択ラウンドで得られたペプチドを図２に示す。

実施例２：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組み換え型ＡＡＶベクターの調製および定量
実施例１において濃縮されたクローンを組み換え型ＡＡＶベクターとして産生し、その形質導入プロファイルを試験した。組み換え型ＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトリプルトランスフェクションによって産生した。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）においてインキュベートした。プラスミドＤＮＡを、トランスフェクト剤Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトさせた。トランスフェクションの４日後、細胞を採取して溶解し、ベクターを、以前に記述された［２９］イオジキサノール密度勾配超遠心分離によって精製した。トランスフェクションに関して、関心対象のＡＡＶカプシドをコードするプラスミドと同様に、ルシフェラーゼ遺伝子ｐＵＦ２−ＣＭＶ−ｌｕｃ［２７］またはＧＦＰ遺伝子ｐＴＲ−ＣＭＶ−ＧＦＰ［３０］をコードするｐＸＸ６を、アデノウイルスヘルパープラスミド［２８］として使用した。ＡＡＶライブラリから先に選択されているＡＡＶカプシド変異体および野生型対照をコードするプラスミドは、改変ｐＸＸ２−１８７［３１］またはｐＸＸ２［２８］であった。インサートを、記述のようにライブラリインサートへと処理した（上記を参照されたい）。組み換え型ベクターを定量するために、ゲノムの力価を、以前に記述されたように［３２］、ＣＭＶ特異的プライマー５’−ＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴ−３’（配列番号２０）、および５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号２１）を使用するリアルタイムＰＣＲによって、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムによって決定した。

結果：ルシフェラーゼレポーター遺伝子による組み換え型ウイルスのウイルス力価に関する収量は、野生型ＡＡＶ２カプシドを含むベクターの収量と同等であることが見出され、このことは、蓄積したペプチドが、カプシドのアセンブリまたは遺伝子のパッケージングに影響を及ぼさないことを示している。

実施例３：インビボでの組み換え型ＡＡＶベクターの指向性の試験
インビボで濃縮されたペプチドの指向性を調べることができるように、ペプチドを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組み換え型ベクターのカプシドに導入した。変異したカプシドを有するベクターを、対照ベクターと共にマウスに注射した。ＡＡＶベクターを、ベクターゲノム（ｖｇ）５×１０¹⁰個／マウス（注射したＡＡＶクローンあたり、動物ｎ＝３）の用量で静脈内投与した。１４日目に、動物をイソフルランで麻酔した。ルシフェリン基質（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｘｅｎｏｇｅｎ）２００μｌ／マウスの腹腔内注射後のルシフェラーゼ発現を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ２００イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ４．０（Ｃａｌｉｐｅｒ）ソフトウェアによって分析した。異なる位置（腹側、背側、外側）でのトランスジーン発現の代表的なインビボ生物発光画像を、相対発光量（光子／秒／ｃｍ²）での発光が最高強度に達したときに撮影した。

次に、動物を屠殺して、関心対象の臓器を迅速に摘出し、個々の臓器におけるトランスジーンの発現画像を直ちに撮影した。次に、臓器を液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。ルシフェラーゼ発現を定量するために、臓器をレポーター溶解緩衝液（ＲＬＢ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）中でホモジナイズした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の決定は、ルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ，Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬの添加後１０秒間隔で、各測定の間で２秒の遅れで、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９ ４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行った。Ｒｏｔｉ ＮａｎｏＱｕａｎｔタンパク質アッセイ（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、タンパク質の全量に関して、値を各試料において標準化した。

結果：１４日後の生物発光のインビボ測定により、ペプチドＮＲＧＴＥＷＤによって脳においてトランスジーンの発現が起こることが示された（≦１０⁴ｐ／秒／ｃｍ²／ｒ）。これらの結果は、エクスビボで体外培養臓器で行った対照実験によって確認された。非選択ライブラリ（ＣＶＧＳＰＣＧ）の無作為に選択した対照クローンでは、主に心臓および腹部のいくつかの部分に弱い遺伝子発現が起こったが、脳には起こらなかった（示していない）。野生型ＡＡＶ２は、心臓、肝臓、および骨格筋において弱い遺伝子発現を引き起こしたが、脳には引き起こさなかった（図３Ａ）。

代表的な臓器の組織溶解物のルシフェラーゼ活性の試験から、脳特異的ＮＲＧＴＥＷＤカプシドを含むベクターが、脳において強く特異的な遺伝子発現（１．１×１０⁷ＲＬＵ／ｍｇタンパク質、図５Ａを参照されたい）をもたらすことが判明した。他の臓器組織では、ＮＲＧＴＥＷＤルシフェラーゼベクターは、ほとんど発現を示さなかった。

結果から、ＮＲＧＴＥＷＤベクターによって媒介されるトランスジーンの脳特異的発現が長期間にわたって臓器特異的であり続けることがさらに示された。ＡＡＶ２ ＮＲＧＴＥＷＤルシフェラーゼベクターの静脈内投与後、トランスジーンの発現を１６８日間にわたって測定した。脳の領域で放出された放射線を定量的に決定した。全期間にわたって、トランスジーンの発現は高レベルで安定であり、脳に限定された（図４）。

実施例４：ベクター分布の分析
静脈内に注射したＮＲＧＴＥＷＤベクターのトランスジーンの脳特異的発現が特異的ホーミングに基づくものかを調べるために、最初に、５×１０¹⁰ｇｐ／マウスの静脈内投与後１４日目にベクターの分布を調べた。ベクターゲノムの定量は、リアルタイムＰＣＲによって行った。最初に、組織ホモジナイザー（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４，Ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造元の説明書に従って、５×１０¹⁰ｖｇ／マウスの静脈内投与後の様々な時点で、関係する臓器から総ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ，ＮＤ−２０００Ｃ、Ｐｅｑｌａｂ）を使用して定量した。組織におけるＡＡＶベクターＤＮＡの分析は、上記のＣＭＶ特異的プライマーを使用して、鋳型４０ｎｇを使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって行い、総ＤＮＡに関して標準化した。

結果：リアルタイムＰＣＲによるベクターゲノムの定量は、ＮＲＧＴＥＷＤの脳特異的ホーミングを示した。脳において検出することができたベクターゲノムの量（１．６×１０⁴±７．１×１０³ｖｇ／１００ｎｇ総ＤＮＡ）は、別の臓器で検出されたベクターゲノムの量より有意に高かった（図５Ｂ）。ベクターのホーミングとトランスジーンの発現との間の直接相関を決定するために、野生型ＡＡＶ２、対照ペプチドＣＶＧＳＰＣＧ、および脳特異的ペプチドＮＲＧＴＥＷＤのベクター分布を、５×１０¹⁰ｇｐ／マウスの静脈内投与後１４日目、すなわち、トランスジーンの発現を決定した日に（上記を参照されたい）測定した。野生型ＡＡＶ２ベクターによってもたらされたゲノムは主に肝臓および脾臓で回収され、対照ペプチドを有するベクターのゲノムは、ほとんど脾臓から得られた（データは示していない）。全体で、脾臓において検出されたベクターゲノムの量は、調べたすべてのカプシドバリアントにおいて相対的に等しく、トランスジーンの提供および発現とは無関係である細網内皮系における粒子の非特異的捕捉機序を示唆している。これに対し、脳特異的ペプチドＮＲＧＴＥＷＤを有するベクターによってもたらされたゲノムの分布データは、トランスジーンの発現データと非常に類似であり、非常に特異的な蓄積が脳において観察された。脳において検出されたペプチドＮＲＧＴＥＷＤを示すベクターの量は、野生型ベクターまたは対照カプシドベクターを注射された脳より約１６８倍高かった。全体として、このデータは、ＮＲＧＴＥＷＤベクターによって媒介されるトランスジーンの脳特異的発現が、循環中の粒子の組織特異的ホーミングによって達成されることを示している。

実施例５：免疫組織化学および組織学
免疫組織化学を使用して、ペプチドＮＲＧＴＥＷＤおよび／または対照としての野生型ＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶ−ＧＦＰベクターの静脈内投与後１４日に、脳ならびに対照臓器の細胞レベルでトランスジーンの発現を可視化した。動物の脳を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定した。組織をパラフィンに包埋した。厚さ２μｍの切片のロウを除去して、再度水和させ、免疫組織化学のために使用した。免疫組織化学技法は、ＧＦＰ（Ａ−１１１２２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＣＤ３１（ＡＢ２８３６４、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）のポリクローナル抗体を使用して行った。内因性のペルオキシダーゼの活性を、１％Ｈ₂Ｏ₂のメタノール溶液によって３０分間不活化した。ＣＤ３１による染色の前に、切片をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１００℃で２０分間加熱した。ＰＢＳで洗浄後、切片をＰＢＳ、１０％ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）および２％粉乳（Ｒｏｔｈ）と共に３０分間インキュベートした。一次抗体を３７℃で１時間結合させた。ＰＢＳで洗浄後、切片を二次ビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）と共に３０分間インキュベートした。結合した抗体を、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ−Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）および３，３’−ジアミノベンジデン（３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を使用して可視化した。選択した切片をヘマラムで対比染色した。

結果：ｒＡＡＶ−ＮＲＧＴＥＷＤを注射したマウスの脳において、顕微鏡検査により、微小血管全体にわたって内皮細胞の強い染色が示され、大血管においてわずかにより弱い程度の染色が示された（データは示していない）。これに対し、野生型ＡＡＶ２ベクターを注射したマウスの脳組織は、染色を示さなかった。組織特異性を確認するために、対照臓器（野生型ＡＡＶ２ベクターの注射後にトランスジーンの高い発現を多く証明することが公知である組織）として肝臓を分析した。肝臓において、野生型ｒＡＡＶ２ベクターの投与後に肝細胞の染色が観察されたが、ｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤベクターの投与後では染色は観察されなかった。ベクターを形質導入した細胞の内皮細胞系列をＣＤ３１染色によって確認したところ、ＧＦＰ染色によって得られたパターンが、ｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤを注射したマウスの脳の連続切片において確認された（データは示していない）。

ｒＡＡＶ−ＮＲＧＴＥＷＤが注射されているマウスの脊髄の試験からも、微小血管の内皮細胞の強い染色が判明し、このことは、脳の内皮細胞のみならず、中枢神経系全体の内皮細胞が本発明のペプチドによって形質導入可能であることを示している（データは示していない）。

実施例６：Ｓｆ９昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系を使用した組み換え型ＡＡＶベクターの産生および定量
Ｓｆ９昆虫細胞［３３〜３５］における組み換え型ＡＡＶベクターの産生に関して、ｃａｐ遺伝子にペプチド挿入をコードする（上記を参照されたい）オリゴヌクレオチドインサートを有する改変ＡＡＶ２ゲノムを、ドナープラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ Ｄｕａｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローニングした。加えて、人工のイントロンを、ｐｏｌｈプロモーターを含むドナープラスミドに挿入し、それによってプラスミドｐＦＢＤ−Ｒｅｐ_in／Ｃａｐ_in［３５］を得た。ドナープラスミドｐＦＢ−ＣＡＧ−ｅＧＦＰを確立するために、ＣＡＧプロモーターおよびｅＧＦＰ遺伝子を、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＡＡＶ２ ＩＴＲと共にプラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。ドナープラスミドを、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換するために使用して、次にＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌細胞を、組み換え型ＡＡＶゲノムまたはｅＧＦＰトランスジーンカセットをそれぞれ含む組み換え型バクミドを単離するために使用した。バクミド（９μｇ）を、Ｆｅｃｔｏｆｌｙトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して６ウェルフォーマットでＳｆ９細胞１×１０⁶個のトランスフェクションに使用した。トランスフェクトしたＳｆ９昆虫細胞を、１％ゲンタマイシン（Ｌｏｎｚａ）を含む昆虫Ｘ−Ｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において２７℃３日間インキュベーション後、細胞培養上清に存在する組み換え型バキュロウイルス５００μｌを、Ｔ１７５細胞培養フラスコにおいて１％ゲンタマイシンを含む昆虫Ｘ−Ｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ）中で、新たなＳｆ９細胞２．５×１０⁷個を２７℃でさらに３日間増幅するために使用した。このようにして増幅されたバキュロウイルスを、組み換え型ＡＡＶベクターを産生するために新たなＳｆ９細胞を感染させるために使用した。この目的に関して、ＡＡＶゲノムが挿入された組み換え型バキュロウイルスおよびｅＧＦＰトランスジーンカセットが挿入された組み換え型バキュロウイルスを混合して、１Ｌアーレンマイヤーフラスコにおいて１％ゲンタマイシンを含む昆虫Ｘ−Ｐｒｅｓｓ培地４００ｍｌ中で、昆虫細胞６×１０⁸個を感染させるために共に使用した。次に、細胞を撹拌（１１０ｒｐｍ）しながら２７℃でインキュベートした。感染後４日目に、細胞を採取して溶解し、ＡＡＶベクターを、前に記述された［２９］イオジキサノール密度勾配超遠心分離によって精製した。組み換え型ベクターの定量に関して、ゲノム力価を、配列番号２０および配列番号２１のＣＭＶ特異的プライマーを使用して、前に記述されたように［３２］ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムで定量的リアルタイムＰＣＲによって決定した。

結果：バキュロウイルス発現系を使用することにより、トリプル感染後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞での産生と比較して、Ｓｆ９昆虫細胞ではより高い力価の組み換え型ＡＡＶベクターが得られた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるウイルス産生の収量は、最大でゲノム粒子１．９×１０⁴個／細胞であったが、Ｓｆ９昆虫細胞ではゲノム粒子７．９×１０⁴個／細胞もの収量が得られた。Ｓｆ９昆虫細胞において産生されたｒＡＡＶ２−ＮＲＧＴＥＷＤベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生されている同等の組み換え型ベクターよりニューロンに対して高い親和性を有することをさらに観察することができた（データは示していない）。このように、組み換え型ベクターの特異的産生プロセスの選択は、ニューロンまたは内皮細胞のそれぞれに対するベクターの特異性を増加させる可能性を提供する。

［１］ Ｔｅｎｅｎｂａｕｍら，２００３，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，３：５４５−５６５
［２］ Ｗｏｒｋら，２００６，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：６８３−６９３
［３］ Ｓｈｉら，２００６，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１７：３５３−３６１
［４］ 米国特許出願公開２００７／０１７２４６０ Ａ１
［５］ Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒら，２００９，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，４（４）：ｅ５１２２
［６］ Ｋａｐｌｉｔｔら，２００７，Ｌａｎｃｅｔ，３６９（９５７９）：ｐ．２０９７−１０５
［７］ Ｇｒａｙら，２０１０，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１８（３）：ｐ．５７０−８
［８］ Ｓｈｅｖｔｓｏｖａら，２００５，Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０（１）：ｐ．５３−９
［９］ Ｇｒａｙら，２０１１，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２２（９）：ｐ．１１４３−５３
［１０］ Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら，１９９６，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２（６）：ｐ．６９６−９
［１１］ ＭｃＣｏｗｎら，１９９６，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，７１３（１−２）：ｐ．９９−１０７
［１２］ Ｄｕｒｉｎｇら，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（６）：ｐ．８２０−７
［１３］ Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ Ｋａｌｂｕｒｇｉら，２０１３，Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｅｄ，１５（８１）：ｐ．１１１−９
［１４］ Ａｌｏｎｓｏら，２０１３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２：ｐ．ｅ７３
［１５］ Ｓｈｉ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，２００３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，７：５１５−５２５
［１６］ Ｌｏｉｌｅｒら，２００３，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１０：１５５１−１５５８
［１７］ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６５：２７４−２８５
［１８］ Ｗｕら，２０００，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７４：８６３５−８６４７
［１９］ Ｓｈｉら，２００１，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１２：１６９７−１７１１
［２０］ Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら，２００４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７８：６５９５−６６０９
［２１］ Ｇｉｒｏｄら，１９９９，Ｎａｔ Ｍｅｄ，５：１０５２−１０５６
［２２］ Ｇｒｉｆｍａｎら，２００１，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，３：９６４−９７５
［２３］ Ｏｐｉｅら，２００３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７７：６９９５−７００６
［２４］ Ｋｅｒｎら，２００３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７７：１１０７２−１１０８１
［２５］ Ｒｕｓｓｅｌｌら，１９９８，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７２：３０９−３１９）
［２６］ Ｍｕｅｌｌｅｒら，２００３，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，１０４０−１０４６
［２７］ Ｗａｔｅｒｋａｍｐ，ら，２００６，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ８，１３０７−１３１９
［２８］ Ｘｉａｏら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２２２４−２２３２
［２９］ Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，ら，１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６，９７３−９８５
［３０］ ＭｃＣａｒｔｙら，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８，１２４８−１２５４
［３１］ Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ，ら，２００７，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３５，１７６６−１７７６
［３２］ Ｒｏｈｒら，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２７，４０−４５
［３３］ Ｕｒａｂｅら，２００２，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３，１９３５−１９４３
［３４］ Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら，２００５，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １２，１２１７−１２２５
［３５］ Ｃｈｅｎ，２００８，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６，９２４−９３０（２００８）

Claims (25)

1. 配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ウイルスベクターのカプシドタンパク質。
2. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のカプシドタンパク質である、請求項１に記載のカプシドタンパク質。
3. 血清型２、４、６、８および９からなる群から選択される血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質である、請求項２に記載のカプシドタンパク質。
4. 血清型２のＡＡＶのカプシドタンパク質である、請求項３に記載のカプシドタンパク質。
5. 血清型２のＡＡＶのＶＰ１タンパク質である、請求項４に記載のカプシドタンパク質。
6. 前記ペプチドがカプシドの５５０〜６００位のアミノ酸の領域に存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質。
7. 配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド。
9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質をコードする核酸。
10. 前記カプシドタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の核酸。
11. 請求項９又は１０に記載の核酸を含むプラスミド。
12. カプシドと、カプシドの中にパッケージングされたトランスジーンとを含む、組み換え型ウイルスベクターであって、該カプシドが、請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質を含む少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む組み換え型ウイルスベクター。
13. 前記カプシドタンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組み換えウイルスベクター。
14. 組み換え型ＡＡＶベクターである、請求項１２または１３に記載の組み換え型ウイルスベクター。
15. 血清型２、４、６、８および９からなる群より選択される血清型のＡＡＶベクターである、請求項１４記載の組み換え型ウイルスベクター。
16. 血清型２のＡＡＶベクターである、請求項１５記載の組み換え型ウイルスベクター。
17. 前記トランスジーンが以下のタンパク質：クローディンまたはオクルディンなどの膜または密着結合タンパク質、ノイラミニダーゼ１などのノイラミニダーゼ、グルクロニダーゼ、ＣＣＬ２−７ＮＤなどのケモカインアンタゴニスト、グリア細胞の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ネプリライシン、コレステロール２４ヒドロキシラーゼ、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩおよび生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、の１つをコードする、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の組み換え型ウイルスベクター。
18. 前記トランスジーンがノイラミニダーゼをコードする、請求項１７に記載の組み換え型ウイルスベクター。
19. 前記トランスジーンがｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの形状である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の組み換え型ウイルスベクター。
20. 対象における脳および／または脊髄の機能障害または疾患を処置する方法に使用するための、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の組み換え型ウイルスベクター。
21. 脳および／または脊髄の前記疾患が、副腎白質ジストロフィー、カナンバン（Ｃａｎａｎｖａｎ）病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハー病、およびアレキサンダー病などの、遺伝的に引き起こされた白質ジストロフィー；筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、およびピック病などの神経変性疾患；多発性硬化症およびギラン・バレー症候群などの中枢神経系の慢性炎症疾患；ならびにセロイド・リポフスチン症およびファブリー病などのライソゾーム蓄積病からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法に使用するための組み換え型ウイルスベクター。
22. 前記対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、方法における使用のための請求項２０または２１に記載の組み換え型ウイルスベクター。
23. 静脈内投与のために処方される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法に使用するための組み換え型ウイルスベクター。
24. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質、請求項８に記載のウイルスカプシド、請求項９または１０に記載の核酸、請求項１１に記載のプラスミド、または請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の組み換え型ウイルスベクター、を含む細胞。
25. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質、請求項８に記載のウイルスカプシド、請求項９または１０に記載の核酸、請求項１１に記載のプラスミド、または請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の組み換え型ウイルスベクター、を含む医薬組成物。

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