JP2022188238A - 神経ペプチド発現ベクター及びてんかんの治療のための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞に核酸配列を導入するための送達ベクターを提供する。【解決手段】プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含む送達ベクターであって、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体であるプレプロペプチドの発現を駆動し、ここで、前記プレプロペプチドが、シグナルペプチドを含み、かつ一方で、前記プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体が、特定の配列群から選択される配列の少なくとも１つを含む、送達ベクターである。【選択図】なし

Description

本発明は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞に、プレプロペプチドをコードする核酸配列を導入するための送達ベクターを提供する。本発明は、細胞に核酸配列を送達する方法、及び焦点性てんかんを治療する方法を提供する。

１～２％の有病率で、てんかんは、世界中で最も頻度の高い神経疾患に属する（McNamara et al.、1999）。内側側頭葉てんかん（ｍＴＬＥ）は、ヒトにおける最も頻度の高いタイプのてんかんであり、かつ外傷性脳損傷によって頻繁に誘発される。海馬硬化症及びそれに伴う神経障害は、ｍＴＬＥの重要な特徴である（概要については、Engel et al.、2001を参照のこと）。過去数十年にわたる多量の抗てんかん薬の導入にも関わらず、薬物耐性てんかんの割合（３０％～７０％）は、１９７１のCoatsworthの研究以来改善しなかった（Coatsworth et al.、1971、Loscher et al.、2011）。今日まで、てんかん原性焦点の外科的切除が、それら患者の一部にとっての最終的な選択肢として残されている。それでも、患者の特定のサブグループにおいて、５０％未満が、てんかん焦点の除去後少なくとも１年間は発作を起こさないままである（Spencer et al.、2008）。

１９８０年代初頭以降、オピオイド、すなわちダイノルフィン（Ｄｙｎ）が、インビトロでニューロンの興奮性のモジュレーターとして作用することが証明された（Henriksen et al.、1982、Siggins et al.、1986）。これと一致して、マウスにおけるプロダイノルフィン（ｐＤｙｎ）コード配列の欠失（Loacker et al.、2007）、及びプロモーター領域における突然変異に起因するヒトにおける低Ｄｙｎレベル（Stogmann et al.、2002、Gambardella et al.、2003）が、てんかんの発症に対する脆弱性の増大と関連付けられている。側頭葉てんかん(ＴＬＥ；皮質で生じるてんかん＝外側ＴＬＥ及びｍＴＬＥを含む）のほとんどの動物モデルにおいて、皮質及び海馬ｐＤｙｎ発現は、過剰発現の初期の短いピーク後に減少する（概要については、Simonato et al.、1996、Schwarzer et al.、2009を参照のこと）。これは、海馬顆粒細胞における最も可能性のある短命な発作後に増大したｐＤｙｎ ｍＲＮＡと一致し（Pirker et al.、2009）ｍＴＬＥ患者から得られた外科的に除去された組織においてＤｙｎ免疫反応の全体的な減少を伴う（de Lanerolle et al.、1997）。

ダイノルフィンは、κオピオイド受容体（ＫＯＲ）に優先的に作用する。内在性Ｄｙｎの減少にも関わらず、ＫＯＲは、てんかん条件下で薬物標的として利用可能なままであり、かつＫＯＲアゴニストの適用は、実験的発作を抑制することができる（Tortella et al.、1988、Takahashi et al.、1990、Solbrig et al.、2006、Loacker et al.、2007、Zangrandi et al.2016）。異なる経路を介して適用される種々の選択的ＫＯＲは、てんかんのモデルにおけるフェニトイン又はフェノバルビタールによる治療時の効果と同様の時間依存的及び用量依存的効果をもたらす（概要については、Simonato et al.、1996を参照のこと）。本発明者らは近年、ＫＯＲの活性化が、マウスにおけるカイニン酸の片側注入後の急性期に続く海馬及び偏桃体ニューロンの生存を促進することを実証した（Schunk et al.、2011）。

本発明の目的は、シグナル配列を含むプレプロペプチド又はペプチドをコードする核酸配列を導入するための送達ベクターを提供することであって、前記シグナル配列は、小胞への前記プロペプチド、例えばプロダイノルフィンのパッキングを可能にし、ここで、プロペプチドは成熟を受け、ダイノルフィン又はダイノルフィンの変異体である活性物質は、特定の励起閾値を超えた活動電位の頻度の際に放出される。したがって、本発明の目的は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞に核酸配列を導入するための送達ベクターを提供することである。本発明の目的は特に、プレプロダイノルフィン又はダイノルフィン又はその変異体による焦点性てんかんの治療のためのベクターベースの療法である。プレプロダイノルフィン又はプロダイノルフィン又はダイノルフィン又はその変異体をコードする核酸を含む本発明の送達ベクターは、ニューロンを形質導入し、プレプロダイノルフィン又はプロダイノルフィン又はダイノルフィン又はその変異体を放出し、従って、てんかん原性焦点におけるＫＯＲの活性化を提供し、それによって発作を阻害するものとする。

本発明の主題は、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含む送達ベクターであって、前記送達ベクターが、シグナルペプチドを含むプレプロペプチドとしてのプレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体の発現を駆動し、前記プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体が、以下の群から選択される配列：
ａ．配列番号７（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２０７－２２３）であるＤｙｎ Ａ、あるいは最初の１３ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体又は最初の８ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体、
ｂ．配列番号８（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２３８）である、Ｄｙｎ Ｂ、
ｃ．配列番号９（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２５４）である、ロイモルフィン
ｄ．配列番号７に係るＤｙｎ Ａの変異体であって、配列番号７のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＩ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号７に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＩ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
ｅ．配列番号８に係るＤｙｎ Ｂの変異体であって、配列番号８のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号８に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＱ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
ｆ．配列番号９に係るロイモルフィンの変異体であって、配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号９に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＱ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
の少なくとも１つを含む、送達ベクターである。

６０％の配列同一性とは、以下のように定義される：最初の８個のＮ末端アミノ酸のうち３個が、除去されるか、又は別のアミノ酸により置換され得る。配列同一性のパーセンテージは、切断されたペプチド変異体の場合、短縮ペプチドについて計算される。付加的なアミノ酸の導入は元の配列におけるギャップとして扱われ、欠失は、配列同一性の計算のために修飾ペプチドにおけるギャップとして扱われる（ＹＧＧＦＬＲＲＱは、ＹＧ－ＦＬＲＲＱとは１ＡＡのみによって異なるが、現在、３、４、５、６及び７位におけるＡＡが異なっている）。いずれの場合にも、最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号７の変異体は、以下の配列を含む変異体であり得る：ＹＧＺＦＬＲＫＺ、Ｚは任意のアミノ酸を表し、Ｋは７位のＲを再置換し、ペプチダーゼ認識部位を保存する。

本願を通じて、アミノ酸配列における「Ｚ」は、天然に存在するアミノ酸のいずれかを表し、特定の実施形態では、「Ｚ」は、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、ロイシン、セリン、バリン及びイソロイシンを含む群から選択され得る。

本発明によれば、前記送達ベクターは、ダイノルフィン又はダイノルフィン変異体のプレプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。これは、前記ベクターが、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことを意味する。一態様として、本発明は、細胞に核酸を導入するための送達ベクターを提供し、送達ベクターは、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含む。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列番号４による配列であり得る。本発明の別の態様では、前記送達ベクターは、プロペプチド断片をコードするＤＮＡ配列を含む。本発明の特定の態様では、前記プロペプチド断片は、配列番号５による配列である。

本送達ベクターの利点は、ダイノルフィン又はダイノルフィン変異体の要求に応じた放出である。これは、プロダイノルフィン（又はプロダイノルフィンの変異体）が、小胞に充填されて、成熟を受け、発作の開始時に起こる高頻度刺激時に要求に応じて放出されることを意味する（例えば刺激≧８Ｈｚ）（図４参照）。したがって、リリースオンデマンド（release-on-demand）製剤は、プレプロダイノルフィン（又はプレプロダイノルフィンの変異体）を提供し、これは次に小胞に充填され、成熟を受け、そして、ダイノルフィン又はダイノルフィンの変異体である活性物質が、特定の閾値を超える活動電位の頻度の際に放出される。前記特定の閾値は、閾値≧６Ｈｚであり得、別の実施形態では、≧７Ｈｚ、別の実施形態では、≧８Ｈｚ、別の実施形態では、≧９Ｈｚであり得る。これは、前記リリースオンデマンドが、増大したニューロン発火頻度（neuronal firing frequency）によって引き起こされることを意味する。前記増大したニューロン発火頻度は、ＥＥＧ（脳波検査法（electroencephalography））によって測定することができ、増大した、とは、前記対象におけるＥＥＧによって測定された値が≧６Ｈｚ、別の実施形態では、≧７Ｈｚ、別の実施形態では、≧８Ｈｚ、別の実施形態では、≧９Ｈｚであることを意味する。

これは、本送達ベクターが、要求に応じてダイノルフィン又はダイノルフィン変異体の提供を可能にするプレプロペプチドの発現を駆動することを意味し、そのような送達ベクターは、最初にニューロンにおいてプレプロペプチドを発現し、ここで、得られたプロペプチドが有芯小胞（large dense core vesicles）にソートされ、それは酵素的に処理され、得られたペプチドは、十分に強い励起がそれらの放出をもたらすまでソートされる。すなわち、前記放出は、上述の増大したニューロン発火頻度によって引き起こされる。Ｄｙｎペプチドは、シナプス前及び／又はシナプス後ＫＯＲに結合し、これはＧ－タンパク質を活性化し、他方で、イオンチャネルを調節して、ニューロン興奮のさらなる増幅及び拡散を抑制する。ｐｐＤｙｎのシグナルペプチドの翻訳は、「有芯（large dense core）」小胞（ＬＤＶ）内へのニューロンで発現したプロダイノルフィンのソーティングの最初のステップである。ニューロンにおける既存のメカニズムを使用して、プロダイノルフィンは成熟ペプチドへと酵素処理され、軸索末端に輸送される。ＬＤＶは軸索末端で貯蔵され、刺激依存的に放出される。発作の開始時のような上述した高頻度刺激（High frequency stimulation）は、放出を誘導するが、低頻度刺激は放出を誘導しない。これは、薬物のオンデマンド状況を作り出す。放出されたＤｙｎペプチドはシナプス前及び／又はシナプス後ＫＯＲに結合し、これはＧ－タンパク質を活性化し、これは他方で、イオンチャネルを調節して、ニューロン興奮のさらなる増幅及び拡散を抑制する。

換言すれば、リリースオンデマンド組成物は、前記対象の発作の開始時に、本発明に係る送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームのいずれかに由来するヒトＫＯＲに対するアゴニスト作用を有するペプチドを放出する組成物である。発作の開始は、ＥＥＧ（脳波検査法）によって測定することができる増大したニューロン発火頻度によって特徴づけることができ、ここで、増大した、とは、前記対象におけるＥＥＧによって測定された値が≧６Ｈｚ、別の実施形態では、≧７Ｈｚ、別の実施形態では、≧８Ｈｚ、別の実施形態では、≧９Ｈｚであることを意味する。

最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号７の変異体は、ＹＧＧＦＬＲＲＩの配列において少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。配列同一性は以下のように定義される：最初の８個のアミノ酸のうち３個が、除去されるか、又は別のアミノ酸によって置換され得る。いずれの場合にも、最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号７の変異体は、以下の配列を含む変異体であり得る：ＹＧ－ＦＬＲＫＺ、ここで、「－」は欠失ＡＡを表し、Ｚは任意のＡＡを表す。

最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号８の変異体は、ＹＧＧＦＬＲＲＱの配列において少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。配列同一性は以下のように定義される：最初の８個のアミノ酸のうち３個が、除去されるか、又は別のアミノ酸によって置換され得る。いずれの場合にも、最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号８の変異体は、以下の配列を含む変異体であり得る：ＹＧＧＦＬＺＺＺ、ここで、Ｚは任意のアミノ酸を表す。

最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号９の変異体は、ＹＧＧＦＬＲＲＱの配列において少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。配列同一性は以下のように定義される：最初の８個のアミノ酸のうち３個が、除去されるか、又は別のアミノ酸によって置換され得る。いずれの場合にも、最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列番号９の変異体は、以下の配列を含む変異体であり得る：ＹＧＡＦＬＲＺＡ、ここで、Ｚは任意のアミノ酸を表す。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、変異体は、それぞれ配列番号７、配列番号８又は配列番号９の最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する。７０％の配列同一性とは、最初の８個のアミノ酸のうち最大で２個が、除去されるか、又は別のアミノ酸によって置換され得ることを意味する。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、変異体は、それぞれ配列番号７、配列番号８又は配列番号９の最初の８ＡＡにおいてＮ末端から少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。８０％の配列同一性とは、最初の８個のアミノ酸のうち１個が、除去されるか、又は別のアミノ酸によって置換され得ることを意味する。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、前記送達ベクターは、プレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含み、斯かるＤＮＡ配列が、以下の群から選択される変異体の配列：
配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２、の少なくとも１つを含み、
ここで、Ｚは任意のアミノ酸であってもよく、ここで、好ましくは配列番号１０において、少なくとも１つのＺは配列番号７の配列と比較して異なり、好ましくは配列番号１１において、少なくとも１つのＺは配列番号８の配列と比較して異なり、好ましくは配列番号１２において、少なくとも１つのＺは配列番号９の配列と比較して異なる。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、前記送達ベクターは、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体をコードする複数のＤＮＡ配列を含み、ここで、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体に係る配列は、ペプチダーゼ認識シグナルに隣接している。

これは、一例として、配列番号７によるペプチドの２つの分子が１つの送達ベクターに由来することになるように、前記送達ベクターが、配列番号７を２回コードするＤＮＡ配列を含み得ることを意味する。

ペプチダーゼ（プロホルモン変換酵素）認識シグナルは、当業者に知られており、かつ単一又は対の塩基性アミノ酸であり得、好ましくは、排他的ではないが、Ｋ、Ｒ、ＫＲ、ＲＫ又はＲＲであり得る。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、前記送達ベクターは、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体をコードする複数のＤＮＡ配列を含み、ここで、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体に係る配列は、ペプチダーゼ認識シグナルに隣接している。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、前記送達ベクターは、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体をコードする複数のＤＮＡ配列を含み、ここで、前記送達ベクターは、配列番号６及び／又は７をコードするＤＮＡを含まない。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、前記送達ベクターは、配列番号２又は配列番号１４をコードするＤＮＡを含む。

特定の実施形態では、本発明の主題は、上述した送達ベクターであり、ここで、前記送達ベクターは、配列番号３又は配列番号１５をコードするＤＮＡを含む。

本発明によって生成される送達ベクターは、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでの細胞への核酸の送達に有用である。特に、送達ベクターは有利には、動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞に、核酸を送達又は導入するために使用することができる。

好適なベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス；ワクシニアウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス）、脂質ベクター、ポリリジンベクター、核酸分子と共に使用される合成ポリアミノポリマーベクター、例えばプラスミド、などを含む。

当該技術分野で知られている任意のウイルスベクターを本発明で使用することができる。そのようなウイルスベクターの例としては、これらに由来するベクターに限定されるものではないが、以下：アデノウイルス科（Adenoviridae）；ビルナウイルス科（Birnaviridae）；ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）；カリシウイルス科（Caliciviridae）、カピロウイルス（Capillovirus）群；カーラウイルス（Carlavirus）群；カルモウイルス（Carmovirus）ウイルス群；カリモウイルス群（Group Caulimovirus）；クロステロウイルス（Closterovirus）群；コンメリーナ黄色斑紋ウイルス群（Commelina yellow mottle virus group）；コモウイルス（Comovirus）ウイルス群；コロナウイルス科（Coronaviridae）； PM2ファージ群；コルシコウイルス科；潜伏ウイルス群（Group Cryptic virus）；クリプトウイルス群（group Cryptovirus）；ククモウイルスウイルス群ファミリー（Cucumovirus virus group Family）；[PHgr]6ファージ群；シシオウイルス科（Cysioviridae）；カーネーションリングスポット群（Group Carnation ringspot）；ダイアンソウイルス（Dianthovirus）ウイルス群；ソラマメウイルト群（Group Broad bean wilt）；ファバウイルス（Fabavirus）ウイルス群；フィロウイルス科（Filoviridae）；フラビウイルス科（Flaviviridae）；フロウイルス（Furovirus）群；ゲルミニウイルス群（Group Germinivirus）；ジアルジアウイルス群（Group Giardiavirus）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）；ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）；ホルデイウイルス（Hordeivirus）ウイルス群；イラルウイルス（Illarvirus）ウイルス群；イノウイルス科（Inoviridae);イリドウイルス科(Iridoviridae）；レヴィウイルス科（Leviviridae）；リポスリクスウイルス科（Lipothrixviridae）；ルテオウイルス（Luteovirus）群；マラフィウイルス（Marafivirus）ウイルス群；トウモロコシ白化萎縮ウイルス （Maize chlorotic dwarf virus）群；イクロウイルス科（icroviridae）；ミオウイルス科（Myoviridae）；ネクロウイルス（Necrovirus）群；ネポウイルス（Nepovirus）ウイルス群；ノダウイルス科（Nodaviridae）；オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）；パポバウイルス科（Papovaviridae）；パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）；パースニップ黄斑ウイルス（Parsnip yellow fleck virus）群；パルティティウイルス科（Partitiviridae）；パルボウイルス科（Parvoviridae）；エンドウひだ葉モザイクウイルス（Pea enation mosaic virus）群；フィコドナウイルス科（Phycodnaviridae）；ピコルナウイルス科（Picomaviridae）；プラズマウイルス科（Plasmaviridae）；プロドウイルス科（Prodoviridae）；ポリドナウイルス科（Polydnaviridae）；ポテックスウイルス（Potexvirus）群；ポティウイルス（Potyvirus）；ポックスウイルス科（Poxviridae）；レオウイルス科（Reoviridae）；レトロウイルス科（Retroviridae）；ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）；リジディオウイルス群（Group Rhizidiovirus）；サイフォウイルス科（Siphoviridae）；ソベモウイルス（Sobemovirus）群；SSV 1型ファージ；テクティウイルス科（Tectiviridae）；テヌイウイルス（Tenuivirus）；テトラウイルス科（Tetraviridae）；タバコモザイクウイルス群（Group Tobamovirus）；トブラウイルス群（Group Tobravirus）；トガウイルス科（Togaviridae）；トンブスウイルス群（Group Tombusvirus）；トボウイルス群（Group Tobovirus）；トティウイルス科（Totiviridae）；チモウイルス群（Group Tymovirus）;及び植物衛星ウイルス（Plant virus satellites）、が挙げられる。組み換えウイルスベクターを産生するための、及び核酸送達のためにウイルスベクターを使用するためのプロトコルは、（Ausubel et al.、1989）に、そして他の標準的な実験マニュアル（例えば、Rosenzweig et al.2007）に見出すことができる。ウイルスベクターの具体例は、核酸の送達のために以前に使用されたベクターであり、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）並びに他のパルボウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルスベクターを含む。本明細書で使用される用語「パルボウイルス」は、自律性（autonomous）パルボウイルス、デンソウイルスおよびデペンドウイルスを含む、パルボウイルス科を包含する。用語ＡＡＶは、全ての脊椎動物変異体、特にヒト、霊長類、他の哺乳動物、鳥類又は蛇類（serpentine）起源の変異体を含む。自律性パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、ボカウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、およびコントラウイルス属のメンバーを含む。例示的な自律性パルボウイルスとしては、これらに限定されるものではないが、マウスの微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、HIパルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、ボカウイルス、ブファウイルス（bufavirus）、ツサウイルス（tusavirus）及びB19ウイルス、並びにパルボウイルスとして国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）によって分類された任意の他のウイルスが挙げられる。他の自律性パルボウイルスは当業者に知られている。例えば（Berns et al.2013）を参照のこと。

本発明の一実施形態では、前記送達ベクターはさらに、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノム又は組み換えレンチウイルスゲノムを含む。

本発明の一つの特定の実施形態では、前記送達ベクターはさらに組み換えＡＡＶベクターを含み、ここで、好ましくは前記ベクターは、ヒト又は霊長類起源の血清型である。

本発明の一つの特定の実施形態では、前記送達ベクターはさらに組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムを含み、ここで、前記ベクターはヒト血清型ベクターであり、斯かるヒト血清型ベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、１１、１２、１３、１４、蛇行性ＡＡＶ、祖先ＡＡＶ、又はそれらに由来するＡＡＶカプシド突然変異体を含む群から選択され、好ましくは、排他的ではないが、ＡＡＶ血清型１又は２のヒト血清型ベクターである。

本発明の一つの特定の実施形態では、前記送達ベクターは、一本鎖ＡＡＶベクター又は自己相補的（又は二量体）二本鎖ベクターである。

本発明の一つの特定の実施形態では、前記送達ベクターは上述した送達ベクターであり、ここで、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列は、治療効果を得るために、目的の遺伝子産物の十分な発現を生じるプロモーター及び／又はエンハンサーを含む発現制御エレメントに動作可能に連結される。

例えば、コード核酸は、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサーなどと操作可能に関連していてもよい。様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望のレベル及び組織特異的発現に応じて使用され得ることがさらに理解されることになる。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的又は誘導性であってもよい。プロモーター／エンハンサーは、天然又は外来性であってもよく、かつ天然又は合成配列であり得る。外来性とは、転写開始領域が導入される野生型宿主に転写開始領域が見られないことを意図する。処置されることになる標的細胞又は対象において機能的であるプロモーター／エンハンサーエレメントが、最も好ましい。哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントも好ましい。最も好ましいのは、ヒトニューロンにおいて活性であり、かつグリア細胞においては活性でないか又は活性の程度が少ない、プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的に又は誘導的に導入遺伝子を発現し得る。

例示的な構成的プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ベータ－アクチンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチンハイブリッドプロモーター、及びラウス肉腫ウイルスプロモーターが挙げられる。誘導性発現制御エレメントは、一般に、異種核酸配列（複数）の過剰発現制御を提供することが望ましい用途において使用される。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ニューロン特異的、脳特異的、筋肉特異的（心筋、骨格筋及び／又は平滑筋を含む）、肝臓特異的、骨髄特異的、膵臓特異的、脾臓特異的、及び肺特異的プロモーター／エンハンサーが挙げられる。特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーは、ＣＮＳの細胞又は組織で機能的であり、ＣＮＳの細胞又は組織に特異的でさえあり得る。そのようなプロモーター／エンハンサーとしては、これらに限定されるものではないが、眼（例えば、網膜及び角膜）、ニューロン（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ、ＡＡＤＣ、シナプシン、又はセロトニン受容体プロモーター）、グリア細胞（例えば、Ｓ１００又はグルタミンシンターゼ（synthase）プロモーター）、及び希突起膠細胞において機能するプロモーター／エンハンサーが挙げられる。ＣＮＳにおいて転写を誘導することが実証されている他のプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター（Tani et al.、1996）、及びプリオンプロモーター（Loftus et al.、2002）が挙げられる。好ましいのは、グリア細胞において有意に減少し、好ましくは発現を示さないニューロン特異的プロモーターである。

他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、薬物誘導性、ホルモン誘導性及び金属誘導性エレメント、並びに外因的に供給される化合物によって調節される他のプロモーターを含み、斯かる他のプロモーターは、限定することなく、亜鉛誘導性メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター；デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号参照）；エクジソン誘導性昆虫プロモーター（No et al、1996）；テトラサイクリン抑制系（Gossen及びBujard、1992）；テトラサイクリン誘導系（Gossen et al.、1995）；また、（Harvey et al.、1998）も参照のこと；ＲＵ４８６誘導性系（Wang、DeMayo et al.、1997）；（Wang、Xu et al.、1997）；及びラパマイシン誘導系（Magari et al.、1997）を含む。

本発明の特定の実施形態では、プロモーター及び／又はエンハンサーは、以下を含む群：構成的活性プロモーター、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス即時型遺伝子エンハンサー／プロモーター）又はＣＢＡプロモーター（ニワトリベータアクチンプロモーター及びヒトサイトメガロウイルスＩＥ遺伝子エンハンサー）、あるいは、誘導性プロモーター、これは、Gene Switch、ｔｅｔ－オペロン由来プロモーター、又は、例えばホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、シナプシン－１（ＳＹＮ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）由来のニューロン特異的プロモーターを含む、から選択され、好ましくは、排他的ではないがヒト起源のプロモーターである。

本発明の特定の実施形態では、前記送達ベクターはさらに、転写後調節エレメントを含み、好ましくはウッドチャック－肝炎ウイルス－転写後調節エレメントを含む。他の可能な転写後調節エレメントは当業者に知られている。

本発明の主題は、さらに、外来の治療用コード配列を含む組み換え遺伝子療法ベクターであり、斯かる治療用コード配列は、その発現のための遺伝的エレメント、及びその複製、ゲノムパッケージング、ゲノム組み込み等のためのウイルス特異的ｃｉｓエレメントに隣接している。前記ウイルスゲノムは、ＡＡＶの場合と同様に、ウイルス特異的タンパク質からなるウイルス粒子としてカプシド形成される。レンチウイルスベクターの場合、ウイルスゲノム及び逆転写酵素のようなウイルス特異的タンパク質などが、レンチウイルスカプシドにカプシド形成される。これらは、ウイルス特異的タンパク質が埋め込まれている脂質二重層によって包まれている。リポソームは、上述のヌクレオチド配列又は遺伝子治療の全ての調節エレメントを含む全体のＤＮＡ骨格、又は送達ベクターを含む。

リポソームの例としては、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノール－ アミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］、又はＤＳＰＥ－ ＰＥＧ２０００－ｍａｌ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノール－ アミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］、又はスフィンゴミエリン／コレステロール及びホスファチジン酸を含む変異体が挙げられる。

本発明の一つの特定の実施形態では、前記送達ベクターはさらに組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムを含み、前記組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムは、ＡＡＶカプシドにカプシド形成されている。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、核酸送達ベクターとして開発された。概要については、（Muzyczka、1992）を参照のこと。ＡＡＶは、ヘルパーウイルス、典型的には生産的複製のためのアデノウイルス又はヘルペスウイルスを必要とするヘルパー依存パルボウイルスである。ＡＡＶは、ヒト又は霊長類起源の現在１４の天然に存在する血清型の増殖するファミリーを表す。他の哺乳動物種、又は鳥類若しくは昆虫起源のＡＡＶが記載されている（Berns et al.、2013参照）。ＡＡＶは、直径が１８～２６ナノメートルの小さな正十二面体カプシドを有し、長さが４～５キロベースの一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは両方のＡＡＶ ＤＮＡ鎖をカプシド形成し、センス又はアンチセンスＤＮＡ鎖のいずれかが１つのビリオンに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、遺伝子ｒｅｐ及びｃａｐをコードする２つの主要なオープンリーディングフレームを有する。Ｒｅｐは、重複している非構造的調節タンパク質のファミリーをコードする。最もよく研究されているＡＡＶプロトタイプ株であるＡＡＶ２において、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８のためのｍＲＮＡｓは、ＡＡＶ ｐ５プロモーターから転写される（Stutika et al.2015）。Ｒｅｐ７８／６８は、ＡＡＶ転写、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、宿主細胞ゲノムへのＡＡＶ組み込み、及び宿主細胞ゲノムからのＡＡＶの救出に必要とされる。Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０は、別々のプロモーターｐ１９から転写されたＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８のＮ末端切断型を表し、予め形成されたＡＡＶカプシドへの新たに合成されたＡＡＶゲノムのカプシド形成に必要とされる。これらは、３つのｃａｐ遺伝子由来タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３によって形成される。ｃａｐ ＯＲＦはまた、ＡＡＰをコードし、これはカプシドの一部を形成しない集合促進タンパク質である。ＡＡＶ ＯＲＦは、ゲノムのいずれかの末端で逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。これらは、ＡＡＶ血清型間で長さが異なり、ＡＡＶ２では、これらは約１４５ｂｐを含み、その最初の１２５ｂｐは、Ｙ型又はＴ型二本鎖構造を形成することができる。ＩＴＲは、ｃｉｓでのＤＮＡ複製、パッケージング、ゲノム組み込み及び救出のために必要とされる最小のＡＡＶ配列を表す。ＤＮＡ複製及びＡＡＶベクターゲノムのパッケージングを確実にするために、これらのみがＡＡＶベクターに保持されなければならない。ＡＡＶ遺伝子ｒｅｐ及びｃａｐが、選択されたパッケージング細胞においてｔｒａｎｓで発現される場合に、ＡＡＶ－ＩＴＲに隣接した外来遺伝子は、複製され、ＡＡＶカプシドにパッケージングされることになる（Muzyczka、1992）。

ＡＡＶは、ニューロン、筋肉、肝臓、心臓などを含むインビボでの非分裂細胞において数か月及び数年にわたって持続することができる数少ないウイルスの１つである。野生型ＡＡＶ２は、Ｒｅｐ７８／６８依存的に宿主細胞ゲノムにそのゲノムを組み込むことが示されており、ＡＡＶ－ＩＴＲの一部を形成するいわゆるＲｅｐ結合部位に対するＤＮＡ配列相同性を有する染色体遺伝子座が優先される（Huser et al.、2014）。対照的に、ＡＡＶベクターはほとんどが核エピソームとして存続する。ＡＡＶ遺伝子ｒｅｐ及びｃａｐを欠くＡＡＶベクターはほとんど組み込まれることはなく、そうであるならばゲノム優先性はない（Huser et al.、2014）。それにもかかわらず、長期のＡＡＶ持続性が、ニューロンを含む非分裂の有糸分裂後細胞において示されており、これは、ＡＡＶベクターを、ＣＮＳ形質導入及び遺伝的又は後天的起源の慢性疾患の長期遺伝子付加療法に理想的なものにする。

一般に、組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）ゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大にするように、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（複数）を保持するのみとなる。構造的及び非構造的タンパク質コード配列は、それぞれの遺伝子をパッケージング細胞に、あるいは（Mietzsch、Grasse et al.、2014）に概説された組み換えヘルパーウイルス、例えばＨＳＶ又はバキュロウイルスに安定して組み込むことによって、例えばプラスミドなどのベクターから、ｔｒａｎｓで提供することができる。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＡＡＶ末端反復、より典型的には２つのＡＡＶ末端反復を含み、これは一般に、異種ヌクレオチド配列（複数）の５’及び３’末端に存在することになる。ＡＡＶ ＩＴＲは、血清型１～１４を含む任意のＡＡＶ由来であり得る。ＡＡＶ２由来ＩＴＲは、事実上あらゆるＡＡＶ血清型カプシドにクロスパッケージ（crosspackaged）され得るので、ＡＡＶ２と組み合わせたＡＡＶ２ ＩＴＲ ｒｅｐが最もよく使用される。末端反復が、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、及び／又はプロウイルスの救出などを媒介する限り、ＡＡＶ末端反復は、野生型末端反復配列を維持する必要はない（例えば、野生型配列は、挿入、欠失、切断又はミスセンス突然変異によって変更され得る）。ｒＡＡＶベクターゲノムは一般に、野生型ゲノムのサイズの８０％～約１０５％であり、かつＡＡＶ－ＩＴＲの一部として適切なパッケージングシグナルを含む。ＡＡＶカプシドへのパッケージングを促進するために、全ベクターゲノムは、好ましくは５．２ｋｂ未満、より好ましくは最大で４．８ｋｂのサイズであり、ＡＡＶカプシドへの組み換えゲノムのパッケージングを促進する。いわゆる二量体又は自己相補的ＡＡＶベクター（ｄｓＡＡＶ）が開発され、これは、一本鎖ＡＡＶゲノムの代わりに二本鎖をパッケージングする（McCarty et al.、2001）。これらは、ＡＡＶ遺伝子発現の増強をもたらすが、しかしながら導入遺伝子容量の減少という代償を伴う。最大で２ｋｂの外来遺伝子しかパッケージングすることができないが、これは小さな遺伝子又は神経ペプチドのための遺伝子を含むｃＤＮＡには十分である。

当該技術分野で知られている任意の好適な方法を、本発明の核酸を発現するＡＡＶベクターを産生するために使用することができる。ＡＡＶベクターストックは、所望の血清型及びＡＡＶ複製のためのアデノウイルス由来ヘルパー遺伝子のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ発現プラスミドと共にする、導入遺伝子を発現するＩＴＲ隣接ＡＡＶベクターゲノムのためのプラスミドのコトランスフェクション（co-transfection）によって産生することができる（Grimm et al.、2003;Xiao et al.、1998）。ＡＡＶベクターはまた、哺乳動物又は昆虫起源の細胞株のパッケージングにおいて産生することができ、及び／又は、組み換えヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヘルペスウイルス科の別のメンバー、又はバキュロウイルス（Mietzsch、Grasse et al.、2014において概説及び議論された）と組み合わせて産生することができる。

本発明の別の実施形態は、中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入するのに十分な条件下で、上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子と細胞とを接触させることを含む、方法である。

本発明の送達ベクターは、中枢神経系の細胞、好ましくはニューロンに核酸配列を送達するための手段を提供する。送達ベクターは、インビトロで細胞に目的のヌクレオチド配列を導入するために使用することができ、例えばインビトロでポリペプチドを産生し、あるいはエクスビボの遺伝子治療のために使用することができる。ベクターは、それを必要とする対象にヌクレオチド配列を送達する方法においてさらに有用である。このようにして、ポリペプチドは結果として対象においてインビボで産生され得る。治療又は他の方法として、並びに以下にさらに説明するように、対象はポリペプチドの欠乏を有するか、あるいは対象におけるポリペプチドの産生が何らかの治療効果を与え得るので、対象はポリペプチドを必要としているであろう。

中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法の一つの特定の実施形態において、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体は産生され、細胞から放出される。

中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法の一つの特定の実施形態において、斯かる方法は、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入するのに十分な条件下で、上述した組み換えウイルス粒子又はリポソームと細胞とを接触させることを含む。プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入するのに十分な条件とは、宿主細胞表面受容体及び共同受容体（coreceptor）へのＡＡＶカプシドの接触である。ＡＡＶ１カプシドは、Ｎ－アセチルガラクトサミンに結合した２－３シアル酸に、次いで１－４－結合Ｎ－アセチルグルコサミンに結合するのに対して、ＡＡＶ２カプシドは、細胞表面上のヘパリン硫酸プロテオグリカン、特に６－Ｏ－及びＮ－硫酸化ヘパリンに結合する（Mietzsch、Broecker et al.、2014）。ＡＡＶ共同受容体は、ＦＧＦＲ－１、インテグリンａＶｂ５、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－ｍｅｔ）及び最近同定されたユニバーサル（universal）ＡＡＶ受容体、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２による形質導入に必要なＡＡＶＲ、及び特定のグリカンの存在とは無関係な受容体を含む（Pillay et al.、2016）。ＡＡＶＲはＡＡＶ粒子に直接結合し、トランスゴルジネットワークへの輸送を助ける。どのようにしてＡＡＶが核に入るかは十分に理解されていない。いずれにせよ、ＡＡＶベクターは細胞核内で発現される。

本発明の一実施形態は、医薬としての使用のための上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームである。

本発明の一実施形態は、医薬の調製に使用するための上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームである。

本発明の一実施形態は、上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームを投与することによる療法を必要とする疾患対象を治療する方法である。

本発明の一実施形態は、対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療の使用のための上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームである。本発明の一実施形態は、対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんを治療するための医薬の調製における使用のための上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームである。本発明の一実施形態は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターの活性化を提供し、それによって発作を阻害する、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームである。特に、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームは、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターに対するアゴニスト作用を有するペプチドのオンデマンド放出（on-demand release）をもたらす。ヒトκオピオイドレセプターに対するアゴニスト作用を有する前記ペプチド（複数）は、一実施形態では、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５の配列を有するペプチドの群から選択される。

本発明の一実施形態は、上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームを投与することによる療法を必要とする疾患対象を治療する方法であり、ここで、前記疾患は、焦点性、特に内側側頭葉てんかんである。

本発明の一実施形態は、対象の焦点性てんかんの治療、又は焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであり、ここで、前記ベクターは、中枢神経系、例えば脳の神経細胞の形質導入に適している。

本発明の一実施形態は、対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんを治療するための医薬の調製のための、上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであり、ここで、前記ベクターは、脳の神経細胞の形質導入に適している。

ベクターは、脳の神経細胞の形質導入に適しており、これは、神経細胞表面受容体に付着し、例えばエンドサイトーシスによって、細胞膜を貫通することを意味する。

特定の実施形態では、前記ベクター又は組み換えウイルス粒子は、末梢投与あるいは頭蓋内又は脳内又は髄腔内投与に適している。これは、カテーテル、注射針等の補助によって達成され、深部脳電極によって誘導されて、てんかん原性焦点を検出する。

本発明の一実施形態は、上述した送達ベクター又は組み換えウイルス粒子、及び任意により薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物である。薬学的に許容される担体は、当業者に知られている。薬学的に許容される担体は、ナノ粒子、リポソーム、ナノゲル、ベクター粒子を放出するインプラント、又はベクター産生細胞であり得る。

本発明の別の実施形態は、上述した送達ベクター又は組み換えウイルス又はリポソーム粒子により［インビトロ又はエクスビボで］感染した細胞である。例えば、上述した送達ベクター又は組み換えウイルス又はリポソーム粒子は、初代細胞培養の調製中にエクスビボで（幹）細胞を感染させることができ、又は培養し続けられている（幹）細胞を感染させることができる。初代細胞又は幹細胞のいずれも、治療されることになる患者に由来するか、又は別の対象、若しくは動物種から生じ得る。感染した細胞は、治療用ペプチドを産生するために疾患組織の焦点に移植される。

本発明の主題は、焦点性てんかんを有する対象を治療する方法であって、上述した送達ベクター、組み換えウイルス粒子、又はリポソームあるいは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与すること、を含む方法である。

本発明の主題はさらに、上述した送達ベクターのいずれかに由来するか、又はそれらから誘導可能なヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチドである。

好ましくは、前記ＫＯＲに対するアゴニスト作用を有するペプチドは、（Toll et al.、1998）によって記載のように測定された、ヒトＫＯＲについて７以上のｐＫｉを示している。

好ましくは、ヒトＫＯＲについて７以上のｐＫｉを示す前記ＫＯＲアゴニストペプチドは、（Toll et al.、1998）によって記載されたように測定された、ヒトＭＵオピオイド受容体（ＭＯＲ）及びヒトデルタオピオイド受容体（ＤＯＲ）についてより低いｐＫｉを示す。ヒトＭＯＲ及びヒトＤＯＲについてより低いｐＫｉとは、６以下のｐＫｉを意味する。

好ましくは、前記ＫＯＲアゴニストペプチドは、（Toll et al.、1998）によって記載されたように測定された、ヒトＫＯＲについて７．５以上のｐＫｉを示し、ヒトＭＯＲ及びヒトＤＯＲについてより低いｐＫｉを有する。ヒトＭＯＲ及びヒトＤＯＲについてより低いｐＫｉとは、６以下のｐＫｉを意味する。

特定の実施形態では、ヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２のペプチドを含む群から選択される。

以下の配列の説明：
配列番号１（ｐｐＤｙｎ）
MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA DCLSRCSLCA VKTQDGPKPI NPLICSLQCQ
AALLPSEEWE RCQSFLSFFT PSTLGLNDKE DLGSKSVGEG PYSELAKLSG
SFLKELEKSK FLPSISTKEN TLSKSLEEKL RGLSDGFREG AESELMRDAQ
LNDGAMETGT LYLAEEDPKE QVKRYGGFLR KYPKRSSEVA GEGDGDSMGH EDLYKRYGGF LRRIRPKLKW DNQKRYGG FLRRQFKVVT RSQEDPNAYS GELFDA
ヒト脳で発現されたプロセシング前のヒトプレプロダイノルフィン。

配列番号２ ｐｐＤｙｎの変異体
MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA DCLSRCSLCA VKTQDGPKPI NPLICSLQCQ
AALLPSEEWE RCQSFLSFFT PSTLGLNDKE DLGSKSVGEG PYSELAKLSG
SFLKELEKSK FLPSISTKEN TLSKSLEEKL RGLSDGFREG AESELMRDAQ
LNDGAMETGT LYLAEEDPKE QVKRYGGFLR RQFKVVTRSQ EDPNAYSGEL
FDAKRSSEVA GEGDGDSMGH EDLYKRYGGF LRRIRPKLKW DNQKRYGG FLRRQFKVVT RSQEDPNAYS GELFDA
ペプチドネオエンドルフィンが除去され、かつロイモルフィンの第２のコピーによって置換されるように操作された、配列番号１におけるようなヒトプレプロダイノルフィン。

配列番号３ ｐｐＤｙｎの変異体２
MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA DCLSRCSLCA VKTQDGPKPI NPLICSLQCQ
AALLPSEEWE RCQSFLSFFT PSTLGLNDKE DLGSKSVGEG PYSELAKLSG
SFLKELEKSK FLPSISTKEN TLSKSLEEKL RGLSDGFREG AESELMRDAQ
LNDGAMETGT LYLAEEDPKE QVKRYGGFLR RQFKVVTRSQ EDPNAYSGEL
FDAKRSSEVA GEGDGDSMGH EDLYKRYGGF LRRQFKVVTR SQEDPNAYSG
ELFDAKRYGG FLRRQFKVVT RSQEDPNAYS GELFDA
ペプチドＤｙｎ Ａが除去され、かつロイモルフィンの第３のコピーによって置換されるように操作された、配列番号２ におけるようなヒトプレプロダイノルフィン変異体。

配列番号４ ｐｐＤｙｎのシグナルペプチド
MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA

配列番号５ 機能が知られていないｐｐＤｙｎのプロペプチド断片
DCLSRCSLCA VKTQDGPKPI NPLICSLQCQ AALLPSEEWE RCQSFLSFFT PSTLGLNDKE DLGSKSVGEG PYSELAKLSG SFLKELEKSK FLPSISTKEN TLSKSLEEKL RGLSDGFREG AESELMRDAQ LNDGAMETGT LYLAEEDPKE QV

配列番号６ ネオエンドルフィン
YGGFLRKYP

配列番号７ Ｄｙｎ Ａ
YGGFLRRIRPKLKWDNQ

配列番号８ Ｄｙｎ Ｂ（リモルフィン）
YGGFLRRQFKVVT

配列番号９：ロイモルフィン
YGGFLRRQFKVVTRSQEDPNAYSGELFDA

配列番号１０ 修飾されたＤｙｎ Ａ
YGZFLRRZRPKLKWDNQ
Zは任意のアミノ酸を表し、好ましくは少なくとも１つが野生型配列と比較して別のアミノ酸によって置換されている。

配列番号１１ 修飾されたＤｙｎ Ｂ
YGZFLRRZFKVVT
Zは任意のアミノ酸を表し、好ましくは少なくとも１つが野生型配列と比較して別のアミノ酸によって置換されている。

配列番号１２：修飾されたロイモルフィン
YGZFLRRZFKVVTRSQEDPNAYSGELFDA
Zは任意のアミノ酸を表し、好ましくは少なくとも１つが野生型配列と比較して別のアミノ酸によって置換されている。

配列番号１３（修飾されたｐｐＤｙｎ）
MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA DCLSRCSLCA VKTQDGPKPI NPLICSLQCQ
AALLPSEEWE RCQSFLSFFT PSTLGLNDKE DLGSKSVGEG PYSELAKLSG
SFLKELEKSK FLPSISTKEN TLSKSLEEKL RGLSDGFREG AESELMRDAQ
LNDGAMETGT LYLAEEDPKE QVKRYGGFLR KYPKRSSEVA GEGDGDSMGH EDLYKRYGZF LRRZRZKLKW DNQKRYGZ FLRRZFKVVT RSQEDPNAYS GELFDA
Zは任意のアミノ酸を表し、好ましくは少なくとも１つが野生型配列と比較して別のアミノ酸によって置換されている。

配列番号１４（修飾されたｐｐＤｙｎの変異体１）
MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA DCLSRCSLCA VKTQDGPKPI NPLICSLQCQ
AALLPSEEWE RCQSFLSFFT PSTLGLNDKE DLGSKSVGEG PYSELAKLSG
SFLKELEKSK FLPSISTKEN TLSKSLEEKL RGLSDGFREG AESELMRDAQ
LNDGAMETGT LYLAEEDPKE QVKRYGZFLR RZFKVVTRSQ EDPNAYSGEL FDAKRSSEVA GEGDGDSMGH EDLYKRYGZF LRRZRZKLKW DNQKRYGZ FLRRZFKVVT RSQEDPNAYS GELFDA
Zは任意のアミノ酸を表し、好ましくは少なくとも１つが野生型配列と比較して別のアミノ酸によって置換されている。

配列番号１５ 修飾されたｐｐＤｙｎの変異体２
MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA DCLSRCSLCA VKTQDGPKPI NPLICSLQCQ
AALLPSEEWE RCQSFLSFFT PSTLGLNDKE DLGSKSVGEG PYSELAKLSG
SFLKELEKSK FLPSISTKEN TLSKSLEEKL RGLSDGFREG AESELMRDAQ
LNDGAMETGT LYLAEEDPKE QVKRYGZFLR RZFKVVTRSQ EDPNAYSGEL FDAKRSSEVA GEGDGDSMGH EDLYKRYGZF LRRZFKVVTR SQEDPNAYSG ELFDAKRYGZ FLRRZFKVVT RSQEDPNAYS GELFDA
Zは任意のアミノ酸を表し、好ましくは少なくとも１つが野生型配列と比較して別のアミノ酸によって置換されている。

ヒトプレプロダイノルフィン（赤色）又はＧＦＰ（青色）を発現するための全ての調節遺伝子エレメントを含むＡＡＶベクター骨格を示す。 ｒＡＡＶ－ｐＤｙｎ（配列番号１）注入の２日前から７日後までの、カイニン酸注入動物の同側海馬から得られたＥＥＧ記録。 ｒＡＡＶ－ｐＤｙｎ注入の２日前から４か月後までのカイニン酸注入動物の同側海馬及び運動皮質からのＥＥＧ記録によって得られた全般発作の頻度。ｐＤｙｎ＝配列番号１；Ｖａｒ．１＝配列番号２；Ｖａｒ．２＝配列番号３ 微量透析及びその後のＥＩＡによって測定された、異なる種類の刺激の間に放出されたプロセシングされたＤｙｎ Ｂ（Ｄｙｎ Ｂ＝配列番号８）の量。ｐＤｙｎノックアウトマウスに、実験の３週間前にｒＡＡＶ ｐＤｙｎ（ｐＤｙｎ＝配列番号１；Ｖａｒ．２＝配列番号３）を注入した。これらのマウスは内因性ｐＤｙｎを発現しないので、測定された全てのＤｙｎ Ｂはベクター由来である。 ｒＡＡＶで処置したナイーブ又はＫＡ注入動物の異なる群からのバーンズ（Barnes）迷路プローブテスト。記憶テストのために、迷路は４分割される。Ｑ１は、ターゲットホールを含むものであり、Ｑ２及びＱ４は、Ｑ１を囲む４分の１であり、及びＱ３は反対のものである。動物（Ｃに示すものを除く）は、ΔＧＦＰ又はｐＤｙｎ配列番号１のいずれかを発現するｒＡＡＶを注入された。Ａ及びＢでは、ｒＡＡＶを注入したが、カイニン酸による処置がされていないマウスについてのデータが示されている。パネルＣは、完全に未処置の動物を示す。パネルＤ、Ｅ及びＦは、パネルに記載されたようにカイニン酸後の時間間隔でカイニン酸の２週間後にｒＡＡＶにより処置された動物の同じ組を示す。 ｒＡＡＶで処置したナイーブ又はＫＡ注入動物の異なる群からのバーンズ（Barnes）迷路プローブテスト。記憶テストのために、迷路は４分割される。Ｑ１は、ターゲットホールを含むものであり、Ｑ２及びＱ４は、Ｑ１を囲む４分の１であり、及びＱ３は反対のものである。動物（Ｃに示すものを除く）は、ΔＧＦＰ又はｐＤｙｎ配列番号１のいずれかを発現するｒＡＡＶを注入された。Ａ及びＢでは、ｒＡＡＶを注入したが、カイニン酸による処置がされていないマウスについてのデータが示されている。パネルＣは、完全に未処置の動物を示す。パネルＤ、Ｅ及びＦは、パネルに記載されたようにカイニン酸後の時間間隔でカイニン酸の２週間後にｒＡＡＶにより処置された動物の同じ組を示す。 ｒＡＡＶで処置したナイーブ又はＫＡ注入動物の異なる群からのバーンズ（Barnes）迷路プローブテスト。記憶テストのために、迷路は４分割される。Ｑ１は、ターゲットホールを含むものであり、Ｑ２及びＱ４は、Ｑ１を囲む４分の１であり、及びＱ３は反対のものである。動物（Ｃに示すものを除く）は、ΔＧＦＰ又はｐＤｙｎ配列番号１のいずれかを発現するｒＡＡＶを注入された。Ａ及びＢでは、ｒＡＡＶを注入したが、カイニン酸による処置がされていないマウスについてのデータが示されている。パネルＣは、完全に未処置の動物を示す。パネルＤ、Ｅ及びＦは、パネルに記載されたようにカイニン酸後の時間間隔でカイニン酸の２週間後にｒＡＡＶにより処置された動物の同じ組を示す。 ペンチレンテトラゾールは、ＧＡＢＡ_A受容体の阻害剤であり、尾静脈への注入時に発作を誘導する。ｐＤｙｎ欠損動物は、野生型マウスと比較して発作閾値の低下を示す。これは、Ｄｙｎ Ｂによる処置によって救うことができる。３位のグリシンのアラニンによる置換を有するＤｙｎ Ｂ変異体（Ｄｙｎ Ｂ＝配列番号８、Ｄｙｎ Ｂ Ｇ３Ａ＝配列番号１１、ここで、３位のＺはアラニンである、Ｄｙｎ Ｂ Ｇ３Ａ＋Ｑ８Ａ＝配列番号１１、ここで、３位のＺはアラニンであり、かつ配列番号１１の８位のＺはアラニンである、Ｄｙｎ Ｂ Ｑ８Ａ＝配列番号１１、ここで、８位のＺはアラニンである）は、この試験においてより高い効力を示し、より低い濃度のこれらペプチドが、抗けいれん効果を引き出すことができることを示唆している。このことから、本発明者らは、遺伝子治療の効果が早期に発現し、患者１人当たりに必要なベクター数が少なることを期待する。

以下の実施形態は本発明の主題である。

１．プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含む送達ベクターであって、前記プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体が、以下の群から選択される配列：
ａ．配列番号７（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２０７－２２３）であるＤｙｎ Ａ、あるいは最初の１３ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体、又は最初の８ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体、
ｂ．配列番号８（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２３８）である、Ｄｙｎ Ｂ、
ｃ．配列番号９（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２５４）である、ロイモルフィン、
ｄ．配列番号７に係るＤｙｎ Ａの変異体であって、配列番号７のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＩ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
ｅ．配列番号８に係るＤｙｎ Ｂの変異体であって、配列番号８のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
ｆ．配列番号９に係るロイモルフィンの変異体であって、配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
の少なくとも１つを含む、送達ベクター。

２．変異体が、それぞれ、配列番号７のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＩ）、配列番号８のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）又は配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１に記載の送達ベクター。

３．変異体が、それぞれ、配列番号７、配列番号８又は配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ内で、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１又は実施形態２に記載の送達ベクター。

４．実施形態１から３のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含み、斯かるＤＮＡ配列が、以下の群から選択される変異体の配列：
ａ．配列番号１０（ＹＧＺＦＬＲＲＺＲＰＫＬＫＷＤＮＱ）
ｂ．配列番号１１（ＹＧＺＦＬＲＲＺＦＫＶＶＴ）
ｃ．配列番号１２（ＹＧＺＦＬＲＲＺＦＫＶＶＴＲＳＱＥＤＰＮＡＹＳＧＥＬＦＤＡ）
の少なくとも１つを含み、ここで、Ｚは、任意のアミノ酸を表し、好ましくは少なくとも１つが置換されている、送達ベクター。

５．実施形態１から４のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体をコードする複数のＤＮＡ配列を含み、ここで、配列番号７、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体に係る配列が、ペプチダーゼ認識シグナルに隣接している、送達ベクター。

６．実施形態１から５のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体をコードする複数のＤＮＡ配列を含み、ここで、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体に係る配列が、ペプチダーゼ認識シグナルに隣接している、送達ベクター。

７．実施形態１から６のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、配列番号８及び／又は配列番号９又はその変異体をコードする複数のＤＮＡ配列を含み、かつ、前記送達ベクターが、配列番号６及び／又は７をコードするＤＮＡを含まない、送達ベクター。

８．実施形態１から７のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、配列番号２又は配列番号１４をコードするＤＮＡを含む、送達ベクター。

９．実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、配列番号３又は配列番号１５をコードするＤＮＡを含む、送達ベクター。

１０．実施形態１から９のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターがさらに組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノム又は組み換えレンチウイルスゲノムを含む、送達ベクター。

１１．組み換えＡＡＶベクターを含む実施形態１から１０のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、好ましくは前記ベクターが、ヒト又は霊長類血清型ベクターである、送達ベクター。

１２．組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムを含む実施形態１から１１のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記ベクターが、ヒト血清型ベクターであり、斯かるヒト血清型ベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、１１、１２、１３、１４、蛇行性ＡＡＶ、祖先ＡＡＶ、又はそれらに由来するＡＡＶカプシド突然変異体を含む群から選択され、好ましくは血清型１又は２である、送達ベクター。

１３．先行する実施形態のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記ベクターが、一本鎖ＡＡＶベクター又は自己相補的（又は二量体）二本鎖ベクターである、送達ベクター。

１４．先行する実施形態のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列が、治療効果を得るために、目的の遺伝子産物の十分な発現を生じるプロモーター及び／又はエンハンサーを含む発現制御エレメントに動作可能に連結され、ここで、プロモーター及び／又はエンハンサーは、以下を含む群：構成的活性プロモーター、例えばＣＭＶ－又はＣＢＡプロモーター（ニワトリベータアクチンプロモーター及びヒトサイトメガロウイルスＩＥ遺伝子エンハンサー）、あるいは、誘導性プロモーター、これは、Gene Switch、ｔｅｔ－オペロン由来プロモーター、又は、例えばホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、シナプシン－１ プロモーター（ＳＹＮ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）由来のニューロン特異的プロモーターを含む、から選択される、送達ベクター。

１５．先行する実施形態のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターがさらに、転写後調節エレメント、好ましくはウッドチャック－肝炎ウイルス－転写後調節エレメントを含む、送達ベクター。

１６．先行する実施形態のいずれか一つに記載の送達ベクターを含む、組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

１７．前記送達ベクターがさらに組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含み、かつ前記ｒＡＡＶベクターゲノムがＡＡＶカプシドにカプシド形成されているか、あるいは、前記送達ベクターがさらに組み換えレンチウイルスベクターゲノムを含み、かつレンチウイルス粒子にパッケージングされている、実施形態１６に記載の組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

１８．中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入するのに十分な条件下で、細胞と、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームとを接触させること、を含む、方法。

１９．プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体が産生され、細胞から放出される、実施形態１８に記載の方法。

２０．中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入するのに十分な条件下で、細胞と、実施形態１８又は１９に記載の組み換えウイルス粒子又はリポソームとを接触させること、を含む、方法。

２１．プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体が産生され、細胞から放出される、実施形態２０に記載の方法。

２２．医薬としての使用のための、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

２３．対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

２４．対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記ベクターが、脳の神経細胞の形質導入に適している、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

２５．対象の焦点性てんかんの治療における使用のための、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記ベクター又は組み換えウイルス粒子が、末梢投与あるいは頭蓋内又は脳内又は髄腔内投与に適している、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

２６．実施形態１から１７のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子、及び任意により薬学的に許容される担体を含有する、医薬組成物。

２７．実施形態１から１７のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス又はリポソーム粒子により、好ましくはインビトロ又はエクスビボで、感染した細胞。

２８．焦点性てんかんを有する対象を治療する方法であって、対象に、実施形態１から１７及び２６のいずれか一つに定義された送達ベクター、組み換えウイルス粒子、又は医薬組成物を投与すること、を含む、方法。

２９．前記方法が、実施形態１８から２１に定義された方法のいずれかを含む、実施形態２８に記載の方法。

３０．実施形態１から１５に記載の送達ベクターのいずれかに由来する、ヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチド。

３１．ヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチドであって、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２のペプチドを含む群から選択される、ペプチド。

さらなる実施形態が本発明の主題である。

１．プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含む送達ベクターであって、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体であるプレプロペプチドを駆動し、ここで、前記プレプロペプチドが、シグナルペプチドを含み、かつ一方で、前記プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体が、以下の群から選択される配列：
ａ．配列番号７（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２０７－２２３）であるＤｙｎ Ａ、あるいは最初の１３ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体又は最初の８ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体、
ｂ．配列番号８（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２３８）である、Ｄｙｎ Ｂ、
ｃ．配列番号９（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２５４）である、ロイモルフィン、
ｄ．配列番号７に係るＤｙｎ Ａの変異体であって、配列番号７のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＩ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号７に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＩ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
ｅ．配列番号８に係るＤｙｎ Ｂの変異体であって、配列番号８のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号８に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＱ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
ｆ．配列番号９に係るロイモルフィンの変異体であって、配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号９に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＱ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
の少なくとも１つを含む、送達ベクター

２．変異体が、それぞれ、配列番号７のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＩ）、配列番号８のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）又は配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１に記載の送達ベクター。

３．変異体が、それぞれ、配列番号７、配列番号８又は配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ内で、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１又は実施形態２に記載の送達ベクター。

４．実施形態１から３のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体であるプレプロペプチドを駆動し、ここで、前記プレプロペプチドが、シグナルペプチドを含み、かつ一方で、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含み、前記プレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列が、以下の群から選択される変異体の配列：
ａ．配列番号１０（ＹＧＺＦＬＲＲＺＲＰＫＬＫＷＤＮＱ）
ｂ．配列番号１１（ＹＧＺＦＬＲＲＺＦＫＶＶＴ）
ｃ．配列番号１２（ＹＧＺＦＬＲＲＺＦＫＶＶＴＲＳＱＥＤＰＮＡＹＳＧＥＬＦＤＡ）
の少なくとも１つを含み、
ここで、Ｚは、任意のアミノ酸を表し、かつ、ａ．；ｂ．又はｃ．に係る配列内の少なくとも１つのＺは、好ましくは、ａ．；ｂ．又はｃ．に係る配列による前記ダイノルフィン断片の野生型配列と比較した場合に、別のアミノ酸によって置換されている、送達ベクター。

５．前記送達ベクターが、さらに、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノム又は組み換えレンチウイルスゲノムを含む、実施形態１から４のいずれか一つに記載の送達ベクター。

６．組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムを含む、実施形態１から５のいずれか一つに記載の送達ベクターであって、前記ベクターがヒト血清型ベクターであり、斯かるヒト血清型ベクターが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、１１、１２、１３、１４、蛇行性ＡＡＶ、祖先ＡＡＶ、又はそれらに由来するＡＡＶカプシド突然変異体を含む群から選択され、好ましくは血清型１又は２である、送達ベクター。

７．先行する実施形態のいずれか一つに記載の送達ベクターを含む、組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

８．前記送達ベクターが、さらに組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含み、かつ前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシドにカプシド形成されているか、あるいは、前記送達ベクターが、さらに組み換えレンチウイルスベクターゲノムを含み、かつレンチウイルス粒子にパッケージングされている、実施形態７に記載の組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

９．中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入するのに十分な条件下で、細胞と、実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームとを接触させること、を含む、方法。

１０．医薬としての使用のための、実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

１１．対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターの活性化を提供し、それによって発作を阻害する、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

１２．対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターの活性化を提供し、それによって発作を阻害し、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターに対するアゴニスト作用を有するペプチドのオンデマンド放出（on-demand release）をもたらす、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

１３．実施形態１０から１２のいずれか一つに記載の、対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記ベクター又は組み換えウイルス粒子が、末梢投与あるいは頭蓋内又は脳内又は髄腔内又は実質内投与に適している、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

１４．実施形態１０から１３のいずれか一つに記載の、対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、脳内適用され、好ましくは焦点適用される、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。

１５．実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム、及び任意により薬学的に許容される担体を含有する、医薬リリースオンデマンド組成物（pharmaceutical release-on-demand composition）。

１６．実施形態１から８のいずれか一つに記載の送達ベクター又は組み換えウイルス又はリポソーム粒子により、好ましくはインビトロ又はエクスビボで、感染した細胞。

１７．焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんを有する対象を治療する方法、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作を予防する方法であって：
対象に、実施形態１から８に定義された送達ベクター、組み換えウイルス粒子、又は医薬組成物を投与すること、を含み、好ましくは前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームは、プレプロペプチドをコードし、斯かるプレプロペプチドは、成熟及び放出後に、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターの活性化を提供し、それによって発作を阻害し、並びに、好ましくは前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームは、脳内適用され、好ましくは焦点適用される、方法。

１８．実施形態１から６のいずれか一つに記載の送達ベクターのいずれかに由来するヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチドであって、好ましくは前記ペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を有するペプチドを含む群から選択される、ペプチド。

１９．ヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチドであって、前記ペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を有するペプチドを含む群から選択される、ペプチド。

２０．実施形態１８又は１９に記載のペプチドを含有する、医薬リリースオンデマンド組成物。

参考文献
Ausubel, F. M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Wiley (1989)
Berns K.I. and C.R. Parrish in FIELDS VIROLOGY, eds. D.N. Knipe and P.M. Howley, volume 2, chapter 57 (6th ed., 2013, Wolters-Kluwer, Lippincott Williams & Wilkins Publishers).
Coatsworth JJ. Studies on the clinical effect of marketed antiepileptic drugs. 1971. NINDS Monograph 12
de Lanerolle NC,Williamson A,Meredith C,Kim JH,Tabuteau H,Spencer DD, Brines ML. Dynorphin and the kappa 1 ligand [3h]u69,593 binding in the human epileptogenic hippocampus. 1997. Epilepsy Res 28:189-205.
Engel JJ. Mesial temporal lobe epilepsy: What have we learned? 2001. Neuroscientist 7:340-352.
Gambardella A,Manna I,Labate A,Chifari R,Serra P,La Russa A,LePiane E,Cittadella R,Andreoli V,Sasanelli F,Zappia M,Aguglia U, Quattrone A. Prodynorphin gene promoter polymorphism and temporal lobe epilepsy. 2003. Epilepsia 44:1255-1256.
Gossen M and Bujard H, (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracyclin-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51.
Gossen M, Freundlieb S, Bender G, Muller G, Hillen W and Bujard H, (1995) Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science 268(5218):1766-9.
Grimm D, Kay MA, Kleinschmidt JA (2003) Helper virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of serotypes 1 to 6, Mol Ther 7(6) 839-50
Harvey DM, Caskey CT (1998) Inducible control of gene expression: prospects for gene therapy. Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-8.
Henriksen SJ,Chouvet G,McGinty J, Bloom FE. Opioid peptides in the hippocampus: Anatomical and physiological considerations. 1982. Ann N Y Acad Sci 398:207-220.
Huser D, Gogol-Doring A, Chen W, Heilbronn R (2014) Adeno-associated virus type 2 wild-type and vector-mediated genomic integration profiles in human diploid fibroblasts analyzed by 3^rd generation PacBio DNA sequencing. J Virol l88 (19): 11253-11263
Loacker S,Sayyah M,Wittmann W,Herzog H, Schwarzer C. Endogenous dynorphin in epileptogenesis and epilepsy: Anticonvulsant net effect via kappa opioid receptors. 2007. Brain 130:1017-1028.
Loftus SK, Erickson RP, Walkley SU, Bryant MA, Incao A, Heidenreich RA, Pavan WJ (2002), Rescue of neurodegeneration in Niemann-Pick C mice by a prion promoter-driven Npc1 cDNA transgene. Hum. Mol. Genet. 11:3107-14.
Loscher W, Schmidt D. Modern antiepileptic drug development has failed to deliver: Ways out of the current dilemma. 2011. Epilepsia 52:657-678.
Magari SR Rivera VM, Iulicci JD, Gilman M, Cerasoli F Jr, (1997) Pharmacologic control of a humanized gene therapy system implanted into nude mice J. Clin. Invest. 100:2865-72
McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ (2001) Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis, Gene Ther 8(16) 1248-54
McNamara JO. Emerging insights into the genesis of epilepsy. 1999. Nature 399:A15-22.
Mietzsch M, Broecker F, Reinhardt A, Seeberger PH, Heilbronn R (2014) Differential adeno-associated virus serotype-specific interaction patterns with synthetic heparins and other glycans. J Virol 88: 2991-3003
Mietzsch M, Grasse S, Zurawski C, Weger S, Bennett A, Agbandje-McKenna M, Muzyczka N, Zolotukhin S, Heilbronn R (2014) OneBac: Platform for scalable and high-titer production of adeno-associated virus serotype 1-12 vectors for gene therapy. Hum Gene Ther 25: 212-222
Muzyczka (1992) Use of adeno-associated virus as a general transduction vector for mammalian cells. Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129).
No D, Yao TP Evans RM (1996) Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3346.-51
Pillay S, Meyer NL, Puschnik AS, Davulcu O, Diep J, Ishikawa Y, Jae LT, Wosen JE, Nagamine CM, Chapman MS, Carette JE (2016) Nature 530 (7588) 108-12.
Pirker S,Gasser E,Czech T,Baumgartner C,Schuh E,Feucht M,Novak K,Zimprich F, Sperk G. Dynamic up-regulation of prodynorphin transcription in temporal lobe epilepsy. 2009. Hippocampus 19:1051-1054.
Rosenzweig A (2007), Vectors for Gene Therapy. In: Current Protocols in Human Genetics. Wiley John and Sons, Inc.: DOI: 10.1002/0471142905.hg1200s52.
Schunk E,Aigner C,Stefanova N,Wenning G,Herzog H, Schwarzer C. Kappa opioid receptor activation blocks progressive neurodegeneration after kainic acid injection. 2011. Hippocampus 21:1010-1020.
Schwarzer C. 30 years of dynorphins--new insights on their functions in neuropsychiatric diseases. 2009. Pharmacol Ther 123:353-370.
Siggins GR,Henriksen SJ,Chavkin C, Gruol D. Opioid peptides and epileptogenesis in the limbic system: Cellular mechanisms. 1986. Adv Neurol 44:501-512.
Simonato M, Romualdi P. Dynorphin and epilepsy. 1996. Prog Neurobiol 50:557-583.
Solbrig MV,Adrian R,Chang DY, Perng GC. Viral risk factor for seizures: Pathobiology of dynorphin in herpes simplex viral (hsv-1) seizures in an animal model. 2006. Neurobiol Dis 23:612-620.
Spencer S, Huh L. Outcomes of epilepsy surgery in adults and children. 2008. Lancet Neurol 7:525-537.
Stogmann E,Zimprich A,Baumgartner C,Aull-Watschinger S,Hollt V, Zimprich F. A functional polymorphism in the prodynorphin gene promotor is associated with temporal lobe epilepsy. 2002. Ann Neurol 51:260-263.
Stutika C, Gogol-Doring A, Botschen L, Mietzsch M, Weger S, Feldkamp M, Chen W, Heilbronn R (2015) A comprehensive RNA-Seq analysis of the adeno-associated virus type 2 transcriptome reveals novel AAV transcripts, splice variants, and derived proteins. J Virol 90(3) 1278-89
Takahashi M,Senda T,Tokuyama S, Kaneto H. Further evidence for the implication of a kappa-opioid receptor mechanism in the production of psychological stress-induced analgesia. 1990. Jpn J Pharmacol 53:487-494.
Tani M, Fuentes ME, Petersen JW, Trapp BD, Durham SK, Loy JK, Bravo R, Ransohoff RM, Lira SA (1996) Neutrophil infiltration, glial reaction, and neurological disease in transgenic mice expressing the chemokine N51/KC in oligodendrocytes. J. Clin. Invest. 98:529-39.
Toll, L., Berzetei-Gurske, I. P., Polgar, W. E., Brandt, S. R., Adapa, I. D., Rodriguez, L., et al. (1998). Standard binding and functional assays related to medications development division testing for potential cocaine and opiate narcotic treatment medications. NIDA Res Monogr 178, 440-466.
Tortella FC. Endogenous opioid peptides and epilepsy: Quieting the seizing brain? 1988. Trends Pharmacol Sci 9:366-372.
Wang Y, DeMayo FJ, Tsai SY, O'Malley BW (1997) Ligand-inducible and liver-specific target gene expression in transgenic mice. Nat. Biotech. 15:239-43
Wang Y, Xu J, Pierson T, O'Malley BW, Tsai SY (1997) Positive and negative regulation of gene expression in eucaryotic cells with an inducible transcriptional regulator. Gene Ther, 4:432-41.
Xiao X, Li J, Samulski RJ (1998) Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus, JVirol 72(3) 2224-32
Zangrandi L, Burtscher J, MacKay J, Colmers W, & *Schwarzer C* (2016) The G-protein biased partial kappa opioid receptor agonist 6’-GNTI blocks hippocampal paroxysmal discharges without inducing aversion. British J Pharmacol, 173(11):1756-67,doi: 10.1111/bph.13475

実施例１
１．１ ＡＡＶコンストラクト
ＡＡＶ２－ＩＴＲ隣接ベクター骨格を有するプラスミドは、ヒトＣＭＶ－ＩＥ遺伝子、続いてニワトリベータアクチンプロモーターの切断型を含んでいた。これらは、全長コドン最適化ヒトｐｐｄｙｎ配列（ＡＡ配列番号１）、あるいは変異体（ＡＡ配列番号２；配列番号３）又は切断変異体（ΔＧＦＰ）のいずれか又はＥＧＦＰの全長形式の発現を駆動する。遺伝子発現は、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後エンハンサーエレメント（ＷＰＲＥ）、続いてウシ成長ホルモンに由来するｐｏｌｙ Ａ⁺シグナル配列によって増強された。ＡＡＶ２ ＩＴＲは、ｓｓＤＮＡゲノムを有するＡＡＶベクターを得るために、その野生型立体配置であるか、あるいは、ｄｓＤＮＡゲノムを有する自己相補的ＡＡＶベクターが生じるように、１つのＩＴＲが切断された（図１）。

１．２ ＡＡＶベクター調製
ＨＥＫ ２９３細胞を、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに２５～３３％の密集度で播種した。細胞を、リン酸カルシウムのコトランスフェクションによって２４時間後にトランスフェクトした。ＡＡＶベクターは、本質的に他に記載されたように産生した（Mietzsch、Grasse et al.、2014）。簡潔には：ＡＡＶ ｒｅｐ、ｃａｐ、Ａｄ５ヘルパー遺伝子のためのプラスミド、及び上述したｐｐｄｙｎ（配列番号１）又はその変異体（配列番号２；配列番号３）を発現するｒＡＡＶのためのプラスミドを用いる、２プラスミド（ｐＤＧ）コトランスフェクションプロトコル。培地を、ＦＣＳ含有量が減少した（２％）培地によって１２時間後に交換した。培養物を、細胞溶解のために３回の凍結溶解サイクルでトランスフェクションの７２時間後に回収した。粗溶解物を、２５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて３７℃で１時間消化して、インプット及びパッケージングされていないプラスミドＤＮＡを分解し、８，０００ｇで３０分間遠心分離して、細胞残屑をペレット化した。

１．３ ｒＡＡＶ精製
ｒＡＡＶベクターを、血清型１又は２カプシドにパッケージングし、そして、ベンゾナーゼ処理した清澄凍結融解上清から、１ステップヘパリンセファロースクロマトグラフィーによって、又はＡＶＢセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって、ＡＫＴＡ精製機（GE Healthcare）で１ｍｌの予め充填されたＨｉＴｒａｐカラムを用いて、以下のようにして精製した：凍結溶解上清を、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び２．５ｍＭのＫＣｌで補充した１・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１・ＰＢＳＭＫ）中で１：１希釈した後に、０．５ｍｌ／分でカラムにロードした。カラムを、１ｍｌ／分の速度で２０ｍｌの１・ＰＢＳ－ＭＫで洗浄した。ＡＡＶベクターを、１ｍｌ／分の速度で０．１Ｍの酢酸ナトリウム及び０．５ＭのＮａＣｌ ｐＨ２．５を用いて溶出し、１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ１０を用いて直ちに中和する。精製したｒＡＡＶ調製物を、Slide-A-Lyzer透析カセット（10,000 MWCO;Thermo Scientific）を用いて１ｘＰＢＳ－ＭＫに対して透析した（Mietzsch、Grasse et al.、2014）。

１．４ ｒＡＡＶベクター調製物の定量化
高度に精製されたｒＡＡＶベクター調製物を、プロテイナーゼＫを用いて２時間５６℃で消化した。ＤＮＡを、フェノール及びクロロホルムで繰り返し抽出することによって精製し、エタノールで沈殿させた。カプシド放出ＡＡＶゲノムの連続希釈物を、定量的Light-Cycler PCRによって、Fast Start DNA Master SYBR Green kit（Roche）を用いて分析した。ＰＣＲプライマーは、ベクター骨格のウシ成長ホルモン遺伝子由来ｐｏｌｙＡ部位に特異的であった（５’－ＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣ－３’及び５’－ＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣ－３’）。高度に精製されたＡＡＶ調製の力価を、ＡＡＶ－ＤＮＡ含有ゲノム粒子（ｇｐ）／ｍｌとして測定した（Mietzsch、Grasse et al.、2014）。

実施例２
動物
本研究では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ野生型及びｐＤｙｎノックアウト（ｐＤｙｎ－ＫＯ）マウスを調査した。ｐＤｙｎ－ＫＯマウスを、１０世代にわたってＣ５７ＢＬ／６Ｎバックグラウンド上に戻し交配した（Loacker et al.、2007）。飼育及び維持のために、マウスを食餌及び水に自由にアクセスできるようにして群に分けた。温度を２３℃及び６０％湿度に固定し、１２時間の明暗サイクル（午前７時間から午後７時まで点灯）とした。動物に関わる全ての手順は、実験及び他の科学目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約ＥＴＳ番号：１２３に従った、オーストリア動物実験倫理委員会、及びカナダ動物管理委員会によって、承認された。使用される動物の数を最小限にするためにあらゆる努力が成された。

実施例３
カイニン酸注入及び電極移殖
雄マウス（１２～１４週）をケタミン（160 mg/kg、i.p.;Graeub Veterinary Products、Switzerland）で鎮静させ、次いで精密気化器（precise vaporizer）（Midmark、USA）を通してセボフルランで深く麻酔した。マウスに、以前に記載されたように(Loacker et al.、2007）、５０ｎｌの２０ｍＭのＫＡ溶液を海馬に注入した（ＲＣ －１．８０ｍｍ；ＭＬ＋１．８０ｍｍ；ＤＶ －１．６０ｍｍ）。２つの電極（１つは皮質電極及び１つは深部電極）を、ＫＡ投与直後に埋め込んだ。エポキシラート被覆タングステン深部電極（直径２５０μｍ；ＦＨＣ、ＵＳＡ）を、ＣＡ１領域に向けて海馬に配置した（ＲＣ －１．８０ｍｍ；ＭＬ＋１．８０ｍｍ；ＤＶ －１．６０ｍｍ）。表面電極は、運動皮質の上部の頭蓋骨内に配置した金めっきネジであり（ＲＣ＋１．７０ｍｍ；ＭＬ＋１．６ｍｍ、ブレグマ（bregma）を基準点として）、異常なＥＥＧ活動の発生をモニタリングした。追加の表面電極を、基準及び参照として小脳上に配置した。電極を歯科用アクリレート（Heraeus Kulzer GmbH、Germany）で所定の位置に固定した。

実施例４
ｒＡＡＶ注入
ｒＡＡＶ投与を必要とする実験のために、ガイドカニューレを移植し、これは海馬深部電極に取り付けられた。全ての動物は、麻酔処置として手術の２０分前にメロキシカム（２ｍｇ／ｋｇ）を受けた。ｒＡＡＶ注入のために、動物を、注入の間（２０分）セボフルランチャンバー内で穏やかに麻酔した。注入は、注入ポンプを有するガイドカニューレを介して、０，１μＬ／分の流量で行われ、２μＬの総容量を注入した。

実施例５
ＥＥＧ記録及び分析
ＥＥＧは、無線記録装置（Neurologger、TSE、Germany）を用いて得られ、SciWorks Software（Datawave Technologies、USA）を用いて自動的に分析された。ＥＥＧを、７０ｍｓ未満続く高振幅放電（＞３×ベースライン）として定義されるてんかん様スパイクについてフィルタリングした。スパイクトレイン（Spike trains）を、１Ｈｚよりも高い頻度でかつ少なくとも１秒間続く少なくとも３つのスパイクの発生として定義した（図２参照）。より低い頻度のスパイクは発作間スパイクとしてカウントした。長期海馬発作性放電（ｈｐｄ）を、最小で１０秒間続くスパイクトレインとして定義した（Zangrandi et al.、2016）。海馬深部及び運動皮質表面電極における高電圧ＥＥＧ異常についての共出現によって、全般発作を視覚的に評価した（図３参照）。

実施例６
空間記憶テスト（バーンズ迷路）
ナイーブ及び処置動物の学習及び記憶を評価するために、バーンズ迷路を使用した。バーンズ迷路は、その外周に２０個の穴が開いた平らな丸テーブル（直径１００ｃｍ）上で、６０ルクスで行われた。それらのうち、１つのみがマウスを迷路から退避の暗い箱へと脱出させる。視覚的手がかりを９０°の間隔でディスクの周りに置いた。初日は馴化日であり、標的の穴を開けて、マウスを５分間迷路を自由に探索させた。退避箱の位置は実験全体を通して一定に保った。マウスが穴を見つけると、箱は閉じられ、動物は２分間そこに維持されて、退避箱を安全な場所として関連付けさせた。動物が５分間の間に標的の穴を見つけられなかった場合、動物はやさしく穴へと導かれた。次の４日間に習得を行った。最大３分の試験を３回行い、マウスが穴を見つけるとすぐに、マウスを２分間内側に保持した。３分後にマウスが穴を見つけられなかった場合、マウスをやさしく穴へと導いた。動物によって成された主要なエラー及び穴を見つけるための潜時を計算し、学習基準として定義した。プローブ試験を６日目に行った。全ての穴を閉じ、マウスを５分間迷路を自由に探索させた。評価のためにボードを四分円に分割し、各四分円に費やされた時間を測定した（図５参照）。以前に開かれた退避穴を含んでいた四分円は、Ｑ１と呼ばれ、これはＱ２及びＱ４に隣接し、Ｑ３はＱ１に対向している。

実施例７
微量透析
微量透析を、微量透析実験の３週間前に上述のように一方の海馬にｒＡＡＶ－ｐＤｙｎ注入を受けたｐＤｙｎ－ＫＯ動物に対して行った。ベクター注入の時点で（ＲＣ －１．８０ｍｍ；ＭＬ＋１．８０ｍｍ；ＤＶ －１．６０ｍｍ）、動物に刺激電極（ＲＣ －４．２０ｍｍ；ＭＬ＋３．２０ｍｍ；ＤＶ －４．９０ｍｍ）、及びｒＡＡＶ注入海馬の門を標的とするガイドカニューレを埋め込んだ。微量透析のために、ＭＡＢ－２プローブ（SciPro、Sanborn、NY）を海馬内に配置し、人工ＣＳＦ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ；３．０ｍＭのＫＣｌ；１．２５ｍＭのＣａＣｌ₂；１．０ｍＭのＭｇＣｌ₂；１．２ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄；０．３ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄；３ｍＭのグルコース、ｐＨ ７．２）によって０．４μＬ／分の流量で洗い流した。ＡＣＳＦを、３ｘ２５分、続いて２５分の低頻度刺激について集めた（３００μＡ；１０秒間隔で孤立した０．３ｍｓｅｃ方形波、ＩＳＯ－ＳＴＩＭ ０１Ｄ、ＮＰＩ、Ｔａｍｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。さらに２５分のベースライン後、２５分の高頻度刺激を行った（１５０μＡ；１秒間に２０ ｍｓｅｃ離れた０．３ｍｓｅｃ方形波のトレイン；トレインは１０秒によって分離された）。

実施例８
ダイノルフィンＢ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）
微量透析実験の溶出液中の処理されたダイノルフィンＢの含有量を、特定のＤｙｎ Ｂ（配列番号８）ＥＩＡ（S-1429;Peninsula;San Carlos、CA）によって、製造業者のマニュアルに従って測定した。簡潔には、試料を抗血清と共に１時間インキュベートし、Ｂｔ－トレーサーと一晩のインキュベートに続く。２日目に、ストレプトアビジン－ＨＲＰを、ＥＩＡ緩衝液を用いて５回洗浄した１時間後に添加した。さらに５回の洗浄後に、試料を５分間ＴＭＢ溶液と反応させ、次に、プレートリーダーで４５０ｎｍで分析した。Ｄｙｎ Ｂ（配列番号８）含有量を、並行して行った較正試料に基づいて分析し、ｎｇ／ｍｌとして表す（図４参照）。

実施例９
統計分析
取得後に、pClamp 10.3（Molecular devices）を用いて電気生理学的記録を観察し分析した。Ｍａｃ用のPrism 5（version 5.0f）を使用して、インビボ実験の統計分析を行い、数値を作成した。統計分析のために、Dunnett事後検定を用いた一元配置分散分析（one-way ANOVA）をインビボ実験に適用した。電気生理学のために、両側の対応のあるｔ検定を、得られた膜電位分析に適用し、一元配置分散分析を使用して、ＩＰＳＣに対する薬物効果を比較した。０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。

実施例１０
発作閾値
発作閾値は、発作を起こしやすいことの尺度である。発作誘導剤又は刺激に対する抵抗性は、動物における読み出し（readout）として使用される。齧歯類の尾静脈へのＧＡＢＡ_A受容体アンタゴニストであるペンチレンテトラゾールの注入は、発作閾値を測定するために認められた方法である。物質又は処置の抗けいれん作用は、適用時の発作閾値の増大によって実証され得る。ｐＤｙｎ欠損マウスは、野生型マウスよりも低い発作閾値を示す。これは、κオピオイド受容体アゴニストによって救うことができる。

自由に動くｐＤｙｎ欠損マウスに対して、１００μｌ／分の速度でのペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）（図６参照）尾静脈注入（１００μｇ／ｍｌの生理食塩水中のＰＴＺ、ｐＨ７．４）によって、発作閾値を決定した。動物が全般間代発作（generalized clonic seizures）を示した際に、注入を停止した。発作閾値用量を、体重に対する注入量から計算した。Ｄｙｎ Ｂ又は修飾されたその変異体を、ＤＭＳＯに溶解し、１０％ＤＭＳＯ、３％Ｔｗｅｅｎ ８０の最終濃度を含有する生理食塩水中で最終用量に希釈した。３μｌのペプチド溶液を３０分適用した。尾静脈注入前に、大槽内に軽いセボフルラン麻酔下とした。以下のペプチドを試験した：Ｄｙｎ Ｂ＝配列番号８、Ｄｙｎ Ｂ Ｇ３Ａ＝配列番号１１、ここで、３位のＺはアラニンである、Ｄｙｎ Ｂ Ｇ３Ａ＋Ｑ８Ａ＝配列番号１１、ここで、３位のＺはアラニンであり、かつ配列番号１１の８位のＺはアラニンである、Ｄｙｎ Ｂ Ｑ８Ａ＝配列番号１１、ここで、８位のＺはアラニンである。

Claims (20)

1. プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含む送達ベクターであって、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体であるプレプロペプチドの発現を駆動し、ここで、前記プレプロペプチドが、シグナルペプチドを含み、かつ一方で、前記プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体が、以下の群から選択される配列：
   ａ．配列番号７（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２０７－２２３）であるＤｙｎ Ａ、あるいは最初の１３ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体、又は最初の８ＡＡ（Ｎ末端から最初の）からなるその変異体、
   ｂ．配列番号８（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２３８）である、Ｄｙｎ Ｂ、
   ｃ．配列番号９（配列番号１；ｐｐＤｙｎのＡＡ ２２６－２５４）である、ロイモルフィン、
   ｄ．配列番号７に係るＤｙｎ Ａの変異体であって、配列番号７のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＩ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号７に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＩ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
   ｅ．配列番号８に係るＤｙｎ Ｂの変異体であって、配列番号８のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号８に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＱ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
   ｆ．配列番号９に係るロイモルフィンの変異体であって、配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、すなわち、配列番号９に含まれる配列ＹＧＧＦＬＲＲＱ内で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異体、
   の少なくとも１つを含む、送達ベクター。
2. 前記変異体が、それぞれ、配列番号７のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＩ）、配列番号８のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）又は配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ（ＹＧＧＦＬＲＲＱ）内で、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の送達ベクター。
3. 前記変異体が、それぞれ、配列番号７、配列番号８又は配列番号９のＮ末端から数えて最初の８ＡＡ内で、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１又は請求項２に記載の送達ベクター。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の送達ベクターであって、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体であるプレプロペプチドを駆動し、ここで、前記プレプロペプチドが、シグナルペプチドを含み、かつ一方で、前記送達ベクターが、プレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を含み、前記プレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列が、以下の群から選択される変異体の配列：
   ａ．配列番号１０（ＹＧＺＦＬＲＲＺＲＰＫＬＫＷＤＮＱ）、
   ｂ．配列番号１１（ＹＧＺＦＬＲＲＺＦＫＶＶＴ）、
   ｃ．配列番号１２（ＹＧＺＦＬＲＲＺＦＫＶＶＴＲＳＱＥＤＰＮＡＹＳＧＥＬＦＤＡ）、
   の少なくとも１つを含み、
   ここで、Ｚは、任意のアミノ酸を表し、かつ、ａ．；ｂ．又はｃ．に係る配列内の少なくとも１つのＺは、好ましくは、ａ．；ｂ．又はｃ．に係る配列による前記ダイノルフィン断片の野生型配列と比較した場合に、別のアミノ酸によって置換されている、送達ベクター。
5. 前記送達ベクターが、さらに、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノム又は組み換えレンチウイルスゲノムを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の送達ベクター。
6. 組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の送達ベクターであって、前記ベクターがヒト血清型ベクターであり、前記ヒト血清型ベクターが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、１１、１２、１３、１４、蛇行性（serpentine）ＡＡＶ、祖先ＡＡＶ、又はそれらに由来するＡＡＶカプシド突然変異体を含む群から選択され、好ましくは血清型１又は２である、送達ベクター。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の送達ベクターを含む、組み換えウイルス粒子又はリポソーム。
8. 前記送達ベクターが、さらに組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含み、かつ前記ｒＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶカプシドにカプシド形成されているか、あるいは、前記送達ベクターが、さらに組み換えレンチウイルスベクターゲノムを含み、かつレンチウイルス粒子にパッケージングされている、請求項７に記載の組み換えウイルス粒子又はリポソーム。
9. 中枢神経系の細胞に核酸を送達する方法であって、プレプロダイノルフィン又はプレプロダイノルフィン変異体をコードするＤＮＡ配列を前記細胞に導入するのに十分な条件下で、前記細胞と、請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームとを接触させること、を含む、方法。
10. 医薬としての使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。
11. 対象の焦点性てんかん（focal epilepsy）、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、てんかん原性焦点（epileptogenic focus）におけるヒトκオピオイドレセプターの活性化を提供し、それによって発作を阻害する、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。
12. 対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターの活性化を提供し、それによって発作を阻害し、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターに対するアゴニスト作用を有するペプチドのオンデマンド放出（on-demand release）をもたらす、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。
13. 請求項１０から１２のいずれか一項に記載の、対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記ベクター又は組み換えウイルス粒子が、末梢投与あるいは頭蓋内又は脳内又は髄腔内（intrathecal）又は実質内投与に適している、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。
14. 請求項１０から１３のいずれか一項に記載の、対象の焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんの治療における使用のための、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作の予防における使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームであって、前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームが、脳内適用され、好ましくは焦点適用（applied focal）される、送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム。
15. 請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソーム、及び任意により薬学的に許容される担体を含有する、医薬リリースオンデマンド組成物（pharmaceutical release-on-demand composition）。
16. 請求項１から８のいずれか一項に記載の送達ベクター又は組み換えウイルス又はリポソーム粒子により、好ましくはインビトロ又はエクスビボで、感染した細胞。
17. 焦点性てんかん、特に内側側頭葉てんかんを有する対象を治療する方法、又は、焦点性てんかんを患う対象のてんかん発作を予防する方法であって：
    対象に、請求項１から８のいずれか一項に定義された送達ベクター、組み換えウイルス粒子、又は医薬組成物を投与すること、を含み、好ましくは前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームは、プレプロペプチドをコードし、前記プレプロペプチドは、成熟及び放出後に、てんかん原性焦点におけるヒトκオピオイドレセプターの活性化を提供し、それによって発作を阻害し、ここで、好ましくは前記送達ベクター又は組み換えウイルス粒子又はリポソームは、脳内適用され、好ましくは焦点適用される、方法。
18. 請求項１から６のいずれか一項に記載の送達ベクターのいずれかに由来するヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチドであって、好ましくは前記ペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を有するペプチドを含む群から選択される、ペプチド。
19. ヒトκオピオイドレセプター（ＫＯＲ）に対するアゴニスト作用を有するペプチドであって、前記ペプチドが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を有するペプチドを含む群から選択される、ペプチド。
20. 請求項１８又は１９に記載のペプチドを含有する、医薬リリースオンデマンド組成物。

Images