EP3132043A2 - Viraler vektor für den zielgerichteten gentransfer in gehirn und rückenmark - Google Patents

Viraler vektor für den zielgerichteten gentransfer in gehirn und rückenmark

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EP3132043A2
EP3132043A2 EP15715750.4A EP15715750A EP3132043A2 EP 3132043 A2 EP3132043 A2 EP 3132043A2 EP 15715750 A EP15715750 A EP 15715750A EP 3132043 A2 EP3132043 A2 EP 3132043A2
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EP
European Patent Office
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protein
amino acid
brain
seq
capsid
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EP15715750.4A
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EP3132043B1 (de
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Jakob Körbelin
Stefan MICHELFELDER
Martin Trepel
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Boehringer Ingelheim International GmbH
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Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
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    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6027—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses ssDNA viruses

Definitions

  • the invention relates to novel peptides, polypeptides or Pro ⁇ proteins that bind specifically to cells of the brain and / or spinal cord.
  • the peptides, polypeptides or proteins may be Be ⁇ component of a viral capsid and are used to direct a recombinant viral vector after systemic administration to a subject selectively to the brain and / or spinal cord, and there for a tissue-specific expression of egg ⁇ nem or to provide several transgenes.
  • the invention thus also relates to a recombinant viral vector, preferably an AAV vector comprising a capsid which holds at least one of the peptides of the invention, polypeptides or proteins ent ⁇ , and at least one packaged in the capsid transgene.
  • the viral vector is particularly useful for the therapeutic treatment of a disease or dysfunction of the brain and / or spinal cord.
  • the invention further relates to cells and pharmaceutical compositions comprising the viral vector of the invention.
  • Gene therapy by means of viral vectors represents a promising treatment option for diseases that do not or not adequately respond to conventional treatment.
  • This approach relies on the introduction of therapeutic genes into the organism to be treated using viruses that have been modified to have the sequence of the corresponding gene in their genome.
  • Viral vectors that have already been used in genetic therapy for gene therapy approaches are based on retroviruses, lentiviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses.
  • Adeno-associated virus are promising Kandida ⁇ th is for use in clinical practice, since they are considered relatively safe.
  • AAV vectors are capable of infiltrating a transgene into a tissue and stably and efficiently expressing it there. At the same time, they have Do not detect any known pathogenicity mechanisms [1].
  • Special significance for clinical use is the AAV vectors serotype 2 (AAV2), which seeks to be particularly well under ⁇ apply.
  • the transgenes may be present in various forms in the transfected cell, eg as episomal, single- or double-stranded DNA. Also concatameric forms of DNA were detected in transduced cells.
  • the genome of AAV2 is formed by a linear, single-stranded DNA molecule of about 4700 nucleotides in length and includes inverted terminal repeats (ITRs) at both ends.
  • the genome further encompasses two large open reading frames, referred to as replication region (rep) and capsid region (cap).
  • the replication region codes for proteins that are required in the context of viral replication.
  • the capsid region encodes the structural proteins VP1, VP2, and VP3, which make up the icosahedral capsid of the virus.
  • wild-type AAV vectors such as those described AAV2 vectors sufficient specificity for a particular tissue, but infect ei ⁇ ne wide range of cell types. Systemic administration of these wild-type vectors thus results in insufficient transduction of the target tissue, whereas due to the unwanted transduction of other tissues, strong immune reactions in the treated patient must be expected.
  • Advances in the development of viral vectors that have increased specificity for certain organs have been achieved in the past through the use of peptide ligands capable of directing the vectors to a particular organ [2-3]. It has been shown that certain peptide ligands "homing" to different organs, such as the brain.
  • Reference [4] describes a method that allows the scree ning ⁇ according to capsids of AAV2 with modified tropism in RAN dominstrumenten peptide libraries. From these libraries can Isolated vectors that specifically transduce a desired cell type in vitro. However, the thus selected capsids are unsuitable for Ver ⁇ application in vivo often, as in the animal model they lacked the nö ⁇ term specificity [5] was found.
  • the brain is a clinically extremely relevant organ as it is the starting point for a number of neurological disorders. Considerable efforts have been made to make this organ accessible to gene therapy interventions [6-12].
  • the blood-brain barrier which is common ⁇ economically formed of endothelial cells, pericytes and astrocytes and forecloses the brain of circulating particles, toxins and mediators, a insurmountable windbares for popular vector systems obstacle. Since so far no suitable Vektorsys ⁇ systems are available that target transduce after intravenous administration with sufficient efficiency, the brain, current gene therapy vectors are most commonly injected directly into the brain [13], which is be ⁇ liable at high risk for the patient.
  • agents capable of modulating the tropism of viral vectors thereby providing sufficient cell or tissue specificity that allows targeted delivery of a viral vector to brain and spinal cord tissues.
  • Such vectors can provide for specific expression of therapeutic genes in these tissues to effectively treat disorders and / or dysfunctions of the brain and spinal cord.
  • the present invention provides viral vectors for gene transfer directed zielge ⁇ ready in the brain and spinal cord.
  • the viral vectors according to the invention express on their capsid surface hitherto unknown amino acid sequences that are in vivo specifically recognized by receptors on the neurons of the brain and the endothelial cells of the blood vessels of the brain and spinal cord.
  • the viral vectors of the present invention specifically transduce its tissue into the brain and spinal cord.
  • the viral vectors of the present invention enable strong and sustained expression of a transgene in the neurons of the brain and the endothelial cells of the blood vessels of the brain and spinal cord. Therefore, the vectors are particularly suitable for the gene therapy of certain diseases and disorders of the brain and spinal cord. It has also been found that the AAV vectors after transfection cause only a slight immune reaction in the host and thus are particularly suitable for gene therapy.
  • various sequences specific for the central nervous system ie brain and spinal cord, have been identified by selection in a randomized AAV2-heptamer-peptide library.
  • a heptamer, which had a ⁇ be sondere specificity for the brain was the peptide NRGTEWD (SEQ ID NO: 1).
  • the recombinant viral vector rAAV2-NRGTEWD was prepared, in which the peptide sequence NRGTEWD is expressed as a partial sequence of the capsid protein VP1.
  • the vector rAAV2- NRGTEWD was administered intravenously to mice with a unique specificity of the vector for the central nervous system ⁇ could be observed both in vitro and in vivo.
  • Both neurons of the brain and endothelial cells of the blood vessels of the brain and spinal cord were transfected from the vector. The specificity could be demonstrated by staining with CD31 as described in the present examples.
  • Another group of peptides which also showed brain and spinal cord specificity included the peptides ADGVQWT (SEQ ID NO: 2), DDGVSWK (SEQ ID NO: 3), SDGLTWS (SEQ ID NO: 4) and SDGLAWV (SEQ ID NO: 5). These peptides each containing all the common motif ⁇ XDGXXWX (SEQ ID NO: 6).
  • the present invention thus provides various specific for the Ge ⁇ brain and spinal cord peptide sequences that are particularly suited to therapeutic agents, such as viral vectors to direct selectively into the brain or the spinal cord of a subject to be treated.
  • the present invention relates to demge ⁇ Telss a peptide, polypeptide or protein which specifically binds to cell h ⁇ len of the brain and / or spinal cord, wherein the Pep ⁇ tid, polypeptide or protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: l or a variant thereof, wherein the variant differs from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by modification of at most one amino acid.
  • the peptide, polypeptide or protein according to the invention preferably binds to endothelial cells and / or to neurons of the brain or spinal cord.
  • the present invention relates to a peptide, polypeptide or protein which specifically binds to cells of the brain and / or spinal cord, wherein the peptide, poly ⁇ peptide or protein the general amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the peptide, polypeptide or protein comprises one of the sequences ADGVQWT (SEQ ID NO: 2), DDGVSWK (SEQ ID NO: 3), SDGLTWS (SEQ ID NO: 4) or SDGLAWV (SEQ ID NO: 5) or a variant thereof, wherein the variant differs from the respective amino acid sequence of SEQ ID NO: 2-5 by modification of at most one amino acid.
  • the peptide, polypeptide or protein according to the invention preferably binds to endothelial cells and / or to neurons of the brain or spinal cord.
  • peptide denotes a linkage of 2-10 amino acids, which has a peptidic linkage are linked together.
  • polypeptide refers to a linkage of 11-100 amino acids linked by a peptidic linkage. Polypeptides with more than 100 amino acids are referred to herein as "protein".
  • a particularly preferred embodiment of the invention is according to the invention, for the brain and the spinal cord specific ⁇ fish peptide sequence according to SEQ ID NO: l, or a variant thereof, or SEQ ID NO: 2-6 or a variant thereof part of a capsid protein of a Virus.
  • SEQ ID NO: l the specific for the Ge ⁇ brain and spinal cord Peptidse-sequence is present as part of a capsid protein of the virus.
  • a corresponding nucleotide sequence coding for the peptide is cloned into the region of the virus genome which codes for a capsid protein of the virus. If the brain or spinal cord-specific sequence is expressed as part of a capsid protein, it can often be presented on the surface of the viral vector.
  • the capsid protein is a sol ⁇ ches, which originates from an adeno-associated virus (AAV).
  • AAV may be any of the serotypes described in the prior art, the capsid protein preferably being derived from an AAV of one of serotypes 2, 4, 6, 8 and 9.
  • a capsid protein of an AAV serotype 2 is be ⁇ Sonder preferred.
  • the AAV wild-type capsid is composed of the capsid proteins VP1, VP2 and VP3, which are overlapped by the cap region. All three proteins have an identical C-terminal region.
  • the capsid of AAV comprises about 60 Ko ⁇ pien of the proteins VP1, VP2 and VP3, which are in the ratio 1: 1: 8 ex ⁇ primed. If a nucleotide sequence encoding one of the peptides with specificity for the brain or spinal cord described herein is cloned C-terminal into the reading frame of VP1 (ie, the region that is identical for all three proteins), then one can expect that theoretically 60 of the specific peptides found on the capsid surface.
  • the nucleotide sequence coding for the peptide with specificity for the brain is cloned into the cap region at the 3 'end of the genome.
  • the sequence encoding the peptide with specificity for the brain or spinal cord can be cloned into the genomic sequence of one of the capsid proteins VP1, VP2 or VP3.
  • the capsid proteins of AAV2 are exemplified in SEQ ID NO: 7 (VP1), SEQ ID NO: 8 (VP2), and SEQ ID NO: 9 (VP3).
  • the sequence coding for the peptide which has specificity for the brain or spinal cord is cloned into the reading frame of a VP1 gene, preferably into the VP1 gene of SEQ ID NO: 7 AAV2. It should be noted that the insertion of the cloned sequence results in no change of the reading frame and no premature termination of the translation. The person skilled in the necessary methods will be readily apparent.
  • the peptide sequence of the invention as shown in SEQ ID NO: l or Va ⁇ riante thereof, or shown in SEQ ID NO: 2-6 or a variant thereof in the region of amino acids 550-600 of the VPl protein of AAV2, in particular the VPl protein of SEQ ID NO: 7, inserted before ⁇ lies. Even more preferred is that the peptide sequence is present in the region of amino acids 560-600, 570-600, 560-590, 570-590 of the VPl protein.
  • the peptide sequence according to SEQ ID NO: 1 or a variant thereof or according to SEQ ID NO: 2-6 or a variant thereof for example directly behind one of the following amino acid of the VPl protein, in particular the protein of SEQ ID NO: 7, subsequently ⁇ SEN: 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573 574 575 576 577 578 579 580 581 582 583 584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598, 599 or 600.
  • the peptide sequence according to SEQ ID NO: 1 or a variant thereof or according to SEQ ID NO: 2-6 or a variant thereof to the amino acid 588 of the VPl protein of SEQ ID NO: 7 follows, as in shown in the examples. It is possible that between the arginine residue in position 588 and the first amino acid of the peptide according to the invention or the variant thereof one or more, and in particular up to 5 (ie 1, 2, 3, 4 or 5) amino acids are are due to the Klo- n mich. Likewise, behind the last amino acid of the peptide according to the invention or the variant thereof may be one or more, in particular up to 5 (i.e. 1, 2, 3, 4 or 5) amino acids.
  • the sites and regions in the amino acid sequence of the capsid protein given above in relation to VP1 also apply analogously to the capsid proteins VP2 and VP3 of AAV2. Since the three capsid proteins VP1, VP2 and VP3 of AAV2 differ only in the length of the N-terminal sequence and accordingly have an identical C-terminal region, one skilled in the art will have no problems by comparing the sequences given above for VP1 To identify sites for the insertion of the peptide ligand in the amino acid sequences of VP1 and VP2. So the amino acid R588 in VP1 of position R451 of VP2 (SEQ ID NO: 8) or position R386 of VP3 (SEQ ID NO: 9).
  • SEQ ID NO: 10 exemplifies the sequence of the VPI protein of AVV2 after introduction of the peptide sequence of SEQ ID NO: 1. Due to the cloning, the capsid protein has two additional amino acids which are not present in the native sequence of the AVV2 VP1 protein. Thus, the peptide sequence of SEQ ID NO: 1 is flanked N-terminally by a glycine at position 589 and C-terminal by an alanine at position 597. In addition, the asparagine at position 587 of the native sequence is exchanged for a glutamine.
  • the present invention thus also relates to a capsid protein comprising or consisting of:
  • the invention is directed to a viral capsid comprising a peptide, polypeptide or protein which binds specifically to cells of the brain or spinal cord and the peptide sequence according to SEQ ID NO: 1 or a variant thereof or according to SEQ ID NO: 2-6 or a variant thereof.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a peptide as described above, poly ⁇ peptide or protein.
  • a nucleic acid suitable for a capsule encoded sid protein, which comprises a erfin ⁇ according to the invention as described above peptide, polypeptide or protein is also provided if ⁇ .
  • the sequence encoding the capsid protein nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or a nucleotide sequence derived therefrom with Minim ⁇ least 80% sequence identity.
  • a plasmid comprising such a nucleic acid ⁇ is also provided.
  • the invention relates to a recombinant, i. a viral vector produced by means of genetic engineering, which comprises a capsid and at least one transgene packed therein, wherein the capsid comprises at least one capsid protein comprising the peptide sequence according to SEQ ID NO: 1 or a variant thereof or according to SEQ ID NO: 2 -6 or a variant thereof.
  • the recombinant viral vector may be a recombinant AAV vector, e.g. such serotype 2, 4, 6, 8, and 9 serotype 2 AAV vectors are particularly preferred.
  • AAV serotypes differ essentially in their natural tropism. So wild type ⁇ -AAV2 binds more strongly to alveolar cells while AAV5, AAV6 and AAV9 primarily infect epithelial cells. The expert can use these natural differences in the specificity of the cells to strengthen mediated by the novel peptides specific for certain cells or tissues continue to ver ⁇ .
  • the different AAV serotypes are highly homologous. For example, the serotypes AAV1, AAV2, AAV3 and AAV6 are 82% identical at the nucleic acid level [25].
  • the capsid of the viral vectors of the invention preferably comprises one or more transgenes.
  • a transgene a gene is referred vorlie ⁇ quietly, has been introduced by genetic engineering techniques into the genome of the vector.
  • the transgene (or transgenes) may be DNA or RNA.
  • ssDNA single-stranded DNA
  • dsDNA double-stranded DNA
  • the transgene which is ches to be transported by means of the recombinant viral vector according to the invention to a human gene.
  • Suitable transgenes are, for example, therapeutic genes intended to replace a dysfunctional gene in the patient. It may also be a gene that is not or only insufficiently expressed in the corresponding target tissue.
  • the transgene expressed by the viral vector of the invention is a.
  • the vectors of the invention may i.a. used for the treatment of multiple sclerosis (MS).
  • the transgene may be e.g. be a gene coding for a membrane or tight junction protein, such as e.g. for a Claudin and Occludin.
  • it is a gene of the Claudine family, e.g. around the gene coding for Claudinl. Overexpression of such a gene could be helpful in "sealing" the disease-damaged blood-brain barrier.
  • a gene coding for a chemokine antagonist can also be used to treat the MS.
  • a negative dominant mutant of the chemokine CCL2 (MCP1 aka) can be primed ex ⁇ for example, referred to as "CCL2-7ND”.
  • CCL2 ensures that immune cells are attracted to a focal point of inflammation, which in the case of MS leads to the inflammatory breakdown of the neuronal myelin sheath.
  • the dominant-negative variant "CCL2-7ND” towards ⁇ forms dimers and blocks the receptor CCR2, whereby the signal cascade is suppressed and the immune cells are no longer lured to the neurons.
  • neprilysin or cholesterol 24-hydroxylase are overexpressed, which can lead to the depletion of amyloid ⁇ plaques and thus contribute to an improvement of the disease state.
  • Parkinson's disease may by vector-mediated Sprint ⁇ pression example of the neurotrophic factor of the glial cells (GDNF), the aromatic L-amino acid decarboxylase, tyrosine hydroxylase or GTP cyclohydrolase I treated ⁇ , which would be expected to have a positive influence on the dopaminergic system.
  • GDNF neurotrophic factor of the glial cells
  • aromatic L-amino acid decarboxylase the aromatic L-amino acid decarboxylase
  • tyrosine hydroxylase or GTP cyclohydrolase I treated ⁇
  • spinal muscular atrophy can be treated by expression of the protein SMN (Survival of Motor Neuron).
  • glucuronidase for example, would be the ß-glucuronidase, as a transgene shusverspre using the vector of the invention ⁇ accordingly.
  • the transgene encodes for a protein radioprotektives such as a radioprotektives En ⁇ zym.
  • a protein radioprotektives such as a radioprotektives En ⁇ zym.
  • the brain is a very radiosensitive organ, wes ⁇ ⁇ diffuse Tu morwachstum can semi primary tumors there is often limited and usually does not require medical radiotherapy.
  • the healthy tissue surrounding the malignant tissue can be protected by targeted expression of radioprotective proteins.
  • the transgene is introduced in the healthy brain tissue, a manganese superoxide dismutase (MnSOD), the convergence ⁇ sion of superoxide anions, one of the essential factors of radiation-induced toxicity, to hydrogen peroxide catalytically ⁇ Siert.
  • MnSOD manganese superoxide dismutase
  • Another embodiment proposed here is the kinase domain of the Ataxia telangiectasia mutant (ATM) gene, which contributes to the repair of radiation-induced DNA damage.
  • both genes are introduced by means of the presently be ⁇ signed vectors in the patient to be treated.
  • the viral vectors of the present invention are particularly suitable for use in a method for the therapeutic treatment of diseases of the brain and / or spinal cord.
  • Diseases of the brain or spinal cord in accordance with the invention include leukodystrophies He ⁇ genetically caused as ad renoleukodystrophie, Canavan disease, Krabbe disease, metachroma ⁇ tables leukodystrophy, Pelizaeus-Merzbacher disease and Mor ⁇ bus Alexander; neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's and Pick's; chronic inflammatory diseases of the Monner ⁇ vensystems, such as multiple sclerosis and Guillain-Barre syndrome; and lysosomal storage diseases such as Ceroid lipofuscinosis and Fabry disease.
  • the viral vectors of the present invention are used for the therapeutic treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's or Huntington's.
  • the transgene encodes an antitumor agent, e.g. a tumor suppressor protein, or an immunomodulator, e.g. a cytokine (e.g., interleukin 1 to 4, gamma interferon, p53) that is to be selectively transported to a brain tumor or spinal cord of the patient.
  • an antitumor agent e.g. a tumor suppressor protein
  • an immunomodulator e.g. a cytokine (e.g., interleukin 1 to 4, gamma interferon, p53) that is to be selectively transported to a brain tumor or spinal cord of the patient.
  • cytokine e.g., interleukin 1 to 4, gamma interferon, p53
  • the vectors may also be used further to transport anti-sense RNA, ribozymes, or the like in cells and tissues of the brain or spinal cord ⁇ Ge.
  • the vectors of the invention may also comprise transgenes encoding secretory proteins to be released into the lumen of the brain or spinal cord microvasculature.
  • Sol ⁇ che secretory proteins can act, for example inflammation- ⁇ inflammatory.
  • the term "subject" refers to any human or animal organisms that can be infected by AAV vectors.
  • the subject to be treated is a mammal, such as a human, a primate, a mouse or a rat.
  • the subject to be treated is a human.
  • the vector After transfection into the subject, the vector provides for the site-specific expression of the transgene in the cells of the brain or spinal cord.
  • the transgene may be present in the viral vector in the form of an expression cassette which, in addition to the sequence of the transgene to be expressed, comprises further elements required for expression, e.g. a suitable promoter, which controls the expression of the transgene after infection of the corresponding cells.
  • suitable promoters include, in addition to the AAV promoters, e.g. the cytomegalovirus (CMV) promoter, the chicken beta
  • Actin / cytomegalovirus hybrid promoter an endothelial cell-specific promoter, such as the VE-catherin promoter, as well as steroid promoters and metallothionein promoters.
  • the promoter used in the vectors of the invention is a CAG promoter.
  • the transgene according to the invention comprises a brain-specific promoter which is connected in functional connection with the transgene to be expressed. In this way, the specificity of the vectors fiction, contemporary ⁇ can be further increased for the brain.
  • a brain-specific promoter is a promoter whose activity in brain tissue is at least 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, 50-fold or 100-fold higher than in a cell other than a brain cell , Preferably, this promoter is a promoter hu ⁇ maner.
  • the expression cassette may also contain an enhancer element to increase the level of expression of the exogenous protein to be expressed. Further, the expression cassette may comprise polyadenylation sequences such as the SV40 polyadenylation sequences or the bovine growth hormone polyadenylation sequences.
  • the viral vectors of the invention can ge ⁇ a Gurss as part of their capsid proteins, preferably a peptide sequence in the SEQ ID NO: 1-5.
  • variants of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-5 may also be used which differ from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-5 by modification of an amino acid.
  • modification can be a substitution, deletion or insertion of amino acids, as long as the variant retains the ability as part of the capsid specific Bin ⁇ -making of the vector to receptor structures of cells of the brain and / or spinal cord convey.
  • the invention extends to variants of the sequence of SEQ ID NO: 1-5 in which the C- or N-terminal amino acid has been altered.
  • variants have a sequence identity greater than 85% to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1-5 when the sequences are compared with the GAP or BESTFIT programs.
  • These computer programs for determining amino acid sequence identity ⁇ are sufficiently be ⁇ known in the art.
  • the variant of the sequence shown in SEQ ID NO: 1-5 may be based on a sub stitution ⁇ an amino acid, that is, one amino acid may be replaced with another amino acid.
  • the substitution by which the variants differ from any of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-5 is a conservative substitution, that is, substitution of an amino acid with an amino acid of similar polarity conferring similar functional properties to the peptide.
  • a hydrophobic residue can be replaced by another hydrophobic residue or a polar residue by another polar residue.
  • non-polar amino acids such as glycine, valine , Alanine, isoleucine, leucine, methionine, proline, phenylalanine, and tryptophan.
  • uncharged polar amino acids include serine, threonine, glutamine, asparagine, tyrosine, and cysteine.
  • charged polar (acidic) amino acids include histidine, arginine and lysine.
  • charged po- Larenic (basic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Variants of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1-5 also include those amino acid sequences in which an amino acid has been inserted. Such insertions may occur as long as the resulting variant retains its ability to bind specifically to cells of the brain and / or spinal cord. Furthermore, in the present case, such proteins also count as variants of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1-5, in which one of the two N-terminal amino acids of the peptide is missing. Requirement is again that the corresponding deleted variant speci ⁇ fish binds to cells of the brain and / or spinal cord.
  • these modified amino acids may be amino acids which have been modified by biotinylation, phosphorylation, glycosylation, acetylation, branching and / or cyclization.
  • Viral vectors whose capsid comprises one of the peptide sequences according to the invention or a variant thereof as defined above specifically bind cells of the brain and / or the spinal cord.
  • "specific" binding of the vectors of the invention means that after systemic administration, the vectors accumulate predominantly on or in the cells of the brain and / or spinal cord. This means that more than 50% of the originally administered vector genome in the area of the cells of the brain and / or spinal cord anrei ⁇ chern, while less than 50% in or in the range of other cells or tissues accumulate (such as in the spleen or liver).
  • more than 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or even more than 99% of the originally administered vector genome accumulate in or around the brain and / or spinal cord cells.
  • Specific binding of the vectors can also be determined via the expression of the transgene.
  • viral vectors that specifically bind cells of the brain and / or spinal cord more than 50% of the total ex ⁇ pression of the transgene in or in the region of the brain and / or spinal cord, while less than 50% of the expression in or im Range of other tissues can be observed.
  • greater than 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or even more than 99% of the total measured expression of the transgene occurs in or around the brain and / or spinal cord.
  • vectors whose capsids contain variants of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1-5 have at least about 50% of the binding activity of a corresponding viral vector whose capsid is that shown in SEQ ID NO: 1-5 Has amino acid sequence. Even more preferred is that the variants have about 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of the binding activity of a corresponding viral vector whose capsid is as described in SEQ ID NO: 1-5 has shown amino acid sequence.
  • the binding ⁇ activity of the vectors can be by means of gemes ⁇ sen in vitro assays such as those described in the present examples.
  • the binding activity of the vectors according to the invention is preferably at least 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, 50-fold for cells of the brain and / or spinal cord.
  • the invention also relates to a cell comprising a invention shown SLI peptide, polypeptide or protein, a coding therefor nuc ⁇ lein Textre, a plasmid that combines such a nucleic acid environmentally, or containing a recombinant AAV vector described above. It is preferably a human cell h ⁇ le or cell line.
  • a cell was obtained from a human subject by a biopsy procedure and then transfected with the viral vector in an ex vivo procedure.
  • the cell can then re-implant ⁇ advantage to the subject or this will be fed back to other ways, such as transplantation or infusion.
  • the likelihood of rejection of transplanted cells is less if the subject from whom the cell was derived is genetically similar to the subject to whom the cell is administered.
  • the subject to whom the transfected cells are delivered is the same subject from which the cells were previously obtained.
  • the cell is preferably a human cell of the brain or spinal cord, in particular a neuronal cell, an endothelial cell of a blood vessel.
  • the cell to be transfected may also be a stem cell, such as an adult human stem cell. It is particularly preferred according to the invention that the cells to be transfected are autologous cells which have been transfected ex vivo with the viral vector according to the invention, for example the recombinant AAV2 vector described.
  • the cells are preferably used in a method of treating a disorder or disorder of the brain and / or spinal cord in a subject.
  • the invention relates to a method for producing an AAV vector, in which a plasmid is used, that codes for a capsid protein having the Aminokla ⁇ resequenz of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof.
  • the vector may also have an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 6, in particular one of the amino acid sequences according to SEQ ID NO: 2-5 or a variant thereof.
  • the basic method of producing recombinant AAV vectors comprising a transgene to be expressed has been well described in the art [28].
  • HEK293-T cells are transfected with three plasmids.
  • a first plasmid contains the cap and rep regions of the AAV genome but lacks the naturally occurring inverted repeats (ITRs).
  • the cap region of this plasmid contains a gene that encodes at least one modifier ⁇ tes capsid protein, ie a gene which comprises the peptide sequence of the invention.
  • a second plasmid comprises a transgene expression cassette flanked by the corresponding ITRs representing the packaging signal. The expression cassette is therefore packed during the assembly of the Vi ⁇ ruspiety in the capsid.
  • the third plasmid han ⁇ delt it is an adenoviral helper plasmid on which the Hel ⁇ ferproteine E1A, E1B, E2A, E4 ORF6, VA are coded, which are required for AAV replication in HEK 293-T cells .
  • the AVV vectors according to the invention in insect cells.
  • a corresponding protocol is listed by way of example in Example 6 below.
  • the vectors of the invention may be purified for example by gel filtration, for example using a Sepharose, desalted and subsequent Filtra ⁇ tion.
  • Other purification methods may further comprise cesium chloride or iodixanol gradient ultracentrifugation.
  • the purification reduces potentially deleterious affects in the subject to which the adeno-associated viral vectors are administered.
  • the administered virus is essentially free of wild-type and replication-competent virus. The purity of the virus can be checked By qualified ⁇ designated process, such as PCR amplification.
  • the invention provides in another aspect, a pharmazeuti ⁇ cal composition
  • a viral vector of the present invention particularly an AAV vector.
  • the viral vector is then administered in a therapeutically effective amount to the patient, ie in an amount ranging from ⁇ to improve at least one symptom to be treated function ⁇ disorder or disease of the brain and / or spinal cord to a considerable extent or to prevent the progression of the disease.
  • a therapeutically effective amount of the vector of the invention causes a positive change in one of said symptoms, that is, an alteration that approximates the phenotype of the subject concerned to the phenotype of a healthy subject who does not suffer from a disease of the brain and / or spinal cord.
  • the administration of the viral vector is in an amount that results in a complete or substantially complete cure of the disorder or disease of the brain and / or spinal cord.
  • the pharmaceutical composition is demge ⁇ Gurss contain a therapeutically effective dose of the vector of the invention.
  • a therapeutically effective dose will usually not be toxic to the subject undergoing the treatment.
  • the exact amount of viral vector that must be administered to achieve a therapeutic effect depends on several parameters. Factors that are relevant to the amount of the ver ⁇ abrialden viral vector, for example, include the route of administration of the viral vector, the type and severity of it ⁇ crane kung, the medical history of the patient to be treated and the age, weight, height and health of the to behan ⁇ delnden patients.
  • the expression level of the transgene needed to achieve a therapeutic effect, the immune response of the patient, as well as the stability of the gene product for the amount to be administered are also relevant.
  • a therapeutically effective amount of the viral vector may be readily determined by one skilled in the art based on the general knowledge and disclosure herein.
  • the viral vector is preferably administered in an amount corresponding to a virus dose in the range of 1.0 x 10 10 to 1.0 x 10 14 vg / kg (viral genomes per kg of body weight), with a range of 1.0 x 10 11 to 1.0 x 10 13 vg / kg is more preferable, and a range of 5.0 x 10 11 to 5.0 x 10 12 vg / kg is more preferable, and a range of 1.0 x 10 12 to 5 , 0x10 12 is even more preferred.
  • a virus dose of about 2.5 x 10 12 vg / kg is most preferred.
  • the quantity to be administered vi ⁇ eral vector, such as the AAV2 vector of the invention can be adjusted depending on the strength of the expression of one or more transgenes.
  • the viral vector of the present invention can be formulated for various Ar ⁇ th of administration, for example, for oral administration as a capsule, a liquid or the like. It is per ⁇ but preferred that the viral vector is administered parenterally, preferably is administered by intravenous injection or intravenous infusion. The administration can, for example, by traven Anlagenr in ⁇ infusion, for example, within 60 minutes, within 30 minutes or within 15 minutes. It is further preferred that the viral vector during surgery locally administered by injection into the brain and / or spinal cord.
  • Compositions suitable for administration by injection and / or infusion typically include solutions and dispersions as well as powders from which appropriate solutions and dispersions can be made.
  • compositions will contain the viral vector and at least one suitable pharmaceutically acceptable carrier.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers for the intrave ⁇ nous administration include bacteriostatic water, Ringer's solution, physiological saline, phosphate buffered Salzlö ⁇ solution (PBS) and Cremophor EL TM.
  • Sterile compositions for injection and / or infusion can be prepared by introducing the viral vector in the required amount in a suitable carrier and subsequently by means of a filter becomes.
  • Compositions for administration by injection or infusion should remain stable for a prolonged period after their preparation under storage conditions.
  • the compositions may contain a preservative for this purpose. Suitable preservatives include ⁇ chlorobutanol, phenol, ascorbic acid and thiomersal.
  • the preparation of corresponding administration forms and suitable auxiliaries are described, for example, in “Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams &Wilkins; 21st edition (2005).
  • the invention features a method of therapeutically treating a disorder or disorder of the brain and / or spinal cord which comprises administering to a subject a viral vector of the invention, preferably an AAV vector as described above ,
  • the vector comprises a capsid which comprises at least one capsid protein which contains the peptide sequence according to SEQ ID NO: 1 or a variant thereof.
  • the vector may also comprise an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 6, in particular one of the amino acid sequences according to SEQ ID NO: 2-5 or a variant thereof.
  • the viral vector further comprises a transmembrane ⁇ gene, such as a therapeutic gene for the treatment of Dysfunction or disease of the brain and / or spinal cord is useful.
  • systemic administration such as intrave ⁇ nous injection or infusion
  • the vector for the specific expression of the gene in the cells of the brain and / or spinal cord makes.
  • FIG. 1 shows the in vivo selection method of the AAV peptide library used in the context of the invention.
  • Figure 2 shows the sequences of the brain specific peptides identified by the selection method.
  • the post-peptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 1 was identified in the fourth round of selection.
  • Figure 3 shows gene expression after intravenous injection of recombinant AAV vectors in the live mouse. Luciferase expression became 14 days after systemic injection of 5x10 10 Vector genomes measured with an IVIS * 200 Imaging Imaging System.
  • FIG. 4 shows a long-term expression analysis in the mouse after systemic administration of the recombinant AAV vector rAAV2-NRGTEWD.
  • FIG. 5 shows the results of the determination of luminescence and vector distribution 14 days after intravenous injection of 5 ⁇ 10 10 vector genomes of the recombinant AAV vector rAAV2-NRGTEWD.
  • A The measurement of gene expression as luminescence in the lysates of various organs of the mouse shows high specificity of the vector for the brain.
  • Example 1 Selection of AAV2 peptide libraries To select tissue-specific AAv2 capsids, a randomized AAV peptide library was prepared and selected over five rounds. A random-based X 7 AAV peptide library with a diversity of the ⁇ oretician lxlO 8 individually occurring clones was prepared using a two-stage protocol as previously described [26-27]. It was first a dege ⁇ nerêts oligonucleotide encoding seven randomized amino acids at nucleotide position 3967 in the AAV genome, which is equivalent to VP1 amino acid position R588.
  • the oligonucleotide had the sequence: 5'-CAGTCGGCCAGAGAGGC (NNK) 7GCCCAGGCGGCTGACGAG-3 '(SEQ ID NO: 12).
  • the second strand was made using a Sequenase
  • the double-stranded insert was cut with BglI, with the Qiagen quick nucleotides Removal Kit (Qiagen, Hilden, Germany) on ⁇ and in the library with SfiI digested plasmid pMT187-0-3 ligated [26].
  • the diversity of the plasmid library was determined by the number of clones growing from a representative aliquot of transformed, electro-competent DH5 bacteria on agar containing 150 mg / ml ampicillin.
  • Library plasmids were harvested and purified under USAGE ⁇ dung of plasmid preparation kit from Qiagen.
  • the AAV library genomes were packaged into chimeric wild-type and library AAV capsids (AAV transfer shuttle) by incubating 2x10 8 293 T cells in 10 cell culture dishes (15 cm) with the plasmid pVP3cm
  • the resultie ⁇ leaders AAV library transfer shuttle were used to 2xl0 8 293T cells in cell culture dishes (15 cm) to infect at a MOI of 0.5 replicative units per cell.
  • the cells were superinfected with Ad5 (provided by the Laboratoire des Therapie Genique, France) at an MOI of 5 plaque-forming units (pfu / cell).
  • Ad5 provided by the Laboratoire des Therapie Genique, France
  • the final AAV Display library was harvested from the supernatants after 48 hours.
  • the supernatants were concentrated using VivaSpin- columns (Vivascience, Hannover, Germany) and described by iodixanol density gradient ultracentrifugation as previously purified [29] and by real-time PCR under Ver ⁇ application of the cap-specific primer 5 ' - GCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACC - 3 '(SEQ ID NO: 14) and 5' - GCCTGGAAGAACGCCTTGTGTG - 3 '(SEQ ID NO: 15) titrated with the LightCycler system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).
  • lxlO were injected 11 particles of the genomic library in the tail vein of FVB / N mice. The particles were given 8 days for the distribution and infection of the target cells. After 8 days, the mice were killed and the brains were removed. The total DNA of the fabric WUR ⁇ de using the DNeasy Tissue Kit (Qiagen).
  • the PCR amplified oligonucleotides were used to produce secondary library for three additional Se ⁇ lesson round.
  • the secondary libraries were generated like the primary libraries (see above) but without the additional step of making transfer shuttles.
  • the secondary plasmid library was used to transfect 2x10 8 293 T cells into cell culture dishes (15 cm) at a ratio of 25 library plasmids per cell using the transfection agent Polyfect (Qiagen). After each round of selection, several clones were sequenced. The ⁇ be applied selection method is shown in FIG. 1. Results: After five rounds of selection several brain binding capsids were sequenced. Capsids comprising the peptide sequence NRGTEWD (SEQ ID NO: 1) bound particularly strongly to cells and tissues of the brain and spinal cord (see below).
  • Another group of peptides which also showed brain and spinal cord specificity included the peptides ADGVQWT (SEQ ID NO: 2), DDGVSWK (SEQ ID NO: 3), SDGLTWS (SEQ ID NO: 4) and SDGLAWV (SEQ ID NO: 5). These peptides contained the general motif XDGXXWX (SEQ ID NO: 6). The peptides obtained in the various selection rounds are shown in FIG.
  • Example 2 Production and quantification of recombinant AAV vectors in HEK293T cells
  • the clones enriched in Example 1 were prepared as recombinant AAV vectors and examined for their transduction profile .
  • Recombinant AAV vectors were generated by triplicate transfection of HEK293T cells. The cells were incubated at 37 ° C, 5% CO 2 in Dulbecco's modified Eagle medium (Invitrogen, Carlsbad, USA) supplemented with 1% penicillin / streptomycin and 10% feta ⁇ lem calf serum supplemented grown. Plasmid DNA was transfected with the transfection agent Polyfect (Qiagen, Hilden, Germany) into 293T cells.
  • pXX6 was used as adenoviral helper plasmid [28], the luciferase gene pUF2-CMV-luc [27] or the GFP gene pTR-CMV-GFP [30], and a plasmid encoding the AAV capsid of interest coded used. Plasmids encoding the AAV capsid mutants previously selected from the AAV library and wild-type controls were modified pXX2-187 [31] and pXX2, respectively [28].
  • the inserts were as ⁇ be attributed library inserts processed (see above).
  • genomic titers were used by quantitative real-time PCR the following CMV-specific primer 5'-GGCGGAGTTGTTACGACAT-3 '(SEQ ID NO: 20) and 5'-GGGACTTTCCCTACTTGGCA-3' (SEQ ID NO: 21) determined with the LightCycler system as previously described [32] ,
  • Example 3 Investigation of the tropism of the recombinant AAV vectors in vivo
  • the peptides were introduced into the capsid of a recombinant vector comprising a luciferase reporter gene. Mutant capsid vectors and control vectors were injected into mice.
  • Luciferase expression was analyzed using a Xenogen IVIS200 Imaging System (Caliper Lifescience, Hopkinton, USA) with the Living Image 4.0 software (Caliper) after intraperitoneal injection of 200 ⁇ l Luciferin substrate (150 mg / kg, Xenogen) per mouse , There are representative in vivo bioluminescence images of the expression of the transgene at different positions (ventral, dorsal, lateral) ⁇ be taken when the luminescence (NEN photon / sec / cm 2) in relative light units reached the highest intensity.
  • luciferase reporter gene activity was performed in a luminometer (Mithras LB9 40, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) at 10-second intervals after addition of 100 ⁇ l luciferase assay reagent (LAR, Promega), wherein each ⁇ wells consisted 2 second delay between measurements. The values were normalized with respect to the total protein level in each sample using the Roti Nanoquant Protein Assay (Roth, Düsseldorf, Germany).
  • the investigations also showed that the brain-specific expression of the transgene mediated by the NRGTEWD vector remained organ-specific over a long period of time.
  • expression of the transgene was measured over a period of 168 days. The radiation emitted in the area of the brain was recorded quantitatively. Over the entire period, expression of the transgene stably occurred at a high level and was restricted to the brain (see FIG. 4).
  • Genomes could be obtained mainly from the liver and spleen, although the genomes of vectors which showed the control peptide were mainly derived from the spleen (data not shown). Overall, the amount of vector genomes detected in the spleen were relatively similar for all capsid variants tested, indicating a nonspecific uptake mechanism for the particles in the reticulo-endothelial system independent of the delivery and expression of the transgene is. In contrast, the distribution data of genomes that have been provided by vectors, which showed the peptide NRGTEWD, the Expressionsda ⁇ th of the transgene, wherein a high specific accumulation in the brain can be observed are similar.
  • the amount of brain-detected vectors that displayed the peptide NRGTEWD was about 168-fold higher than in brains injected with a wild-type vector or a control capsid vector.
  • the activity of the endogenous peroxidase was inactivated with 1% H 2 O 2 in methanol for 30 minutes. Prior to staining with CD31, sections were heated in citrate buffer (pH 6.0) at 100 ° C for 20 minutes. After washing in PBS, The sections were incubated for 30 minutes with PBS, 10% goat serum (Vector Lab, Burlingame, USA) and 2% milk powder (Roth). Pri ⁇ tales antibodies were allowed to bind for 1 hour at 37 ° C. After washing in PBS, the sections were incubated for 30 minutes with a secondary, biotinylated goat anti-rabbit antibody (Vector Lab). Bound antibodies were visualized using the VECTASTAIN Elite ABC Kit (Vector Lab) and 3,3'-diaminobenzidine (DAB, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Selected sections were counterstained with Hemalum.
  • mice injected with rAAV-NRGTEWD was injected, a microscopic examination revealed across a inten sive ⁇ staining of endothelial cells throughout the microvasculature and to a slightly lesser extent in the size ⁇ ren vessels (data not shown).
  • Ge ⁇ brain tissue from mice wild type AAV2 vector was injected showed no staining.
  • the liver was analyzed as a control (a tissue known to frequently show high expression of a transgene after injection of wild-type AAV2 vector). Staining of hepatocytes was observed in the liver after administration of wild-type RAAV2 vector, but no staining after administration of the rAAV2-NRGTEWD vector.
  • the endothelial origin of the cells transduced with the vectors was confirmed by CD31 staining, confirming the pattern obtained by GFP staining in serial sections of the brains of mice injected with rAAV2-NRGTEWD (data not shown).
  • the modified AAV2 genome with the oligonucleotide insert coding for the Pepti ⁇ dinsertion in the cap gene in the donor plasmid pFASTBAC Dual (Life Technolgies, Dar ⁇ mstadt, Germany). Furthermore, an artificial intron was inserted into the donor plasmid, which encompassed the polh promoter, resulting in the plasmid pFBD-Repi n / Capi n [35].
  • the CAG promoter and the eGFP gene together with the SV40 polyadenylation signal and the AAV2 ITRs were cloned into the plasmid pFASTBAC1 (Life Technologies).
  • the donor plasmids were used for transformers ⁇ tion of E. coli DHlOBac cells used, from which subsequently ⁇ ruinedd recombinant bacmids were isolated containing the recombinant AAV genome and the eGFP transgene cassette.
  • the bacmids (9yg) were analyzed by FectoflyTrans Stammionsreagenz (Polyplus Transfection / VWR International GmbH, Darmstadt, Germany) was used to transfect each lxlO 6 Sf9 Zel ⁇ len in 6-well format. After incubation of the transfected Sf9 insect cells at 27 ° C.
  • recombinant baculovirus with inserted AAV genome and recombinant baculovirus were mixed with inse ⁇ ferred eGFP transgene cassette and used together in 400 ml Insect-XPress medium with 1% gentamycin in 11 Erlenmeyer flasks for infection of 6xl0 8 insect cells. The cells were then incubated at 27 ° C with shaking (110 rpm). Four days after infection, the cells were harvested, lysed and the AAV vectors were purified by iodixanol density gradient ultracentrifugation as previously described [29].
  • the genomic titers were determined by quantitative real-time PCR using the CMV-specific primers of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 with the LightCycler system as described previously [32]. ,

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Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Peptide, Polypeptide oder Proteine, die spezifisch an Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks binden. Die Peptide, Polypeptide oder Proteine können Bestandteil eines viralen Kapsids sein und dazu verwendet werden, einen rekombinanten viralen Vektor nach systemischer Verabreichung an ein Subjekt selektiv zum Gehirn und/oder zum Rückenmark zu leiten und dort für eine gewebespezifische Expression von einem oder mehreren Transgenen zu sorgen. Die Erfindung betrifft somit auch einen rekombinanten viralen Vektor, vorzugsweise einen AAV-Vektor, der ein Kapsid umfasst, welches mindestens eines der erfindungsgemäßen Peptide, Polypeptide oder Proteine enthält, sowie mindestens ein in dem Kapsid verpacktes Transgen. Der virale Vektor eignet sich insbesondere zur therapeutischen Behandlung einer Erkrankung oder Funktionsstörung des Gehirns und/oder des Rückenmarks. Die Erfindung betrifft ferner Zellen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die den erfindungsgemäßen viralen Vektor umfassen.

Description

VIRALER VEKTOR FÜR DEN ZIELGERICHTETEN GENTRANSFER
IN GEHIRN UND RÜCKENMARK
Die Erfindung betrifft neuartige Peptide, Polypeptide oder Pro¬ teine, die spezifisch an Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks binden. Die Peptide, Polypeptide oder Proteine können Be¬ standteil eines viralen Kapsids sein und dazu verwendet werden, einen rekombinanten viralen Vektor nach systemischer Verabreichung an ein Subjekt selektiv zum Gehirn und/oder zum Rückenmark zu leiten und dort für eine gewebespezifische Expression von ei¬ nem oder mehreren Transgenen zu sorgen. Die Erfindung betrifft somit auch einen rekombinanten viralen Vektor, vorzugsweise einen AAV-Vektor, der ein Kapsid umfasst, welches mindestens eines der erfindungsgemäßen Peptide, Polypeptide oder Proteine ent¬ hält, sowie mindestens ein in dem Kapsid verpacktes Transgen. Der virale Vektor eignet sich insbesondere zur therapeutischen Behandlung einer Erkrankung oder Funktionsstörung des Gehirns und/oder des Rückenmarks. Die Erfindung betrifft ferner Zellen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die den erfindungsgemäßen viralen Vektor umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die gentherapeutische Behandlung mittels viraler Vektoren stellt eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit für Erkrankungen dar, die auf eine konventionelle Behandlung nicht oder nicht in ausreichendem Maße ansprechen. Dieser Ansatz beruht auf der Ein- schleusung von therapeutischen Genen in den zu behandelnden Organismus mit Hilfe von Viren, die so modifizierte wurden, dass sie die Sequenz des entsprechenden Gens in ihrem Genom aufweisen. Virale Vektoren, die im Rahmen der Gentherapie bereits für gentherapeutische Therapieansätze verwendet wurden, basieren auf Retroviren, Lentiviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren.
Adeno-assozierte Viren (AAV) stellen vielversprechende Kandida¬ ten für den Einsatz in der der klinischen Praxis dar, da sie als verhältnismäßig sicher eingestuft werden. AAV-Vektoren sind in der Lage, ein Transgen in ein Gewebe einzuschleusen und dort stabil und effizient zu exprimieren. Gleichzeitig weisen diese Vektoren keine bekannten Pathogenitätsmechanismen auf [1]. Besondere Bedeutung für eine klinische Anwendung kommt den AAV- Vektoren vom Serotyp 2 (AAV2) zu, die als besonders gut unter¬ sucht gelten. Nach Einschleusung durch AAV-Vektoren können die Transgene in verschiedenen Formen in der transfizierten Zelle vorliegen, z.B. als episomale, einzel- oder doppelsträngige DNA. Auch konkatamere Formen der DNA wurden in transduzierten Zellen nachgewiesen .
Das Genom von AAV2 wird von einem linearen, einzelsträngigen DNA-Molekül von etwa 4700 Nukleotiden Länge gebildet und umfasst an beiden Enden Inverted Terminal Repeats (ITRs) . Das Genom um¬ fasst ferner zwei große offene Leserahmen, die als Replikations- Region (rep) und Kapsid-Region (cap) bezeichnet werden. Die Rep- likations-Region kodiert für Proteine, die im Rahmen der Virus- replikation erforderlich sind. Die Kapsid-Region hingegen kodiert für die strukturellen Proteine VP1, VP2 und VP3, aus denen sich das ikosaedrische Kapsid des Virus zusammensetzt.
Wie die meisten im Stand der Technik bekannten, gentherapeutisch verwendbaren Vektoren allerdings weisen Wildtyp-AAV-Vektoren, wie z.B. die beschriebenen AAV2-Vektoren, keine ausreichende Spezifität für ein bestimmtes Gewebe auf, sondern infizieren ei¬ ne große Bandbreite von Zelltypen. Bei systemischer Gabe dieser Wildtyp-Vektoren kommt es somit zu einer unzureichenden Transduktion der Zielgewebe, während aufgrund der unerwünschten Transduktion von anderen Geweben mit starken Immunreaktionen im behandelten Patienten gerechnet werden muss. Fortschritte bei der Entwicklung von viralen Vektoren, die eine erhöhte Spezifität für bestimmte Organe aufweisen, wurden in der Vergangenheit durch den Einsatz von Peptidliganden erreicht, die in der Lage sind, die Vektoren zu einem bestimmten Organ zu leiten [2-3] . Es konnte gezeigt werden, dass bestimmte Peptidliganden für ein "Homing" zu verschiedenen Organen wie z.B. zum Gehirn sorgen.
Literaturstelle [4] beschreibt ein Verfahren, welches das Scree¬ ning nach Kapsiden von AAV2 mit modifiziertem Tropismus in ran- domisierten Peptidbanken erlaubt. Aus diesen Bibliotheken können Vektoren isoliert werden, die in vitro spezifisch einen gewünschten Zelltyp transduzieren . Jedoch wurde festgestellt, dass die auf diese Weise selektierten Kapside oftmals für eine Ver¬ wendung in vivo ungeeignet sind, da ihnen im Tiermodell die nö¬ tige Spezifität fehlte [5].
Das Gehirn stellt ein klinisch extrem relevantes Organ dar, da es Ausgangspunkt für eine Reihe von neurologischen Erkrankungen ist. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, dieses Organ für gentherapeutische Interventionen erreichbar zu machen [6-12]. Allerdings stellt die Blut-Hirn-Schranke, die gemein¬ schaftlich von Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten gebildet wird und das Gehirn von zirkulierenden Partikeln, Toxinen und Botenstoffen abschottet, ein für gängige Vektorsysteme unüber- windbares Hindernis dar. Da bislang keine geeigneten Vektorsys¬ teme verfügbar sind, die nach intravenöser Applikation zielgerichtet mit ausreichender Effizienz das Gehirn transduzieren, werden heutige Gentherapievektoren meist direkt in das Gehirn injiziert [13], was mit einem hohen Risiko für den Patienten be¬ haftet ist. Die Möglichkeit, die Blut-Hirn-Schranke kurzzeitig für größere Partikel passierbar zu machen, z.B. durch Ultraschall [14] oder mittels chemischer Komponenten [7], wird ebenfalls als sehr riskant erachtet.
Es besteht daher ein großes Bedürfnis nach Mitteln, die in der Lage sind, den Tropismus viraler Vektoren zu modulieren und damit für eine ausreichende Zell- oder Gewebespezifität sorgen, die einen gezielten Transport eines viralen Vektors zu Geweben des Gehirn und Rückenmarks, ermöglicht. Solche Vektoren können für eine spezifische Expression von therapeutischen Genen in diesen Geweben sorgen, um auf diese Weise Erkrankungen und/oder Funktionsstörungen des Gehirns und Rückenmarks wirksam zu behandeln .
Die vorliegende Erfindung stellt virale Vektoren für den zielge¬ richteten Gentransfer in das Gehirn und Rückenmarks bereit. Die erfindungsgemäßen viralen Vektoren exprimieren auf ihrer Kapsid- Oberfläche bislang unbekannte Aminosäuresequenzen, die in vivo spezifisch von Rezeptoren auf den Neuronen des Gehirns und den Endothelzellen der Blutgefäße von Gehirn und Rückenmark erkannt werden. Somit transduzieren die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung nach systemischer Verabreichung an ein Subjekt spezifisch dessen Gewebe in Gehirn und Rückenmark.
Die erfindungsgemäßen viralen Vektoren ermöglichen darüber hinaus eine starke und lang anhaltende Expression eines Transgens in den Neuronen des Gehirns und den endothelialen Zellen der Blutgefäße von Gehirn und Rückenmark. Daher sind die Vektoren insbesondere für die gentherapeutische Behandlung von bestimmten Erkrankungen und Funktionsstörungen von Gehirn und Rückenmark geeignet. Es wurde darüber hinaus festgestellt, dass die die AAV-Vektoren nach der Transfektion lediglich eine geringfügige Immunreaktion in dem Wirt hervorrufen und somit besonders für die Gentherapie geeignet sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden durch Selektion in einer randomisierten AAV2-Heptamer-Pepidbibliothek verschiedene für das Zentralnervensystem, d.h. für Gehirn und Rückenmark, spezifische Sequenzen identifiziert. Ein Heptamer, das eine be¬ sondere Spezifität für das Gehirn aufwies, war das Peptid NRGTEWD (SEQ ID NO : 1 ) . Auf Basis dieser Sequenz wurde der rekom- binante virale Vektor rAAV2-NRGTEWD hergestellt, bei dem die Peptidsequenz NRGTEWD als Teilsequenz des Kapsid-Proteins VP1 exprimiert wird. Anschließend wurde der Vektor rAAV2- NRGTEWD intravenös an Mäuse verabreicht, wobei sowohl in vitro als auch in vivo eine eindeutige Spezifität des Vektors für das Zentral¬ nervensystem beobachtet werden konnte. Sowohl Neuronen des Gehirns als auch Endothelzellen der Blutgefäße von Gehirn und Rückenmark wurden von dem Vektor transfiziert . Die Spezifität konnte durch Färbung mit CD31 nachgewiesen werden, wie es in den vorliegenden Beispielen beschrieben wird. Eine weitere Gruppe von Peptiden, die ebenfalls eine Spezifität für Gehirn und Rückenmark zeigten, umfasste die Peptide ADGVQWT (SEQ ID NO:2), DDGVSWK (SEQ ID NO : 3 ) , SDGLTWS (SEQ ID NO : 4 ) und SDGLAWV (SEQ ID NO:5). Diese Peptide enthielten jeweils das all¬ gemeine Motiv XDGXXWX (SEQ ID NO: 6).
Die vorliegende Erfindung stellt daher verschiedene für das Ge¬ hirn und das Rückenmark spezifische Peptidsequenzen bereit, die in besonderer Weise dazu geeignet sind, therapeutische Mittel, wie z.B. virale Vektoren, gezielt in das Gehirn bzw. das Rückenmark eines zu behandelnden Subjekts zu leiten.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung demge¬ mäß ein Peptid, Polypeptid oder Protein, das spezifisch an Zel¬ len des Gehirns und/oder des Rückenmarks bindet, wobei das Pep¬ tid, Polypeptid oder Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:l oder eine Variante davon umfasst, wobei sich die Variante von der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:l durch Modifikation von maximal einer Aminosäure unterscheidet. Das erfindungsgemäße Peptid, Polypeptid oder Protein bindet vorzugsweise an Endothel- zellen und/oder an Neuronen des Gehirns oder Rückenmarks.
In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid, Polypeptid oder Protein, das spezifisch an Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks bindet, wobei das Peptid, Poly¬ peptid oder Protein die allgemeine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid, Polypeptid oder Protein eine der Sequenzen ADGVQWT (SEQ ID NO : 2 ) , DDGVSWK (SEQ ID NO:3), SDGLTWS (SEQ ID NO: 4) oder SDGLAWV (SEQ ID NO: 5) oder eine Variante derselben, wobei sich die Variante von der jeweiligen Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2-5 durch Modifikation von maximal einer Aminosäure unterscheidet. Das erfindungsgemäße Peptid, Polypeptid oder Pro¬ tein bindet vorzugsweise an Endothel zellen und/oder an Neuronen des Gehirns oder Rückenmarks.
Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung bezeichnet der Begriff "Peptid" eine Verknüpfung von 2-10 Aminosäuren, die über eine peptidische Bindung miteinander verbunden sind. Der Begriff "Polypeptid" bezeichnet eine Verknüpfung von 11-100 Aminosäuren, die über eine peptidische Bindung miteinander verbunden sind. Polypeptide mit mehr als 100 Aminosäuren werden vorliegend als "Protein" bezeichnet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die erfindungsgemäße, für das Gehirns und das Rückenmark spezi¬ fische Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder einer Variante davon oder gemäß SEQ ID NO: 2-6 oder einer Variante davon Teil eines Kapsid-Proteins eines Virus. Dies bedeutet, dass die für das Ge¬ hirn und das Rückenmark spezifische Peptidse-quenz als Teil eines Kapsid-Proteins des Virus vorliegt. Um derartige Kapsid- Proteine herzustellen, wird eine entsprechende, für das Peptid kodierende Nukleotidsequenz in die Region des Virus-Genoms klo- niert, die für ein Kapsid-Protein des Virus kodiert. Wird die für das Gehirn bzw. das Rückenmark spezifische Sequenz als Teil eines Kapsid-Proteins exprimiert, so kann sie vielfach an der Oberfläche des viralen Vektors präsentiert werden.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Kapsid-Protein um ein sol¬ ches, das von einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) stammt. Bei dem AAV kann es sich um einen beliebigen der im Stand der Technik beschriebenen Serotypen handeln, wobei das Kapsid-Protein vorzugsweise von einem AAV von einem der Serotypen 2, 4, 6, 8 und 9 stammt. Ein Kapsid-Protein eines AAV vom Serotyp 2 ist be¬ sonders bevorzugt.
Das Kapsid des AAV-Wildtyps setzt sich aus den Kapsid-Proteinen VP1, VP2 und VP3 zusammen, die überlappend von der cap-Region kodiert werden. Alle drei Proteine weisen einen identischen C- terminalen Bereich auf. Das Kapsid von AAV umfasst etwa 60 Ko¬ pien der Proteine VP1, VP2 und VP3, die im Verhältnis 1:1:8 ex¬ primiert werden. Wird eine Nukleotidsequenz, die für eine der vorliegend beschriebenen Peptide mit Spezifität für das Gehirn bzw. das Rückenmark kodiert, C-terminal in den Leserahmen von VP1 kloniert (d.h. in den Bereich, der bei allen drei Proteinen identisch ist) , so kann man erwarten, dass theoretisch 60 der spezifischen Peptide der auf der Kapsid-Oberflache zu finden sind .
Wird ein AAV-Vektor im Sinne der vorliegenden Erfindung modifiziert, so wird die für das Peptid mit Spezifität für das Gehirn kodierende Nukleotidsequenz in die cap-Region am 3 ' -Ende des Genoms kloniert. Die Sequenz, die für das Peptid mit Spezifität für das Gehirn bzw. Rückenmark kodiert, kann in die genomische Sequenz eines der Kapsid-Proteine VP1, VP2 oder VP3 kloniert werden. Die Kapsid-Proteine von AAV2 sind beispielhaft in SEQ ID NO:7 (VP1), SEQ ID NO : 8 (VP2) und SEQ ID NO : 9 (VP3) dargestellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Sequenz, die für das Peptid kodiert, welches Spezifität für das Gehirn bzw. Rückenmark aufweist, in den Leserahmen eines VPl-Gens kloniert, vorzugsweise in das in SEQ ID NO: 7 gezeigte VPl-Gen von AAV2. Dabei sollte beachtet werden, dass sich durch die Insertierung der klonierten Sequenz kein Wechsel des Leserahmens und kein vorzeitiger Abbruch der Translation ergibt. Dem Fachmann werden die dazu erforderlichen Methoden ohne Weiteres ersichtlich sein.
In allen drei Kapsid-Proteinen von AVV wurden Stellen identifiziert, an denen Peptidsequenzen für das Homing eingefügt werden können [15-20] . So wurde unter anderem das im VP1 von AAV2 vorkommende Arginin in Position 588 (R588) spezifisch für die Insertion eines Peptidliganden vorgeschlagen [21-22]. Diese Aminosäureposition des viralen Kapsids ist offenbar an der Bindung von AAV2 an seinen natürlichen Rezeptor beteiligt. Es wurde vermutet, dass R588 einer von vier Arginin-Resten ist, der die Bindung von AAV2 an seinen natürlichen Rezeptor vermittelt [23-24] . Eine Modifikation in diesem Bereich des Kapsids schwächt den natürlichen Tropismus von AAV2 ab oder beseitigt diesen vollständig .
Demgemäß ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder einer Va¬ riante davon oder gemäß SEQ ID NO: 2-6 oder einer Variante davon im Bereich der Aminosäuren 550-600 des VPl-Proteins von AAV2, insbesondere des VPl-Proteins von SEQ ID NO: 7, insertiert vor¬ liegt. Noch stärker bevorzugt ist es, dass die Peptidsequenz im Bereich der Aminosäuren 560-600, 570-600, 560-590, 570-590 des VPl-Proteins inseriert vorliegt.
So kann sich die Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder einer Variante davon oder gemäß SEQ ID NO: 2-6 oder einer Variante davon z.B. unmittelbar hinter einer der folgenden Aminosäure des VPl- Proteins, insbesondere des Proteins von SEQ ID NO: 7, anschlie¬ ßen: 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599 oder 600.
Besonders bevorzugt ist es, dass die Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder einer Variante davon oder gemäß SEQ ID NO: 2-6 oder einer Variante davon auf die Aminosäure 588 des VPl-Proteins von SEQ ID NO:7 folgt, wie es in den Beispielen gezeigt ist. Es ist dabei möglich, dass zwischen dem Arginin-Rest in Position 588 und der ersten Aminosäure des erfindungsgemäßen Peptids oder der Variante davon eine oder mehrere, und insbesondere bis zu 5 (d.h. 1, 2, 3, 4 oder 5) Aminosäuren liegen, die durch die Klo- nierung bedingt sind. Ebenso können hinter der letzten Aminosäure des erfindungsgemäßen Peptids oder der Variante davon eine oder mehrere, insbesondere bis zu 5 (d.h. 1, 2, 3, 4 oder 5) Aminosäuren liegen.
Die oben in Bezug auf VP1 angegebenen Stellen und Bereiche in der Aminosäuresequenz des Kapsid-Proteins gelten analog auch für die Kapsid-Proteine VP2 und VP3 von AAV2. Da sich die drei Kap- sid-Proteine VP1, VP2 und VP3 von AAV2 lediglich durch die Länge der N-terminalen Sequenz unterscheiden und demgemäß einen identischen C-terminalen Bereich aufweisen, wird der Fachmann keine Probleme haben, durch Sequenzvergleich die oben für VP1 angegebenen Stellen für die Insertierung des Peptidliganden in den Aminosäuresequenzen von VP1 und VP2 zu identifizieren. So ent- spricht die Aminosäure R588 in VP1 der Position R451 von VP2 (SEQ ID NO:8) bzw. der Position R386 von VP3 (SEQ ID NO:9).
SEQ ID NO: 10 zeigt beispielhaft die Sequenz des VPl-Proteins von AVV2 nach Einbringung der Peptidsequenz von SEQ ID NO:l. Bedingt durch die Klonierung weist das Kapsid-Protein zwei zusätzliche Aminosäuren auf, die in der nativen Sequenz des VPl-Proteins von AVV2 nicht vorkommen. So wird die Peptidsequenz von SEQ ID NO:l N-terminal von einem Glycin in Position 589 und C-terminal von einem Alanin in Position 597 flankiert. Darüber hinaus ist das Asparagin in Position 587 der nativen Sequenz gegen ein Glutamin ausgetauscht .
In einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit auch ein Kapsid-Protein, das Folgendes umfasst oder daraus besteht:
(a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10;
(b) eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% und vorzugsweise 90, 95 oder 99% Identität zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 aufweist und darüber hinaus (i) die Sequenz von SEQ ID NO:l umfasst oder (ii) eine Aminosäuresequenz, die sich von der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:l durch Modifikation von einer Aminosäure unterscheidet; oder
(c) ein Fragment von einer der in (a) oder (b) definierten AminosäureSequenzen .
In einem weiteren Aspekt richtet sich die Erfindung auf ein virales Kapsid, das ein Peptid, Polypeptid oder Protein umfasst, welches spezifisch an Zellen des Gehirns bzw. des Rückenmarks bindet und die Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder einer Variante davon oder gemäß SEQ ID NO: 2-6 oder einer Variante davon umfasst .
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung auch eine Nukleinsäure bereit, die für ein wie oben beschriebenes Peptid, Poly¬ peptid oder Protein kodiert. Eine Nukleinsäure, die für ein Kap- sid-Protein kodiert, welches ein wie oben beschriebenes, erfin¬ dungsgemäßes Peptid, Polypeptid oder Protein umfasst, wird eben¬ falls bereitgestellt. Vorzugsweise umfasst die für das Kapsid- Protein kodierende Nukleinsäure die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 11 oder eine davon abgeleitete Nukleotidsequenz mit mindes¬ tens 80% Sequenzidentität. Ein Plasmid, das eine solche Nuklein¬ säure umfasst, wird ebenfalls bereitgestellt.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen re- kombinanten, d.h. einen mittels gentechnischer Verfahren hergestellten, viralen Vektor, der ein Kapsid und mindestens ein darin verpacktes Transgen umfasst, wobei das Kapsid mindestens ein Kapsid-Protein umfasst, welches die Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder einer Variante davon oder gemäß SEQ ID NO: 2-6 oder einer Variante davon umfasst. Bei dem rekombinanten viralen Vektor kann es sich um einen rekombinanten AAV-Vektor handeln, z.B. um einen solchen vom Serotyp 2, 4, 6, 8 und 9. AAV-Vektoren vom Serotyp 2 sind besonders bevorzugt.
Die unterschiedlichen AAV-Serotypen unterscheiden sich im Wesentlichen anhand ihres natürlichen Tropismus. So bindet Wild¬ typ-AAV2 stärker an alveolare Zellen, während AAV5, AAV6 und AAV9 vorwiegend Epithelzellen infizieren. Der Fachmann kann diese natürlichen Unterschiede hinsichtlich der Spezifität der Zellen nutzen, um die durch die erfindungsgemäßen Peptide vermittelte Spezifität für bestimmte Zellen oder Gewebe weiter zu ver¬ stärken. Auf der Nukleinsäureebene sind die verschiedenen AAV- Serotypen stark homolog. So sind z.B. die Serotypen AAV1, AAV2 , AAV3 und AAV6 auf der Nukleinsäureebene zu 82% identisch [25] .
Das Kapsid der erfindungsgemäßen viralen Vektoren umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Transgene. Als Transgen wird vorlie¬ gend ein Gen bezeichnet, das mittels gentechnischer Verfahren in das Genom des Vektors eingebracht wurde. Bei dem Transgen (oder den Transgenen) kann es sich um DNA oder RNA handeln. Vorzugsweise handelt es sich um einzelsträngige DNA (ssDNA) oder doppelsträngige DNA (dsDNA) , wie beispielsweise genomische DNA oder cDNA. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Transgen, wel- ches mit Hilfe des erfindungsgemäßen rekombinanten viralen Vektors transportiert werden soll, um ein humanes Gen. Geeignete Transgene sind z.B. therapeutische Gene, die ein im Patienten dysfunktionales Gen ersetzen sollen. Es kann sich ferner um ein Gen handeln, das in dem entsprechenden Zielgewebe nicht oder nur in unzureichendem Umfang exprimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Transgen, welches vom viralen Vektor der Erfindung exprimiert wird, um ein.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können u.a. zur Behandlung der multiplen Sklerose (MS) eingesetzt werden. In diesem Fall kann es sich bei dem Transgen z.B. um ein Gen handeln, das für ein Membran- oder Tight-Junction-Protein kodiert, wie z.B. für ein Claudin und Occludin. Verzugsweise handelt es sich um ein Gen aus der Familie der Claudine handeln, z.B. um das für Claudinl kodierende Gen. Die Überexpression eines solchen Gens könnte hilfreich sein, um die durch die Krankheit geschädigte Blut- Hirn-Schranke "abzudichten".
Ferner kann zur Behandlung der MS auch ein Gen eingesetzt werden, das für einen Chemokin-Antagonisten kodiert. So kann z.B. eine negativ-dominante Mutante des Chemokins CCL2 (aka MCP1) ex¬ primiert werden, die als "CCL2-7ND" bezeichnet wird. CCL2 sorgt dafür, dass Immunzellen zu einem Entzündungsherd gelockt werden, was im Fall der MS zum entzündlichen Abbau der neuronalen Myelinscheide führt. Die dominant-negative Variante "CCL2-7ND" hin¬ gegen bildet Dimere und blockiert den Rezeptor CCR2, wodurch die Signalkaskade unterbunden wird und die Immunzellen nicht mehr zu den Neuronen gelockt werden.
Zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit kann z.B. das kodierende Gen für Neuraminidasel (NEU1), Neprilysin oder Cholesterol 24- Hydroxylase überexprimiert werden, was zur Abreicherung von Amyloid ß-Plaques führen und damit zu einer Verbesserung des Krankheitszustands beitragen kann.
Die Parkinson Krankheit kann durch Vektor-vermittelte Überex¬ pression z.B. des neurotrophischen Faktors der Gliazellen (GDNF) , der aromatischen L-Aminosäure-Decarboxylase, der Tyrosynhydroxylase oder der GTP-Cyclohydrolase I behandelt wer¬ den, wobei ein positiver Einfluss auf das dopaminergische System zu erwarten wäre. Eine Behandlung der Spinalen Muskelatrophie kann z.B. durch Expression des Proteins SMN (Survival of Motor Neuron) erfolgen.
Für die Therapie einer lysosomalen Speicherkrankheit wäre die Expression einer Glucuronidase, z.B. der ß-Glucuronidase, als Transgen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Vektors erfolgsverspre¬ chend .
In einer weiteren Ausführungsform kodiert das Transgen für ein radioprotektives Protein, wie z.B. für ein radioprotektives En¬ zym. Eine wesentliche Limitation beim Einsatz der Radiotherapie im Rahmen der Behandlung von Krebs ist die strahleninduzierte Schädigung des Normalgewebes, was häufig eine Verringerung der Strahlendosis, eine Unterbrechung des Therapieregimes, oder so¬ gar einen völligen Verzicht auf diese Therapieform nötig macht. Das Gehirn ist ein besonders strahlenempfindliches Organ, wes¬ halb Primärtumoren dort oft nur eingeschränkt und diffuses Tu¬ morwachstum meistens gar nicht radiotherapeutisch behandelt werden kann. Mit Hilfe der Vektoren der vorliegenden Erfindung kann das gesunde Gewebe, welches das maligne Gewebe umgibt, durch zielgerichtete Expression radioprotektiver Proteine geschützt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Transgen, welches in das gesunde Gehirngewebe eingeschleust wird, um eine Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD) , die die Konver¬ sion von Superoxidanionen, einem der wesentliche Faktoren der strahleninduzierten Toxizität, zu Wasserstoffperoxid kataly¬ siert. In einer weiteren hier vorgeschlagenen Ausführungsform handelt es sich um die Kinase-Domäne des Ataxia telangiectasia mutant (ATM) -Gens, das zur Reparatur der durch Bestrahlung entstandenen DNA-Schäden beiträgt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden beide Gene mittels der vorliegend be¬ schriebenen Vektoren in den zu behandelnden Patienten eingebracht . Die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Erkrankungen des Gehirns und/oder Rückenmarks. Erkrankungen des Gehirns bzw. des Rückenmarks im Sinne der Er¬ findung umfassen genetisch verursachte Leukodystrophien, wie Ad- renoleukodystrophie, Morbus Canavan, Morbus Krabbe, metachroma¬ tische Leukodystrophie, Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit und Mor¬ bus Alexander; neurodegenerative Erkrankungen, wie amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington und Morbus Pick; chronisch-entzündliche Erkrankungen des Zentralner¬ vensystems, wie Multiple Sklerose und Guillain-Barre-Syndrom; und Lysosomen-Speichererkrankungen, wie Ceroid-Lipofuszinose und Morbus Fabry. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung zur therapeutischen Behandlung von neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer, Parkinson oder Chorea Huntington eingesetzt.
In einer noch weiteren Ausführungsform kodiert das Transgen für ein Antitumormittel , wie z.B. ein Tumorsupressor-Protein, oder einen Immunmodulator, wie z.B. ein Zytokin (z.B. Interleukin 1 bis 4, Gamma-Interferon, p53) , das selektiv zu einem Gehirntumor oder einen Tumor des Rückenmarks des Patienten transportiert werden soll.
Die Vektoren können ferner auch dazu verwendet werden, um Anti- sense-RNA, Ribozyme, oder Ähnliches in Zellen und Gewebe des Ge¬ hirns bzw. Rückenmarks zu transportieren. Ferner können die erfindungsgemäßen Vektoren auch Transgene umfassen, die für sekretorische Proteine kodieren, die in das Lumen der Mikrovaskulatur des Gehirns oder des Rückenmarks freigesetzt werden sollen. Sol¬ che sekretorischen Proteine können beispielsweise entzündungs¬ hemmend wirken.
Wie vorliegend verwendet, bezeichnet der Begriff "Subjekt" alle menschlichen oder tierischen Organismen, die durch AAV-Vektoren infiziert werden können. Vorzugsweise handelt es sich bei dem zu behandelnden Subjekt um ein Säugetier, wie z.B. um einen Menschen, einen Primaten, eine Maus oder eine Ratte. In einer be- vorzugten Ausführungsform ist das zu behandelnde Subjekt ein Mensch. Nach Transfektion in das Subjekt sorgt der Vektor für die ortsspezifische Expression des Transgens in den Zellen des Gehirns bzw. des Rückenmarks.
Das Transgen kann in dem viralen Vektor in Form einer Expressionskassette vorliegen, die neben der zu exprimierenden Sequenz des Transgens weitere für die Expression erforderliche Elemente umfasst, wie z.B. einen geeigneten Promoter, der nach Infektion der entsprechenden Zellen die Expression des Transgens steuert. Geeignete Promotoren umfassen neben den AAV-Promotoren z.B. den Cytomegalovirus (CMV) -Promoter, den Chicken-Beta-
Actin/Cytomegalovirus-Hybridpromoter (CAG) , einen Endothel- zellen-spezifischen Promoter, wie z.B. den VE-Catherin Promoter, sowie Steroid-Promotoren und Metallothionein-Promotoren . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der in den erfindungsgemäßen Vektoren verwendete Promoter ein CAG-Promoter . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Transgen einen hirnspezifischen Promoter, der in funktionaler Verbindung mit dem zu exprimierenden Transgen verbunden ist. Auf diese Weise kann die Spezifität der erfindungs¬ gemäßen Vektoren für das Gehirn weiter erhöht werden. Wie hierin verwendet, ist ein hirnspezifischer Promoter ein Promoter, dessen Aktivität in Hirngewebe mindestens 2-fach, 5-fach, 10-fach, 20-fach, 50-fach oder 100-fach höher ist als in einer Zelle, die keine Gehirnzelle ist. Vorzugsweise ist dieser Promoter ein hu¬ maner Promoter. Die Expressionskassette kann auch ein Enhancer- Element zur Erhöhung des Expressionslevels des zu exprimierenden exogenen Proteins enthalten. Ferner kann die Expressionskassette Polyadenylierungssequenzen, wie z.B. die SV40-Polyadenylierungs- sequenzen oder die Polyadenylierungssequenzen des bovinen Wachstumshormons umfassen.
Die erfindungsgemäßen viralen Vektoren können als Bestandteil eines ihrer Kapsid-Proteine vorzugsweise eine Peptidsequenz ge¬ mäß einer der in den SEQ ID NO: 1-5 umfassen. Alternativ können auch Varianten der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1-5 verwendet werden, die sich von der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1-5 durch Modifikation von einer Aminosäure unterscheiden. Bei der Modifikation kann es sich um einen Austausch, eine Deletion oder eine Insertion von Aminosäuren handeln, solang die Variante die Fähigkeit beibehält, als Teil des Kapsids die spezifische Bin¬ dung des Vektors an Rezeptor-Strukturen von Zellen des Gehirns und/oder Rückenmarks zu vermitteln. Die Erfindung erstreckt sich somit z.B. auf Varianten der Sequenz von SEQ ID NO: 1-5, bei denen die C- oder N-terminale Aminosäure verändert wurde. Diese Varianten weisen eine Sequenzidentität von mehr als 85% zu der in SEQ ID NO: 1-5 gezeigten Aminosäuresequenz auf, wenn die Sequenzen mit den Programmen GAP oder BESTFIT miteinander verglichen werden. Diese Computerprogramme zur Bestimmung der Amino¬ säuresequenzidentität sind im Stand der Technik hinreichend be¬ kannt .
Die Variante der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1-5 kann auf einer Sub¬ stitution einer Aminosäure beruhen, d.h. eine Aminosäure kann gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sein. Vorzugsweise ist die Substitution, durch die sich die Varianten von einer der in SEQ ID NO: 1-5 dargestellten Aminosäuresequenzen unterscheidet, eine konservative Substitution, d.h. eine Substitution einer Aminosäure durch eine Aminosäure ähnlicher Polarität, die dem Peptid ähnliche funktionelle Eigenschaften verleiht. Vorzugswei¬ se stammt die ausgetauschte Aminosäure aus der gleichen Gruppe von Aminosäuren wie die ersetzende Aminosäure. Beispielsweise kann ein hydrophober Rest durch einen anderen hydrophoben Rest ersetzt werden oder ein polarer Rest durch einen anderen polaren Rest. Funktionell ähnliche Aminosäuren, die im Rahmen einer konservativen Substitution gegeneinander ausgetauscht werden können, umfassen z.B. nicht-polare Aminosäuren wie z.B. Glycin, Va- lin, Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, und Tryptophan. Beispiele von ungeladenen polaren Aminosäuren umfassen Serin, Threonin, Glutamin, Asparagin, Tyrosin, und Cys- tein. Beispiele von geladenen polaren (sauren) Aminosäuren umfassen Histidin, Arginin und Lysin. Beispiele von geladenen po- laren (basischen) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure .
Als Varianten der in SEQ ID NO: 1-5 gezeigten Aminosäuresequenzen gelten auch solche Aminosäuresequenzen, bei denen eine Aminosäure eingefügt wurde. Solche Insertionen können erfolgen, so lange die resultierende Variante ihre Fähigkeit beibehält, spezifisch an Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks zu binden. Ferner gelten vorliegend auch solche Proteine als Varianten der in SEQ ID NO: 1-5 gezeigten Aminosäuresequenzen, bei denen eine der beiden N-terminalen Aminosäuren des Peptids fehlt. Voraussetzung ist wiederum, dass die entsprechend deletierte Variante spezi¬ fisch an Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks bindet.
Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind spezifische Varianten der in SEQ ID NO: 1-5 gezeigten Aminosäuresequenzen, die an einer Aminosäure strukturell verändert wurden, wie beispielsweise durch Einführen einer modifizierten Aminosäure. Bei diesen modifizierten Aminosäuren kann es sich erfindungsgemäß um Aminosäuren handeln, die durch Biotinylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Acetylierung, Verzweigung und/oder Zyklisierung verändert wurden.
Virale Vektoren, deren Kapsid eine der erfindungsgemäßen Peptid- sequenzen oder eine wie oben definierte Variante davon umfassen, binden spezifisch Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks. Wie vorliegend verwendet bedeutet eine "spezifische" Bindung der erfindungsgemäßen Vektoren, dass sich die Vektoren nach systemischer Verabreichung vorwiegend an oder in den Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks anreichern. Dies bedeutet, dass sich mehr als 50% der ursprünglich verabreichten Vektorgenome im Bereich der Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks anrei¬ chern, während sich weniger als 50% in oder im Bereich von anderen Zellen oder Geweben anreichern (wie z.B. in der Milz oder Leber) . Es ist bevorzugt, dass sich mehr als 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, oder sogar mehr als 99% der ursprünglich verabreichten Vektorgenome in oder im Bereich der Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks anreichern. Eine spezifische Bindung der Vektoren kann auch über die Expression des Transgens ermittelt werden. Bei viralen Vektoren, die spezifisch Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks binden, erfolgt mehr als 50% der gesamten Ex¬ pression des Transgens in oder im Bereich des Gehirns und/oder des Rückenmarks, während weniger als 50% der Expression in oder im Bereich von anderen Geweben beobachtet werden kann. Es ist allerdings bevorzugt, dass mehr als 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, oder sogar mehr als 99% der insgesamt gemessenen Expression des Transgens in oder im Bereich des Gehirns und/oder des Rückenmarks erfolgt.
Der Fachmann wird problemlos in der Lage sein, die spezifische Bindung der erfindungsgemäßen Vektoren an Zellen des Gehirns bzw. des Rückenmarks und die Expression des mit Hilfe der Vekto¬ ren eingeschleusten Transgens zu bestimmten. Zu diesem Zweck geeignete Verfahren zur Messung der Spezifität von Transduktion und Expression sind in den nachstehenden Beispielen gezeigt.
Es ist darüber hinaus erfindungsgemäß bevorzugt, dass Vektoren, deren Kapside Varianten der in SEQ ID NO: 1-5 gezeigten Aminosäuresequenz enthalten, mindestens etwa 50% der Bindungsaktivität eines entsprechenden viralen Vektors aufweisen, dessen Kapsid die in SEQ ID NO: 1-5 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Noch stärker bevorzugt ist es, dass die Varianten etwa 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Bindungsaktivität eines entsprechenden viralen Vektors aufweisen, dessen Kapsid die in SEQ ID NO: 1-5 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Die Bindungs¬ aktivität der Vektoren kann mit Hilfe von in vitro-Assays gemes¬ sen werden, wie sie in den vorliegenden Beispielen beschrieben werden .
Vorzugsweise ist die Bindungsaktivität der erfindungsgemäßen Vektoren, wie sie durch Verteilung der Vektorgenome oder Expression des Transgens bestimmt werden kann, für Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks mindestens 2-fach, 5-fach, 10-fach, 20- fach, 50-fach, 75-fach, 100-fach, 150-fach, 200-fach, 250-fach, 500-fach, 600-fach, 700-fach, 800-fach, 900-fach, 1000-fach, 2000-fach, 5000-fach, oder 10000-fach höher als die Bindungsak- tivität für eine Kontroll-Zelle, die keine Zelle des Gehirns oder Rückenmarks ist, Z.B. eine Milz- oder Leber-Zelle) .
Die Erfindung betrifft auch eine Zelle, die ein erfindungsgemä¬ ßes Peptid, Polypeptid oder Protein, eine dafür kodierende Nuk¬ leinsäure, ein Plasmid, welches eine solche Nukleinsäure um- fasst, oder einen wie oben beschriebenen rekombinanten AAV- Vektor enthält. Es handelt sich vorzugsweise um eine humane Zel¬ le oder Zelllinie.
In einer Ausführungsform wurde eine Zelle z.B. durch ein Biopsieverfahren aus einem humanen Subjekt gewonnen und anschließend mit dem viralen Vektor in einem ex vivo Verfahren transfiziert . Die Zelle kann anschließend dem Subjekt reimplan¬ tiert oder diesem auf andere Weise wieder zugeführt werden, z.B. durch Transplantation oder Infusion. Die Wahrscheinlichkeit einer Abstoßung von transplantierten Zellen ist geringer, wenn das Subjekt, aus dem die Zelle gewonnen wurde, genetisch dem Subjekt ähnelt, an das die Zelle verabreicht wird. Vorzugsweise handelt es sich daher bei dem Subjekt, dem die transfizierten Zellen zugeführt werden, um dasselbe Subjekt, aus dem zuvor die Zellen gewonnen wurden. Die Zelle ist vorzugsweise eine humane Zelle des Gehirns oder Rückenmarks, insbesondere eine neuronale Zelle, eine Endothelzelle eines Blutgefäßes. Die die zu transfizierende Zelle kann auch eine Stammzelle, wie z.B. eine adulte humane Stammzelle, sein. Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass es sich bei den zu transfizierenden Zellen um autologen Zellen handelt, die mit dem erfindungsgemäßen viralen Vektor, z.B. dem beschriebenen rekombinanten AAV2-Vektor, ex vivo trans- fiziert wurde. Die Zellen werden vorzugsweise in einem Verfahren zur Behandlung einer Funktionsstörung oder Erkrankung des Gehirns und/oder des Rückenmarks in einem Subjekt verwendet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines AAV-Vektors, bei dem ein Plasmid verwendet wird, dass für ein Kapsid-Protein kodiert, welches die Aminosäu¬ resequenz von SEQ ID NO : 1 oder einer Variante davon umfasst. Alternativ kann der Vektor auch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 umfassen, insbesondere eine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:2-5 oder eine Variante davon. Das grundsätzliche Verfahren der Herstellung von rekombinanten AAV-Vektoren, die ein zu exprimierendes Transgen umfassen, ist im Stand der Technik hinreichend beschrieben [28]. HEK293-T Zellen werden mit drei Plasmiden transfiziert . Ein erstes Plasmid enthält das die cap- und rep-Regionen des AAV-Genoms, wobei jedoch die natürlich vorkommenden Inverted Repeats (ITRs) fehlen. Die cap-Region dieses Plasmids enthält ein Gen, das für mindestens ein modifizier¬ tes Kapsid-Protein kodiert, d.h. ein Gen, welches die erfindungsgemäße Peptidsequenz umfasst. Ein zweites Plasmid umfasst eine Transgen-Expressionskassette, die von den entsprechenden ITRs flankiert wird, die das Verpackungssignal darstellen. Die Expressionskassette wird daher im Zuge des Zusammenbaus der Vi¬ ruspartikel in das Kapsid verpackt. Bei dem dritten Plasmid han¬ delt es sich um ein adenovirales Helferplasmid, auf dem die Hel¬ ferproteine E1A, E1B, E2A, E4-orf6, VA kodiert sind, die für die AAV-Replikation in den HEK 293-T-Zellen erforderlich sind. Alternativ ist auch möglich, die erfindungsgemäßen AVV-Vektoren in Insektenzellen zu erzeugen. Ein entsprechendes Protokoll ist beispielhaft im unten aufgeführten Beispiel 6 aufgeführt.
Es hat sich überraschend gezeigt, dass die Herstellung der re¬ kombinanten Vektoren deren Spezifität beeinflussen kann. So wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung beobachtet, dass Vektoren, die mit Hilfe des Protokolls von Beispiel 2 in HEK293T- Zellen hergestellt wurden, vorwiegend Endothelzellen der Blutgefäße von Gehirn und Rückenmark transfizierten und nur zu einem geringeren Teil Neuronen des Gehirns oder des Rückenmarks. An¬ derseits transfizierten die rekombinanten Vektoren, die mit Hilfe des Protokolls von Beispiel 6 in Sf9-Zellen hergestellt wur¬ den, vorwiegend Neuronen und im wesentlich geringeren Umfang Endothelzellen. Diese Beobachtung kann entsprechend genutzt werden, um die Spezifität der Transfektion weiter zu erhöhen.
Bedingungen, welche die Anreicherung und Aufreinigung der erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren erlauben, sind im Stand der Technik bekannt. Die erfindungsgemäßen Vektoren können beispielsweise durch Gelfiltrationsverfahren, z.B. unter Verwendung einer Sepharosematrix, entsalzt und durch anschließende Filtra¬ tion aufgereinigt werden. Andere Aufreinigungsverfahren können ferner eine Cäsiumchlorid- oder Iodixanol-Gradienten- Ultrazentrifugation umfassen. Die Aufreinigung reduziert potentiell abträgliche Affekte in dem Subjekt, an das die adeno- assoziierten viralen Vektoren verabreicht werden. Der verabreichte Virus ist im Wesentlichen frei von Wildtyp- und replika- tionskompetenten Virus. Die Reinheit des Virus kann durch geeig¬ nete Verfahren, wie PCR-Amplifikation, überprüft werden.
Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt eine pharmazeuti¬ sche Zusammensetzung bereit, die einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung, insbesondere einen AAV-Vektor, umfasst. Der virale Vektor wird dabei in einer therapeutisch wirksamen Menge an den Patienten verabreicht, d.h. in einer Menge, die aus¬ reicht, um mindestens ein Symptom der zu behandelnden Funktions¬ störung oder Erkrankung des Gehirns und/oder des Rückenmarks in einem erheblichen Maße zu verbessern oder die Progression der Erkrankung zu unterbinden. Eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Vektors ruft eine positive Veränderung in einem der besagten Symptom hervor, d.h. eine Veränderung die den Phänotyp des betroffenen Subjekts an den Phänotyp eines gesunden Subjekts, das nicht unter einer Erkrankung des Gehirns und/oder des Rückenmarks leidet, annähert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Verabreichung des viralen Vektors in einer Menge, die zu einer vollständigen oder im Wesentlichen vollständigen Heilung der Funktionsstörung oder Erkrankung des Gehirns und/oder des Rückenmarks führt. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird demge¬ mäß eine therapeutisch wirksame Dosis des erfindungsgemäßen Vektors enthalten. Eine therapeutisch wirksame Dosis wird in der Regel für das Subjekt, welches sich der Behandlung unterzieht, nicht toxisch sein. Die genaue Menge an viralen Vektor, die verabreicht werden muss, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen, hängt von mehreren Parametern ab. Faktoren, die relevant für die Menge des zu ver¬ abreichenden viralen Vektors sind, umfassen z.B. die Art der Verabreichung des viralen Vektors, die Art und Schwere der Er¬ krankung, die Krankheitsgeschichte des zu behandelnden Patienten sowie Alter, Gewicht, Größe und Gesundheitszustand des zu behan¬ delnden Patienten. Ferner sind auch das Expressionslevel des Transgens, das benötigt wird um einen therapeutischen Effekt zu erzielen, die Immunantwort des Patienten, sowie die Stabilität des Genproduktes für die zu verabreichende Menge relevant. Eine therapeutisch wirksame Menge des viralen Vektors kann von einem Fachmann ohne Weiteres auf Basis des allgemeinen Fachwissens und der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden.
Der virale Vektor wird vorzugsweise in einer Menge verabreicht, die einer Virusdosis im Bereich von 1,0 x 1010 bis 1,0 x 1014 vg/kg (Virusgenome pro kg Körpergewicht) entspricht, wobei ein Bereich von 1,0 x 1011 bis 1,0 x 1013 vg/kg stärker bevorzugt ist, und ein Bereich von 5,0 x 1011 bis 5,0 x 1012 vg/kg stärker bevorzugt ist, und ein Bereich von 1,0 x 1012 bis 5,0 x 1012 noch stärker bevorzugt ist. Eine Virusdosis von etwa 2,5 x 1012 vg/kg ist am stärksten bevorzugt. Die zu verabreichende Menge des vi¬ ralen Vektors, z.B. des erfindungsgemäßen AAV2-Vektors, kann abhängig von der Stärke der Expression des einen oder der mehreren Transgene angepasst werden.
Der virale Vektor der vorliegenden Erfindung, wie z.B. der erfindungsgemäß bevorzugte AVV2-Vektor, kann für verschiedene Ar¬ ten der Verabreichung formuliert werden, z.B. für die orale Verabreichung als Kapsel, als Flüssigkeit oder Ähnliches. Es ist je¬ doch bevorzugt, dass der virale Vektor parenteral, vorzugsweise mittels intravenöser Injektion oder intravenöser Infusion verabreicht wird. Die Verabreichung kann beispielsweise mittels in¬ travenöser Infusion, z.B. innerhalb von 60 Minuten, innerhalb von 30 Minuten, oder innerhalb von 15 Minuten erfolgen. Es ist ferner bevorzugt, dass der virale Vektor während einer Operation lokal mittels Injektion in das Gehirn und/oder das Rückenmark verabreicht wird. Zusammensetzungen, die für die Verabreichung mittels Injektion und/oder Infusion geeignet sind, umfassen in der Regel Lösungen und Dispersionen sowie Pulver, aus denen entsprechende Lösungen und Dispersionen hergestellt werden können. Derartige Zusammensetzungen werden den viralen Vektor und mindestens einen geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger für die intrave¬ nöse Verabreichung umfassen bakteriostatisches Wasser, Ringer- Lösung, physiologische Salzlösung, Phosphat-gepufferte Salzlö¬ sung (PBS) und Cremophor EL™. Sterile Zusammensetzungen für die Injektion und/oder Infusion können hergestellt werden, indem der viralen Vektor in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Träger eingebracht und anschließend mittels eines Filters wird. Zusammensetzungen für die Verabreichung mittels Injektion oder Infusion sollten nach ihrer Herstellung unter Lagerungsbedingungen über einen längeren Zeitraum stabil bleiben. Die Zusammensetzungen können zu diesem Zweck ein Konservierungsmittel enthalten. Geeignete Konservierungsmittel um¬ fassen Chlorbutanol , Phenol, Ascorbinsäure und Thiomersal. Die Herstellung von entsprechenden Darreichungsformen sowie geeignete Hilfsstoffe sind beispielsweise in "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 21. Auflage (2005) beschrieben.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung einer Funktionsstörung oder einer Erkrankung des Gehirns und/oder des Rückenmarks, bei dem man einen erfindungsgemäßen viralen Vektor, vorzugsweise einen AAV-Vektor, wie er oben beschrieben ist, an ein Subjekt verabreicht. Der Vektor umfasst ein Kapsid, das mindestens ein Kap- sid-Protein umfasst, welches die Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO:l oder einer Variante davon enthält. Alternativ kann der Vektor auch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 umfassen, insbesondere eine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2-5 oder eine Variante davon. Der virale Vektor umfasst ferner ein Trans¬ gen, z.B. ein therapeutisches Gen, das für die Behandlung der Funktionsstörung oder Erkrankung des Gehirns und/oder des Rückenmarks nützlich ist. Nach Verabreichung an das zu behandelnde Subjekt, vorzugsweise durch systemische Gabe, wie z.B. intrave¬ nöse Injektion oder Infusion, sorgt der Vektor für die spezifische Expression des Gens in den Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks .
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Figur 1 zeigt das im Rahmen der Erfindung angewendete in vivo Selektionsverfahren der AAV-Peptidbank .
1. : Randomisierte AAV Peptidbibliothek mit -lxlO8 unterschiedli¬ chen Kapsidvarianten;
2. : Entnahme des Zielorgans, 8 Tage nach Injektion;
3. : DNS Isolierung und Amplifikation der viralen DNS-Fragmente per Real-Time-PCR;
4. : Klonierung in Peptidbibliotheks-Plasmide für Sequenzierung und Produktion einer sekundären Peptidbibliothek;
5. : Co-Transfektion von HEK293T Zellen, Produktion einer sekundären Peptidbibliothek;
6. : sekundäre AAV Peptidbibliothek für weitere Selektionsrunden.
Beinhaltet vorselektierte Kapsidvarianten;
7. : intravenöse Injektion der Peptidbibliothek in die Maus.
Figur 2 zeigt die Sequenzen der mittels des Selektionsverfahrens identifizierten, für das Gehirn spezifischen Peptide. Das Nach Peptid mit der in SEQ ID NO:l gezeigten Sequenz wurde in der vierten Selektionsrunde identifiziert.
Figur 3 zeigt die Genexpression nach intravenöser Injektion von rekombinanten AAV-Vektoren in der lebenden Maus. Die Luzifera- seexpression wurde 14 Tage nach systemischer Injektion von 5xl010 Vektorgenomen mit einem IVIS* 200 Imaging Imaging System gemessen. A: Vektoren auf Basis des unmodifizierten AAV2-Wildtyp- kapsids zeigen Genexpression hauptsächlich in der Leber. Es kommt zu keine messbaren Genexpression im Gehirn. B: Der erfindungsgemäße rekombinante AAV-Vektor rAAV2-NRGTEWD hingegen vermittelt eine starke und spezifische Genexpression im Gehirn.
Figur 4 zeigt eine Langzeit-Expressionsanalyse in der Maus nach systemischer Gabe des rekombinanten AAV-Vektors rAAV2-NRGTEWD . Wiederholte Messungen mittels IVIS® 200 Imaging System zeigen ei¬ ne stabile Genexpression im Gehirn über einen Zeitraum von 168 Tagen (n=2 ) .
Figur 5 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Lumineszenz und Vektorverteilung 14 Tage nach intravenöser Injektion von 5xl010 Vektorgenomen des rekombinanten AAV-Vektors rAAV2-NRGTEWD . A: Die Messung der Genexpression als Lumineszenz in den Lysaten verschiedener Organe der Maus zeigt hohe Spezifität des Vektors für das Gehirn. B: Die Messung der Vektorgenom-Verteilung in den Lysaten zeigt eine deutliche Anreicherung des Vektors im Gehirn. Mittelwerte + Standartabweichung. Die Statistik wurde mittels One-Way ANOVA berechnet. P-Werte sind p<0,05=*; p<0,01=**; p<0, 001=*** für n=3.
BEISPIELE
Alle Daten wurden als Mittelwerte + Standardabweichung (SD) bestimmt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des GraphPad Prism Programms 3.0 (GraphPad Software, San Diego, USA) durchgeführt. Die Daten wurden durch Einweg-ANOVA, gefolgt von multiplen Vergleichstests nach Bonferoni analysiert. P-Werte >0,05 wurden als signifikant erachtet.
Beispiel 1: Selektion von AAV2-Peptidbanken Um gewebespezifische AAv2-Kapside zu selektieren, wurde eine randomisierte AAV-Peptidbank hergestellt und über fünf Runden selektiert. Eine zufallsbasierte X7-AAV-Peptidbank mit einer the¬ oretischen Diversität von lxlO8 einzeln vorkommenden Klonen wurde unter Verwendung eines zweistufigen Protokolls hergestellt, wie es zuvor beschrieben wurde [26-27] . Es wurde zunächst ein dege¬ neriertes Oligonukleotid hergestellt, das für sieben zufällig angeordnete Aminosäuren an der Nukleotidposition 3967 im AAV- Genom kodiert, was der Aminosäureposition R588 in VP1 entspricht. Das Oligonukleotid hatte die Sequenz: 5 ' - CAGTCGGCCAGAGAGGC (NNK) 7GCCCAGGCGGCTGACGAG - 3 ' (SEQ ID NO: 12) . Der zweite Strang wurde unter Verwendung einer Sequenase
(Amersham, Freiburg, Deutschland) und des Primers mit der Se¬ quenz 5 '-CTCGTCAGCCGCCTGG - 3 ' (SEQ ID NO: 13) hergestellt. Das doppelsträngige Insert wurde mit Bgll geschnitten, mit dem QIA- quick Nucleotide Removal Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) auf¬ gereinigt und in das mit Sfil verdaute Bibliothek-Plasmid pMT187-0-3 ligiert [26] . Die Diversität der Plasmid-Bibliothek wurde anhand der Anzahl von Klonen bestimmt, die ausgehend von einem repräsentativen Aliquot von transformierten, elektrokompe- tenten DH5 -Bakterien auf Agar wuchsen, der 150 mg/ml Ampicillin enthielt. Bibliothek-Plasmide wurden geerntet und unter Verwen¬ dung des Plasmid Preparation Kit von Qiagen aufgereinigt . Die AAV-Bibliothek-Genome wurden in chimäre Wildtyp- und Bibliothek- AAV-Kapside (AAV-Transfer-Shuttle) verpackt, indem 2xl08 293T- Zellen in 10 Zellkulturschalen (15 cm) mit dem Plasmid pVP3cm
(enthält das Wildtyp-Cap-Gen mit modifizierter Kodonnutzung ohne die terminalen inverted repeats) [27], dem Bibliothek-Plasmiden und dem pXX6-Helferplasmid [28] transfiziert wurden, wobei das Verhältnis zwischen den Plasmiden 1:1:2 betrug. Die resultie¬ renden AAV-Bibliothek-Transfer-Shuttle wurden dazu verwendet, 2xl08 293T-Zellen in Zellkulturschalen (15 cm) bei einer MOI von 0,5 replikativen Einheiten pro Zelle zu infizieren. Die Zellen wurden mit Ad5 (bereitgestellt durch das Laboratoire des Therapie Genique, Frankreich) bei einer MOI von 5 Plaque- bildenden Einheiten (pfu/Zelle) superinfiziert. Die finale AAV- Display-Bibliothek wurde nach 48 Stunden aus den Überständen geerntet. Die Überstände wurden unter Verwendung von VivaSpin- Säulen (Viva Science, Hannover, Deutschland) aufkonzentriert und durch Iodixanol-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wie zuvor beschrieben [29] aufgereinigt und durch real-time-PCR unter Ver¬ wendung der cap-spezifischen Primer 5 ' - GCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACC - 3 ' (SEQ ID NO: 14) und 5 ' - GCCTGGAAGAACGCCTTGTGTG - 3 ' (SEQ ID NO: 15) mit dem LightCycler-System (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) titriert .
Für die in vivo Selektion wurden lxlO11 Partikel der genomischen Bibliothek in die Schwanzvene von FVB/N-Mäusen injiziert. Den Partikeln wurde 8 Tage Zeit für die Verteilung und die Infektion der Zielzellen gegeben. Nach 8 Tagen wurden die Mäuse getötet und die Gehirne wurden entfernt. Die Gesamt-DNA des Gewebes wur¬ de unter Verwendung des DNeasy Tissue Kits (Qiagen) extrahiert. Die Zufallsoligonukleotide, die in AAV-Partikeln der Bibliothek enthalten waren und sich in dem Gewebe von Interesse angerei¬ chert hatten, wurden durch Nested-PCR unter Verwendung der Primer 5 ' -ATGGCAAGCCACAAGGACGATG - 3' (SEQ ID NO:16) und 5' - CGTGGAGTACTGTGTGATGAAG - 3' (SEQ ID NO: 17) für die erste PCR und den Primern 5' - GGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAG - 3' (SEQ ID NO: 18) und 5 ' -TGATGAGAATCTGTGGAGGAG - 3' (SEQ ID NO: 19) für die zweite PCR amplifiziert . Die mittels PCR amplifizierten Oligonukleotide wurden verwendet, um sekundäre Bibliothek für drei weitere Se¬ lektionsrunden herzustellen. Die sekundären Bibliotheken wurden wie die primären Bibliotheken erzeugt (siehe oben), jedoch ohne den zusätzlichen Schritt der Herstellung von Transfer-Shutteln . Die sekundäre Plasmid-Bibliothek wurde verwendet, um 2xl08 293T- Zellen in Zellkulturschalen (15 cm) bei einem Verhältnis von 25 Bibliothek-Plasmiden pro Zelle zu transfizieren, wobei das Transfektionsmittel Polyfect (Qiagen) verwendet wurde. Nach je¬ der Selektionsrunde wurden einige Klone sequenziert. Das ange¬ wendete Selektionsverfahren ist in Fig. 1 abgebildet. Ergebnisse : Nach fünf Selektionsrunden wurden mehrere Gehirnbindenden Kapside sequenziert. Kapside, welche die Peptidsequenz NRGTEWD (SEQ ID NO : 1 ) umfassten, banden besonders stark an Zellen und Gewebe des Gehirns und Rückenmarks (siehe unten) . Eine weitere Gruppe von Peptiden, die ebenfalls eine Spezifität für Gehirn und Rückenmark zeigten, umfasste die Peptide ADGVQWT (SEQ ID NO:2), DDGVSWK (SEQ ID NO:3), SDGLTWS (SEQ ID NO : 4 ) und SDGLAWV (SEQ ID NO:5). Diese Peptide enthielten das allgemeine Motiv XDGXXWX (SEQ ID NO: 6). Die in den verschiedenen Selektionsrunden gewonnenen Peptide sind in Fig. 2 gezeigt.
Beispiel 2: Herstellung und Quantifizierung rekombinanter AAV- Vektoren in HEK293T-Zellen
Die in Beispiel 1 angereicherten Klone wurden als rekombinante AAV-Vektoren hergestellt und auf ihr Transduktionsprofil unter¬ sucht. Rekombinante AAV-Vektoren wurden durch dreifache Trans- fektion von HEK293T-Zellen erzeugt. Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (Invitrogen, Carlsbad, USA), das mit 1% Penicillin/Streptomycin und 10% feta¬ lem Kälberserum supplementiert war, angezüchtet. Plasmid-DNA wurde mit dem Transfektionsmittel Polyfect (Qiagen, Hilden, Deutschland) in 293T-Zellen transfiziert . Vier Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, lysiert und die Vekto¬ ren wurden mittels Iodixanol-Dichtegradienten- Ultrazentrifugation aufgereinigt , wie es zuvor beschrieben wurde [29] . Für die Transfektionen wurde pXX6 als adenovirales Helfer- Plasmid [28], das Luciferase-Gen pUF2-CMV-luc [27] oder das GFP- Gen pTR-CMV-GFP [30], sowie ein Plasmid, das für das AAV-Kapsid von Interesse kodiert, verwendet. Plasmide, die für die AAV- Kapsid-Mutanten kodierten, welche zuvor aus der AAV-Bibliothek selektiert worden waren, und Wildtyp-Kontrollen waren modifiziertes pXX2-187 [31] bzw. pXX2 [28] . Die Inserts wurden wie be¬ schrieben zu Bibliothek-Inserts verarbeitet (siehe oben) . Für die Quantifizierung der rekombinanten Vektoren wurden die genomischen Titer durch quantitative real-time PCR unter Verwendung der folgenden CMV-spezifischen Primer 5 ' - GGCGGAGTTGTTACGACAT - 3 ' (SEQ ID NO:20) und 5 ' - GGGACTTTCCCTACTTGGCA - 3 ' (SEQ ID NO:21) mit dem LightCycler-System bestimmt, wie es zuvor beschrieben wurde [ 32 ] .
Ergebnisse : Es wurde herausgefunden, dass die Ausbeute in Bezug auf die Vektor-Titer bei rekombinanten Vektoren mit Luciferase- Reporter-Gen vergleichbar zu Vektoren war, die ein Wildtyp-AAV2- Kapsid trugen, was darauf schließen ließ, dass die angereicherten Peptide den Zusammenbau des Kapsids oder die Verpackung des Gens nicht negativ beeinflussen.
Beispiel 3 : Untersuchung des Tropismus der rekombinanten AAV- Vektoren in vivo
Um den Tropismus der angereicherten Peptide in vivo untersuchen zu können, wurden die Peptide in das Kapsid eines rekombinanten Vektors eingebracht, der ein Luciferase-Reporter-Gen umfasste. Vektoren mit mutierten Kapsiden sowie Kontrollvektoren wurden in Mäuse injiziert. Die AAV-Vektoren wurden intravenös in einer Do¬ sis von 5xl010 Vektorgenomen (vg) /Maus verabreicht (n=3 Tiere pro injiziertem AAV-Klon) . Am Tag 14 wurden die Tiere mit Isofluran betäubt. Die Luciferase-Expression wurde unter Verwendung eines Xenogen IVIS200-Imaging Systems (Caliper Lifescience, Hopkinton, USA) mit der Software Living Image 4.0 (Caliper) nach intraperitonialer Injektion von 200 μΐ Luciferin-Substrat (150 mg/kg, Xenogen) pro Maus analysiert. Es wurden repräsentative in vivo Biolumineszenz-Abbildungen der Expression des Transgens an unterschiedlichen Positionen (ventral, dorsal, lateral) aufge¬ nommen, wenn die Lumineszenz in relativen Lichteinheiten (Photo- nen/Sek/cm2) die höchste Intensität erreichte.
Anschließend wurden die Tiere getötet, die Organe von Interesse wurden schnell entfernt, und es wurden sofort Abbildungen der Expression des Transgens in einzelnen Organen aufgenommen. Anschließend wurden die Organe in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Um die Luciferase-Expression zu quanti¬ fizieren wurden die Organe in Reporter-Lysepuffer (RLB, Promega, Madison, USA) homogenisiert. Die Bestimmung der Luciferase- Reporter-Gen-Aktivität wurde in ein Luminometer (Mithras LB9 40, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) in 10-Sekunden Intervallen nach Zugabe von 100 μΐ Luciferase-Assay-Reagenz (LAR, Promega) durchgeführt, wobei zwischen den Messungen je¬ weils 2 Sekunden Verzögerung bestand. Die Werte wurden in Bezug auf die Gesamtproteinmenge in jeder Probe normalisiert, wobei der Roti Nanoquant-Proteinassay (Roth, Karlsruhe, Deutschland) verwendet wurde.
Ergebnisse : Die in vivo Messung der Biolumineszenz nach 14 Tagen ergab, dass das Peptid NRGTEWD für eine Expression des Transgens im Gehirn sorgte (^104p/sek/cm2/r) (siehe Fig. 3B) . Diese Ergebnisse wurden durch die ex vivo durchgeführten Kontrollversuche mit explantierten Organen bestätigt. Ein auf Zufallsbasis ausge¬ wählter Kontrollklon der nicht-selektierten Bibliothek (CVGSPCG) führte zu einer schwachen Gen-Expression, die vornehmlich im Herz und an einigen Stellen des Abdomens auftrat, nicht jedoch im Gehirn (nicht gezeigt) . Wildtyp-AAV2 verursachte eine schwa¬ che Gen-Expression in Herz, Leber und Skelettmuskel, nicht je¬ doch im Gehirn (siehe Fig. 3A) .
Die Untersuchung der Luciferase-Aktivität von Gewebelysaten aus repräsentativen Organen ergab, dass die Vektoren, die das Gehirn-spezifische NRGTEWD-Kapsid aufwiesen, zu einer sehr starken und spezifischen Gen-Expression im Gehirn führten ( Ι , Ι χ Ι Ο 7 RLU/mg Protein, siehe Fig. 5A) . In anderen Organgeweben zeigte der NRGTEWD-Luciferase-Vektor kaum Expression.
Die Untersuchungen zeigten ferner, dass die durch den NRGTEWD- Vektor vermittelte gehirnspezifische Expression des Transgens auch über einen langen Zeitraum organspezifisch blieb. Nach intravenöser Verabreichung der AAV2-NRGTEWD-Luciferasev-Vektoren wurde die Expression des Transgens über einen Zeitraum von 168 Tagen gemessen. Die im Bereich des Gehirns emittierte Strahlung wurde dabei quantitativ erfasst. Über den gesamten Zeitraum hin- weg erfolgte die Expression des Transgens stabil auf hohem Ni- veau, und sie war auf das Gehirn beschränkt (siehe Fig. 4) .
Beispiel 4 : Analyse der Vektor-Verteilung
Um nachzuprüfen, ob die gehirnspezifische Expression des Trans¬ gens von intravenös injizierten NRGTEWD-Vektoren auf einem spezifischen Homing basiert, wurde zunächst die Verteilung der Vektoren 14 Tage nach intravenöser Verabreichung von 5xl010 gp/Maus untersucht. Die Quantifizierung der Vektorgenome erfolgte durch real-time PCR. Zunächst wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Verabreichung von 5xl010 vg/Maus die Gesamt-DNA aus dem betreffenden Organ unter Verwendung eines
Gewebehomogenisators (Precellys 24, Peqlab, Erlangen, Deutsch¬ land) und des DNeasy Tissue Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die DNA wurde unter Verwendung eines Spektralphotometers (Nanodrop ND-2000C, Peqlab) quantifiziert. Die Analyse der AAV-Vektor-DNA in den Ge¬ weben wurde durch quantitative real-time PCR unter Verwendung der zuvor beschriebenen CMV-spezifischen Primer durchgeführt, wobei 40 ng Template verwendet wurden, die in Bezug auf die Ge¬ samt-DNA normalisiert wurden.
Ergebnisse : Die Quantifizierung der Vektorgenome durch real-time PCR zeigte ein für das Gehirn spezifisches Homing von NRGTEWD. Die Menge an Vektorgenomen, die im Gehirn nachgewiesen werden konnten (Ι.βχΙΟ4 ± 7.1xl03 vg/100 ng Gesamt-DNA) war deutlich höher als die Menge an Vektorgenomen, die in einem anderen Organ nachgewiesen wurde (Fig. 5B) . Um die direkte Korrelation zwischen Vektor-Homing und Expression des Transgens zu ermitteln, wurde die Vektorverteilung von Wildtyp-AAV2 , des Kontrollpeptids CVGSPCG und des gehirnspezifischen Peptids NRGTEWD 14 Tage nach intravenöser Verabreichung von 5x 1010 gp/Maus gemessen, d.h. zu dem Zeitpunkt, an dem die Expression des Transgens bestimmt wur¬ de (siehe oben) . Die von Wildtyp-AAV2-Vektoren bereitgestellten Genome konnten hauptsächlich aus Leber und Milz gewonnen werden, wobei auch die Genome von Vektoren, die das Kontrollpeptid auf¬ wiesen, hauptsächlich aus der Milz gewonnen wurden (Daten nicht gezeigt) . Insgesamt waren die Menge an Vektor-Genomen, die in der Milz nachgewiesen wurden, bei allen untersuchten Kapsid- Varianten verhältnismäßig ähnlich, was auf einen unspezifischen Aufnahmemechanismus für die Partikel im retikulo-endothelialen System verweist, der unabhängig von der Bereitstellung und der Expression des Transgens ist. Im Gegensatz dazu ähneln die Verteilungsdaten von Genomen, die durch Vektoren bereitgestellt wurden, welche das Peptid NRGTEWD aufwiesen, den Expressionsda¬ ten des Transgens, wobei eine hochspezifische Anreicherung im Gehirn beobachtet werden kann. Die Menge von im Gehirn nachgewiesenen Vektoren, die das Peptid NRGTEWD zeigten, war etwa 168- fach höher als in Gehirnen, denen ein Wildtyp-Vektor oder ein Kontroll-Kapsid-Vektor injiziert wurde. Insgesamt zeigen diese Daten, dass eine gehirnspezifische Expression des Transgens, die durch NRGTEWD-Vektoren vermittelt wird, durch ein Gewebespezifisches Homing von zirkulierenden Partikeln erreicht wird.
Beispiel 5: Immunhistochemie und Histologie
Es wurde eine Immunhistochemie durchgeführt, um 14 Tage nach in¬ travenöser Verabreichung des rAAV-GFP-Vektors , der das Peptid NRGTEWD aufweist, bzw. des Wildtyp-AAV-Kapsids als Kontrolle die Expression des Transgens auf zellulärer Ebene im Gehirn sowie in einem Kontroll-Organ sichtbar zu machen. Die Gehirne der Tiere wurden mit 4% (w/v) Paraformaldehyd fixiert. Die Gewebe wurden in Paraffin eingebettet. Schnitte einer Stärke von 2 ym wurden von Wachs entfernt, rehydratisiert und für die Immunhistochemie verwendet. Die Immunhistochemie wurde mit polyklonalen Antikör¬ pern gegen GFP (A-11122, Invitrogen) oder CD31 (AB28364, Abcam, Cambridge, USA) durchgeführt. Die Aktivität der endogenen Pero- xidase wurde mit 1% H2O2 in Methanol für 30 Minuten inaktiviert. Vor der Färbung mit CD31 wurden die Schnitte in Citratpuffer (pH 6,0) für 20 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach Waschen in PBS wur- den die Schnitte für 30 Minuten mit PBS, 10% Ziegenserum (Vector Lab, Burlingame, USA) und 2% Milchpulver (Roth) inkubiert. Pri¬ mären Antikörpern wurde es erlaubt, für 1 Stunde bei 37 °C zu binden. Nach Waschen in PBS wurden die Schnitte für 30 Minuten mit einem sekundären, biotinylierten Ziege-Anti-Kaninchen- Antikörper (Vector Lab) inkubiert. Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung des VECTASTAIN-Elite-ABC-Kits (Vector Lab) und 3 , 3 ' -Diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) visua- lisiert. Ausgewählte Schnitte wurden mit Hemalum gegengefärbt.
Ergebnisse : In den Gehirnen von Mäusen, denen rAAV-NRGTEWD injiziert wurde, ergab eine mikroskopische Untersuchung eine inten¬ sive Färbung der Endothelzellen über die gesamte Mikrovaskulatur hinweg und in einem geringfügig geringeren Ausmaß in den größe¬ ren Gefäßen (Daten nicht gezeigt) . Im Gegensatz dazu zeigte Ge¬ hirn-Gewebe von Mäusen, denen Wildtyp-AAV2-Vektor injiziert wurde, keine Färbung. Um die Gewebespezifität zu bestätigen, wurde die Leber als Kontrollorgan analysiert (ein Gewebe, von dem bekannt ist, dass es häufig eine hohe Expression eines Transgens nach Injektion von Wildtyp-AAV2-Vektor zeigt) . In der Leber wurde eine Färbung von Hepatozyten nach der Verabreichung von Wild- typ-RAAV2 -Vektor beobachtet, jedoch keine Färbung nach Verabreichung des rAAV2-NRGTEWD-Vektors . Die endotheliale Abstammung der mit den Vektoren transduzierten Zellen wurde durch CD31-Färbung bestätigt, wobei das durch die GFP-Färbung erhaltene Muster in seriellen Schnitten der Gehirne von Mäusen, denen rAAV2-NRGTEWD injiziert wurde, bestätigt wurde (Daten nicht gezeigt).
Die Untersuchung des Rückenmarks von Mäusen, denen rAAV-NRGTEWD injiziert wurde, ergab ebenfalls eine intensive Färbung der Endothelzellen der Mikrovaskulatur, was zeigt, dass nicht nur die Endothelzellen des Gehirns, sondern vielmehr die Endothelzellen des gesamten Zentralnervensystems mit den erfindungsgemä¬ ßen Peptiden transduzierbar sind (Daten nicht gezeigt) . Beispiel 6: Herstellung und Quantifizierung rekombinanter AAV- Vektoren mit Hilfe des Baculovirus Expressionssystem in Sf9 Insektenzellen
Zur Produktion rekombinanter AAV-Vektoren in Sf9-Insektenzellen [33-35] wurde das modifizierte AAV2 Genom mit dem für die Pepti¬ dinsertion kodierenden Oligonukleotid-Insert im cap-Gen (siehe oben) in das Donorplasmid pFASTBAC Dual (Life Technolgies, Dar¬ mstadt, Deutschland) kloniert. In das Donorplasmid wurde ferner ein artifizielles Intron inseriert, das den polh-Promoter um- fasste, wodurch das Plasmid pFBD-Repin/Capin entstand [35]. Zur Erstellung des Donorplasmids pFB-CAG-eGFP wurden der CAG- Promoter und das eGFP-Gen zusammen mit dem SV40-Polyadenyl- ierungssignal und den AAV2-ITRs in das Plasmid pFASTBACl (Life Technologies) kloniert. Die Donorplasmide wurden zur Transforma¬ tion von DHlOBac E. coli Zellen verwendet, aus denen anschlie¬ ßend rekombinante Bacmide isoliert wurden, welche das rekombi- nante AAV-Genom bzw. die eGFP-Transgencassette enthielten. Die Bacmide (9yg) wurden zur Transfektion von jeweils lxlO6 Sf9 Zel¬ len im 6-Well Format mittels FectoflyTransfektionsreagenz (Polyplus Transfection/VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland) verwendet. Nach dreitägiger Inkubation der transfi- zierten Sf9-Insektenzellen bei 27°C in Insect X-Press Medium (Lonza, Köln, Deutschland) mit 1% Gentamycin (Lonza) wurden 500μ1 der im Zellkulturüberstand befindlichen rekombinanten Ba- culoviren zur Amplifikation mit frischen 2,5xl07 Sf9 Zellen in T175 Zellkulturflaschen für weitere drei Tage bei 27°C in Insect X-Press Medium (Lonza) mit 1% Gentamycin inkubiert. Die auf diese Weise amplifizierten Baculoviren wurden zur Infektion von frischen Sf9 Zellen verwendet, um rekombinante AAV-Vektoren herzu¬ stellen. Zu diesem Zweck wurden rekombinantes Baculovirus mit inseriertem AAV-Genom und rekombinantes Baculovirus mit inse¬ rierter eGFP-Transgencassette vermischt und zusammen in 400 ml Insect-XPress Medium mit 1% Gentamycin im 11 Erlenmeyerkolben zur Infektion von 6xl08 Insektenzellen verwendet. Die Zellen wurden anschließend bei 27°C unter Schütteln (110 UpM) inkubiert. Vier Tage nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, lysiert und die AAV-Vektoren wurden mittels Iodixanol-Dichtegradienten- Ultrazentrifugation aufgereinigt , wie es zuvor beschrieben wurde [29]. Für die Quantifizierung der rekombinanten Vektoren wurden die genomischen Titer durch quantitative real-time PCR unter Verwendung der CMV-spezifischen Primer von SEQ ID NO: 20 und SEQ ID NO: 21 mit dem LightCycler-System bestimmt, wie es zuvor beschrieben wurde [32] .
Ergebnisse : Durch Verwendung des Baculovirus-Expressionsystems konnten in Sf9 Insektenzellen höhere Titer rekombinanter AAV- Vektoren erzielt werden als bei der Produktion in HEK293T-Zellen nach Dreifach-Transfektion . Während die Ausbeute der Virusproduktion in HEK293T-Zellen bei maximal l,9xl04 genomischen Partikeln pro Zelle lag, wurde bei Sf9-Insektenzellen eine Ausbeute von bis zu 7,9xl04 genomischen Partikeln pro Zelle beobachtet. Ferner konnte beobachtet werden, dass rAAV2-NRGTEWD-Vektoren, die in Sf9-Insektenzellen hergestellt wurden, eine erhöhte Affinität zu neuronalen Zellen aufwiesen als entsprechende rekombi- nante Vektoren, die in HEK293T-Zellen erzeugt wurden (Daten nicht gezeigt) . Somit bietet die Wahl des konkreten Herstel¬ lungsverfahrens für die rekombinanten Vektoren die Möglichkeit, die Spezifität der Vektoren für die Neuronen bzw. Endothelzellen weiter zu erhöhen.
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Claims

PATENTA S PRÜCHE
1. Peptid, Polypeptid oder Protein, das spezifisch an Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks bindet, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass es folgendes umfasst:
(a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:l, oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die sich von der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:l durch Modifikation von einer Aminosäure unterscheidet.
2. Peptid, Polypeptid oder Protein, das spezifisch an Zellen des Gehirns und/oder des Rückenmarks bindet, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass es die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst .
3. Peptid, Polypeptid oder Protein nach Anspruch 2, das folgendes umfasst:
(a) eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2-5, oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die sich von einer der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO:l durch Modifikation von einer Aminosäure unterscheidet.
4. Protein nach einem der Ansprüche 1-3, wobei es sich um ein Kapsid-Protein eines viralen Vektors handelt, vorzugsweise um ein Kapsid-Protein eines Adeno-assoziierten Virus (AAV) handelt .
5. Protein nach Anspruch 4, wobei es sich um ein Kapsid-Protein eines AAV von einem Serotyp ausgewählt aus der Gruppe beste¬ hend aus den 2, 4, 6, 8 und 9 handelt.
6. Protein nach Anspruch 5, wobei es sich um ein Kapsid-Protein eines AAV vom Serotyp 2 handelt.
7. Protein nach Anspruch 6, wobei es sich um das VPl-Protein eines AAV vom Serotyp 2 handelt.
8. Protein nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das Peptid im Bereich der Aminosäuren 550-600 des Kapsids vorliegt.
9. Protein nach einem der Ansprüche 1-8, das folgendes umfasst:
(a) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10;
(b) eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% Identität zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 aufweist und darüber hinaus die Sequenz von SEQ ID NO:l umfasst oder eine Aminosäuresequenz, die sich von der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:l durch Modifikation von einer Aminosäure unterscheidet; oder
(c) ein Fragment von einer der in (a) oder (b) definierten Aminosäuresequenzen .
10. Virales Kapsid, das ein Peptid, Polypeptid oder Protein nach einem der Ansprüche 1-9 umfasst.
11. Nukleinsäure, die für ein Peptid, Polypeptid oder Protein nach einem der Ansprüche 1-9 kodiert.
12. Plasmid, das eine Nukleinsäure nach Anspruch 11 umfasst.
13. Rekombinanter viraler Vektor, der ein Kapsid und ein darin verpacktes Transgen umfasst, wobei das Kapsid mindestens ein Kapsid-Protein umfasst, welches ein Peptid, Polypeptid oder Protein nach den Ansprüchen 1-9 umfasst.
14. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 13, wobei es sich um einen rekombinanten AAV-Vektor handelt.
15. Rekombinanter AAV-Vektor nach Anspruch 14, wobei es sich um einen AAV-Vektor eines Serotyps ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Serotypen 2, 4, 6, 8 und 9 handelt.
16. Rekombinanter AAV-Vektor nach Anspruch 15, wobei es sich um einen AAV-Vektor vom Serotyp 2 handelt. Rekombinanter AAV-Vektor nach einem der Ansprüche 13-16, wobei das Transgen für eines der folgenden Proteine kodiert: ein Membran- oder Tight-Junction-Protein, wie z.B. ein Claudin oder Occludin, Neuraminidase, z.B. Neuraminidase 1, Glucuronidase, ein Chemokin-Antagonist , wie z.B. CCL2-7ND, Neurotrophischer Faktor der Gliazellen (GDNF) , Neprilysin, Cholesterol 24-Hydroxylase, aromatische L-Aminosäure- Decarboxylase, Tyrosynhydroxylase, GTP-Cyclohydrolase I und Survival of Motor Neuron ( SMN) -Protein .
Rekombinanter AAV-Vektor nach Anspruch 17, wobei das Transgen für eine Neuraminidase kodiert.
Rekombinanter AAV-Vektor nach einem der Ansprüche 13-18, wobei das Transgen in Form einer ssDNA oder einer dsDNA vorliegt .
Rekombinanter AAV-Vektor nach einem der Ansprüche 13-19 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Funktionsstörung oder einer Erkrankung des Gehirns und/oder Rückenmarks in einem Subjekt.
Rekombinanter AAV-Vektor zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Erkrankung des Gehirns und/oder Rückenmarks ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ge¬ netisch verursachten Leukodystrophien, wie Adrenoleukodystrophie, Morbus Canavan, Morbus Krabbe, meta¬ chromatische Leukodystrophie, Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit und Morbus Alexander; neurodegenerativen Erkrankungen, wie amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington und Morbus Pick; chronisch-entzündlichen Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie Multiple Sklerose und Guillain-Barre-Syndrom; und Lysosomen-Speichererkrankungen, wie Ceroid-Lipofuszinose und Morbus Fabry.
Rekombinanter AAV-Vektor zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 20-21, wobei das Subjekt ein Säuge- tier, vorzugsweise ein Mensch ist. Rekombinanter AAV-Vektor zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 20-22, wobei der Vektor für die intravenöse Verabreichung formuliert ist.
Zelle, die ein Peptid, Polypeptid oder Protein nach einem der Ansprüche 1-9, ein virales Kapsid nach Anspruch 10, eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 11, ein Plasmid nach Anspruch 12, oder einen rekombinanten AAV-Vektor nach einem der Ansprüche 13-19 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid, Polypeptid oder Protein nach einem der Ansprüche 1-9, ein virales Kapsid nach Anspruch 10, eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 11, ein Plasmid nach Anspruch 12, oder einen rekombinanten AAV-Vektor nach einem der Ansprüche 13-19 umfasst.
Verwendung eines Peptids, Polypeptids oder Proteins nach ei¬ nem der Ansprüche 1-9, eines viralen Kapsids nach Anspruch 10, einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 11, eines Plasmids nach Anspruch 12 oder eines rekombinanten AAV-Vektors nach einem der Ansprüche 13-19 zur Behandlung einer Funktionsstö¬ rung oder einer Erkrankung des Gehirns und/oder Rückenmarks in einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Erkrankung des Gehirns und/oder Rückenmarks ausgewählt ist aus der Gruppe be¬ stehend aus genetisch verursachten Leukodystrophien, wie Adrenoleukodystrophie, Morbus Canavan, Morbus Krabbe, meta¬ chromatische Leukodystrophie, Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit und Morbus Alexander; neurodegenerativen Erkrankungen, wie amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington und Morbus Pick; chronisch-entzündlichen Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie Multiple Sklerose und Guillain-Barre-Syndrom; und Lysosomen-Speichererkrankungen, wie Ceroid-Lipofuszinose und Morbus Fabry.
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