CN113646436A - 腺相关病毒对cln3多核苷酸的递送 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及对蜡样脂褐质沉积症神经元3(CLN3)多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)递送。本公开提供了rAAV和使用所述rAAV对神经元蜡样脂褐质沉积症或CLN3‑巴藤病进行CLN3基因疗法的方法。
Description
本申请要求于2019年2月4日提交的美国临时专利申请第62/800,911号的优先权，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
通过引用对序列表的并入
本申请含有作为公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：53576_SeqListing.txt；26，705字节-于2020年1月31日创建的ASCII文本文件)，所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及对蜡样脂褐质沉积症神经元3(CLN3)多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)递送。本公开提供了rAAV和使用rAAV用于神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)或CLN3-巴藤病的CLN3基因疗法的方法。
背景技术
神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)是一组严重的神经退行性疾病。
CLN3基因的突变导致幼年NCL或CLN3-巴藤病(Kitzmü等人，《人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)》2008；17(2)：303-312；Munroe等人，《美国人类遗传学杂志(Am J Hum Genet.)》1997；61：310-316)，也被称为Spielmeyer-Sjogren-Vogt病。突变干扰溶酶体贮积清除过程。此时，已经描述了67种引起疾病的突变。然而，85％的患者是1.02kb缺失的纯合子，导致外显子7和外显子8的缺失。在患者中发现的CLN3突变主要导致蛋白质(battenin)的丰度或功能降低。
CLN3-巴藤病的典型发病年龄在4岁到7岁之间，具有潜在的但快速进展的视力丧失。患有幼年NCL的儿童在数月内从视力正常变为失明，但在若干年之后可以维持明暗感知。认知和运动衰退通常在接下来(7岁到10岁)伴随行为问题，如好斗性(8岁到10岁)，并且然后癫痫发作(10岁到12岁)。帕金森氏病(Parkinsonian)的特征发展在11-13岁之间。在疾病的后期阶段，已经报道了个体中的心脏传导异常。在患有CLN3-巴藤病的个体中存在高表型变异性，但是所有患者都具有共同的低视力或进行性失明。此外，已经在82名患者中验证的统一巴藤病评定量表(UBDRS)的物理分量表示出了每年稳定并且可测量的下降2.86点(2.27-3.45，p＜0.0001)。从症状发作到寿命结束，平均存活期通常为15年。
CLN3-巴藤病的治疗措施范围广泛，旨在努力减轻疾病。这些包含如靶向AMPA受体的EGIS-8332和他仑帕奈(talampanel)等药物疗法；允许通读过早停止突变的药物；有助于分解积累的存储材料(半胱胺酒石酸氢盐(cystagon)/半胱胺(cysteamine))的药物；以及甚至免疫抑制疗法(霉酚酸酯(mycophenolate)、泼尼松龙(prednisolone))。还评估了酶替代和干细胞疗法。虽然已经研究了许多治疗方法，但很少有人在临床环境中进行评估。没有可用于减缓进展或治愈疾病的方法。患者和家属依靠治疗来改善症状和姑息治疗。
Cln3Δex7/8小鼠模型创建于21世纪初，用于模仿CLN3-巴藤病患者中最常见的致病突变：从CLN3基因中消除外显子7和8的大约1kb突变(Cotman等人，《人类分子遗传学》2002；11(22)：2709-2721；Mole等人，《欧洲儿科神经学杂志(Eur J Paediatr Neurol.)》2001；5：7-10)。所述突变在85％的患者中以纯合方式发现，并且在另外15％的患者中作为杂合突变与另一个等位基因上的点突变组合发现。预测外显子丢失会产生移码突变，导致活性丧失或降低的截短的蛋白质产物(Lerner等人，《细胞(Cell)》1995年9月22日；82(6)：949-57；Kitzmüller等人，《人类分子遗传学》2008年1月15日；17(2)：303-12)。在最初的研究中，Cotman等人证明了CLN3Δex7/8小鼠模型成功地概括了CLN3疾病的若干个方面。CLN3Δex7/8动物在不同时间点在神经系统中积累自发荧光储存材料和ATP合酶亚单位C，并且在10个月大时开始在脑中展现出星形胶质细胞反应性。随后的研究详述了小脑中谷氨酸受体功能的改变，与加速旋转棒测定中的运动缺陷相对应(Cotman等人，《人类分子遗传学》2002；11(22)：2709-2721)。在行为方面，Cln3Δex7/8小鼠已经在年轻和成熟时间点进行了表征，其中在初生的和年轻成年小鼠中观察到神经发育运动迟缓，并且在10个月到12个月大时观察到步态和后肢紧扣的缺陷(Cotman等人，《人类分子遗传学》2002；11(22)：2709-2721；Osório等人，《基因大脑和行为(Genes Brain Behav.)》2009年4月；8(3)：337-345)。CLN3Δex7/8小鼠似乎没有显现出功能性视觉障碍，但与12个月大的小鼠对照相比存在轻微的存活缺陷(Cotman等人，《人类分子遗传学》2002；11(22)：2709-2721；Seigel等人，《分子和细胞神经科学(MolCell Neurosci.)》2002年4月；19(4)：515-27)。总之，携带最常见人类突变的Cln3Δex7/8小鼠模型展现出与CLN3-巴藤病一致的许多细胞和行为变化，使其成为用于测试疗法的合适模型。
因此，本领域仍然有治疗CLN3-巴藤病的需求。
发明内容
本文提供了使用重组AAV进行CLN3基因疗法的方法和产品。
本文提供了编码CLN3多肽的重组腺相关病毒9(rAAV9)，其包括rAAV9基因组，所述rAAV9基因组以5′到3′的顺序包括：P546启动子和编码所述CLN3多肽的多核苷酸。在一些实施例中，所述rAAV9基因组包括自身互补型基因组。在一些实施例中，所述rAAV9基因组包括单链基因组。
提供了自身互补型重组腺相关病毒9(scAAV9)，其编码SEQ ID NO：1中所示的CLN3多肽，其中所述scAAV9的基因组以5′到3′的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQID NO：3的序列的P546启动子；编码SEQ ID NO：1中所示的CLN3多肽的多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列。编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸可以与SEQ ID NO：2至少90％相同。
还提供了具有以5′到3′的顺序包括以下的基因组的scAAV9：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ ID NO：3的序列的P546启动子；SV40内含子；编码SEQ ID NO：1的CLN3多肽的多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列；具有以5′到3′的顺序包括以下的基因组的scAAV9：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ ID NO：3的序列的P546启动子；编码SEQ IDNO：1的所述CLN3多肽的多核苷酸；牛生长激素多腺苷酸化poly A序列；以及第二AAV末端反向重复序列。在示例性实施例中，所述scAAV9具有包括SEQ ID NO：4中所示的基因盒的基因组。
提供了单链重组腺相关病毒9(ssAAV9)，其编码SEQ ID NO：1中所示的CLN3多肽，其中所述ssAAV9的基因组以5′到3′的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ IDNO：3的序列的P546启动子；编码SEQ ID NO：1中所示的CLN3多肽的多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列。编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸可以与SEQ ID NO：2至少90％相同。还提供了具有以5′到3′的顺序包括以下的基因组的ssAAV9：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ ID NO：3的序列的P546启动子；SV40内含子；编码SEQ ID NO：1的CLN3多肽的多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列；具有以5′到3′的顺序包括以下的基因组的ssAAV9：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ ID NO：3的序列的P546启动子；编码SEQ ID NO：1的所述CLN3多肽的多核苷酸；牛生长激素多腺苷酸化poly A序列；以及第二AAV末端反向重复序列。
SEQ ID NO：4中所示的核酸序列是图1A中提供的基因盒。提供了具有scAAV9基因组或ssAAV9基因组的rAAV9，其包括与SEQ ID NO：4的核酸序列至少90％相同或与SEQ IDNO：4的核酸序列至少95％相同或与SEQ ID NO：4的核酸序列至少98％相同的核酸序列。
还提供了包括第一AAV末端反向重复序列、包括SEQ ID NO：3的序列的P546启动子、编码SEQ ID NO：1的CLN3多肽的核酸序列和第二AAV末端反向重复序列的核酸分子。在一些实施例中，编码CLN3多肽的多核苷酸与SEQ IDNO：2至少90％相同。
还提供了包括以下的核酸分子：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ ID NO：3的核苷酸序列的P546启动子；SV40内含子；编码SEQ ID NO：1的所述CLN3多肽的核酸序列；以及第二AAV末端反向重复序列。另外提供了包括以下的多核苷酸：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ ID NO：3的核苷酸序列的P546启动子；编码SEQ ID NO：1的所述CLN3多肽的核酸；牛生长激素多腺苷酸化poly A序列；以及第二AAV末端反向重复序列。在提供的任何多核苷酸中，所述CLN3多肽可以由SEQ ID NO：2中示出的核酸序列或与SEQ ID NO：2至少90％相同的序列编码。
提供了包括任何多核苷酸的rAAV9、scAAV9或ssAAV9。还提供了具有单链基因组的rAAV。
进一步提供了编码CLN3多肽的rAAV9病毒颗粒，其中rAAV9基因组以5′到3′的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；包括与SEQ ID NO：3至少90％相同的核酸序列的P546启动子；编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％相同的CLN3多肽的多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列。提供的rAAV9颗粒可以包括编码CLN3多肽的多核苷酸，其包括与SEQID NO：1至少90％相同的氨基酸序列。另外，rAAV9病毒颗粒可以包括AAV9基因组，所述AAV9基因组包括与SEQ ID NO：4的核酸序列至少90％相同、与SEQ ID NO：4的核酸序列至少95％相同或与SEQ ID NO：4的核酸序列至少98％相同的核酸序列。任何rAAV9病毒颗粒可以进一步包括SV40内含子和/或BGH poly-A序列。
在所提供的任何rAAV、ssAAV和scAAV中，AAV末端反向重复序列可以是AAV2末端反向重复序列。
还提供了核酸分子，其包括rAAV9基因组，所述rAAV9基因组以5′到3′的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；包括与SEQ ID NO：3至少90％相同的核酸序列的P546启动子；以及编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％相同的CLN3多肽的多核苷酸。所提供的核酸分子可以包括自身互补型基因组或单链基因组。
进一步提供了核酸分子，其包括rAAV9基因组，所述rAAV9基因组以5′到3′的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；包括与SEQ ID NO：3至少90％相同的核酸序列的P546启动子；编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％相同的CLN3多肽的多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列。所提供的核酸分子可以包括编码CLN3多肽的多核苷酸，其包括与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。另外，核酸分子可以包括AAV9基因组，所述AAV9基因组包括与SEQ ID NO：4的核酸序列至少90％相同、与SEQ ID NO：4的核酸序列至少95％相同、与SEQ ID NO：4的核酸序列至少98％相同的核酸序列。提供的任何核酸分子可以进一步包括SV40内含子和/或BGH poly-A序列。
进一步提供了包括以下的组合物：本文所描述的scAAV9、本文所描述的ssAAV9、本文所描述的核酸分子或本文所描述的rAAV病毒颗粒以及至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，所述药学上可接受的赋形剂包括非离子低渗透化合物、缓冲液、聚合物、盐或其组合。在一些实施例中，所述聚合物是共聚物。在一些实施例中，所述共聚物是泊洛沙姆。例如，所述组合物可以至少包括药学上可接受的赋形剂，其包括非离子低渗透化合物。例如，药学上可接受的赋形剂包括约20到40％的非离子低渗透化合物或约25％到约35％非离子低渗透化合物。一种示例性组合物包括调配在20mM的Tris(pH为8.0)、1mM的MgCl2、200mM的NaCl、0.001％泊洛沙姆188和约25％到约35％的非离子低渗透化合物的scAAV。另一种示例性组合物包括调配在1X PBS和0.001％普郎尼克F68中的scAAV。
仍进一步提供了治疗受试者的CLN3-巴藤病的方法，所述方法包括向受试者施用包括治疗有效量的以下各项的组合物：本文公开的任何rAAV9病毒颗粒、本文公开的任何scAAV9、本文公开的任何ssAAV9、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物。
在所提供的任何方法中，组合物、rAAV9、ssAAV9、scAAV9和/或核酸分子通过选自由以下组成的组的途径施用：鞘内、脑室内、脑实质内、静脉内和其组合。
治疗有效量的本文公开的任何rAAV9病毒颗粒、本文公开的任何scAAV9、本文公开的任何ssAAV9、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何组合物用于制备用于治疗有需要的受试者的CLN3-巴藤病的药物的用途。
还提供了包括治疗有效量的以下各项的组合物：本文公开的任何rAAV9病毒颗粒、本文公开的任何scAAV9、本文公开的任何ssAAV9、本文所描述的任何核酸分子或所描述的用于治疗有需要的受试者的疗CLN3-巴藤病的任何组合物。
通过鞘内途径施用的scAAV9、ssAAV9或rAAV9的示例性剂量为每个受试者约1×1011vg的scAAV9、ssAAV9或rAAV9病毒颗粒到每个受试者约2×1015vg或者每个受试者约1×1011vg的scAAV9、ssAAV9或rAAV9病毒颗粒到每个受试者约1×1015vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒或者每个受试者约1×1012vg的scAAV9、ssAAV9或rAAV9病毒颗粒到每个受试者约1×1014vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒或者每个受试者约1×1012vg的scAAV9、ssAAV9或rAAV9病毒颗粒到每个受试者约1×1015vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒。例如，向受试者施用约1×1013vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒或者向受试者施用约1.5×1013vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒或者向受试者施用约3.4×1013vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒或者向受试者施用约6×1013vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒或者向受试者施用约1.2×1014vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒或者向受试者施用约2×1014vg的scAAV9、ssAAV9或AAV9病毒颗粒。
与治疗前的受试者或未经治疗的CLN3-巴滕病患者相比，用于治疗的方法、药物或组合物使受试者得到以下中的一种或多种：(a)自发荧光储存材料的溶酶体积累减少或减缓；(b)ATP合成酶亚单位C的溶酶体积累减少或减缓；(c)胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化减少或减缓；(d)星形细胞增生减少或减缓；(e)通过MRI测量的脑量损失减少或减缓；(f)癫痫发作减少或减缓；以及(g)稳定、进展减少或减缓或用于评估CLN3巴藤病的进展和/或改善的量表，例如统一巴藤病评定系统(UBDRS)评估量表或汉堡运动(Hamburg Motor)和语言量表中的一个或多个提高。在施用本文公开的rAAV9、ssAAV9或scAAV或核酸分子后，受试者可以保持在特伦德伦伯格位置(Trendelenberg position)。
仍进一步提供了治疗有需要的患者的CLN3疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者的脑或脊髓递送包括以下的组合物：本文提供的任何一种rAAV病毒、本文公开的任何scAAV9、本文公开的任何ssAAV9、本文所描述的任何核酸分子、本文所描述的任何组合物或本文所描述的任何药物。
在所提供的任何方法或用途中，组合物或药物可以通过鞘内、脑室内、脑实质内或静脉内注射或其组合来递送。所提供的任何方法可以进一步包括在鞘内注射本文公开的组合物、rAAV9病毒颗粒或scAAV或核酸分子后将患者置于特伦德伦伯格位置。
在所提供的任何方法或用途中，所述组合物或药物可以包括非离子低渗透造影剂。例如，所述组合物包括非离子低渗透造影剂，其中所述非离子低渗透造影剂选自由以下组成的组：碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰和其组合。
施用的所述组合物或药物可以包括药学上可接受的赋形剂。例如，药学上可接受的赋形剂包括约20到40％的非离子低渗透化合物或约25％到约35％的非离子低渗透化合物。一种示例性组合物包括调配在20mM的Tris(pH为8.0)、1mM的MgCl2、200mM的NaCl、0.001％泊洛沙姆188和约25％到约35％的非离子低渗透化合物的scAAV。另一种示例性组合物包括调配在1X PBS和0.001％普郎尼克F68中的scAAV。
在所提供的任何方法或用途中，当向脑或脊髓递送组合物或药物时，可以向脑干或可以向小脑或可以向视觉皮层或可以向运动皮层递送组合物。进一步地，在所提供的任何方法或用途中，当向脑或脊髓递送组合物或药物时，可以向神经细胞、胶质细胞或两者递送组合物。例如，其中递送到脑或脊髓包括递送到神经系统的细胞，如神经元、下运动神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、许旺细胞或其组合。
与治疗前的受试者或未经治疗的受试者相比，组合物或药物的方法、用途或施用使受试者得到以下中的一种或多种：(a)自发荧光储存材料的溶酶体积累减少或减缓；(b)ATP合成酶亚单位C的溶酶体积累减少或减缓；(c)胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化减少或减缓；(d)星形细胞增生减少或减缓；(e)通过MRI测量的脑量损失减少或减缓；(f)癫痫发作减少或减缓；以及(g)稳定、进展减少或减缓或用于评估CLN3巴藤病的进展和/或改善的量表，例如统一巴藤病评定系统(UBDRS)评估量表或汉堡运动和语言量表中的一个或多个提高。
本文的标题是为了方便读者而不是限制性的。
本文中“可能/可以(may)”和“可以(can)”的使用是描述权利要求书中包含的各个实施例，而不是指示权利要求书的范围的不确定性。
附图说明
图1提供了(图1A)scAAV9.P546.CLN3基因盒和(图1B)用于产生scAAV9.P546.CLN3的质粒构建体pAAV.P546.CLN3.KAN的示意图。在P546启动子的控制下，将人类CLN3 cDNA插入源自AAV2的末端反向重复序列(ITR)结构之间。SV40内含子(人类CLN3 cDNA的上游)和牛生长激素聚腺苷酸化(BGH Poly A)终止子序列(人类CLN3 cDNA的下游)有助于mRNA加工并且增强转基因表达。SEQ ID NO：5中示出了质粒构建体pAAV.P546.CLN3.KAN的序列。将基因组包装在AAV9衣壳蛋白中。
图2提供了显示在注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠中存在人类CLN3转录物的图像。
图3提供了显示在注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠中在注射后第2个月时ASM积累较早减少的图表。所有图表上所示的y轴表示ASM积累的总面积。黑色条表示野生型小鼠(WT-PBS)，浅灰色条表示注射PBS的CLN3Δex7/8小鼠，并且深灰色小鼠表示注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠。
图4提供了注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠的图表，其示出了在注射PBS的野生型小鼠(“WT”)、注射PBS的CLN3Δex7/8(“CLN3”)和注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8(“CLN3-AAV”)的各个脑区中注射后第4个月和第6个月ASM的积累强烈减少。
图5提供了图像和图表，其证明ICV施用scAAV9.P546.CLN3减少4个月龄和6个月龄CLN3Δex7/8小鼠脑中的线粒体蛋白ATP合酶亚单位C的异常溶酶体积累。上图中提供了针对ATP合酶亚单位C染色并且在6个月的时间点通过DAB染色可视化的冷冻组织切片的代表性图像。下图中的图表提供了在注射后4个月(4M)和6个月(6M)在皮层的躯体感觉1桶状场(S1BF)、在注射后4个月和6个月以及腹侧后内侧/腹侧后外侧核(VPM/VPL)，注射PBS的WT(“WT”)、注射PBS的CLN3Δex7/8(“CLN3”)以及注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8(“CLN3-AAV”)小鼠中亚单位C积累的定量。在未经治疗的CLN3Δex7/8与经scAAV9.P546.CLN3治疗的动物以及野生型动物之间，N＝5，p≤0.0001，在注射后4个月和6个月在SIBF中，野生型与经治疗的CLN3Δex7/8小鼠之间，p≤0.5。
图6提供了ICV施用scAAV9.P546.CLN3的图像和图表，其使4个月龄和6个月龄CLN3Δex7/8小鼠脑中的星形细胞增生减少。上图：针对作为活化星形胶质细胞标志物的GFAP进行染色并且通过DAB染色可视化的固定组织切片的代表性图像(6个月时间点)。下图：在注射后4个月和6个月，注射PBS的WT(“WT”)、注射PBS的CLN3Δex7/8(“CLN3”)以及注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8(“CLN3-AAV”)小鼠中GFAP阳性面积的定量。对于每组和时间点而言，N＝5。S1BF＝桶状皮层。VPM/VPL＝腹侧后内侧/腹侧后外侧核。
图7提供了ICV施用scAAV9.P546.hCLN3的图像和图表，其使4个月龄和6个月龄CLN3Δex7/8小鼠脑中的小胶质细胞活化减少。上图：针对作为活化小胶质细胞标志物的CD68进行染色并且通过DAB染色可视化的固定组织切片的代表性图像(6个月时间点)。下图：在注射后4个月和6个月，注射PBS的WT(“WT”)、注射PBS的CLN3Δex7/8(“CLN3”)以及注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8(“CLN3-AAV”)小鼠中CD68阳性面积的定量。对于每组和时间点而言，N＝5。S1BF＝桶状皮层。VPM/VPL＝腹侧后内侧/腹侧后外侧核。
图8提供了显示在直至注射后18个月，野生型和PBS或经治疗的CLN3Δex7/8小鼠的旋转棒分析的图表。所有小鼠不分性别(上图)、仅雄性(中图)、仅雌性(下图)。
图9提供了显示野生型以及经PBS或scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex78小鼠在达到18月龄时的Morris水迷宫性能的图表。所有小鼠(上图)、仅雄性(中图)、仅雌性(下图)。
图10提供了显示在经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠和经PBS治疗的小鼠在爬杆测定中的性能的图表。在爬杆测定中，将小鼠面朝上放置在垂直杆上，并且让其随着跌落次数转身和下降的时间来测量平衡和敏捷性。所有小鼠(上图)、仅雄性(中图)、仅雌性(下图)。
图11提供了显示与经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠相比，经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠通常自垂直杆跌落较少的图表。将小鼠面朝上放置在垂直杆上，并且在试图转身时测量跌落次数，以测量平衡和敏捷性。所有小鼠(上图)、仅雄性(中图)、仅雌性(下图)。
图12提供了显示在用scAAV9.P546.GFP注射后三周，免疫荧光蛋白质印迹发检测各个脑区以及外周小鼠组织中的GFP蛋白的图像。
图13提供了显示在鞘内腰椎注射3×1013vg的scAAV9.P546.CLN3后12周，对人类CLN3在四岁食蟹猴的各个脑区中的表达的逆转录定量PCR的图表。将所述值相对于腰椎脊髓4-7中的CLN3蛋白水平归一化。
图14提供了scAAV9.P546.CLN3基因盒的核酸序列(SEQ ID NO：4)。AAV2 ITR核酸序列以斜体显示(5′ITR如SEQ ID NO：6所示，并且3′ITR如SEQ ID NO：9所示)，P546启动子核酸序列(SEQ ID NO：3)用单线加下划线，SV40内含子核酸序列(SEQ ID NO：7)用双线加下划线，人类CLN3 cDNA序列(SEQ ID NO：2)的核酸序列用粗体表示，BGH polyA终止子的核酸序列(SEQ ID NO：8)用虚线加下划线。
图15提供了全长AAV.P546.CLN3的核酸序列(SEQ ID NO：5)。
图16提供了表明scAAV9.p546.CLN3治疗导致Cln3Δ7/8小鼠的大脑皮层和脊髓中hCLN3转录物表达水平增加，如通过qPCR测量的，直至24个月龄的数据。平均值±SEM，每个月的普通单向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图17提供了显示scAAV9.p546.CLN3治疗在Cln3Δ7/8小鼠的整个脑中产生稳定的hCLN3转录物，如通过RNAscope(红色荧光)测量的，直至24个月龄的图像。以20X拍摄的图像。
图18提供了表明scAAV9.p546.CLN3治疗在直至24个月龄的Cln3Δ7/8小鼠脑的两个区域中预防并减少ASM积累的数据。平均值±SEM，每个月的普通单向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍摄的图像。
图19提供了表明scAAV9.p546.CLN3治疗在直至24个月龄的Cln3Δ7/8小鼠脑的两个区域中预防大量亚单位C积累(ASM的成分)的数据。平均值±SEM，每个月的普通单向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍摄的图像。
图20提供了表明scAAV9.p546.CLN3治疗在直至24个月龄的Cln3Δ7/8脑的两个区域中预防星形胶质细胞活化(GFAP+)的数据。平均值±SEM，每个月的普通单向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍摄的图像。
图21提供了表明scAAV9.p546.CLN3治疗在直至24个月龄的Cln3Δ7/8脑的两个区域中预防一些小胶质细胞活化(CD68+)，这取决于时间点的数据。平均值±SEM，每个月的普通单向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍摄的图像。
图22提供了表明scAAV9.CB.CLN3治疗在预防6个月龄和12个月龄Cln3Δ7/8小鼠的各种巴藤病病理学方面类似地有效的数据。平均值±SEM，普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图23提供了表明Cln3Δ7/8没有红细胞异常的数据，如直至24个月龄所测量的。平均值±SEM，普通双向方差分析
图24提供了Cln3Δ7/8小鼠没有白细胞异常的数据，如直至24个月龄所测量的。平均值±SEM，普通双向方差分析
图25表明经scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月龄时基于性别在海马体的CA3区中显示出不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法(Tukey1s post-hoctest)的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图26表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在多个时间点基于性别在梨状皮层(PiriformCortex；PIRC)中显示出微妙的、不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图27表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在多个时间点基于性别在网状丘脑核(Reticular Thalamic Nucleus；RTN)中显示出不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图28表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在12个月时基于性别在躯体感觉皮层中显示出不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图29表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在12个月时基于性别在丘脑的VPM/VPL中显示出不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图30表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在12个月时基于性别在基底外侧杏仁核(Basolateral Amygdala；BLA)中显示出不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图31提供了scAAV9.p546.CLN3小鼠在12个月和18个月时基于性别在齿状回(DG)多形层中显示出不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图32表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在12个月和18个月时基于性别在缰核(Hab)中显示出不同水平的SubC积累。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图33提供了表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在12个月和18个月时基于性别在背内侧核(Mediodorsal Nucleus；MD)中显示出不同水平的SubC积累的数据。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图34表明scAAV9.p546.CLN3小鼠基于性别在后压部皮层(RetrosplenialCortex；RSC)中SubC积累水平没有差异。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图35表明scAAV9.p546.CLN3小鼠在6个月时基于性别在躯体感觉皮层(S1BF)中显示出不同水平的活化小胶质细胞(CD68+)。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图36表明scAAV9.p546.CLN3小鼠基于性别在VPM-VPL(丘脑)中显示出不同水平的小胶质细胞(CD68+)活化。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图37表明scAAV9.p546.CLN3小鼠基于性别在背内侧核(MD)中显示出不同水平的活化小胶质细胞(CD68+)。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图38表明scAAV9.p546.CLN3小鼠基于性别在内侧核(Submedial Nucleus；SM)中显示出不同水平的活化小胶质细胞(CD68+)。平均值±SEM，具有图基事后检验法的普通双向方差分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
具体实施方式
本公开提供了用于治疗CLN3-巴藤病的方法和产品。所述方法涉及使用rAAV作为基因递送载体将CLN3多核苷酸递送到受试者。
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度约为4.7kb，包含145个核苷酸的末端反向重复序列(ITR)并且可以用于指病毒本身或其衍生物。所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式，除非另有说明。存在多种血清型AAV。AAV的血清型各自与特定进化枝相关，其成员具有血清学和功能相似性。因此，进化枝也可以指AAV。例如，AAV9序列被称为“进化枝F”序列(Gao等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》，78：6381-6388(2004)。本公开设想在特定进化枝内使用任何序列，例如进化枝F。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401中提供以及Srivastava等人，《病毒学杂志》，45：555-564{1983)；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人，《病毒学杂志》78：6381-6388(2004)提供；AAV-10基因组在《分子疗法(Mol.Ther.)》，13(1)：67-76(2006)中提供；AAV-11基因组在《病毒学(Virology)》，330(2)：375-383(2004)中提供；AAV-12基因组的部分在Genbank登录号DQ813647中提供；AAV-13基因组的部分在Genbank登录号EU285562中提供。参见美国专利9,434,928中提供了AAVrh.74基因组的序列，所述美国专利通过引用并入本文。AAV-B1基因组的序列在Choudhury等人，《分子疗法》，24(7)：1247-1257(2016)中提供。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR中。三个AAV启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)与单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)结合导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep40)。Rep蛋白具有多种酶性质，所述酶性质最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性剪接和非共有转译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka，《当前微生物学和免疫学的话题(Current Topics inMicrobiology and Immunology)》，158：97-129(1992)中评论。
AAV具有独特的特征，这使其作为例如在基因疗法中将外源DNA递送到细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人类和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用如含有启动子、感兴趣的DNA和多腺苷酸化信号的基因盒等外源DNA替代。在一些情况下，rep和cap蛋白以反式提供。AAV的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。其易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃到65℃，持续数小时)，使AAV的冷保存不太重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。
如本文所使用的术语“AAV”是指野生型AAV病毒或病毒颗粒。术语“AAV”、“AAV病毒”和“AAV病毒颗粒”在本文中可互换使用。术语“rAAV”是指重组AAV病毒或重组感染性包封的病毒颗粒。术语“rAAV”、“rAAV病毒”和“rAAV病毒颗粒”在本文中可互换使用。
术语“rAAV基因组”是指源自已经修饰的天然AAV基因组的多核苷酸序列。在一些实施例中，已经修饰rAAV基因组以去除天然cap和rep基因。在一些实施例中，rAAV基因组包括内源性5′和3′末端反向重复序列(ITR)。在一些实施例中，rAAV基因组包括来自AAV血清型的ITR，所述AAV血清型不同于衍生AAV基因组的AAV血清型。在一些实施例中，rAAV基因组包括感兴趣的转基因(例如，编码CLN3的多核苷酸)，其通过末端反向重复序列(ITR)侧接在5′和3′末端。在一些实施例中，rAAV基因组包括“基因盒”。示例性基因盒在图1A中和SEQ IDNO：4的核酸序列中示出。rAAV基因组可以是自身互补型(sc)基因组，其在本文中称为“scAAV基因组”。可替代地，rAAV基因组可以是单链(ss)基因组，其在本文中称为“ssAAV基因组”。
术语“scAAV”是指包括自身互补型基因组的rAAV病毒或rAAV病毒颗粒。术语“ssAAV”是指包括单链基因组的rAAV病毒或rAAV病毒颗粒。
本文提供的rAAV基因组可以包括编码CLN3多肽的多核苷酸。CLN3多肽包括SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽，并且其编码具有CLN3活性的多肽(例如，与例如治疗前的患者相比，治疗时，溶酶体自发荧光储存材料的清除率增加、ATP合酶亚单位C的溶酶体积累减少、以及患者中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少中的至少一种)。
在一些情况下，本文提供的rAAV基因组包括编码CLN3多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多核苷酸，并且编码具有CLN3活性的多肽(例如，与例如治疗前的患者相比，治疗时，溶酶体自发荧光储存材料的清除率增加、ATP合酶亚单位C的溶酶体积累减少、以及患者中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少中的至少一种)。
在一些实施例中，本文提供的rAAV基因组包括编码具有CLN3活性的多肽，并且在严格条件下与SEQ ID NO：2的核酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸序列。术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交的严格性主要由温度、离子强度、以及如甲酰胺等变性剂的浓度确定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例包含但不限于0.015M氯化钠、65℃到68℃下0.0015M柠檬酸钠，或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和42℃下50％甲酰胺。参见例如，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)》，第2版，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(冷泉港，纽约1989)。
在一些实施例中，本文提供的rAAV基因组包括侧接编码CLN3多肽的多核苷酸的一个或多个AAV ITR。CLN3多核苷酸与转录控制元件(包含但不限于启动子、增强子和/或多腺苷酸化信号序列)可操作地连接，所述转录控制元件在靶细胞中起作用以形成基因盒。启动子的实例是鸡β肌动蛋白启动子和P546启动子。本文设想了其它启动子，包含但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。本文另外提供了SEQ ID NO：3中所示的P546启动子序列，和与SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的启动子序列，其是具有P546转录促进活性的启动子。转录控制元件的其它实例是组织特异性控制元件，例如，允许在神经元内特异性表达或在星形胶质细胞内特异性表达的启动子。实例包含神经元特异性烯醇酶和胶质原纤维酸性蛋白启动子。还设想了诱导型启动子。诱导型启动子的非限制性实例包含但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节的启动子。基因盒还可以包含内含子序列，以便在哺乳动物细胞中表达时促进CLN3 RNA转录物的加工。这种内含子的一个实例是SV40内含子。“包装”是指一系列细胞内事件，其导致AAV颗粒的组装和衣壳化。术语“生产”是指通过包装细胞生产rAAV(感染性的、包封的rAAV颗粒)的过程。
AAV“rep”和“cap”基因分别是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。
AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于AAV的各种这样的辅助病毒是本领域已知的，包含腺病毒、疱疹病毒和如牛痘病毒等痘病毒。腺病毒可以涵盖许多不同的亚组，尽管最常用的是亚单位C的5型腺病毒。许多人类、非人类哺乳动物和禽类的腺病毒是已知的并且可从如ATCC等存放处获得。疱疹病毒家族的病毒包含例如单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；这些也可以从如ATCC等存放处获得。
“一种或多种辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的一种或多种功能，其允许AAV复制和包装(结合本文所描述的复制和包装的其它要求)。如本文所描述的，“辅助病毒功能”可以以多种方式提供，包含通过提供辅助病毒或向反式生产细胞提供例如编码必需功能的多核苷酸序列。
本文提供的rAAV基因组缺乏AAV rep和cap DNA。本文设想的rAAV基因组(例如，ITR)中的AAVDNA可以来自适于衍生重组病毒的任何AAV血清型，包含但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74和AAV-B1。如上文所述，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。还设想了具有衣壳突变的rAAV。参见例如，Marsic等人，《分子疗法》，22(11)：1900-1909(2014)。本文还设想了修饰的衣壳，并且包含具有各种转译后修饰的衣壳，如糖基化和脱酰胺。天冬酰胺或谷氨酰胺侧链的脱酰胺作用导致天冬酰胺残基转化为天冬氨酸或异天冬氨酸残基，并且本文提供的rAAV衣壳中设想了谷氨酰胺向谷氨酸或异谷氨酸的转化。参见例如，Giles等人，《分子疗法》，26(12)：2848-2862(2018)。本文还设想了修饰的衣壳包括将rAAV导向受影响的组织和需要治疗的器官的靶向序列。
本文提供的DNA质粒包括本文所描述的rAAV基因组。可以将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如，腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配到具有AAV9衣壳蛋白的感染性病毒颗粒中。产生rAAV的技术是本领域的标准，其中将待包装的rAAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV颗粒的产生需要以下组分存在于单个细胞(在本文中表示为包装细胞)内：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即，不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任何可以衍生重组病毒的AAV血清型，并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型。假型rAAV的产生在例如WO 01/83692中公开，所述文献通过引用整体并入本文。在各个实施例中，可以修饰AAV衣壳蛋白以增强重组rAAV的递送。对衣壳蛋白的修饰通常是本领域已知的。参见例如US 2005/0053922和US 2009/0202490，所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。
生成包装细胞的方法是创建稳定表达rAAV产生的所有必需组分的细胞系。例如，包括缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组的质粒(或多个质粒)、与rAAV基因组分开的AAVrep和cap基因、以及如新霉素抗性基因等可选择的标志物可以整合到细胞的基因组中。可以通过如GC拖尾等程序将rAAV基因组引入细菌质粒中(Samulski等人，1982，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.S6.USA)》，79：2077-2081)，添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成连接子(Laughlin等人，1983，《基因(Gene)》，23：65-73)或通过直接平末端连接(Senapahy和Carter，1984，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，259：4661-4666)。然后可以用如腺病毒等辅助病毒感染包装细胞系。此方法的优点是细胞是可选择的并且适合于大规模生产rAAV。合适方法的其它非限制性实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞。
rAAV颗粒产生的一般原理在例如Carter，1992，《生物技术当前述评(CurrentOpinions in Biotechnology)》，1533-539；和Muzyczka，1992，《微生物学和免疫学的当前课题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》，158：97-129)中评论。各种方法描述于Ratschin等人，《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4：2072(1984)；Hermonat等人，《美国国家科学院院刊》，81：6466(1984)；Tratschin等人，《分子与细胞生物学》5：3251(1985)；McLaughlin等人，《病毒学杂志》，62：1963(1988)；以及Lebkowski等人，1988《分子与细胞生物学》，7：349(1988)。Samulski等人，(1989，《病毒学杂志》，63：3822-3828)；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365和对应美国专利第5,658.776号；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)《疫苗(Vaccine)》13：1244-1250；Paul等人(1993)《人类基因疗法(Human GeneTherapy)》4：609-615；Clark等人(1996)《基因疗法(Gene Therapy)》3：1124-1132；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；以及美国专利第6,258,595号中。前述文献在此通过引用整体并入本文，特别强调与rAAV颗粒产生有关的文献的那些部分。
本文进一步提供了产生感染性rAAV颗粒的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施例中，包装细胞可以是未转化的癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人类胚肾细胞)、MRC-5细胞(人类胚胎成纤维细胞)、WI-38细胞(人类胚胎成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。
本文还提供了包括本公开的rAAV基因组的rAAV(例如，感染性衣壳化的rAAV颗粒)。rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA，即在rAAV的基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。rAAV基因组可以是自身互补型(sc)基因组。具有sc基因组的rAAV在本文中称为scAAV。rAAV基因组可以是单链(ss)基因组。具有单链基因组的rAAV在本文中称为ssAAV。
本文提供的示例性rAAV是名为“scAAV9.P546.CLN3”的scAAV。scAAV9.P546.CLN3scAAV含有scAAV基因组，其包括在P546启动子(SEQ ID NO：3)控制下的人类CLN3 cDNA。scAAV基因组还包括SV40内含子(人类CLN3 cDNA的上游)和牛生长激素多腺苷酸化(BGHPolyA)终止子序列(人类CLN3 cDNA的下游)。此scAAV9.P546.CLN3基因盒的序列如SEQ IDNO：4中所示。scAAV基因组包装在AAV9衣壳中，并且包含AAV2 ITR(P546启动子上游的一个ITR和BGH Poly A终止子序列下游的另一个ITR)。
rAAV可以通过本领域标准方法纯化，如通过柱色谱法或氯化铯梯度。用于从辅助病毒中纯化rAAV的方法是本领域已知的，并且可以包含在例如Clark等人，《人类基因疗法》，10(6)：1031-1039(1999)；Schenpp和Clark，《分子医学方法(Methods Mol.Med.)》，69：427-443(2002)；美国专利第6,566,118号和WO 98/09657中公开的方法。
还提供了包括rAAV的组合物。组合物包括编码CLN3多肽的rAAV。组合物可以包含编码不同感兴趣的多肽的两种或更多种rAAV。在一些实施例中，rAAV是scAAV或ssAAV。
本文提供的组合物包括rAAV和药学上可接受的一种或多种赋形剂。可接受的赋形剂对受体无毒，并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包含但不限于缓冲液，如磷酸盐[例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)]、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、共聚物如泊洛沙姆188，普郎尼克(如普郎尼克F68)或聚乙二醇(PEG)。本文提供的组合物可以包括药学上可接受的水性赋形剂，其含有非离子低渗透化合物，如碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰，其中含有非离子的低渗透化合物的水性赋形剂可以具有下列特性中的一种或多种：约180mgI/mL，蒸气压渗透法测定的渗透压约为322mOsm/kg水，渗透压约为273mOsm/L，在20℃下绝对粘度为约2.3cp并且在37℃下为约1.5cp，并且在37℃下的比重为约1.164。示例性组合物包括约20到40％的非离子低渗透化合物或约25％到约35％的非离子低渗透化合物。一种示例性组合物包括调配在20mM的Tris(pH为8.0)、1mM的MgCl2、200mM的NaCl、0.001％泊洛沙姆188和约25％到约35％的非离子低渗透化合物的scAAV或rAAV病毒颗粒。另一种示例性组合物包括调配在1X PBS和0.001％普郎尼克F68中的scAAV。
在本公开的方法中待施用的rAAV的剂量将根据例如特定rAAV、施用方式、施用时间、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准的方法确定。剂量可以以病毒基因组(vg)为单位表示。本文设想的剂量包含约1×1011、约1×1012、约1×1013、约1.1×1013、约1.2×1013、约1.3×1013、约1.5×1013、约2×1013、约2.5×1013、约3×1013、约3.4×1013、约3.5×1013、约4×1013、约4.5×1013、约5×1013、约6×1013、约1×1014、约1.2×1014、约2×1014、约3×1014、约4×1014、约5×1014、约1×1015到约1×1016或更多个总病毒基因组。约1×1011到约1×1015vg、约1×1012到约1×1015vg、约1×1012到约1×1014vg、约1×1013到约6×1014vg和约6×1013到约1.2×1014vg的剂量也是可以设想的。本文例示的一个剂量是6×1013vg。本文例示的另一个剂量是1.2×1014。
提供了用rAAV转导靶细胞(包含但不限于神经系统、神经或胶质细胞的细胞)的方法。神经系统的细胞包含神经元、下运动神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、许旺细胞或其组合。
术语“转导”用于指通过本公开的复制缺陷型rAAV在体内或在体外向靶细胞施用/递送CLN3多核苷酸，导致受体细胞表达功能性多肽。用本公开的rAAV转导细胞导致由rAAV编码的多肽或RNA的持续表达。因此，本公开提供了通过鞘内、脑室内、脑实质内或静脉内途径或其任何组合向受试者施用/递送编码CLN3多肽的rAAV的方法。鞘内递送是指递送到脑或脊髓的蛛网膜下的空间。在一些实施例中，鞘内施用是通过脑池内施用。
鞘内施用在本文中举例说明。这些方法包含用本文所描述的一种或多种rAAV转导靶细胞(包含但不限于神经和/或神经胶质细胞)。在一些实施例中，将包括编码CLN3多肽的多核苷酸的rAAV病毒颗粒施用或递送到患者的脑和/或脊髓。在一些实施例中，将多核苷酸递送到脑。设想用于递送的脑区包含但不限于运动皮层、视觉皮层、小脑和脑干。在一些实施例中，将多核苷酸递送到脊髓。在一些实施例中，将多核苷酸递送到神经元或下运动神经元。多核苷酸可以递送到神经和神经胶质细胞。神经胶质细胞是小胶质细胞、少突胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施例中，将多核苷酸递送到许旺细胞。
在本文提供的方法的一些实施例中，在施用rAAV后(例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟或约20分钟)将患者保持在特伦德伦伯格位置(头向下位置)。例如，患者可以在头部向下位置倾斜约1度到约30度、约15度到约30度、约30度到约60度、约60度到约90度或约90度到约180度。
本文提供的方法包括将包括本文提供的rAAV的组合物的有效剂量或有效多剂量施用于有需要的受试者(例如，包含但不限于人类患者的动物)的步骤。如果在CLN3-巴藤病发展之前施用剂量，则施用是预防性的。如果在CLN3-巴藤病发展之后施用剂量，则施用是治疗性的。有效剂量是减轻(消除或减少)与疾病相关的至少一种症状的剂量，其减缓或阻止疾病的进展、减少疾病的程度、导致疾病的缓解(部分或全部)和/或延长生存期。与治疗前的受试者相比或与未治疗的受试者相比，本文提供的方法导致用于评估CLN3巴藤病的进展和/或改善的一种或多种量表的稳定化、进展减少或改善，例如统一的巴藤病评估系统(UBDRS)或汉堡运动和语言量表。UBDRS评估量表(如Marshall等人，《神经病学(Neurology)》2005 65(2)：275-279中所描述)[包含UBDRS物理评估量表、UBDRS癫痫发作评估量表、UBDRS行为评估量表、UBDRS能力评估量表、UBDRS症状发作序列和UBDRS临床总体印象(CGI)]；小儿生活质量量表(PEDSQOL)量表、运动功能、语言功能、认知功能和生存。与治疗前的受试者相比或与未治疗的受试者相比，本文提供的方法可以导致以下一种或多种：自发荧光储存材料的溶酶体积累减少或减缓、ATP合成酶亚单位C的溶酶体积累减少或减缓、减少或减缓胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化；减少或减缓星形细胞增生，并且示出了通过MRI测量的脑量损失减少或延迟。
还提供了组合疗法。如本文所使用的组合包含同时治疗或顺序治疗。本文所描述的方法与标准医学治疗的组合是特别设想的。进一步地，特别设想了根据本发明使用的组合物的组合(例如，scAAV9.P546.CLN3和本文公开的造影剂的组合)(同时治疗或顺序治疗)。
虽然设想了在出生后向有需要的受试者递送，但还设想了胎儿宫内分娩。
实例
虽然以下实例描述了具体实施例，但应理解，本领域的技术人员将想到变化和修改。因此，只有权利要求书中出现的这些限制才能适用于本发明。
在实例中，产生在P546启动子的控制下携带CLN3 cDNA的自身互补型AAV(命名为scAAV9.P546.CLN3)。P546启动子是MeCP2启动子的截短形式，允许转基因在神经元和星形胶质细胞两者中以中等水平表达。在CLN3Δex7/8敲入小鼠模型中测试这种基因疗法载体的功效，所述模型携带在人类患者中发现的最频繁突变。评估scAAV9.P546.CLN3在CLN3Δex7/8敲入小鼠模型、野生型小鼠和非人类灵长类动物体内的安全性和功效。来自小鼠和非人类灵长类动物的数据清楚地表明星形胶质细胞和神经元在整个脑和脊髓中的有效转导，包含深部脑结构，如丘脑、海马体、纹状体、杏仁核、髓质和小脑。
实例1
scAAV9.P546.CLN3的产生
由美国欧陆基因组学公司(Eurofin Genomics，USA)合成包含位于两个Not1限制性位点之间的人类CLN3(SEQ ID NO：2)的开放阅读框的DNA，并且然后将其插入基于双链AAV2-ITR的生产质粒中。图1示出了显示插入在AAV2 ITR之间的CLN3 DNA的质粒构建体的示意图[5′ITR如先前在McCarty等人，《基因疗法》8：1248-1254(2001)中所述被修饰以生成scAAV]。质粒构建体还包含P546启动子、SV40嵌合内含子和牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号。
scAAV9.P546.CLN3是在cGMP条件下通过使用基于双链AAV2-ITR的生产质粒的瞬时三重质粒转染程序产生的，其中编码如先前所述的Rep2Cap9序列的质粒[Gao等人，《病毒学杂志》，78：6381-6388(2004)]，连同在HEK293细胞中的腺病毒辅助质粒pHelper(加利福尼亚州圣克拉拉的Stratagene公司(Stratagene，Santa Clara，CA))。通过两个氯化铯密度梯度纯化步骤对病毒进行纯化，相对于PBS进行透析并且用0.001％普郎尼克-F68调配以防止病毒累积并在4℃下储存。使用Taq-Man技术通过定量PCR对所有scAAV制剂进行滴定。如通过4-12％十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳和银染色(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))对scAAV的纯度进行评估。
实例2
CLN3Δex7/8小鼠中CSF递送的scAAV9.P546.CLN3的长期功效研究
细胞靶向和表达
为了确认病毒引入的人类CLN3在小鼠中的表达和生物分布，将scAAV9.P546.CLN3调配在1x PBS和0.001％普郎尼克F68中或调配在20mM Tris(pH为8.0)、1mM MgCl2、200mMNaCl、0.001％泊洛沙姆188中，并且在出生36小时内通过脑室内(ICV)注射施用于CLN3Δex7/8小鼠，并且在不同时间点监测表达。注射等体积PBS的野生型和CLN3Δex7/8小鼠作为对照。使用NCH病毒载体核心滴度，有效施用剂量为2.2×1010vg/小鼠。
为了获得详细的脑生物分布曲线，使用RNAscope原位杂交技术来特异性地鉴定脑、颈部脊髓、胸椎脊髓和腰椎脊髓中的人类CLN3 mRNA。这项技术涉及使用RNA与特异性探针原位杂交以仅检测由scAAV9编码的人类转基因。与PBS注射的对照中没有信号相比，在注射后4个月和6个月观察到强信号，特别是在注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Aex7/8小鼠的皮层(区域A-C)中。所述分析表明，AAV9递送的CLN3转基因在脑的各个区域(包含皮层、丘脑、后脑、小脑和脊髓)中以足够的水平表达。在小脑中，浦肯野神经元(Purkinje neuron)中的信号特别强。在4个月和6个月时通过逆转录PCR在脑和脊髓的所有区域中还检测到转基因表达(图2)。
总之，对来自CLN3Δex7/8小鼠的组织进行的逆转录PCR数据和RNAscope分析证实，单次ICV注射scAAV9.P546.CLN3导致人类CLN3在注射后长达6个月内在整个脑和脊髓中的成功靶向和表达。这证实了scAAV9的ICV介导的递送对特异性靶细胞的有效性，所述靶细胞不成比例地参与CLN3-巴藤病的发病机理。CLN3Δex7/8小鼠模型中的表达数据在使用相同引物用于通过定量RT-PCR检测人类转基因的野生型小鼠研究中进一步得到证实。
递送scAAV9.P546.CLN3后的病理学改善
自发荧光储存材料(ASM)的积累
自发荧光储存材料(ASM)的积累是巴藤病进展的标志性组织学标志物(Mole等人，《生物化学与生物物理学报-疾病分子基础(Biochim Biophys Acta-Mol Basis Dis.)》2015；1852(10)：2237-2241；Cotman等人，《临床脂类学(Clin Lipidol.)》2012年2月；7(1)：79-91；Seehafer等人，《衰老神经生物学(Neurobiol Aging.)》2006；27：576-588)。ASM的积累是许多形式的巴藤病的疾病进展的强有力指标(Bosch等人，《神经科学杂志(JNeurosci.)》2016；36(37)：9669-9682；Morgan等人，《公共科学图书馆综合(PLoS One.)》2013；8(11)：e78694)。本文设想了ASM的减少用作成功治疗的指标。作为CLN3-巴藤病的最早可检测的疾病表现之一，ASM在2个月龄的CLN3Δex7/8小鼠的许多脑区中已经是可见的(图3)。
荧光像素区域的自动定量证实了在2个月龄时注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠的躯体感觉皮层和丘脑中积累的ASM的显著减少。由于在这个早期时间点，在经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠中观察到运动皮层和视觉皮层中ASM积累的更高变异性，对于这两个区域分析的统计能力更低。在注射后4个月和6个月，与经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠相比，所有四个脑区显示ASM积累的高度显著减少(图4)。当将注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠与野生型动物进行比较时，在注射后4个月在注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠的躯体感觉和视觉皮层中发现稍高的ASM水平，而在运动皮层和丘脑中在野生型与经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠之间没有发现显著差异。在注射后6个月，所有区域在野生型和经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠中显示出相当低的ASM水平，所述小鼠与经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠相比低得多，从而证实ASM积累的持续时间长且高效减少(p≤0.0001)。(每组N＝10只)，除了在经PBS与经scAAV9.P546.CLN3治疗的动物之间注射后4个月时的视觉皮层(p≤0.001)和6个月时的运动皮层(p≤0.001)外的所有动物，p≤0.0001。
线粒体蛋白ATP合酶亚单位C的积累
分析野生型和注射CLN3Δex7/8PBS或注射scAAV9.P546.CLN3的小鼠的脑组织的ATP合酶亚单位C的积累。在健康个体中，此蛋白质是线粒体膜中呼吸链的一部分，但是在患有巴藤病的患者中，蛋白质异常地在溶酶体中积累(Palmer等人，《美国医学遗传学杂志(Am JMed Genet.)》1992；42(4)：561-567)。在CLN3Δex7/8小鼠中，与野生型动物相比，丘脑腹侧后内侧核和腹侧后外侧核4个月时亚单位C积累明显(VPM/VPL区)，脑区经常在NCL小鼠模型中受到影响(Morgan等人，《公共科学图书馆综合》2013；8(11)：e78694；Pontikis等人，《疾病神经生物学(Neurobiol Dis.)》2005；20(3)：823-836)。虽然未经治疗的动物在躯体感觉皮层和丘脑的VPM/VPL区域中显示出积累的ATP合酶sub C的强信号，但是经scAAV9.P546.CLN3治疗的动物在注射后4个月和6个月显示与野生型动物相当的最小信号(图5)(经PBS与经scAAV9.P546.CLN3治疗的动物之间p≤0.0001)。
胶质细胞和星形胶质细胞活化
除了存储材料的异常积累和ATP合酶sub C的积累之外，人类患者和动物模型中疾病进展的其它组织学标志物包含星形胶质细胞和小胶质细胞的活化(Cotman等人，《人类分子遗传学》2002；11(22)：2709-2721；Morgan等人，《公共科学图书馆综合》2013；8(11)：e78694；Pontikis等人，《疾病神经生物学》2005；20(3)：823-836；Palmer等人，《美国医学遗传学杂志》1992；42(4)：561-567)。具体地，反应性小胶质细胞被引发释放如IL1-β26等促炎介质，这可能是CLN3-巴藤病晚期神经元细胞死亡的关键原因。通过在4个月和6个月时间点染色胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，在VPM/VPL丘脑和躯体感觉皮层切片中鉴定活化的星形胶质细胞。对于躯体感觉皮层，在躯体感觉皮层的皮层IV内的桶状皮层中进行定量。图6中示出了注射后6个月的代表性图像。
治疗之后4个月和6个月的GFAP阳性区域的定量显示，与注射PBS的CLN3Δex7/8小鼠相比，注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠的两个脑区中的星形胶质细胞活化显著降低(图6)。尽管与经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠相比，在这些脑区中注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3Δex7/8小鼠中的GFAP染色水平低得多，但是对于所分析的大多数区域，其在注射后4个月和6个月均保持在高于野生型水平。
还使用抗CD68染色作为活化小胶质细胞的标志物，在VPM/VPL和躯体感觉皮层切片中确定胶质细胞活化。CD68是溶酶体蛋白，其在引发如吞噬作用等促炎功能的细胞中上调(Seehafer等人，《神经免疫学杂志(J Neuroimmunol.)》2011；230：169-172)。与用星形胶质细胞观察到的类似，4个月后，与注射PBS的CLN3Δex7/8小鼠相比，注射AAV9的CLN3Δex7/8小鼠中的VPM/VPL和躯体感觉皮层区中的胶质活化显著降低(图7)。在躯体感觉皮层中，用scAAV9.P546.CLN3治疗使CD68染色降低到与野生型小鼠相当的水平。在6个月的时间点，在VPM/VPL区中，与经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠相比，在经scAAV9.P546.CLN3治疗的小鼠中的CD68染色水平没有显著改善，然而，在经scAAV9.P546.CLN3治疗的小鼠的躯体感觉皮层中反应性胶质仍有显著减少(图7)。
递送scAAV9.P546.CLN3后的行为改善
在人类CLN3-巴藤病患者中，神经缺陷(如运动和认知功能障碍)与早期发作疾病变体，如CLN3-巴藤病(晚期婴儿巴藤病)相比变得明显晚得多，这可能是由于截短的CLN3蛋白的残余功能(Kitzmüller等人，《人类分子遗传学》2008年1月15日；17(2)：303-12)。表型的这种延迟也存在于CLN3Δex7/8小鼠模型中。在scAAV9.P546.CLN3的功效研究中，从2个月龄开始，并且以2个月的间隔持续，对小鼠进行一系列行为测试范例，包含：加速旋转棒测定和爬杆以测试运动功能和协调，以及Morris水迷宫来评估学习和记忆。当前，动物在注射后被跟踪10个月，并且正在进行研究。表征这种小鼠模型的先前出版物指示神经发育行为的初始延迟，随后是归一化，并且之后在约10-12个月龄时开始下降(Osório等人，《基因大脑和行为(Genes Brain Behav.)》2009年4月；8(3)：337-345)。
旋转棒分析显示在直至注射后18个月野生型与PBS或经治疗的CLN3Δex7/8小鼠之间没有统计学显著差异。
每2个月进行一次旋转棒测定。将小鼠置放在加速轮上并且测量直到小鼠跌落的时间。在每个时间点，在上午训练小鼠并且在下午4小时后进行测试。与先前公开的数据不同，在直至注射后18个月，没有观察到野生型小鼠和PBS CLN3Δex7/8小鼠的表现的显著差异(Bosch等人，《神经科学杂志》2016；36(37)：9669-9682)。然而，在雌性WT小鼠对经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠，在注射后2个月观察到跌落潜伏期的显著差异。与先前数据相比的这种差异最可能存在于测试方案的设计和/或外壳中的环境因素。本研究中使用的当前方案是在每个时间点仅在一天测试动物，而先前公开的数据在4天的时间跨度内重复测试。此外，与先前公开的数据(4小时休息对2小时休息)相比，本研究中使用的方案以稍低的起始速度(36rpm对40rpm)进行并且在早晨训练与下午测试期之间具有更长的时间间隔进行。此外，训练设置也有所不用：而在先前研究中，小鼠仅在早上以恒定的5rpm在车轮滑转上进行训练持续5分钟，当前研究中的动物使用与然后在下午测试中应用的非常相同的设置进行训练，这导致车轮每2秒加速0.3rpm。总之，直至注射后18个月，与具有所描述设置的野生型动物(图8，上图)相比，在未经治疗的小鼠或经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠中未观察到保持加速转棒轮的能力的缺陷。
Morris水迷宫分析显示在注射后2个月、4个月、16个月和18个月野生型与CLN3Δex7/8小鼠之间的统计学显著差异。
在Morris水迷宫测试中，将动物放置在含有隐藏平台的充满水的池中。在训练之后，测量动物使用环境线索来定位隐藏平台的时间被测量为学习和记忆能力的标志。在注射后2个月和4个月，在野生型动物与经PBS或经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠之间观察到统计学差异，这表明在疾病的这个时间点，通过这项测试可测量的学习和记忆受损，从而导致动物找到隐藏平台的潜伏期。此外，在16个月和18个月时，在野生型与经PBS或经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠之间观察到潜伏期的更显著统计学差异(图9，左上图)。16个月时增加的潜伏期还与经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠的增加的游泳速度相关(图9，右上图)。另外，当按性别分开时，在16个月和18个月时，在雄性野生型动物与经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠之间观察到潜伏期的统计学差异(图9，左中图)，而经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8雄性小鼠游泳速度在16个月时显著降低(图9，右中图)。与野生型或经PBS治疗的CLN3Δex7/8动物相比，经scAAV9.P546.CLN3治疗的雌性CLN3Δex7/8小鼠在18个月时显示显著增加的潜伏期(图9，左下图)，而经PBS治疗的CLN3Δex7/8雄性小鼠游泳速度在16个月时显著增加(图9，右下图)。
与注射PBS的动物相比，爬杆测定显示经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8的表现有所改善。
爬杆测试测量在将小鼠面朝向上置放在垂直杆上时转身所花费的时间以及在将其面朝下置放在垂直杆上时下杆的时间。此外，有时也会测量试图转身或下降时自杆上跌落的次数。这项测试评估协调和平衡能力。
在注射后10个月和12个月，与经PBS治疗的动物相比，scAAV9.P546.CLN3动物在下杆中显著更快(图10，左上图)。在注射后10个月和12个月，在经PBS治疗的CLN3Δex7/8动物下杆时所花费的时间中看到统计学显著差异，而野生型和经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8是不可区分的(图10，左上图)。关于动物从面朝上位置转到面朝下位置所花费的时间，发现了两个统计学显著差异。在2个月龄和16个月龄时，与经scAAV9.P546.CLN3和经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠两者相比，野生型动物变得显著更快。与雌性小鼠(图10，左下图)相比，这种差异在雄性小鼠(图10，左中部图)中更显著，其中与野生型相比未观察到差异。2个月和16个月的时间点是在研究组之间观察到此参数差异的唯一时间点(图10，左上图)。
自杆上跌落的平均次数中看到另外的统计学显著差异，其中与野生型和经scAAV9.P546.CLN3治疗的动物相比，经PBS治疗的CLN3Δex7/8雄性和雌性更频繁地跌落(图11)。上图：在第2个月发现经scAAV9.P546.CLN3治疗的动物与经PBS治疗的动物之间的跌落次数有着显著差异。在注射后16个月，在野生型与经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠之间也观察到统计学显著差异。中图：仅雄性。经PBS治疗的CLN3Δex7/8小鼠比其它治疗组更经常自杆上跌落，在注射后16个月具有最大统计学显著性。下图：对于雌性，跌落差异在注射后8个月是显著的，但是在整个研究期间趋势是可见的。对于每个治疗组，N＝5(5M/5F)。有趣的是，在整个18个月期间看到自杆上跌落的差异，并且在早期时间点(4个月)以及在8个月和16个月时是统计学显著的。在8个月时，差异仅在雌性中是统计学显著的，但是在雄性中也存在明显的趋势，并且在注射后16个月时在雄性中是统计学显著的。通常，经PBS治疗的CLN3Δex7/8雄性比其它治疗组更频繁地自杆上跌落。
总之，有强有力的证据表明，用scAAV9.P546.CLN3治疗CLN3Δex7/8小鼠防止ASM物质以及ATP合酶亚单位C(这两者均为CLN3-巴藤病进展的主要标志)的积累。这些数据与胶质细胞活化(星形胶质细胞和小胶质细胞)的强烈减少相关。尽管在疾病早期进程，朝向行为表型的改善的第一趋势变得明显：与经PBS治疗的动物相比，经scAAV9.P546.CLN3治疗的CLN3Δex7/8小鼠更能够下降垂直杆，因为其移动更快并且更不经常跌落。总之，这些数据支持scAAV9.P546.CLN3基因疗法作为这种疾病的治疗策略。
实例3
用scAAV9.P546.GFP在小鼠中进行表达研究
P546启动子允许以与鸡-β-肌动蛋白(CBA)启动子类似的方式在整个CNS中表达转基因。为了在两种启动子之间进行并列比较，在出生后第1天，以每只动物5×1010个病毒基因组向小鼠注射调配在1x PBS以及0.001％普郎尼克F68或20mM Tris(pH为8.0)、1mMMgCl2、200mM NaCl、0.001％泊洛沙姆188中的scAAV9.CB.GFP或scAAV9.P546.GFP。3周后，处死动物并且将脑直接置于荧光解剖显微镜下。根据荧光图像，明显的是GFP分布类似，但是与接受scAAV9.CB.GFP的动物相比，接受scAAV9.P546.GFP的动物的荧光水平更低，证实了与CBA启动子相比，P546启动子导致转基因的更中度表达水平。
向另一只小鼠注射scAAV9.P546.GFP，并且保持存活200天。200天后，处死动物并且对全脑矢状切片进行染色以实现GFP表达。甚至在注射后200天，在包含皮层、海马体、中脑、髓质、杏仁核和小脑的整个脑中观察到GFP转基因的广泛表达，进一步表明P546启动子是CNS基因疗法的良好候选者。
来自各种组织和脑区的蛋白质印迹数据进一步支持来自GFP荧光和GFP免疫荧光染色的数据。在用scAAV9.P546.GFP(n＝3)治疗的小鼠中使用液体体系通过荧光蛋白质印迹技术注射后三周，可以容易地检测到GFP表达，而在用作对照(n＝1)的注射PBS的动物中未检测到条带。转基因表达在全脑裂解物以及包含皮层、髓质、中脑、海马体、小脑和脊髓的区域特异性裂解物中是明显的。
此外，在心脏和肝脏中也证实了GFP表达，而肺和脾显示很少至没有转录物表达(图12)。用scAAV9.P546.GFP的蛋白质印迹数据与来自小鼠和非人灵长类动物安全性研究的表达数据一致，其中发现非常类似的表达谱。此外，脑和外周器官中的这种表达模式与scAAV9.CB.GFP所发现的模式相当。
总之，使用免疫染色和蛋白质印迹技术在小鼠中进行广泛表达分析表明，P546启动子在整个神经系统中导致非常类似且持久的表达谱，同时与强CBA启动子相比允许更中度表达水平。
实例4
用scAAV9.P546.CLN3在非人类灵长类动物中进行表达研究
单剂量的3.4×1013vg scAAV9.P546.CLN3存在于1x PBS和0.001％普郎尼克F68中，并且施用于三个3-4岁的食蟹猴。
在注射scAAV9.P546.CLN3的食蟹猴的脑组织中进行靶向分析时，使用对人类CLN3转基因具有特异性并且不与内源性非人类灵长类动物CLN3 RNA交叉反应的引物在RNA水平上分析靶向。来自注射后12周处死的食蟹猴之一的各个脑区的组织中的逆转录定量PCR揭示人类CLN3在脊髓、皮层、丘脑、纹状体、小脑和视网膜中的所有水平的表达，进一步强调了scAAV9的广泛到达范围以及具有P546启动子的转录物在整个脑和脊髓中的表达(图13)。值得注意的是，用于检测载体源性人类CLN3的引物不与内源性NHP CLN3转录物交叉反应。因此，针对在腰椎脊髓中发现的载体源性CLN3 RNA水平进行归一化，其被设置为1而不是注射盐水或未注射盐水的动物，因为归一化为零是不可能的。肌动蛋白用作归一化基因。
总之，来自非人类灵长类动物的数据证明scAAV9在单次鞘内腰椎注射后穿过神经系统并到达CNS的大区域的高潜力。值得注意的是，通过鞘内注射scAAV9.P546.CLN3治疗的所有非人类灵长类动物对治疗耐受良好，并且在直至注射后6个月的任何时间点在任何动物中均未观察到副作用。
实例5
scAAV9.P546.CLN3基因疗法的临床试验
scAAV9.P546.CLN3将通过鞘内递送到患有CLN3-巴藤病的人类患者。
用于临床试验的scAAV由全国儿童医院临床制造设施(Nationwide Children′sHospital Clinical Manufacturing Facility)利用HEK293细胞的三重转染方法在如实例1中所描述的cGMP条件下产生。
选择参与的患者的年龄将为3-10岁，诊断为如由基因型确定的CLN3疾病。第一组群(n＝3)将接受每位患者一次性基因转移剂量为6×1013vg总scAAV。将scAAV9.P546.CLN3调配在20mM 1mM MgCl2、200mM NaCl、0.001％泊洛沙姆188Tris(pH为8.0)中，并且将通过由腰椎穿刺插入的鞘内导管一次性递送到棘突间进入腰椎隙囊的蛛网膜下腔中。安全性将是根据临床情况进行评估，并且通过检查安全性标签进行评估。每个受试者的登记之间至少有四周的时间，以允许审查基因转移后第30天的安全性数据。如果不存在安全性问题，则在注射后一个月评估第三个受试者之后，将登记具有四个另外的受试者的第二组群。组群2(n＝4)中的每个受试者将接受递增剂量的1.2×1014vg总scAAV。在组群1完成与组群2开始之间至少有六周的时间窗口，以允许从五个时间点(第1天、第2天、第7天、第14天和第21天)以及DSMB审查安全性分析在给予下一个受试者之前进行审查。
疾病进展将使用UBDRS量表(在上文的详细描述中参考)并且使用小儿生活质量(PEDSQOL)量表的治疗对生活质量的影响以及延长存活的潜力来测量。
当所有患者完成为期三年的研究时，将功效的主要分析进行评估。确定功效的基础是基于专门针对CLN3-巴藤病而开发的完善的统一巴藤病评定量表(UBDRS)的疾病稳定或减少疾病的进展。完成三年研究期后，患者将按照FDA指导每年监测，持续5年。
实例6
Cln3Δ7/8小鼠模型的另外的研究
如实例中所述，在出生后第1天通过脑室内(ICV)注射向2只野生型(WT)和Cln3Δ7/8小鼠给药PBS、scAAV9.p546.CLN3或scAAV9.CB.CLN3基因疗法。在这项研究中，向小鼠施用5×1010vg/动物(4μL体积)。
选择注射方法和时间安排以靶向CLN3-巴藤病患者体内相关的特定神经元群体。在手术期间通过体温过低对动物进行镇静，监测直到完全恢复，并且如先前所述进行基因分型(参见，Morgan等人，《公共科学图书馆综合》8；以及实验室，TJ协议18257：标准PCR测定)。
使用GraphPad Prism进行统计分析，并且细节在图例中注明。通常，在适当的事后检验法中采用双向方差分析，并且用ROUT方法去除异常值，Q＝0.1-1％。如果合适，使用未配对t测试。
hCLN3转录物在脑中的表达和分布
进行定量PCR，以测量经过治疗的小鼠的脑中的hCLN3转录物。如先前所述生成总RNA和cDNA(参见，Cain等人，《分子疗法》，2019)。使用2^-Delta-Delta Ct方法来计算相对于Gapdh归一化的作为管家对照的人类CLN3转录物的相对基因表达。hCLN3正向引物序列：CGCTAGCATCTCATCAGGCCTTG(SEQ ID NO：11)；hCLN3反向引物序列：AGCATGGACAGCAGGGTCTG(SEQ ID NO：12)。
如图16所示，scAAV9.p546.CLN3治疗导致Cln3Δ7/8小鼠的大脑皮层和脊髓中hCLN3转录物表达水平增加，如通过qPCR测量的，直至24个月龄。因此，scAAV9.p546.CLN3的单次新生儿ICV施用导致hCLN3的持续且靶向良好的表达。
另外，进行RNAscope，以检测经治疗的小鼠的脑中的CLN3转录物。对小鼠进行CO2安乐死并且用PBS进行心脏灌注。收集脑并且置放在1mm矢状脑块上。在中线和中线右侧3mm处切割大脑。将3mm矢状片用-50℃异戊烷进行快速冷冻，并且然后在16μm的低温恒温器上进行切片并且置放在载玻片上。然后根据制造商建议的方案(ACDBio手册320293和320513)处理载玻片。将切片用人特异性CLN3探针(ACDBio目录号470241)进行标记，所述探针由CLN3基因的区域中的20个双z对组成，所述CLN3基因在小鼠与人类CLN3之间具有极少同源性(区域631-1711)。将载玻片用RNAscope荧光多重试剂盒(ACDBio目录号320850)使用其4-FL-AltC进行荧光标记，所述Amp 4-FL-AltC用550nm荧光团标记hCLN3探针，用DAPI复染载玻片以标记细胞核。使用抗褪色封固剂(Dako faramount，安捷伦科技公司(Agilent))将组织切片封固在盖玻片下的载玻片上。将切片在成像前储存在黑暗中。使用具有NIS-Elements Advanced Research软件(v4.20)的Nikon NiE显微镜对切片进行成像和分析。
如图17所示，scAAV9.p546.CLN3治疗在Cln3Δ7/8小鼠的整个脑中产生稳定的hCLN3转录物，如通过RNAscope(红色荧光)测量的，直至24个月龄。定量PCT和RNAscope测定证实了scAAV9.p546的单次新生儿ICV施用导致hCLN3的持续且靶向良好的表达。scAAV9.p546.CLN3基因疗法增加了整个脑和脊髓中的hCLN3基因表达，直至24个月龄。
经典巴藤病病理学
为了确定施用scAAV9.p546.CLN3是否预防Cln3Δ7/8小鼠脑中的经典巴藤病病理学，在ICV施用后检查储存物质积累(ASM)和神经胶质反应性。对野生型和Cln3Δ7/8小鼠进行CO2安乐死，用PBS灌注，并且用4％PFA固定组织。在50μm的振动切片机(Leica VT10008)上对固定脑进行切片。用标准免疫荧光和DAB染色方案处理切片。一级抗体包含抗CD68(AbDSerotec公司，MCA1957；1∶2000)、抗GFAP(Dako公司，Z0334；1∶8000)以及抗ATP合酶亚单位C(艾博抗公司(Abcam)，ab181243，1∶1000)。二级抗体包含抗大鼠和抗兔生物素酰化的(VectorLabs公司，BA-9400；1∶2000)。使用Aperio载玻片扫描显微镜以20X对切片进行成像和分析。从丘脑的VPM/VPL和躯体感觉皮层的2/3层提取图像，其中从每只动物获取多个组织的多个图像。在ImageJ中使用阈值分析对免疫反应性的总面积进行定量。
图18表明scAAV9.p546.CLN3治疗在直至24个月龄的Cln3Δ7/8小鼠脑的两个区域中预防并减少ASM积累。图19表明scAAV9.p546.CLN3治疗通常在直至24个月龄的Cln3Δ7/8小鼠脑的两个区域中预防大量亚单位C积累(ASM的成分)。图20表明scAAV9.p546.CLN3治疗通常在直至24个月龄的Cln3Δ7/8脑的两个区域中预防星形胶质细胞活化(GFAP+)。图21表明scAAV9.p546.CLN3治疗在直至24个月龄的Cln3Δ7/8脑的两个区域中预防一些小胶质细胞活化(CD68+)，这取决于时间点。因此，scAAV9.p546.CLN3预防Cln3Δ7/8小鼠脑中的经典巴藤病病理学，包含储存物质积累和神经胶质反应性。图22表明scAAV9.CB.CLN3治疗在预防6个月龄和12个月龄Cln3Δ7/8小鼠的各种巴藤病病理学方面类似地有效。
另外，用scAAV9.p546.CLN3进行的治疗不会引起任何红细胞(CBC)异常或白细胞(WBC)异常，如直至ICV施用后24个月测量的。图23提供了以下CBC参数的数据：RBC计数、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、RBC分布、血小板计数和平均血小板体积。图24提供了以下WBC参数的数据：WBC计数、淋巴细胞计数百分比、单核细胞百分比、粒细胞百分比。
scAAV9.p546.CLN3基因疗法预防了Cln3Δ7/8小鼠在直至24个月龄时出现CLN3-巴藤病的许多细胞特点，包含ASM、亚单位C、GFAP和CD68表达。另外，scAAV9.CB.CLN3基因疗法预防了Cln3Δ7/8小鼠在直至24个月龄时出现CLN3-巴藤病的许多细胞特点，包含ASM、亚单位C、GFAP和CD68表达。
实例7
在Cln3Δ7/8小鼠模型中基于性别的组织病理学分析
如实例中所述，在出生后第1天通过脑室内(ICV)注射向2只野生型(WT)和Cln3Δ7/8小鼠给药PBS、scAAV9.p546.CLN3或scAAV9.CB.CLN3基因疗法。在这项研究中，向小鼠施用5×1010vg/动物(4μL体积)。
对野生型和Cln3Δ7/8小鼠进行CO2安乐死，用PBS灌注，并且用4％PFA固定组织。在50μm的振动切片机(Leica VT10008)上对固定脑进行切片。用标准免疫荧光和DAB染色方案处理切片。一级抗体包含抗CD68(AbD Serotec公司，MCA1957；1∶2000)以及抗ATP合酶亚单位C(艾博抗公司，ab181243，1∶1000)。二级抗体包含抗大鼠和抗兔生物素酰化的(VectorLabs公司，BA-9400；1∶2000)。使用Aperio载玻片扫描显微镜以20X对切片进行成像和分析。图像提取自以下区域：海马体的CA2/CA3区、海马齿状回多形层、基底外侧杏仁核、缰核、丘脑网状核、丘脑腹侧后外侧/腹后内侧核、背内侧和内侧区域丘脑、梨状皮层、后压部皮层和躯体感觉皮层的2/3层，其中从每只动物获取多个组织的多张图像。在ImageJ中使用阈值分析对免疫反应性的总面积进行定量。
图25表明用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月龄时基于性别在海马体的CA3区中显示出不同水平的SubC积累。在12个月龄时，经治疗的雌性Cln3Δ7/8小鼠积累的SubC显著多于野生型，而经治疗的雄性的SubC的积累与野生型没有区别。然而，在所分析的任何其它时间点都没有看到这种差异。
图26表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在多个时间点基于性别在梨状皮层(PIRC)中显示出微妙的、不同水平的SubC积累。在12个月龄时，经治疗的雌性突变体CLN3小鼠积累的SubC显著多于野生型，其中AAV治疗没有预防低于PBS突变水平的积累，而经治疗的雄性的SubC的积累与野生型没有区别。然而，在所分析的任何其它时间点都没有看到这种相关性，并且这种相关性与18个月龄时的发现不一致，其中经治疗的雌性的SubC积累与野生型没有显著差异，并且显著低于未经治疗的突变小鼠。在18个月龄时，经治疗的雄性的SubC的积累显著高于WT水平。
图27表明，经scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在多个时间点基于性别在网状丘脑核(RTN)中显示出不同水平的SubC积累。在6个月龄时，经治疗的雌性突变体CLN3小鼠积累的SubC显著多于野生型，而经治疗的雄性的SubC的积累与野生型没有区别。在12个月龄时，经治疗的雄性保持在野生型水平，而经治疗的雌性的SubC显著高于野生型和未经治疗的突变小鼠两者。雌性经处理和未经处理的突变体之间的这种差异在18个月时不存在，其中SubC显著高于WT，但显著低于雄性和雌性两者的未经处理的突变体。
图28表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月时基于性别在躯体感觉皮层中显示出不同水平的SubC积累。在12个月龄时，与未经治疗的突变体雌性相比，用AAV治疗不会减少SubC的积累，同时预防经治疗的雄性的SubC的积累，并且与野生型没有区别。然而，在所分析的任何其它时间点都没有看到这种差异。
图29表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月时基于性别在丘脑的VPM/VPL中显示出不同水平的SubC积累。在6个月龄时，经治疗的雌性积累的SubC显著少于未经治疗的突变体雌性，但显著多于野生型雌性。这种差异持续了12个月和18个月，其中在所分析的任何时间点，野生型与经治疗的雄性之间都没有差异。
图30表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月时基于性别在基底外侧杏仁核(BLA)中显示出不同水平的SubC积累。在12个月龄时，AAV没有显著预防经治疗的雌性动物的SubC的积累。在18个月时，经治疗的雌性的SubC积累仍然显著高于野生型，但低于未经治疗的雌性。到18个月时，经治疗的雄性也开始具有比其野生型对应物显著更多的SubC，模仿在雌性组中看到的情况。
图31表明，经scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月和18个月时基于性别在齿状回(DG)多形层中显示出不同水平的SubC积累。在12个月龄时，经治疗的雌性积累的SubC似乎显著多于野生型雌性和未经治疗的突变体雌性两者。原始图像(未示出)显示围绕可能影响阈值结果的齿状回多形层的变暗颗粒细胞层。这种变暗只出现在这个组中，并且只出现在12个月的时间点。这种增加在雌性中在18个月时也不再出现，然而在18个月时，经治疗的雄性开始具有比野生型雄性显著更多的SubC积累。
图32表明，经scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月和18个月时基于性别在缰核中显示出不同水平的SubC积累。在12个月龄时，经治疗的雌性积累的SubC显著少于未经治疗的突变体雌性，但显著多于野生型雌性。这种差异也在18个月时出现，其中在所分析的任何时间点，野生型与经治疗的雄性之间都没有差异。
图33表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在12个月和18个月时基于性别在背内侧核中显示出不同水平的SubC积累。在12个月龄时，经治疗的雌性积累的SubC显著少于未经治疗的突变体雌性，但显著多于野生型雌性。这种差异也在18个月时出现，其中在所分析的任何时间点，野生型与经治疗的雄性之间都没有差异。
图34表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠基于性别在后压部皮层(RSC)中SubC积累水平没有差异。在所分析的任何时间点，野生型与经治疗的雄性之间没有差异。
图35表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠在6个月时基于性别在躯体感觉皮层(S1BF)中显示出不同水平的活化小胶质细胞(CD68+)。在6个月龄时，与野生型和未经治疗的雌性相比，经治疗的雌性的小胶质细胞活化增加，其中经治疗的雄性高于野生型但低于未经治疗的雄性。在12个月龄和18个月龄时没有发现性别差异。
图36表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠基于性别在VPM-VPL(丘脑)中显示出不同水平的小胶质细胞活化。在6个月龄时，与野生型和未经治疗的雌性相比，经治疗的雌性的小胶质细胞活化增加，其中经治疗的雄性高于野生型但低于未经治疗的雄性。这种差异也在12个月时出现。在18个月时在雌性组中观察到同样的情况，然而，在这个时间点，经治疗的雄性与野生型没有显著差异。
图37表明scAAV9.p546.CLN3小鼠基于性别在背内侧核(MD)中显示出不同水平的活化小胶质细胞(CD68+)。在6个月龄时，与野生型和未经治疗的雌性相比，经治疗的雌性的小胶质细胞活化增加，其中经治疗的雄性高于野生型但与未经治疗的雄性没有区别。在12个月龄和18个月龄两者时，经治疗的雄性的小胶质细胞活化高于野生型并且低于未经治疗的雄性，而治疗似乎对雌性没有影响。
图38表明，用scAAV9.p546.CLN3治疗的小鼠基于性别在内侧核(SM)中显示出不同水平的活化小胶质细胞。在6个月龄时，与野生型和未经治疗的雌性相比，经治疗的雌性的小胶质细胞活化增加，而经治疗的雄性与未经治疗的雄性没有显著差异，两者都比野生型具有更多的活化。到12个月时，治疗似乎对任何性别的小胶质细胞活化程度都没有影响。到18个月时，经治疗的雄性的小胶质细胞活化降低到野生型水平，而经治疗的雌性的活化程度与未经治疗的雌性相同。
上述数据表明，经scAAV9.p546.CLN3治疗的动物在Cln3Δ7/8小鼠脑的若干个区域中具有与ATP-合酶亚单位C积累和CD68+小胶质细胞活化相关的基于性别的不同病理学。基于性别的不同病理学差异似乎更具有女性特异性。12个月的时间点是大多数差异最一致的地方，其中许多差异仅在12个月时出现并且到18个月时不再出现。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员来说将明显的是，此类实施例仅通过举例方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应该理解，可以采用本文所描述的实施例的各种替代方案。本发明的意图在于以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。
本申请中提及的所有文献均通过引用整体并入本文。
Claims (71)
1.一种编码CLN3多肽的自身互补型重组腺相关病毒9(scAAV9)，其包括scAAV9基因组，所述scAAV9基因组以5'到3'的顺序包括：包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列的P546启动子；以及编码SEQ ID NO:1的所述CLN3多肽的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的scAAV9，其中所述scAAV9基因组以5'到3'的顺序包括：包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列的P546启动子；SV40内含子；以及编码SEQ ID NO:1的所述CLN3多肽的多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的scAAV9，其中所述scAAV9基因组以5'到3'的顺序包括：包括SEQ ID NO:3的序列的P546启动子；编码SEQ ID NO:1的所述CLN3多肽的多核苷酸；以及牛生长激素多腺苷酸化polyA序列。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的scAAV9，其进一步包括两个AAV末端反向重复序列。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的scAAV9，其中编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。
6.根据权利要求1到4中任一项所述的scAAV9，其中编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸包括SEQ ID NO:2的核酸序列。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的scAAV9，其中所述scAAV9基因组包括与SEQ IDNO:4至少90％相同的核酸序列
8.根据权利要求1到6中任一项所述的scAAV9，其中所述scAAV9基因组包括与SEQ IDNO:4至少95％相同的核酸序列。
9.根据权利要求1到6中任一项所述的scAAV9，其中所述scAAV9基因组包括SEQ ID NO:4的核酸序列。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的scAAV9，其中所述AAV末端反向重复序列是AAV2末端反向重复序列。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的scAAV9，其中所述rAAV9基因组包括单链基因组。
12.一种核酸分子，其包括：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ ID NO:3的序列的P546启动子；编码SEQ ID NO:1的CLN3多肽的核酸序列；以及第二末端反向重复序列。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其包括：第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ IDNO:3的核苷酸序列的P546启动子；SV40内含子；编码SEQ ID NO:1的所述CLN3多肽的核酸序列；以及第二AAV末端反向重复序列。
14.根据权利要求12所述的核酸分子，其包括第一AAV末端反向重复序列；包括SEQ IDNO:3的核苷酸序列的P546启动子；编码SEQ ID NO:1的所述CLN3多肽的核酸；牛生长激素多腺苷酸化polyA序列；以及第二AAV末端反向重复序列。
15.根据权利要求12到14中任一项所述的核酸分子，其中编码所述CLN3多肽的所述核酸包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。
16.根据权利要求12到14中任一项所述的核酸分子，其中编码所述CLN3多肽的所述核酸包括SEQ ID NO:2的核酸序列。
17.根据权利要求12到16中任一项所述的核酸分子，其包括与SEQ ID NO:4的核酸序列至少90％相同的核酸序列
18.根据权利要求12到16中任一项所述的核酸分子，其包括与SEQ ID NO:4的核酸序列至少95％相同的核酸序列。
19.根据权利要求12到17中任一项所述的核酸分子，其包括SEQ ID NO:4的核酸序列。
20.根据权利要求15到20中任一项所述的核酸分子，其中所述AAV末端反向重复序列是AAV2末端反向重复序列。
21.一种自身互补型重组腺相关病毒9(scAAV9)，其包括根据权利要求12到20中任一项所述的核酸分子。
22.根据权利要求21所述的scAAV9，其中所述scAAV9包括单链基因组。
23.一种rAAV颗粒，其包括根据权利要求12到20中任一项所述的核酸分子。
24.根据权利要求23所述的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包括单链基因组。
25.一种编码CLN3多肽的重组腺相关病毒9(rAAV9)病毒颗粒，其包括rAAV9基因组，所述rAAV9基因组以5'到3'的顺序包括：P546启动子和编码所述CLN3多肽的多核苷酸。
26.根据权利要求25所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述rAAV9基因组包括自身互补型基因组。
27.根据权利要求25所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述rAAV9基因组包括单链基因组。
28.根据权利要求25到27中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述rAAV9基因组以5'到3'的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；所述P546启动子；编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列。
29.根据权利要求25到28中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述P546启动子包括与SEQ ID NO:3的核酸序列至少90％相同的序列。
30.根据权利要求25到29中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述CLN3多肽包括与SEQ ID NO:1的核酸序列至少90％相同的序列。
31.根据权利要求25到30中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:2的核酸序列至少90％相同的序列。
32.根据权利要求25到31中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述rAAV9基因组包括与SEQ ID NO:4的核酸序列至少90％相同的序列。
33.根据权利要求25到31中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述rAAV9基因组包括与SEQ ID NO:4的核酸序列至少95％相同的序列。
34.根据权利要求28到33中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述AAV末端反向重复序列是AAV2末端反向重复序列。
35.根据权利要求25到34中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述rAAV9基因组进一步包括SV40内含子。
36.根据权利要求25到35中任一项所述的rAAV9病毒颗粒，其中所述rAAV9基因组进一步包括BGH poly-A序列。
37.一种核酸分子，其包括rAAV9基因组，所述rAAV9基因组以5'到3'的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；P546启动子；编码CLN3多肽的多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列。
38.根据权利要求37所述的核酸分子，其中所述rAAV9包括自身互补型基因组。
39.根据权利要求37所述的核酸分子，其中所述rAAV9包括单链基因组。
40.根据权利要求37到39中任一项所述的核酸分子，其中所述rAAV9基因组以5'到3'的顺序包括：第一AAV末端反向重复序列；所述P546启动子；编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸；以及第二AAV末端反向重复序列。
41.根据权利要求37到40中任一项所述的核酸分子，其中所述P546启动子包括与SEQID NO:3的核酸序列至少90％相同的序列。
42.根据权利要求37和41中任一项所述的核酸分子，其中所述CLN3多肽包括与SEQ IDNO:1的核酸序列至少90％相同的序列。
43.根据权利要求37到42中任一项所述的核酸分子，其中编码所述CLN3多肽的所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:2的核酸序列至少90％相同的序列。
44.根据权利要求37到43中任一项所述的核酸分子，其中所述rAAV9基因组包括与SEQID NO:4的核酸序列至少95％相同的序列。
45.根据权利要求37到44中任一项所述的核酸分子，其中所述AAV末端反向重复序列是AAV2末端反向重复序列。
46.根据权利要求37到4537中任一项所述的核酸分子，其中所述rAAV9基因组包括与SEQ ID NO:4的核酸序列至少90％相同的序列。
47.根据权利要求377到46中任一项所述的核酸分子，其中所述rAAV9基因组进一步包括SV40内含子。
48.根据权利要求37到47中任一项所述的核酸分子，其中所述rAAV9基因组进一步包括牛生长激素(BGH)poly-A序列。
49.一种组合物，其包括：根据权利要求1到12、21或22中任一项所述的scAAV；根据权利要求12到20或37到48中任一项所述的核酸分子；根据权利要求23到36中任一项所述的rAAV9病毒颗粒；以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述赋形剂包括非离子低渗透化合物、缓冲液、聚合物、盐或其组合。
51.一种治疗受试者的CLN3-巴藤病(CLN3-BattenDisease)的方法，所述方法包括向受试者施用包括治疗有效量以下各项的组合物：根据权利要求1到12、21或22中任一项所述的scAAV；根据权利要求12到20或37到48中任一项所述的核酸分子；根据权利要求23到36中任一项所述的rAAV9病毒颗粒；根据权利要求37到48中任一项所述的核酸；或根据权利要求49或权利要求50所述的组合物。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述组合物通过选自由以下组成的组的途径施用：鞘内、脑室内、脑实质内、静脉内和其组合。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述组合物是鞘内施用的。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述组合物是脑室内施用的。
55.根据权利要求51所述的方法，其中所述组合物是静脉内施用的。
56.根据权利要求51或55中任一项所述的方法，其中约1×1012到约1×1015vg的所述rAAV9病毒颗粒被施用。
57.根据权利要求51或56中任一项所述的方法，其中约6×1013到约1.2×1014的所述rAAV9病毒颗粒被施用。
58.根据权利要求51到57中任一项所述的方法，其中所述治疗减少CLN3-巴藤病的选自以下的一种或多种症状：
(a)自发荧光储存材料的溶酶体积累减少或减缓；
(b)ATP合成酶亚单位C的溶酶体积累减少或减缓；
(c)胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化减少或减缓；
(d)星形细胞增生减少或减缓；
(e)通过MRI测量的脑量损失减少或减缓；
(f)癫痫发作减少或减缓；
(g)稳定、进展减少或延迟、或UBDRS评估量表中的一个或多个提高，其中所述减少、稳定或提高是与施用所述组合物之前的所述受试者或未经治疗的CLN3-巴藤病患者相比而言的。
59.根据权利要求51到58中任一项所述的方法，其进一步包括在施用所述rAAV9病毒颗粒后将所述受试者置于特伦德伦伯格位置(Trendelenberg position)。
60.一种治疗有需要的受试者的CLN3疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者的脑或脊髓递送包括以下的组合物：根据权利要求1到12、21或22中任一项所述的scAAV；根据权利要求12到20或37到48中任一项所述的核酸分子；根据权利要求23到36中任一项所述的rAAV9病毒颗粒。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述组合物通过鞘内注射、脑室内注射、脑实质内注射或静脉内注射或其组合递送。
62.根据权利要求61所述的方法，进一步包括在鞘内注射所述组合物后将所述受试者置于特伦德伦伯格位置。
63.根据权利要求60到62中任一项所述的方法，其中所述组合物包括非离子低渗透造影剂。
64.根据权利要求6363所述的方法，其中所述非离子低渗透造影剂选自由以下组成的组：碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普胺、碘佛醇、碘昔兰和其组合。
65.根据权利要求60到64中任一项所述的方法，其中递送到所述脑或所述脊髓包括递送到脑干。
66.根据权利要求60到64中任一项所述的方法，其中递送到所述脑或所述脊髓包括递送到小脑。
67.根据权利要求60到64中任一项所述的方法，其中递送到所述脑或所述脊髓包括递送到视觉皮层。
68.根据权利要求60到64中任一项所述的方法，其中递送到所述脑或所述脊髓包括递送到运动皮层。
69.根据权利要求60到64中任一项所述的方法，其中递送到所述脑或所述脊髓包括递送到神经细胞、胶质细胞或两者。
70.根据权利要求60到69中任一项所述的方法，其中递送到所述脑或所述脊髓包括递送到神经元、下运动神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、许旺细胞(Schwanncell)或其组合。
71.根据权利要求60到70中任一项所述的方法，其中所述治疗导致以下中的一种或多种：
(a)自发荧光储存材料的溶酶体积累减少；
(b)ATP合成酶亚单位C的溶酶体积累减少；
(c)胶质细胞活化(星形胶质细胞和/或小胶质细胞)活化减少；
(d)星形细胞增生减少；
(e)通过MRI测量的脑量损失减少；
(f)癫痫发作减少；以及
(g)稳定、进展减少或UBDRS评估量表中的一个或多个提高，其中所述减少、稳定或提高是与递送所述组合物之前的所述受试者或未经治疗的CLN3-巴藤病患者相比而言的。
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