JP6768895B2 - 肺に対する特異性を有する新たなペプチド - Google Patents
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Description
れ得る。
(a)配列番号9のアミノ酸配列、
(b)配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列、または
(c)(a)もしくは(b)に定義されるアミノ酸配列のうちの1つの断片、を含むか、これらからなるカプシドタンパク質に関する。
更なる一態様において、本発明は、本発明のウイルスベクター、特にAAVベクターを含む薬学的組成物を提供する。この場合のウイルスベクターは、治療的に有効な量で、すなわち、治療される肺機能障害または肺疾患の少なくとも1つの症状を相当に改善するか、疾患の悪化を防ぐために十分な量で、患者に投与される。肺疾患に通常関連付けられる症状は、咳、発熱、胸痛、嗄声、及び呼吸困難を含む。治療的に有効な量の本発明に従うベクターは、言及した症状のうちの1つにおける正の変化、すなわち、罹患した対象の表現型が、肺疾患を患わない健康な対象の表現型に近づくことをもたらす変化を引き起こす。
組織特異的AAV2カプシドの選択のために、無作為表示ペプチドライブラリを調製し、4回選択した。以前に説明された2段階プロトコル[26〜27]を使用して、個々にクローンを発生する、1×108個の理論上の多様性を有する無作為X7−AAVペプチドライブラリを調製した。VP1におけるアミノ酸位置R588に対応する、AAVゲノムにおけるヌクレオチド位置3967で7つの無作為化アミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチドを、最初に産生した。オリゴヌクレオチドは、配列5′−CAGTCGGCCAGAGAGGC(NNK)7GCCCAGGCGGCTGACGAG−3′(配列番号
11)を有した。Sequenase(Amersham,Freiburg,Germany)及び配列5′−CTCGTCAGCCGCCTGG−3′(配列番号12)を有するプライマーを使用して、第2の鎖を産生した。二本鎖挿入断片をBglIで切断し、QIAquick Nucleotide Removal Kit(Qiagen,Hilden,Germany)で精製し、SfiI消化ライブラリプラスミドpMT187−0−3でライブラリに結紮した[26]。寒天を含有する150mg/mlのアンピシリン上、代表的な一定分量の、形質転換した電気適格性DH5αバクテリアから増殖したクローンの数によって、プラスミドライブラリの多様性を決定した。ライブラリプラスミドを収集し、QiagenからのPlasmid Preparation Kitを使用して精製した。10枚の細胞培養皿(15cm)中の2×108個の293T細胞に
、プラスミドpVP3cm(末端逆位配列を有さない修飾コドンの使用を有する野生型cap遺伝子を含有)[27]、ライブラリプラスミド、及びpXX6ヘルパープラスミド[28]を形質移入することによって、AAVライブラリゲノムをキメラ野生型及びライブラリAAVカプシド(AAV導入シャトル)内にパッケージングし、プラスミド間の比率は1:1:2であった。結果として生じるAAVライブラリ導入シャトルを使用して、細胞培養皿(15cm)中の2×108個の293T細胞を、1つの細胞当たり0.5複
製単位の感染効率で感染させた。細胞を、5プラーク形成単位(pfu/細胞)の感染効率で、Ad5(Laboratoire de Therapie Genique,F
ranceによる提供)で重感染させた。48時間後に、上清から最終AAV表示ライブラリを収集した。VivaSpin Column(Viva Science,Hannover,Germany)を使用して上清を濃縮し、以前に説明されたイオジキサノール密度勾配超遠心分離[29]によって精製し、LightCyclerシステム(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)で、cap特異的プライマー5′− GCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACC−3′(配列番号13)及び5′−GCCTGGAAGAACGCCTTGTGTG−3′(配列番号14)を使用するリアルタイムPCRによって滴定した。
質移入した。各回の選択後、いくつかのクローンが配列決定された。適用された選択方法を、図1に示す。
実施例1で濃縮されたクローンを組み換えAAVベクターとして産生し、それらの形質導入プロファイルについて試験した。組み換えAAVベクターを、HEK293T細胞の三重形質移入によって産生した。1%のペニシリン/ストレプトマイシン及び10%のウシ胎仔血清を補った、Dulbecco’s modified Eagle Medium(Invitrogen,Carlsbad,USA)中、37℃、5%のCO2で
細胞をインキュベートした。形質移入薬剤Polyfect(Qiagen,Hilden,Germany)によって、プラスミドDNAを293T細胞内に形質移入した。形質移入の4日後、細胞を収集し、溶解させ、以前に説明されたイオジキサノール密度勾配超遠心分離の手段[29]によってベクターを精製した。形質移入のために、ルシフェラーゼ遺伝子pUF2−CMV−luc[27]またはGFP遺伝子pTR−CMV−GFP[30]をコードするアデノウイルスヘルパープラスミドとしてpXX6を使用し、対象のAAVカプシドをコードするプラスミドもまた使用した[28]。AAVライブラリから既に選択されているAAVカプシド変異体をコードするプラスミド、及び野生型対照は、修飾pXX2−187[31]またはpXX2[28]であった。更に、アラニンスキャニングのために、ペプチドESGHGYFの修飾変異形をコードする、更なるオリゴヌクレオチド挿入断片を作製した。記載するように、挿入断片をライブラリ挿入断片に処理した(上記を参照されたい)。組み換えベクターを定量化するために、以前に説明されたLightCyclerシステム[32]によって、CMV特異的プライマー5′−GGCGGAGTTGTTACGACAT−3′(配列番号19)及び5′−GGGACTTTCCCTACTTGGCA−3′(配列番号20)を使用するリアルタイムPCRによって、ゲノム力価を決定した。
インビボでの濃縮ペプチドの向性の検査を可能にするために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組み換えベクターのカプシド中にペプチドを導入した。変異カプシドを有するベクターを、対照ベクターとともにマウスに注入した。5×1010個のベクターゲノム(vg)/マウス(1つの注入されたAAVクローン当たり、n=3匹の動物)の用量で、AAVベクターを静脈内投与した。14日目に、イソフルランで動物を麻酔した。1匹のマウス当たり200μlのルシフェリン基質(150mg/kg、Xenogen)の腹腔内注入に続いて、Living Image4.0(Caliper)ソフトウェアを備えるXenogen IVIS200撮像システム(Caliper Lifescience,Hopkinton,USA)を使用して、ルシフェラーゼ発現を分析した。相対光単位(光子/秒/cm2)における発光が最高の強度に達するとき、異なる位置(腹側、背側、外側)での導入遺伝子の発現の、代表的なインビボ生物発光画像を撮影した。その後、動物を屠殺し、対象の器官を素早く取り除き、各器官内の導入遺伝子の発現の画像を直ちに撮影した。その後、器官を液体窒素中で凍結させ、−80℃で保管した。Living Image4ソフトウェアのDLIT選択肢を使用することによって、インビボ発光画像の3次元再構築を得、発光された光を、560〜640nmの5つの異なる波長においてそれぞれ3分間ずつ測定した。ルシフェラーゼ発現を定量化するために、器官をレポーター溶解緩衝液(RLB,Promega,Madison,USA)中でホモジナイズした。100μLのルシフェラーゼアッセイ試薬(LAR,Promega)の添加後、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の決定を、ルミノメーター(Mithras LB9 40,Berthold Technologies,Bad Wildbad,Germany)において、10秒間隔、各測定間に2秒間の遅延で実行した。Roti NanoQuant protein assay(Roth,Karlsruhe,Germany)を使用して、タンパク質の全量に関して各試料において値を正規化した。
m2/rに増加し、ベクター注入の28日後に肺において特異的に観察することができた
。これらの結果は、外植された器官によってエキソビボで実行した対照実験によって確認された。代表的な器官からの組織可溶化液のルシフェラーゼ活性の調査は、野生型AAV2が心臓において低い遺伝子発現(2.9×104RLU/mgのタンパク質、図3A上
部パネルを参照されたい)、及び他の器官においてはより低いレベルの発現を引き起こすことを示した。対照ペプチドCVSGPCGは、心臓において中程度の遺伝子発現(8.7×104RLU/mgのタンパク質、図3A中部パネルを参照されたい)を産生した。
対照的に、肺特異的ESGHGYFカプシドを有するベクターは、肺における強力かつ特異的な遺伝子発現(4.1×105RLU/mgのタンパク質、図3A下部パネルを参照
されたい)をもたらした。心臓及び肝臓において(すなわち、野生型AAV2及びペプチドベクターCVGSPCGが強力な発現をもたらす2つの器官において)、肺特異的ESGHGYFベクターは、およそバックグラウンド信号の発現(約1×103RLU/mg
のタンパク質)のみを示した。対照的に、ESGHGYFベクターの肺における導入遺伝子の発現は、野生型AAV2またはCVGSPCG対照ベクターによって媒介された発現よりも200倍超高かった(図3Bを参照されたい)。
肺特異性に関する、ペプチドESGHGYFにおける個々のアミノ酸の重要性を調査するために、アラニンスキャニングを実行した。
静脈内注入されたESGHGYFベクターの導入遺伝子の肺特異的発現が、肺特異的ホーミングに基づくかどうかを確認するために、まず、5×1010gp/マウスの静脈内投与の4時間後にベクターの分布を調査した。ベクターゲノムの定量化を、リアルタイムPCRによって実行した。まず、組織ホモジナイザー(Precellys24,Peqlab,Erlangen,Germany)及びDNeasy Tissue Kit(Qiagen,Hilden,Germany)を製造業者の説明書に従って使用して、5×1010vg/マウスの静脈内投与後の様々な時点で、関係する器官から全DNAを抽出した。分光光度計(NanoDrop ND−2000C,Peqlab)を使用して、DNAを定量化した。前述のCMV特異的プライマーを使用する定量的リアルタイムPCRによって、組織内のAAVベクターDNAの分析を実行し、40ngのテンプレートを使用し、全DNAに関して正規化した。
1.9×105vg/100ngの全DNA)は、別の器官において実証されたベクター
ゲノムの量よりも約6〜100倍高かった(図5A)。ベクターホーミングと導入遺伝子の発現との間の直接の相関性を決定するために、5×1010gp/マウスの静脈内投与の14日後、すなわち、導入遺伝子の発現が決定されたとき(上記を参照されたい)に、野生型AAV2、対照ペプチドCVGSPCG、及び肺特異的ペプチドESGHGYFのベクター分布を測定した。野生型AAV2ベクターによって提供されたゲノムは、主に肝臓及び脾臓から回収され、対照ペプチドを有するベクターのゲノムは、大部分が脾臓から得られた。全体として、脾臓内で検出されたベクターゲノムの量は、検査されたすべてのカプシド変異形において比較的等しく(4×103vp/100ngの全DNA)、これは
、導入遺伝子の提供及び発現から独立した、網内皮系内の粒子の非特異的捕捉機序を示す。対照的に、肺特異的ペプチドESGHGYFを有するベクターによって提供されたゲノムの分布データは、高度な特異的蓄積が肺において観察されて、導入遺伝子の発現データに高度に類似した。ペプチドESGHGYFを示す、肺において検出されたベクターの量は、他の器官においてよりも約250倍高く、野生型ベクターまたは対照カプシドベクターを注入した肺においてよりも最大500倍高かった(図5B)。器官間の同一の分布値が、ベクター投与の28日後に見出された。見出されるゲノムの量についての、3つのベクターカプシド変異形間の直接の比較を、関連性のある量のベクターDNAが検出された3つの組織について、図5Cに示す。全体的として、このデータは、ESGHGYFベクターによって媒介される導入遺伝子の肺特異的発現が、循環する粒子の組織特異的ホーミングによって達成されることを示す。
免疫組織化学的検査を使用して、ペプチドESGHGYF及び/または対照として野生型AAVカプシドを有するrAAV−GFPベクターの静脈内投与の14日後の、肺及び対照器官における細胞レベルでの導入遺伝子の発現を可視化した。動物の肺を、20分間、20cmの水の静水圧下、気管を通して、4%(w/v)のパラホルムアルデヒドによってエキソサイチュで固定し、同一の固定液中、24時間の浸漬を続けた。肺組織をパラフィン内に包埋した。2μmの厚さを有する切片をワックスから取り除き、再水和し、免疫組織化学的検査のために使用した。GFP(A−11122、Invitrogen)またはCD31(AB28364、Abcam,Cambridge,USA)のポリクローナル抗体を使用して、免疫組織化学的手順を実行した。内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中、1%のH2O2で30分間不活性化した。CD31での染色前に、切片をクエン酸緩衝液(pH6.0)中、100℃で20分間加熱した。PBS中で洗浄した後、PBS、10%のヤギ血清(Vector Lab,Burlingame,USA)及び2%の粉乳(Roth)とともに切片を30分間インキュベートした。原発抗体を37℃で1時間結合させた。PBS中で洗浄した後、二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体(Vector Lab)とともに切片を30分間インキュベートした。VECTASTAIN−Elite ABC Kit(Vector Lab)及び3,3′−ジアミノベンジデン(DAB,Sigma−Aldrich,St.Louis,USA)を使用することによって、結合した抗体を可視化した。選択された切片をヘマラムで対比染色した。
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Claims (2)
- カプシド及びその中にパッケージングされた導入遺伝子を含む組み換えウイルスベクターであって、前記カプシドが配列番号9のアミノ酸配列を含む少なくとも1つのカプシドタンパク質を含む、前記組み換えウイルスベクター。
- 請求項1に記載の組み換えウイルスベクターを含む、薬学的組成物。
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