CN109843913A

CN109843913A - 神经肽表达载体以及用于治疗癫痫的方法

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Publication number: CN109843913A
Application number: CN201780037765.4A
Authority: CN
Inventors: 雷吉娜·海尔布隆; 克里斯托弗·施瓦策尔
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2016-06-16
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN109843913B; CA3027784A1; WO2017216301A1; US20210108225A1; JP2022188238A; EP3472196A1; JP2019524071A

Abstract

本发明提供了用于在体外、离体或体内将核酸序列转移至细胞中的递送载体。本发明提供了将核酸序列递送至细胞中的方法以及治疗局灶性癫痫的方法。

Description

神经肽表达载体以及用于治疗癫痫的方法

技术领域

本发明提供了用于体外、离体或体内将对前肽原进行编码的核酸序列转移至细胞中的递送载体。本发明提供了将核酸序列递送至细胞中的方法以及治疗局灶性癫痫的方法。

背景技术

癫痫患病率为1％至2％，属于全球最常见的神经系统疾病(McNamara等人，1999年)。内侧颞叶癫痫(mTLE)是人类中最常见的癫痫类型，并且经常由创伤性脑损伤诱发。海马体硬化和伴随的神经功能缺损是mTLE的关键特征(综述请见Engel等人，2001年)。尽管在过去几十年中引入了大量的抗癫痫药物，但是自1971年Coatsworth的研究以来，耐药性癫痫的发作率(30％至70％)并未得到改善(Coatsworth等人，1971年；Loscher等人，2011年)。迄今为止，致癫痫病灶的手术切除仍然是其中一些患者的最终选择。即使那样，在某些亚组的患者中，在移除致癫痫病灶后至少一年内只有不到50％的患者没有癫痫发作(Spencer等人，2008年)。

自20世纪80年代初以来，已有证据表明阿片样物质，即，强啡肽(Dyn)，在体外充当神经元兴奋性的调节剂(Henriksen等人，1982年；Siggins等人，1986年)。与此一致，由于启动子区域(Stogmann等人，2002年；Gambardella等人，2003年)的突变导致的小鼠中的强啡肽原(pDyn)编码序列的缺失(Loacker等人，2007年)和人类中的低Dyn水平与癫痫发展的易损性增加相关。在颞叶癫痫(TLE；包括癫痫发作皮质＝外侧TLE和mTLE)的大多数动物模型中，皮质和海马体pDyn表达在过度表达的初始短峰后减少(综述请见Simonato等人，1996年；Schwarzer等人，2009年)。这与伴随着从mTLE患者获得的手术移除组织中Dyn免疫反应性的全面降低(de Lanerolle等人，1997年)的海马体颗粒细胞中最可能短暂的发作后增加的pDyn mRNA相一致(Pirker等人，2009年)。

强啡肽优先作用于κ(kappa)阿片受体(KOR)。尽管内源性Dyn降低，但在癫痫病症下KOR仍可作为药物靶点，并且KOR激动剂的应用可以抑制实验性癫痫发作(Tortella等人，1988年；Takahashi等人，1990年；Solbrig等人，2006年；Loacker等人，2007年；Zangrandi等人，2016年)。通过不同途径应用的多种选择性KOR产生了与在癫痫模型中用苯妥英或苯巴比妥治疗时的那些相类似的时间相关和剂量相关效应(综述请见Simonato等人，1996年)。我们最近证明，KOR的激活促进了在小鼠中单侧注射红藻氨酸后的急性期之后海马体和杏仁核神经元的存活(Schunk等人，2011年)。

发明内容

本发明的目的是提供用于转移对前肽原或肽编码的核酸序列的递送载体，所述前肽原或肽包含能够将所述前肽原(例如，强啡肽原)包装到囊泡中的信号序列，其中所述前肽经历成熟，并且作为强啡肽或强啡肽变体的活性物质在超过特定激发阈值的动作电位频率时被释放。因此，本发明的目的是提供用于在体外、离体或体内将核酸序列转移至细胞中的递送载体。本发明的目的特别是用前强啡肽原或强啡肽或其变体治疗局灶性癫痫的基于载体的疗法。包含对前强啡肽原或强啡肽原或强啡肽或其变体编码的核酸的本发明的递送载体将转导神经元，释放前强啡肽原或强啡肽原或强啡肽或其变体，从而提供致癫痫病灶中的KOR的激活，由此抑制癫痫发作。

本发明的主题是递送载体，其包含对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列，并且其中所述递送载体驱动作为前肽原的前强啡肽原或前强啡肽原变体的表达，所述前肽原包含信号肽，其中所述前强啡肽原或前强啡肽原变体包含选自以下组的以下序列中的至少一个：

a.Dyn A，其是SEQ Id No.7(SEQ ID No.1的207位至223位AA；ppDyn)，或由前13位AA(第一个从N-末端开始)组成的其变体，或由前8位AA(第一个从N-末端开始)组成的其变体，

b.Dyn B，其是SEQ ID No.8(SEQ ID No.1的226位至238位AA；ppDyn)，

c.亮脑吗啡(leumorphin)，其是SEQ ID No.9(SEQ ID No.1的226位至254位AA；ppDyn)，

d.根据SEQ Id No.7的Dyn A的变体，其在从SEQ ID No.7(YGGFLRRI)的N-端计数的前8位AA内具有至少60％的氨基酸序列同一性，即，在SEQ ID No.7中包含的所述序列YGGFLRRI中具有至少60％的氨基酸序列同一性，

e.根据SEQ ID No.8的Dyn B的变体，其在从SEQ ID No.8(YGGFLRRQ)的N-端计数的前8位AA内具有至少60％的氨基酸序列同一性，即，在SEQ ID No.8中包含的所述序列YGGFLRRQ中具有至少60％的氨基酸序列同一性，

f.根据SEQ ID No.9的亮脑啡肽的变体，其在从SEQ ID No.9(YGGFLRRQ)的N-端计数的前8位AA内具有至少60％的氨基酸序列同一性，即，在SEQ ID No.9中包含的所述序列YGGFLRRQ中具有至少60％的氨基酸序列同一性。

将60％的序列同一性定义如下：前8位N-端氨基酸中的3个可能被移除或被另一个氨基酸置换。在截短的肽变体的情况下，针对缩短的肽计算序列同一性的百分比。将另外的氨基酸的引入处理为原始序列中的缺口，将缺失处理为修饰肽中的缺口以计算序列同一性(YGGFLRRQ与YG-FLRRQ仅相差1位AA，尽管现在AA在3、4、5、6和7位是不同的)。在任何情况下，在前8位AA中具有来自N-端的至少60％的氨基酸序列同一性的SEQ ID No.7的变体可以是包含序列YGZFLRKZ的变体，其中Z代表任何氨基酸，K在第7位重新替换R，保留肽酶识别位点。

在整篇申请中，氨基酸序列中的“Z”代表任何天然存在的氨基酸；在具体的实施方案中，“Z”可以选自包括丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的组。

根据本发明，所述递送载体包括对强啡肽或强啡肽变体的前肽原编码的DNA序列。这意味着所述载体包含对信号肽编码的DNA序列。作为一个方面，本发明提供了用于将核酸转移至细胞中的递送载体，所述递送载体包含对分泌信号肽编码的区段。对信号肽编码的DNA序列可以是根据SEQ ID No.:4的序列。在本发明的另一方面，所述递送载体包括对前肽片段编码的DNA序列。在本发明的一个特定方面，所述前肽片段是根据SEQ ID NO.5的序列。

本发明的递送载体的优点是按需释放强啡肽或强啡肽变体。这意味着将强啡肽原(或强啡肽原的变体)包装到囊泡中，经历成熟，并在随着癫痫发作开始而出现的高频刺激(例如，刺激≥8Hz)时按需释放(见图4)。因此，按需释放制剂(formulation)提供了前强啡肽原(或前强啡肽原的变体)，然后将其包装到囊泡中，经历成熟，并且作为强啡肽或强啡肽变体的活性物质在超过特定阈值的动作电位频率时被释放。所述特定阈值可以是≥6Hz的阈值，在另一实施方案中≥7Hz，在另一实施方案中≥8Hz，在另一实施方案中≥9Hz。这意味着所述按需释放是由增加的神经元放电频率触发的。所述增加的神经元放电频率可以通过EEG(脑电图)测量，增加意味着所述对象中由EEG测量的值≥6Hz，在另一实施方案中≥7Hz，在另一实施方案中≥8Hz，在另一实施方案中≥9Hz。

这意味着本发明的递送载体驱动前肽原的表达，这使得能够按需提供强啡肽或强啡肽变体，因为这样的递送载体首先在神经元中表达前肽原，其中将所得的前肽分选到大的致密核心囊泡中，将其在致密核心囊泡中进行酶处理，并且将衍生的肽储存，直到足够强的激发导致其释放，即，如上所述，所述释放由增加的神经元放电频率触发。Dyn肽与突触前和/或突触后KOR结合，其激活G蛋白，除此之外，其还调节离子通道以抑制神经元激发的进一步扩增和扩散。ppDyn的信号肽的翻译是将神经元中表达的强啡肽原分选到“大的致密核心”囊泡(LDV)中的最初步骤。利用神经元中的现有机制，将强啡肽原酶处理成成熟肽并转运至轴突末端。将LDV储存在轴突末端中并以依赖于刺激的方式释放。如上所述的高频刺激，如在癫痫发作开始时，诱导释放，而低频刺激则不会。这创造了按需释放药物的情况。所释放的Dyn肽与突触前和/或突触后KOR结合，其激活G蛋白，除此之外，其还调节离子通道以抑制神经元激发的进一步扩增和扩散。

换言之，按需释放组合物是在所述对象发作癫痫开始时释放对人KOR具有激动作用的肽的组合物，所述肽来源于根据本发明的任何递送载体或重组病毒颗粒或脂质体。癫痫发作开始的特征在于增加的神经元放电频率，该频率可以通过EEG(脑电图)测量，其中增加意味着所述对象中由EEG测量的值≥6Hz，在另一实施方案中≥7Hz，在另一实施方案中≥8Hz，在另一实施方案中≥9Hz。

在前8位AA中具有来自N-端的至少60％的氨基酸序列同一性的SEQ ID No.7的变体是在YGGFLRRI的序列中具有至少60％的氨基酸序列同一性的变体。将序列同一性定义如下：前8位氨基酸中的3个可能被移除或被另一个氨基酸置换。在任何情况下，在前8位AA中具有来自N-端的至少60％的氨基酸序列同一性的SEQ ID No.7的变体可以是包含序列YG-FLRKZ的变体，其中“-”代表缺失的AA，而Z代表任何AA。

在前8位AA中具有来自N-端的至少60％的氨基酸序列同一性的SEQ ID No.8的变体是在YGGFLRRQ的序列中具有至少60％的氨基酸序列同一性的变体。将序列同一性定义如下：前8位氨基酸中的3个可能被移除或被另一个氨基酸置换。在任何情况下，在前8位AA中具有来自N-端的至少60％的氨基酸序列同一性的SEQ ID No.8的变体可以是包含序列YGGFLZZZ的变体，其中Z代表任何氨基酸。

在前8位AA中具有来自N-端的至少60％的氨基酸序列同一性的SEQ ID No.9的变体是在YGGFLRRQ的序列中具有至少60％的氨基酸序列同一性的变体。将序列同一性定义如下：前8位氨基酸中的3个可能被移除或被另一个氨基酸置换。在任何情况下，在前8位AA中具有来自N-端的至少60％的氨基酸序列同一性的SEQ ID No.9的变体可以是包含序列YGAFLRZA的变体，其中Z代表任何氨基酸。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述变体分别在SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的前8位AA中具有来自N-端的至少70％的氨基酸序列同一性。70％序列同一性意指前8位氨基酸中的多达2个可能被移除或被另一个氨基酸置换。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述变体分别在SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的前8位AA中具有来自N-端的至少80％的氨基酸序列同一性。80％序列同一性意指前8位氨基酸中的1个可能被移除或被另一个氨基酸置换。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述递送载体包含对前强啡肽原变体编码的DNA序列，所述前强啡肽原变体包含选自以下组的变体的以下序列中的至少一个：SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12，其中Z可以是任何氨基酸，并且其中优选地在SEQ ID No.10中，与序列SEQ ID No.7相比，至少一个Z是不同的，并且其中优选地在SEQ ID No.11中，与序列SEQ ID No.8相比，至少一个Z是不同的，并且其中优选地在SEQ ID No.12中，与序列SEQ ID No.9相比，至少一个Z是不同的。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和/或SEQ ID No.9或其变体编码的多个DNA序列，其中根据SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和/或SEQ ID No.9或其变体的所述序列侧接肽酶识别信号。

这意味着作为一个实例，所述递送载体可以包含对SEQ ID No.7编码两次的DNA序列，以使得根据SEQ ID No.7的肽的两个分子将来源于一个递送载体。

肽酶(激素原转化酶)识别信号是本领域技术人员已知的，可以是单个或成对的碱性氨基酸，优选但不限于K、R、KR、RK或RR。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ ID No.8和/或SEQ ID No.9或其变体编码的多个DNA序列，其中根据SEQ IDNo.8和/或SEQ ID No.9或其变体的所述序列侧接肽酶识别信号。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ ID No.8和/或SEQ ID No.9或其变体编码的多个DNA序列，并且其中所述递送载体不包含对SEQ ID No.6和/或SEQ ID No.7编码的DNA。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ ID No.2或SEQ ID No.14编码的DNA。

在一个具体实施方案中，本发明的主题是如上所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ ID No.3或SEQ ID No.15编码的DNA。

根据本发明生产的递送载体可用于在体外、离体和体内将核酸递送至细胞中。特别地，可以将所述递送载体有利地用于将核酸递送或转移至动物细胞中，更优选的是哺乳动物细胞中。

合适的载体包括病毒载体(例如，逆转录病毒、慢病毒、甲病毒；牛痘病毒；腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)、脂质载体、聚赖氨酸载体、与核酸分子一起使用的合成多氨基聚合物载体如质粒等。

本领域已知的任何病毒载体均可用于本发明。这样的病毒载体的实例包括但不限于来源于以下的载体：腺病毒科(Adenoviridae)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；杯状病毒科(Caliciviridae)；毛状病毒组(Capillovirusgroup)；荷兰石竹潜伏病毒群(Carlavirus group)；香石竹斑驳病毒组(Carmovirus virusgroup)；花椰菜花叶病毒组(Group Caulimovirus)；黄化病毒群(Closterovirus Group)；鸭跖草黄斑驳病毒组(Commelina yellow mottle virus group)；豇豆花叶病毒组(Comovirus virus group)；冠状病毒科(Coronaviridae)；PM2噬菌体组(PM2phagegroup)；Corcicoviridae；隐秘病毒组(Group Cryptic virus)；隐潜病毒组(groupCryptovirus)；黄瓜花叶病毒组(Cucumovirus virus group)家族([PHgr]6噬菌体组(Family([PHgr]6phage group)；Cysioviridae；康乃馨环斑病毒组(Group Carnationringspot)；香石竹病毒组(Dianthovirus virus group)；蚕豆枯萎病毒组(Group Broadbean wilt)；豆病毒组(Fabavirus virus group)；纤丝病毒科(Filoviridae)；黄病毒科(Flaviviridae)；真菌传棒状病毒组(Furovirus group)；联体病毒组(GroupGerminivirus)；贾第虫病毒组(Group Giardiavirus)；嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)；疱疹病毒科(Herpesviridae)；大麦病毒组(Hordeivirus virus group)；Illarvirus病毒组(Illarvirus virus group)；丝杆病毒科(Inoviridae)；虹膜病毒科(Iridoviridae)；轻病毒科(Leviviridae)；脂毛病毒科(Lipothrixviridae)；黄体病毒组(Luteovirus group)；玉米雷亚多非纳病毒组(Marafivirus virus group)；玉米缺绿病矮小病毒组(Maizechlorotic dwarf virus group)；icroviridae；肌病毒科(Myoviridae)；坏死病毒组(Necrovirus group)；蠕传多角体病毒组(Nepovirus virus group)；野田村病毒科(Nodaviridae)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)；乳多空病毒科(Papovaviridae)；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)；欧防风黄点病毒组(Parsnip yellow fleck virus group)；分体病毒科(Partitiviridae)；细小病毒科(Parvoviridae)；豌豆耳突花叶病毒群(Peaenation mosaic virus group)；藻DNA病毒科(Phycodnaviridae)；微小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)；原生病毒科(Plasmaviridae)；Prodoviridae；多DNA病毒科(Polydnaviridae)；马铃薯X病毒组(Potexvirus group)；马铃薯Y病毒组(Potyvirus)；痘病毒科(Poxviridae)；呼肠病毒科(Reoviridae)；逆转录病毒科(Retroviridae)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)；根前毛菌噬菌体组(Group Rhizidiovirus)；管状病毒科(Siphoviridae)；南方菜豆花叶病毒组(Sobemovirus group)；SSV 1-Type噬菌体(SSV 1-Type Phages)；覆盖层病毒科(Tectiviridae)；纤细病毒属(Tenuivirus)；四病毒科(Tetraviridae)；烟草花叶病毒组(Group Tobamovirus)；烟草脆裂病毒组(GroupTobravirus)；披膜病毒科(Togaviridae)；番茄丛矮病毒组(Group Tombusvirus)；GroupTobovirus；全病毒科(Totiviridae)；芜菁黄花叶病毒组(Group Tymovirus)；以及植物病毒卫星(Plant virus satellites)。用于生产重组病毒载体和用于使用病毒载体进行核酸递送的方案可以在(Ausubel等人，1989年)和其它标准实验室手册(例如，Rosenzweig等人，2007年)中找到。病毒载体的特定实例是先前用于递送核酸的那些病毒载体，例如包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和其它细小病毒、疱疹病毒和痘病毒载体。如本文所用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科，包括自主性细小病毒、浓核病毒和依赖病毒。术语AAV包括所有脊椎动物变体，尤其是人、灵长类动物、其它哺乳动物、禽类或蛇来源(serpentine origin)的脊椎动物变体。自主性细小病毒包括细小病毒属、红病毒属、博卡病毒属、浓核病毒属、重复病毒属(Iteravirus)和浓核病毒亚科(Contravirus)的成员。示例性自主性细小病毒包括但不限于小鼠的细小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫传染性粒细胞缺乏症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、HI细小病毒、疣鼻栖鸭细小病毒、博卡病毒、蟾蜍病毒(bufavirus)、图沙病毒(tusavirus)和B19病毒，以及由国际病毒分类委员会(ICTV)分类为细小病毒的任何其它病毒。其它自主性细小病毒是本领域技术人员已知的，例如参见(Berns等人，2013年)。

在本发明的一个实施方案中，所述递送载体另外包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组或重组慢病毒基因组。

在本发明的一个特定实施方案中，所述递送载体另外包含重组AAV载体，其中优选地所述载体是人或灵长类动物来源的血清型。

在本发明的一个特定实施方案中，所述递送载体另外包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其中所述载体是选自以下组的人血清型载体，该组包括：血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型rh10、血清型11、血清型12、血清型13、血清型14、蛇AAV、原始AAV或其衍生的AAV衣壳突变体，优选但不特定地是AAV血清型1或AAV血清型2。

在本发明的一个特定实施方案中，所述递送载体是单链AAV载体或自身互补(或二聚)双链载体。

在本发明的一个特定实施方案中，所述递送载体是如上所述的递送载体，其中对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列可操作地连接到表达控制元件，所述表达控制元件包含启动子和/或增强子，所述启动子和/或增强子产生目的基因产物的充分表达以获得治疗效果。

例如，编码核酸可以可操作地与表达控制元件相连，所述表达控制元件例如是转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号和内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。还应理解，根据期望的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。启动子/增强子可以是组成型的或诱导型的，这取决于期望的表达模式。启动子/增强子可以是原始的或外源的，并且可以是天然的序列或合成的序列。外源旨在表示在引入转录起始区的野生型宿主中未发现转录起始区。最优选的是在靶细胞或待治疗的对象中起作用的启动子/增强子元件。哺乳动物启动子/增强子元件也是优选的。最优选的是在人类神经元中有活性，而在神经胶质细胞中没有活性，或者有较小程度的活性的启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以组成性地或诱导性地表达转基因。

示例性组成型启动子包括但不限于β-肌动蛋白启动子、巨细胞病毒启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白杂交启动子和劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子。诱导型表达控制元件通常用于那些期望对异源核酸序列的表达提供调控的应用中。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件包括神经元特异性、脑特异性、肌肉特异性(包括心脏、骨骼和/或平滑肌)、肝脏特异性、骨髓特异性、胰腺特异性、脾脏特异性和肺特异性启动子/增强子元件。在特定的实施方案中，启动子/增强子在CNS的细胞或组织中起作用，甚至可以对CNS的细胞或组织特异。这样的启动子/增强子包括但不限于在眼睛(例如，视网膜和角膜)、神经元(例如，神经元特异性烯醇酶、AADC、突触蛋白或血清素受体启动子)、神经胶质细胞(例如，S100或谷氨酰胺合酶启动子)和少突神经胶质细胞中起作用的启动子/增强子。已经证明在CNS中诱导转录的其它启动子包括但不限于髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子(Tani等人，1996年)和朊病毒启动子(Loftus等人，2002年)。优选的是神经元特异性启动子展示显著地降低，优选地在神经胶质细胞中无表达。

其它诱导型启动子/增强子元件包括药物诱导型、激素诱导型和金属诱导型元件，以及被外源提供的化合物调节的其它启动子，包括但不限于：锌诱导型金属硫蛋白(MT)启动子；地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子；T7聚合酶启动子系统(参见WO98/10088)；蜕皮激素诱导型昆虫启动子(No等人，1996年)；四环素可抑制系统(Gossen和Bujard，1992年)；四环素诱导型系统(Gossen等人，1995年)；另见(Harvey等人，1998年)；RU486诱导型系统(Wang，DeMayo等人，1997年)；(Wang，Xu等人，1997年)；以及雷帕霉素诱导型系统(Magari等人，1997年)。

在本发明的一个特定实施方案中，启动子和/或增强子选自包括组成型活性启动子的组，例如，CMV(巨细胞病毒立即早期基因增强子/启动子)-或CBA启动子(鸡β肌动蛋白启动子和人巨细胞病毒IE基因增强子)，或诱导型启动子，诱导型启动子包括基因开关、tet-操纵子衍生的启动子，或衍生自例如磷酸甘油酸激酶(PGK)、突触蛋白-1(SYN)、神经元特异性烯醇酶(NSE)的神经元特异性启动子，优选但不限于人来源。

在本发明的一个特定实施方案中，所述递送载体还包含转录后调控元件，优选土拨鼠-肝炎病毒-转录后调控元件。其它可能的转录后调控元件是本领域技术人员已知的。

此外，本发明的主题是重组基因治疗载体，其包含外源的治疗性编码序列，该治疗性编码序列两侧连接用于其表达的遗传元件和用于其复制、基因组包装、基因组整合等的病毒特异性顺式元件。如在AAV的情况中那样，将所述病毒基因组包裹为由病毒特异性蛋白质组成的病毒颗粒。在慢病毒载体的情况下，将病毒基因组和病毒特异性蛋白质如逆转录酶和其它蛋白质包裹到慢病毒衣壳中。通过嵌入了病毒特异性蛋白质的脂质双层将它们进行包膜。脂质体包含上述核苷酸序列或完整的DNA骨架，包括基因治疗的所有调控元件，或递送载体。

脂质体的实例包括DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，胆固醇)、DSPE-PEG2000(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000])或DSPE-PEG2000-mal(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000])或包含鞘磷脂/胆固醇的变体。

在本发明的一个特定实施方案中，所述递送载体另外包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组并且将所述重组AAV(rAAV)载体基因组包裹在AAV衣壳中。

已经将腺相关病毒(AAV)开发为核酸递送载体。对于综述，请参见(Muzyczka，1992年)。AAV是辅助依赖型细小病毒，需要辅助病毒，通常是用于生产性复制的腺病毒或疱疹病毒。AAV代表了目前14种天然存在的人或灵长类动物来源的血清型的不断增长的家族。已经描述了其它哺乳动物物种或禽类或昆虫来源的AAV(参见Berns等人，2013年)。AAV具有小的二十面体衣壳，直径为18纳米至26纳米，含有长度为4千碱基至5千碱基的单链DNA基因组。AAV包裹两种AAV DNA链，将有义DNA链或反义DNA链整合到一个病毒粒子中。AAV基因组携带两个主要的开放阅读框，所述开放阅读框对基因rep和cap编码。Rep对重叠的、非结构调节蛋白质的家族编码。在最佳研究的AAV原型菌株AAV2中，Rep78和Rep68的mRNA由AAV p5启动子转录(Stutika等人，2015年)。Rep78/68是AAV转录、AAV DNA复制、AAV整合到宿主细胞基因组中并从中拯救(rescue)其所必需的。Rep52和Rep40表示从单独的启动子p19转录的Rep78和Rep68的N-端截短形式，并且是将新合成的AAV基因组包裹到预先形成的AAV衣壳所必需的。这些通过三种cap基因衍生的蛋白质VP1、VP2和VP3形成。cap ORF还编码AAP，AAP是不构成衣壳的一部分的组装增强蛋白质。AAV ORF在基因组的任一端侧接反向末端重复序列(ITR)。它们在AAV血清型之间的长度不同，在AAV2中它们包含约145bp，其前125bp能够形成Y-或T-形双链结构。ITR表示顺式DNA复制、包装、基因组整合和拯救所需的最小AAV序列。只有这些必须保留在AAV载体中以确保AAV载体基因组的DNA复制和包装。将侧接AAV-ITR的外源基因复制并包装到AAV衣壳中，条件是AAV基因rep和cap在所选择的包装细胞中以反式表达(Muzyczka，1992年)。

AAV是少数可在体内非分裂细胞中坚持数月和数年的病毒之一，所述体内包括神经元、肌肉、肝脏、心脏等。已示出野生型AAV2以Rep78/68依赖性方式将其基因组整合到宿主细胞基因组中，优选的是染色体基因座与所谓的Rep-结合位点具有DNA序列同源性，所述Rep-结合位点形成AAV-ITR的一部分(Hüser等人，2014年)。相比之下，AAV载体大多以核附加体形式存在。缺乏AAV基因rep和cap的AAV载体很少整合，如果整合了，也没有基因组偏好(Hüser等人，2014年)。尽管如此，在包括神经元的未分裂的、有丝分裂后细胞中已经表明AAV长期持续存在，这使得AAV载体理想地用于CNS转导和遗传或获得性起源的慢性疾病的长期基因添加疗法。

通常，重组AAV载体(rAAV)基因组将仅保留反向末端重复(ITR)序列，以便使载体可有效包装的转基因的大小最大化。可以通过将相应基因稳定地整合到包装细胞中，或者在重组辅助病毒如HSV或杆状病毒中，例如从载体如质粒反式提供结构性和非结构性蛋白质编码序列，例如参见(Mietsch，Grasse等人，2014年)中所综述的。通常，rAAV载体基因组包含至少一个AAV末端重复，更通常地是两个AAV末端重复，其一般将位于异源核苷酸序列的5’和3’端。AAV ITR可以来自任何AAV，包括血清型1至14。由于AAV 2衍生的ITR可以交叉包装到几乎任何AAV血清型衣壳中，所以AAV 2ITR与AAV 2rep组合使用得最多。AAV末端重复不需要维持野生型末端重复序列(例如，野生型序列可以通过插入、缺失、截短或错义突变而改变)，只要末端重复介导所期望的功能即可，例如，复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等。rAAV载体基因组一般为野生型基因组大小的80％至约105％，并且包含作为AAV-ITR的一部分的适当包装信号。为了便于包装到AAV衣壳中，整个载体基因组的大小优选地低于5.2kb，更优选地达到4.8kb，以便于将重组基因组包装到AAV衣壳中。开发了所谓的二聚或自身互补AAV载体(dsAAV)，其包装双链而非单链AAV基因组(McCarty等人，2001年)。这导致AAV基因表达增强，但是代价是转基因能力降低。至多只能包装2kb的外源基因，这对于包括用于神经肽的那些在内的小基因或cDNA来说足够了。

本领域已知的任何合适的方法都可用于生产本发明的表达核酸的AAV载体。AAV载体原料(stocks)可以通过表达转基因的ITR侧接AAV载体基因组的质粒以及所期望的血清型和用于AAV复制的腺病毒衍生的辅助基因的AAV rep/cap表达质粒的共转染来生产(Grimm等人，2003年；Xiao等人，1998年)。AAV载体也可以在哺乳动物或昆虫来源的包装细胞系中生产和/或与重组辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、疱疹病毒家族的另一成员或杆状病毒组合地生产，如(Mietsch，Grasse等人，2014年)所综述和讨论的。

本发明的另一个实施方案是将核酸递送至中枢神经系统细胞中的方法，其包括在足以将对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列引入所述细胞中的条件下，使所述细胞与如上所述的递送载体或重组病毒颗粒接触。

本发明的递送载体提供了用于将核酸序列递送到中枢神经系统细胞、优选神经元中的方式。可将递送载体用于在体外将目的核苷酸序列转移至细胞中，例如，以在体外生产多肽或用于离体基因治疗。还可将载体用于将核苷酸序列递送至需要其的对象中的方法。以这种方式，因此可以在对象体内产生多肽。对象可能需要多肽，因为对象缺乏多肽，或者因为对象中多肽的产生可以作为治疗方法或以其他方式赋予一定的治疗效果，如下文进一步解释的。

在将核酸递送至中枢神经系统细胞中的方法的一个特定实施方案中，从细胞中产生并释放前强啡肽原或前强啡肽原变体。

在将核酸递送至中枢神经系统细胞中的方法的一个特定实施方案中，所述方法包括在足以将对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列引入细胞中的条件下，使所述细胞与如上所述的重组病毒颗粒或脂质体接触。足以将对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列引入细胞中的条件是AAV衣壳与宿主细胞表面受体和共同受体的接触。AAV1衣壳与2至3个与N-乙酰半乳糖胺相连的唾液酸结合，然后与1至4个连接的N-乙酰葡糖胺结合，而AAV2衣壳与硫酸肝素蛋白聚糖，特别是在细胞表面上的6-O-硫酸化肝素和N-硫酸化肝素结合(Mietzsch，Broecker等人，2014年)。AAV共同受体包括FGFR-1，整合素aVb5，肝细胞生长因子受体(c-met)和最近鉴定的通用AAV受体，AAV1、AAV2等转导所必需的AAVR，不论是否存在特异性聚糖(Pillay等人，2016年)。AAVR直接与AAV颗粒结合并帮助运输到反式高尔基体网络。只是不够了解AAV如何进入细胞核。在任何情况下，AAV载体都在细胞核中表达。

本发明的一个实施方案是如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用作药物。

本发明的一个实施方案是如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于制备药物。

本发明的一个实施方案是通过施用如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体来治疗需要治疗的患病对象的方法。

本发明的一个实施方案是如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫。本发明的一个实施方案是如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于制备用于治疗对象的局灶性癫痫、特别是内侧颞叶癫痫的药物。本发明的一个实施方案是如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体提供致癫痫病灶中的人κ阿片受体的激活，从而抑制癫痫发作。特别地，所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体导致肽的按需释放，这对致癫痫病灶中的人κ阿片受体具有激动作用。在一个实施方案中，对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的所述肽选自具有序列SEQ ID No.s 10、SEQID No.s 11、SEQ ID No.s 12、SEQ ID No.s 13、SEQ ID No.s 14或SEQ ID No.s 15的肽的组。

本发明的一个实施方案是通过施用如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体来治疗需要治疗的患病对象的方法，其中所述疾病是局灶性的，特别是内侧颞叶癫痫。

本发明的一个实施方案是如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗患有局灶性癫痫、特别是内侧颞叶癫痫的对象的局灶性癫痫或预防癫痫发作，其中所述载体适用于转导中枢神经系统例如脑的神经元细胞。

本发明的一个实施方案是如上所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于制备用于治疗对象的局灶性癫痫、特别是内侧颞叶癫痫的药物，其中所述载体适用于转导脑的神经元细胞。

载体适用于转导脑的神经元细胞，这意味着其附着于神经元细胞表面受体并穿透细胞膜，例如，通过内吞作用。

在一个特定实施方案中，所述载体或重组病毒颗粒适于外周施用或颅内施用或脑内施用或鞘内施用。这是借助于导管、注射针等来实现的，由深部脑电极引导以检测致癫痫病灶。

本发明的一个实施方案是药物组合物，其包含如上所述的递送载体或重组病毒颗粒和可选的可药用的载剂。可药用的载剂是本领域技术人员已知的。可药用的载剂可以是纳米颗粒、脂质体、纳米凝胶、释放载体颗粒的植入物或产生载体的细胞。

本发明的另一个实施方案是用如上所述的递送载体或重组病毒或脂质体颗粒[体外或离体]感染的细胞。例如，如上所述的递送载体或重组病毒或脂质体颗粒可在制备原代细胞培养物期间离体感染(干)细胞，或感染保持在培养物中的(干)细胞。原代细胞或干细胞两者均可以来源于待治疗的患者或来自另一个对象的干细胞，或动物物种。将感染的细胞移植到患病组织的病灶中以产生治疗性肽。

本发明的主题是治疗患有局灶性癫痫的对象的方法，包括向有此需要的对象施用如上所述的递送载体、重组病毒颗粒或脂质体或药物组合物。

此外，本发明的主题是对人κ阿片(Opiod)受体(KOR)具有激动作用的肽，所述肽来源于或可来源于如上所述的任何递送载体。

优选地，对KOR具有激动作用的所述肽对人KOR显示出7或更高的pKi，如(Toll等人，1998年)所描述的测量。

优选地，对于人KOR显示7或更高的pKi的所述KOR激动肽表现出对人MU阿片样(Opioid)受体(MOR)和人Δ阿片样受体(DOR)的较低pKi，如(Toll等人，1998年)所描述的测量。对于人MOR和人DOR的较低的pKi意指pKi为6或更低。

优选地，所述KOR激动肽对于人KOR显示出7.5或更高的pKi，而对于人MOR和人DOR显示出较低的pKi，如(Toll等人，1998年)所描述的测量。对于人MOR和人DOR的较低pKi意指pKi为6或更低。

在一个特定实施方案中，对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的肽选自包括SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12的肽的组。

以下序列的描述：

SEQ ID No.1(ppDyn)

在处理之前，在人脑中表达人前强啡肽原。

ppDyn的SEQ ID No.2变体1

设计如SEQ ID No.1中的人前强啡肽原，以便移除肽新内啡肽，并由第二拷贝的亮脑啡肽所置换。

ppDyn的SEQ ID No.3变体2

设计如SEQ ID No.2中的人前强啡肽原变体，以便移除肽Dyn A，并由第三拷贝的亮脑啡肽所置换。

ppDyn的SEQ ID No.4信号肽

MAWQGLVLAA CLLMFPSTTA

ppDyn的SEQ ID No.5前肽片段，没有已知的功能

SEQ ID No.6新内啡肽

YGGFLRKYP

SEQ ID No.7Dyn A

YGGFLRRIRPKLKWDNQ

SEQ ID No.8Dyn B(强啡肽B(rimorphin))

YGGFLRRQFKVVT

SEQ ID No.9:亮脑啡肽

YGGFLRRQFKVVTRSQEDPNAYSGELFDA

SEQ ID No.10Dyn A修饰的

YGZFLRRZRPKLKWDNQ

Z代表任何氨基酸，与野生型序列相比，至少一个氨基酸优选地被另一个氨基酸替换。

SEQ ID No.11Dyn B修饰的

YGZFLRRZFKVVT

SEQ ID No.12:亮脑啡肽修饰的

YGZFLRRZFKVVTRSQEDPNAYSGELFDA

SEQ ID No.13(ppDyn修饰的)

SEQ Id No.14(ppDyn修饰的变体1)

SEQ ID No.15(ppDyn修饰的变体2)

以下实施方案是本发明的主题

1.递送载体，其包含对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列，其中所述前强啡肽原或前强啡肽原变体包含选自以下组中的以下序列中的至少一个：

a.Dyn A，其是SEQ Id No.7(SEQ ID No.1的207位至223位AA；ppDyn)，或由前13位AA(第一个从N-末端开始)组成的其变体，或由前8位AA组成(第一个从N-末端开始)的其变体，

b.Dyn B，其是SEQ ID No.8(SEQ ID No.1的226位至238位AA；ppDyn)，

d.根据SEQ Id No.7的Dyn A的变体，其在从SEQ ID No.7(YGGFLRRI)的N-端计数的前8位AA内具有至少60％的氨基酸序列同一性，

e.根据SEQ ID No.8的Dyn B的变体，其在从SEQ ID No.8(YGGFLRRQ)的N-端计数的前8位AA内具有至少60％的氨基酸序列同一性，

f.根据SEQ ID No.9的亮脑啡肽的变体，其在从SEQ ID No.9(YGGFLRRQ)的N-端计数的前8位AA内具有至少60％的氨基酸序列同一性。

2.根据实施方案1所述的递送载体，其中所述变体分别在从SEQ ID No.7(YGGFLRRI)、SEQ ID No.8(YGGFLRRQ)或SEQ ID No.9(YGGFLRRQ)的N-端计数的前8位AA内具有至少70％的氨基酸序列同一性。

3.根据实施方案1或实施方案2所述的递送载体，其中所述变体分别在从SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的N-端计数的前8位AA内具有至少80％的氨基酸序列同一性。

4.根据实施方案1至3中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体包含对前强啡肽原变体编码的DNA序列，所述前强啡肽原变体包含选自以下组的变体的以下序列中的至少一个：

a.SEQ ID No.10(YGZFLRRZRPKLKWDNQ)

b.SEQ ID No.11(YGZFLRRZFKVVT)

c.SEQ Id No.12(YGZFLRRZFKVVTRSQEDPNAYSGELFDA)

Z代表任何氨基酸，至少一个优选地被替换。

5.根据实施方案1至4中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8和/或SEQ ID No.9或其变体编码的多个DNA序列，其中根据SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8和/或SEQ ID No.9或其变体的序列侧接肽酶识别信号。

6.根据实施方案1至5中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ IDNo.8和/或SEQ ID No.9或其变体编码的多个DNA序列，其中根据SEQ ID No.8和/或SEQ IDNo.9或其变体的序列侧接肽酶识别信号。

7.根据实施方案1至6中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ IDNo.8和/或SEQ ID No.9或其变体编码的多个DNA序列，并且其中所述递送载体不包含对SEQID No.6和/或SEQ ID No.7编码的DNA。

8.根据实施方案1至7中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ IDNo.2或SEQ ID No.14编码的DNA。

9.根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体包含对SEQ IDNo.3或SEQ ID No.15编码的DNA。

10.根据实施方案1至9中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体另外包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组或重组慢病毒基因组。

11.根据实施方案1至10中任一项所述的递送载体，其包含重组AAV载体，其中优选地所述载体是人或灵长类动物血清型载体。

12.根据实施方案1至11中任一项所述的递送载体，其包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其中所述载体是选自以下组的人血清型载体，所述组包含：血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型rh10、血清型11、血清型12、血清型13、血清型14、蛇AAV、原始AAV或其衍生的AAV衣壳突变体，优选为血清型1或血清型2。

13.根据前述实施方案中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体是单链AAV载体或自身互补(或二聚)双链载体。

14.根据前述实施方案中任一项所述的递送载体，其中所述对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列可操作地连接到表达控制元件，所述表达控制元件包含启动子和/或增强子，所述启动子和/或增强子产生目的基因产物的充分表达以获得治疗效果，其中所述启动子和/或增强子选自组成型活性启动子，例如，CMV-或CBA启动子(鸡β肌动蛋白启动子和人巨细胞病毒IE基因增强子)，或诱导型启动子，其包括基因开关、tet-操纵子衍生的启动子，或衍生自例如磷酸甘油酸激酶(PGK)、突触蛋白-1启动子(SYN)、神经元特异性烯醇酶(NSE)的神经元特异性启动子。

15.根据前述实施方案中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体还包含转录后调控元件，优选为土拨鼠-肝炎病毒-转录后调控元件。

16.重组病毒颗粒或脂质体，其包含根据前述实施方案中任一项所述的递送载体。

17.根据实施方案16所述的重组病毒颗粒或脂质体，其中所述递送载体另外包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，并且将所述rAAV载体基因组包裹在AAV衣壳中，或者其中所述递送载体另外包含重组慢病毒载体基因组并将其包装在慢病毒颗粒中。

18.将核酸递送至中枢神经系统的细胞中的方法，其包括在足以将所述对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列引入所述细胞中的条件下，使所述细胞与根据实施方案1至17中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体接触。

19.根据实施方案18所述的方法，其中所述前强啡肽原或前强啡肽原变体由所述细胞产生和释放。

20.将核酸递送至中枢神经系统细胞中的方法，其包括在足以将所述对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列引入所述细胞中的条件下，使所述细胞与根据实施方案18或19所述的重组病毒颗粒或脂质体接触。

21.根据实施方案20所述的方法，其中所述前强啡肽原或前强啡肽原变体由所述细胞产生和释放。

22.根据实施方案1至17中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体，用作药物。

23.根据实施方案1至17中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体，用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫。

24.根据实施方案1至17中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体，其用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，其中所述载体适用于转导脑的神经元细胞。

25.根据实施方案1至17中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体，用于治疗对象的局灶性癫痫，其中所述载体或重组病毒颗粒适于外周施用或颅内施用或脑内施用或鞘内施用。

26.药物组合物，其包含根据实施方案1至17中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒，以及可选的可药用的载剂。

27.用根据实施方案1至17所述的递送载体或重组病毒或脂质体颗粒优选地在体外或离体感染的细胞。

28.治疗患有局灶性癫痫的对象的方法，其包括向所述对象施用如实施方案1至17和26中所限定的递送载体、重组病毒颗粒或药物组合物。

29.根据实施方案28所述的方法，其中所述方法包括如实施方案18至21中所限定的方法中的任一种。

30.来源于根据实施方案1至15所述的任何递送载体的对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的肽。

31.对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的肽，选自包括SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12的肽的组。

另外的实施方案是本发明的主题

1.递送载体，其包含对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列，并且其中所述递送载体驱动前肽原的表达，所述前肽原是前强啡肽原或前强啡肽原变体，其中所述前肽原包含信号肽，并且其中所述前强啡肽原或前强啡肽原变体包含选自以下组的以下序列中的至少一个：

b.Dyn B，其是SEQ ID No.8(SEQ ID No.1的226位至238位AA；ppDyn)，

4.根据实施方案1至3中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体驱动前肽原的表达，所述前肽原是前强啡肽原或前强啡肽原变体，其中所述前肽原包含信号肽，并且其中所述递送载体包含对前强啡肽原变体编码的DNA序列，所述前强啡肽原变体包含选自以下组的变体的以下序列中的至少一个：

a.SEQ ID No.10(YGZFLRRZRPKLKWDNQ)

b.SEQ ID No.11(YGZFLRRZFKVVT)

c.SEQ Id No.12(YGZFLRRZFKVVTRSQEDPNAYSGELFDA)，

其中Z代表任何氨基酸，并且其中当与根据a.、b.或c.的序

列的所述强啡肽片段的野生型序列相比时，在根据a.、b.或c.的

序列中的至少一个Z优选地被另一种氨基酸替换。

5.根据实施方案1至4中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体还包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组或重组慢病毒基因组。

6.根据实施方案1至5中任一项所述的递送载体，其包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其中所述载体是选自以下组的人血清型载体，所述组包含：血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型rh10、血清型11、血清型12、血清型13、血清型14、蛇AAV、原始AAV或其衍生的AAV衣壳突变体，优选为血清型1或血清型2。

7.重组病毒颗粒或脂质体，其包含根据前述实施方案中任一项所述的递送载体。

8.根据实施方案7所述的重组病毒颗粒或脂质体，其中所述递送载体还包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，并且将所述rAAV载体基因组包裹在AAV衣壳中，或者其中所述递送载体还包含重组慢病毒载体基因组并将其包装在慢病毒颗粒中。

9.将核酸递送至中枢神经系统的细胞中的方法，其包括在足以将所述对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列引入所述细胞中的条件下，使所述细胞与根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体接触。

10.根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体，用作药物。

11.根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体提供致癫痫病灶中的人κ阿片受体的激活，从而抑制癫痫发作。

12.根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体提供所述致癫痫病灶中的人κ阿片受体的激活，从而抑制癫痫发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体导致肽的按需释放，所述肽对所述致癫痫病灶中的人κ阿片受体具有激动作用。

13.根据实施方案10至12所述，根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述载体或重组病毒颗粒适于外周施用或颅内施用或脑内施用或鞘内施用或脑实质内施用。

14.根据实施方案10至13所述，根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体应用于脑内，优选地应用于病灶。

15.药物按需释放组合物，其包含根据实施方案1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体，以及可选的可药用的载剂。

16.用根据实施方案1至8所述的递送载体或重组病毒或脂质体颗粒优选地在体外或离体感染的细胞。

17.治疗患有局灶性癫痫、特别是内侧颞叶癫痫的对象的方法，或预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫发作的方法：

包括向所述对象施用如实施方案1至8中所限定的递送载体、重组病毒颗粒或药物组合物，其中优选地，所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体对前肽原编码，前肽原在成熟和释放后提供致癫痫病灶中的人κ阿片受体的激活，从而抑制癫痫发作，并且其中优选地，所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体应用于脑内，优选地应用于病灶。

18.来源于根据实施方案1至6所述的任一种递送载体、对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的肽，其中优选地，所述肽选自包含具有SEQ ID No.s 10、SEQ ID No.s 11、SEQID No.s 12、SEQ ID No.s 13、SEQ ID No.s 14和SEQ ID No.s 15的肽的组。

19.对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的肽，其中所述肽选自包含具有SEQ IDNo.s 10、SEQ ID No.s 11、SEQ ID No.s12、SEQ ID No.s 13、SEQ ID No.s 14和SEQ IDNo.s 15的肽的组。

20.药物按需释放组合物，其包含根据实施方案18或19所述的肽。

附图说明

图1：

描绘的是AAV载体骨架，其包括表达人前强啡肽原(红色)或□GFP(蓝色)的所有调控遗传元件。

图2：

在注射rAAV-pDyn(SEQ ID No.1)之前两天至之后七天，从红藻氨酸注射的动物的同侧海马体获得的EEG记录。

图3：

在注射rAAV-pDyn之前2天至之后4个月，通过红藻氨酸注射的动物的同侧海马体和运动皮质的EEG记录来获得的全身性癫痫发作的频率。pDyn＝SEQ ID No.1；Var.1＝SEQ IDNo.2；Var.2＝SEQ ID No.3

图4：

通过微透析和随后的EIA测量的在不同类型的刺激期间释放的经处理的Dyn B(Dyn B＝SEQ ID No.8)的量。在实验之前3周时，向pDyn敲除小鼠注射rAAV pDyn(pDyn＝SEQ IDNo.1；Var.2＝SEQ ID No.3)。由于这些小鼠不表达内源性pDyn，因此测量的所有Dyn B都是载体衍生的。

图5(A至F):

来自不同组的用rAAV处理的自然(naive)动物或KA注射的动物的巴恩斯迷宫探针(Barnes maze probe)测试。对于记忆测试，将迷宫分为多个象限(quarters)。Q1是包含目标孔的一个象限，Q2和Q4是围绕Q1的象限，Q3是相对的一个象限。用表达□GFP或pDyn SeqID no.1的rAAV来注射动物(除了C中描述的那些)。在A和B中，描述了用rAAV注射但未用红藻氨酸处理的小鼠的数据。图C示出完全未处理的动物。图D、E和F示出在红藻酸处理后两周，在红藻氨酸之后每隔一段时间用rAAV处理的同一组动物，如图表所示。

图6:

戊四唑是GABA_A受体的抑制剂，并且在注射到尾静脉中时诱导癫痫发作。与野生型小鼠相比，pDyn缺陷型动物表现出降低的癫痫发作阈值。这可以通过用Dyn B处理来拯救。第3位的甘氨酸被丙氨酸置换的Dyn B变体(Dyn B＝SEQ ID No.8，Dyn B G3A＝SEQ ID No.11，其中第3位的Z是丙氨酸，Dyn B G3A+Q8A＝SEQ ID No.11，其中，第3位的Z是丙氨酸，SEQ IDNo.11的第8位的Z是丙氨酸，Dyn B Q8A＝SEQ ID No.11，其中第8位的Z是丙氨酸)在该测试中表现出效能更高，表明较低浓度的这些肽可引起抗惊厥作用。由此，我们预期基因治疗的效果会很早开始，每位患者所需的载体数量也会更少。

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具体实施方式

实施例1

1.1 AAV构建物

具有AAV2-ITR侧接载体骨架的质粒含有人CMV-IE基因增强子，随后是截短形式的鸡β肌动蛋白启动子。这些驱动了全长密码子优化的人ppdyn序列(AA SEQ ID No.1)或者变体(AA SEQ ID No.2；SEQ ID No.3)或截短的变体(□GFP)中任一个或全长形式的EGFP的表达。通过土拨鼠肝炎病毒翻译后增强子元件(WPRE)来增强基因表达，随后是来源于牛生长激素的poly A⁺信号序列。AAV2ITR处于其野生型构型以产生具有ssDNA基因组的AAV载体，或者将一个ITR截短以便产生具有dsDNA基因组的自身互补AAV载体(图1)。

1.2 AAV载体制备

将HEK 293细胞以25％至33％融合接种在含有5％FCS的DMEM中。24小时后通过磷酸钙共转染来转染细胞。基本上如其它地方所述来生产AAV载体(Mietzsch，Grasse等人，2014年)。简言之：如上所述，双质粒(pDG)共转染方案使用AAV rep、cap、Ad5辅助基因的质粒和表达ppdyn(SEQ ID No.1)或其变体(SEQ ID No.2；SEQ ID No.3)的rAAV的质粒。12小时后用FCS含量降低(2％)的培养基来替换所述培养基。转染后72小时，收获培养物，通过三次冻融循环使细胞裂解。将粗制裂解物用250U/ml核酸酶(benzonase)(Merck)在37℃下消化1小时以降解输入和未包装的质粒DNA，以8,000g离心30分钟以使细胞碎片沉淀。

1.3 rAAV纯化

将rAAV载体包装在血清型1或2衣壳中，并通过一步肝素琼脂糖凝胶色谱法或通过AVB琼脂糖凝胶亲和色谱法在纯化器(GE Healthcare)上使用1ml预装的HiTrap柱从核酸酶处理的、澄清的冻融上清液中进行纯化，如下：将冻融上清液在补充有1mM MgCl2和2.5mM KCl(1·PBSMK)的1·磷酸盐缓冲盐水(PBS)中1：1稀释，然后以0.5ml/分钟加载到柱上。用20ml 1·PBS-MK以1ml/分钟的速率冲洗柱。用0.1M乙酸钠和0.5M NaCl pH 2.5以1ml/分钟的速率洗脱AAV载体，并立即用1/10体积的1M Tris-HCl pH 10进行中和。使用Slide-A-Lyzer透析盒(10,000MWCO；Thermo Scientific)针对1xPBS-MK来透析经纯化的rAAV制备物(preparation)(Mietzsch，Grasse等人，2014年)。

1.4.rAAV载体制备物的定量

将高度纯化的rAAV载体制备物用蛋白酶K在56℃下消化2小时。通过用苯酚和氯仿反复萃取来纯化DNA，并用乙醇沉淀。使用Fast Start DNA Master SYBR Green试剂盒(Roche)，通过定量Light-Cycler PCR分析衣壳释放的AAV基因组的系列稀释液。PCR引物对载体骨架的牛生长激素基因衍生的polyA位点(5’-CTAGAGCTCGCTGATCAGCC-3’和5’-TGTCTTCCCAATCCTCCCCC-3’)具有特异性。将高纯度AAV制剂的滴度测量为含有基因组颗粒(gp)/ml的AAV-DNA(Mietzsch，Grasse等人，2014年)。

实施例2

动物

在该研究中考察了C57BL/6N野生型和pDyn敲除(pDyn-KO)小鼠。使pDyn-KO小鼠与C57BL/6N背景经过10代回交(Loacker等人，2007年)。为了繁殖和维持，将小鼠分组饲养，自由获取食物和水。将温度固定在23℃和60％湿度下，12小时光-暗循环(光照在上午7点到下午7点)。涉及动物的所有程序均经奥地利动物实验伦理委员会(Austrian AnimalExperimentation Ethics Board)按照欧洲保护用于实验和其它科学目的的脊椎动物保护公约ETS编号：123和加拿大动物保护委员会批准。我们尽一切努力减少使用的动物数量。

实施例3

红藻氨酸注射和电极植入

将雄性小鼠(12周至14周)用氯胺酮(160mg/kg，i.p.；Graeub兽医产品，瑞士)镇静，然后通过精确的蒸发器(Midmark，美国)用七氟醚深度麻醉。如前所述，给小鼠注射50nl20mM KA溶液到海马体内(RC-1.80mm；ML+1.80mm；DV-1.60mm)(Loacker等人,2007年)。在KA施用后立即植入两个电极(一个皮质电极和一个深度电极)。将环氧类树脂涂覆的钨深度电极(直径250μm；FHC，美国)置于海马体中，靶向CA1区域(RC-1.80mm；ML+1.80mm；DV-1.60mm)。表面电极是放置在运动皮层顶部的颅骨中的镀金螺钉(RC+1.70mm；ML+1.6mm，前囟作为参考点)，以监测异常EEG活动的概括。将另外的表面电极作为接地(ground)和参比放置在小脑上。用牙科用丙烯酸酯(Heraeus Kulzer GmbH，德国)将电极固定在适当位置。

实施例4

rAAV注射

对于需要施用rAAV的实验，植入引导插管，将其连接到海马体深度电极。所有动物在手术前20分钟接受美洛昔康(2mg/kg)作为镇痛治疗。对于rAAV注射，在注射的时间期间(20分钟)将动物在七氟醚室中轻度麻醉。使用注射泵以0.1μL/分钟的流量通过引导插管进行注射，注射的总体积为2μL。

实施例5

脑电图记录(recoding)和分析

使用无线记录装置(Neurologger，TSE，德国)获得EEG，并使用SciWorks软件(Datawave Technologies，美国)自动分析。对EEG的癫痫样尖峰进行过滤，其定义为持续小于70ms的高振幅放电(>3×基线)。将尖峰序列(train)定义为至少发生三次频率高于1Hz且持续至少1s的尖峰(见图2)。将频率较低的尖峰计为发作间尖峰。将延长的海马体阵发性放电(hpd)定义为持续最少10秒的尖峰序列(Zangrandi等人，2016年)。通过海马体深度电极和运动皮质表面电极中的高压EEG异常的共同表观目测评估全身性癫痫发作(参见图3)。

实施例6

空间记忆测试(巴恩斯迷宫)

为了评估自然动物和经处理的动物的学习和记忆，使用巴恩斯迷宫。巴恩斯迷宫在60lux的平的圆形桌子(直径100厘米)上进行，其周围有20个孔。在这些孔中，只有一个允许小鼠离开迷宫进入逃跑暗盒。将视觉线索围绕圆盘放置，间隔为90°。第一天是适应日，允许小鼠在5分钟内自由探索迷宫，其中目标孔打开。在整个实验过程中，逃跑暗盒的位置保持不变。当小鼠找到孔时，将盒子关闭，将动物放在这里2分钟，以让其把逃跑暗盒当作安全的地方。如果动物在5分钟内没有找到目标孔，则将动物轻轻地引导到所述孔。在接下来的4天内完成采集。进行了3次最长3分钟的试验，一旦小鼠发现所述孔，就将其放在里面2分钟。如果小鼠在3分钟后没有找到孔，则将其轻轻地引导到所述孔。计算动物所犯的主要错误和寻找孔的等待时间，并将其定义为学习标准。在第六天进行了一次探针试验。将所有的孔都关闭，小鼠可以在5分钟内自由探索迷宫。为了评估，将板划分为多个象限，并测量在每个象限中花费的时间(参见图5)。将先前包含开放式逃跑孔的象限称为Q1，其侧面为Q2和Q4，而Q3则与Q1相对。

实施例7

微透析

在pDyn-KO动物上进行微透析，所述pDyn-KO动物如上所述在微透析实验前3周接受rAAV-pDyn注射到一个海马体中。在载体注射时(RC-1.80mm；ML+1.80mm；DV-1.60mm)，给动物植入刺激电极(RC-4.20mm；ML+3.20mm；DV-4.90mm)和引导插管，所述引导插管靶向rAAV注射的海马体的门(hilus)。对于微透析，将MAB-2探针(SciPro，Sanborn，NY)置于海马体中并用人工CSF(140mM NaCl；3.0mM KCl；1.25mM CaCl₂；1.0mM MgCl₂；1.2mM Na₂HPO₄；0.3mM NaH₂PO₄；3mM葡萄糖，pH 7.2)以0.4μL/分钟的速率进行冲洗。收集ACSF 3×25分钟，然后进行25分钟低频刺激(300μA；分离的0.3毫秒矩形脉冲(square pulses)，间隔为10秒，ISO-STIM 01D，NPI，Tamm，德国)。在另外25分钟基线后，进行25分钟的高频刺激(150μA；0.3毫秒矩形脉冲的序列，相隔20毫秒，持续1秒；序列间隔为10秒)。

实施例8

强啡肽B酶免疫测定(EIA)

根据制造商的手册，通过特异性Dyn B(SEQ ID No.8)EIA(S-1429；Peninsula；SanCarlos，CA(加拿大))测量微透析实验洗脱液中经处理的强啡肽B的含量。简言之，将样品与抗血清一起孵育1小时，然后与Bt-示踪剂一起孵育一整夜。在第二天，在用EIA缓冲液洗涤五次后，添加抗生蛋白链菌素-HRP一小时。在另外洗涤5次后，使样品与TMB溶液反应5分钟，然后在平板读取器上在450nm下进行分析。基于平行运行的校准样品分析Dyn B(SEQ IDNo.8)含量并表示为ng/ml(参见图4)。

实施例9

统计分析

采集后，使用pClamp 10.3(分子装置)观察和分析电生理记录。使用Mac的Prism 5(5.0f版本)进行体内实验的统计分析并生成图。对于统计分析，将具有Dunnett事后检验的单向ANOVA应用于体内实验。对于电生理学，将双尾配对t检验应用于静息膜电位分析，将单向ANOVA用于比较药物对IPSC的影响。认为p值小于0.05是显著的。将数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。

实施例10

癫痫发作阈值

癫痫发作阈值是发生癫痫发作的易感性的量度。将对癫痫发作诱发剂或刺激的抗性用作动物中的读数。将GABA_A受体拮抗剂戊四唑输注到啮齿动物的尾部静脉是测量癫痫发作阈值的可接受方法。物质或治疗的抗惊厥活性可通过在应用时增加的癫痫发作阈值来证明。pDyn缺陷小鼠表现出比野生型小鼠更低的癫痫发作阈值。这可以通过κ阿片受体激动剂来拯救。

通过在自由移动的pDyn缺陷小鼠上以100μl/分钟(100μg/ml PTZ的盐水溶液，pH7.4)的速率的戊四唑(PTZ)(参见图6)尾部静脉输注来测定癫痫发作阈值。当动物表现出全身性阵挛性癫痫发作时停止输注。癫痫发作阈值剂量是根据与体重相关的输注体积计算的。将Dyn B或其修饰的变体溶解在DMSO中并在含有终浓度为10％DMSO、3％吐温80的盐水中稀释至最终剂量。在轻度七氟醚麻醉下在尾部静脉输注前30分钟将3μl肽溶液施用到小脑延髓池中。测试下列肽：Dyn B＝SEQ ID No.8，Dyn B G3A＝SEQ ID No.11，其中第3位的Z是丙氨酸，Dyn B G3A+Q8A＝SEQ ID No.11，其中第3位的Z是丙氨酸，并且SEQ ID No.11的第8位的Z是丙氨酸，Dyn B Q8A＝SEQ ID No.11，其中第8位的Z是丙氨酸。

Claims

1.一种递送载体，包含对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列，并且其中所述递送载体驱动前肽原的表达，所述前肽原是前强啡肽原或前强啡肽原变体，其中所述前肽原包含信号肽，并且其中所述前强啡肽原或前强啡肽原变体包含选自以下组的以下序列中的至少一个：

b.Dyn B，其是SEQ ID No.8(SEQ ID No.1的226位至238位AA；ppDyn)，

c.亮脑啡肽，其是SEQ ID No.9(SEQ ID No.1的226位至254位AA；ppDyn)，

2.根据权利要求1所述的递送载体，其中所述变体分别在从SEQ ID No.7(YGGFLRRI)、SEQ ID No.8(YGGFLRRQ)或SEQ ID No.9(YGGFLRRQ)的N-端计数的前8位AA内具有至少70％的氨基酸序列同一性。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的递送载体，其中所述变体分别在从SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的N-端计数的前8位AA内具有至少80％的氨基酸序列同一性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体驱动前肽原的表达，所述前肽原是前强啡肽原或前强啡肽原变体，其中所述前肽原包含信号肽，并且其中所述递送载体包含对前强啡肽原变体编码的DNA序列，所述前强啡肽原变体包含选自以下组的变体的以下序列中的至少一个：

a.SEQ ID No.10(YGZFLRRZRPKLKWDNQ)

b.SEQ ID No.11(YGZFLRRZFKVVT)

c.SEQ Id No.12(YGZFLRRZFKVVTRSQEDPNAYSGELFDA)，

其中Z代表任何氨基酸，并且其中当与根据a.、b.或c.的序列的所述强啡肽片段的野生型序列相比时，在根据a.、b.或c.的序列中的至少一个Z优选地被另一种氨基酸替换。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的递送载体，其中所述递送载体另外包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组或重组慢病毒基因组。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的递送载体，其包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，其中所述载体是选自以下组的人血清型载体，所述组包含：血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型rh10、血清型11、血清型12、血清型13、血清型14、蛇AAV、原始AAV或来源于其的AAV衣壳突变体，优选为血清型1或血清型2。

7.一种重组病毒颗粒或脂质体，其包含根据前述权利要求中任一项所述的递送载体。

8.根据权利要求7所述的重组病毒颗粒或脂质体，其中所述递送载体另外包含重组腺相关病毒(AAV)载体基因组，并且将所述rAAV载体基因组包裹在AAV衣壳中，或者其中所述递送载体另外包含重组慢病毒载体基因组并将其包装在慢病毒颗粒中。

9.一种将核酸递送至中枢神经系统细胞中的方法，其包括在足以将所述对前强啡肽原或前强啡肽原变体编码的DNA序列引入所述细胞中的条件下，使所述细胞与根据权利要求1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体接触。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用作药物。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体提供致癫痫病灶中的人κ阿片受体的激活，从而抑制癫痫发作。

12.根据权利要求1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体提供所述致癫痫病灶中的人κ阿片受体的激活，从而抑制癫痫发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体导致肽的按需释放，所述肽对所述致癫痫病灶中的人κ阿片受体具有激动作用。

13.根据权利要求10至12所述的、根据权利要求1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述载体或重组病毒颗粒适于外周施用或颅内施用或脑内施用或鞘内施用或脑实质内施用。

14.根据权利要求10至13所述的、根据权利要求1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体用于治疗对象的局灶性癫痫，特别是内侧颞叶癫痫，或用于预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作，其中所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体应用于脑内，优选地应用于病灶。

15.一种药物按需释放组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的递送载体或重组病毒颗粒或脂质体，以及可选的可药用的载剂。

16.用根据权利要求1至8所述的递送载体或重组病毒或脂质体颗粒优选地在体外或离体感染的细胞。

17.一种治疗患有局灶性癫痫、特别是内侧颞叶癫痫的对象的方法，或预防患有局灶性癫痫的对象的癫痫性发作的方法，包括：

向所述对象施用如权利要求1至8中所限定的递送载体、重组病毒颗粒或药物组合物，其中优选地，所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体对前肽原编码，所述前肽原在成熟和释放后提供所述致癫痫病灶中的人κ阿片受体的激活，从而抑制癫痫发作，并且其中优选地，所述递送载体或重组病毒颗粒或脂质体应用于脑内，优选地应用于病灶。

18.来源于自根据权利要求1至6所述的递送载体中的任一种的对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的肽，其中优选地所述肽选自包含具有SEQ ID No.s 10、SEQ ID No.s 11、SEQID No.s 12、SEQ ID No.s13、SEQ ID No.s 14和SEQ ID No.s 15的肽的组。

19.对人κ阿片受体(KOR)具有激动作用的肽，其中所述肽选自包含具有SEQ ID No.s10、SEQ ID No.s 11、SEQ ID No.s 12、SEQ ID No.s 13、SEQ ID No.s 14和SEQ ID No.s15的肽的组。

20.一种药物按需释放组合物，其包含根据权利要求18或19所述的肽。