JP6702851B2 - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

Description

この発明は、被撮像物からの反射光と参照光との干渉光成分を検出して撮像を行う技術に関し、特に光透過性を有する容器内の被撮像物を撮像する技術に関するものである。

医学や生化学の技術分野では、容器中で培養された細胞や微生物を観察することが行われる。観察対象となる細胞等に影響を与えることなく観察を行う方法として、顕微鏡等を用いて細胞等を撮像する技術が提案されている。このような技術の１つとして、光コヒーレンストモグラフィ技術を利用したものがある。この技術は、光源から出射される低コヒーレンス光を照明光として被撮像物に入射させ、被撮像物からの反射光（信号光）と光路長が既知である参照光との干渉光を検出することで、被撮像物からの反射光の深さ方向における強度分布を求めて断層画像化するものである。

このうち、広帯域成分を含む信号光と参照光とを干渉させ、干渉光のスペクトルをフーリエ変換することで深さ方向の反射光強度分布を得る技術は、フーリエドメイン光干渉断層撮像技術（Fourier Domain Optical Coherence Tomography；ＦＤ−ＯＣＴ）と呼ばれる。ＦＤ−ＯＣＴ技術では、干渉光のスペクトルにおける波長が被撮像物の深さ方向に対応する情報となるため、光学系の被写界深度内の被撮像物の断層情報を一括して取得することができ、高速撮像が可能である。

ＦＤ−ＯＣＴ技術においては、画像に複素共役ノイズと呼ばれるノイズが被撮像物の像に重畳されることが知られている。これは、フーリエ変換によって干渉光のスペクトルを深さ方向の反射光強度分布に変換するという原理上、不可避的に発生するものである。このようなノイズの影響を排除するための技術としては、例えば特許文献１に記載の技術がある。この技術は、複素共役ノイズをキャンセルするための従来技術である位相シフト法が有する複数回の撮像を要するという問題を解決するため、光路長の異なる２つの参照光をチョッパで切り替えながら信号光と干渉させるようにしたものである。

特開２０１０−１６４５７４号公報

容器中に担持された細胞等を被撮像物とする場合、光透過性を有する容器の壁部（例えば底部）を介して撮像が行われる場合がある。このような場合、容器壁面が強い反射面として作用するため、断層画像には容器壁面からの反射光に起因する複素共役ノイズが重畳されることになる。参照基準面の設定によっては、必要とされる被撮像物の像と容器壁面の複素共役像とが重なってしまうことがあり、被撮像物の正確な断層情報が得られないという問題が生じ得る。

上記従来技術のノイズ除去方法は、このようなケースにも一定の効果を奏し得ると考えられる。しかしながら、容器壁部からの強い反射がある場合を想定したものではないため、実効性は不明である。また、複数の参照系を有する特殊な装置構成が必要となり、装置が複雑化、大型化して高コストになるという問題がある。このことから、このような複雑な装置構成を必要とせずに、容器壁面からの反射光に起因する複素共役ノイズの影響を抑制することのできる技術の確立が望まれる。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、被撮像物からの反射光と参照光との干渉を利用して容器内の被撮像物を撮像する技術において、簡単な構成で、容器壁面での反射に起因する画像ノイズの影響のない画像品質の良好な断層画像を得ることのできる技術を提供することを目的とする。

この発明の一の態様は、光透過性の壁部を有する容器内に収容された被撮像物を断層撮像する撮像装置において、上記目的を達成するため、光源から出射される広帯域の低コヒーレンス光が分岐された一の分岐光を照明光として前記壁部を介して前記被撮像物に入射させ、前記壁部を介して出射される前記被撮像物の反射光を物体光学系により集光した信号光と、他の一の分岐光から生成された参照光とが干渉して生じる干渉光を検出し、検出された前記干渉光に応じた干渉信号を出力する検出手段と、前記干渉信号に基づき、前記干渉光のスペクトルをフーリエ変換して前記照明光の入射方向における前記被撮像物の反射光強度分布を求め、該反射光強度分布から断層画像を作成する信号処理手段と、前記被撮像物に対する前記物体光学系の焦点深さおよび前記参照光の光路長を変更設定する制御手段とを備え、前記制御手段は、前記壁部の表面のうち前記被撮像物側の第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離が前記壁部の厚さより小さい所定の閾値よりも小さくなるように前記焦点深さを設定するとき、前記参照光の光路長を、前記第１表面までの前記照明光の光路長と等しい値に設定する。

また、この発明の他の態様は、光透過性の壁部を有する容器内に収容された被撮像物を断層撮像する撮像方法において、上記目的を達成するため、光源から出射される広帯域の低コヒーレンス光が分岐された一の分岐光を照明光として前記壁部を介して前記被撮像物に入射させ、前記壁部を介して出射される前記被撮像物の反射光を物体光学系により集光した信号光と、他の一の分岐光から生成された参照光とが干渉して生じる干渉光を検出し、検出された前記干渉光に応じた干渉信号を出力する工程と、前記干渉信号に基づき、前記干渉光のスペクトルをフーリエ変換して前記照明光の入射方向における前記被撮像物の反射光強度分布を求め、該反射光強度分布から断層画像を作成する工程とを備え、前記被撮像物に対する前記物体光学系の焦点深さおよび前記参照光の光路長を変更設定可能であり、前記壁部の表面のうち前記被撮像物側の第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離が前記壁部の厚さより小さい所定の閾値よりも小さくなるように前記焦点深さを設定するとき、前記参照光の光路長を、前記第１表面までの前記照明光の光路長と等しい値に設定する。

この発明における撮像原理は、広帯域成分を含む信号光と参照光とを干渉させ、干渉光のスペクトルをフーリエ変換することで深さ方向の反射光強度分布を得る、ＦＤ−ＯＣＴ技術によるものである。容器壁部を介したＦＤ−ＯＣＴ撮像では、壁部の表面のうち被撮像物に近い側の表面、該表面を挟んで被撮像物とは反対側の表面それぞれの複素共役像が被撮像物の像に重なってノイズとなり得る。

容器壁面の複素共役像は、容器壁面の像が現れる位置に対して共役な、すなわち当該位置に対し参照光の光路長で規定される参照基準面に関して対称な位置に現れるから、その出現位置は参照基準面の設定に依存する。このため、参照基準面を被撮像物から十分に離すことで容器壁面の複素共役像を被撮像物の像から分離するという対応も考えられるが、画像品質の点では参照基準面を被撮像物の近傍に設定することが望ましい。より具体的には、被撮像物からの反射光を集光する物体光学系の焦点面と参照基準面とができるだけ近いことが好ましい。

そこで本発明では、物体光学系の焦点深さに応じて参照基準面の位置が設定される。具体的には、壁部の表面のうち被撮像物側の第１表面から物体光学系の焦点までの距離が壁部の厚さより小さい所定の閾値よりも小さくなるように焦点深さを設定するとき、参照光の光路長を、第１表面までの照明光の光路長と等しい値に設定する。このことは、壁部の表面のうち被撮像物とは反対側の第２表面から、照明光の光路に直交する仮想的な平面であって当該平面までの照明光の光路長が参照光の光路長と等しい参照基準面までの距離と、壁部の厚さとが等しくなるように、参照光の光路長あるいは基準参照面の位置を設定することと等価である。このように参照光の光路長を設定するとき、第１表面の複素共役像は、断層画像における第１表面と同じ位置にその実像と重なって現れる。一方、第２表面の複素共役像は、断層画像において第１表面から壁部の厚さ分だけ離れた位置に現れる。

したがって、容器内の断層画像の深さ方向においては、第１表面からの距離が壁部の厚さよりも小さい範囲には容器壁面に起因する複素共役像は現れない。そして、物体光学系の焦点位置から第１表面までの距離は壁部の厚さより小さいから、焦点位置は容器壁面に起因する複素共役像のない範囲に含まれる。つまり、焦点面の近傍では容器壁面に起因する複素共役ノイズの影響を受けずに被撮像物の断層情報を取得することが可能である。

使用される容器の形状から壁部の厚さを予め把握しておくことが可能であり、撮像時において第１表面および第２表面が占める位置も推定可能である。したがって、第１表面の複素共役像が上記の位置に出現するような参照光の光路長を、焦点深さの設定に連動させて設定することが可能である。参照基準面を焦点面から大きく離して設定する必要がないので、画像品質も良好なものとすることができる。

上記のように、本発明によれば、物体光学系の焦点深さに相当する位置の近傍において容器壁面に起因する複素共役ノイズの影響を排除することができる。物体光学系の焦点深さの設定に連動させて参照光の光路長を設定する機能があれば上記効果が得られるので、簡単な装置構成で複素共役ノイズの影響を排除した断層画像を取得することができる。

本発明が適用された画像処理装置の構成例を示す原理図である。 この画像処理装置における撮像原理を説明する図である。 ＯＣＴ装置の具体的構成例を示す図である。 物体光学系の焦点深さと参照基準面との位置関係を模式的に示す図である。 参照基準面の位置と反射光強度分布との関係を示す図である。 この撮像装置における撮像動作の原理を説明する図である。 焦点深さに応じた参照基準面の設定原理を示す図である。 複素共役信号のピークが一定の広がりを有する場合の考え方を示す図である。 この撮像装置における撮像動作を示すフローチャートである。 焦点深さが容器底部厚さの半分未満であるときの反射光ピーク位置を示す図である。

図１は本発明が適用された画像処理装置の構成例を示す原理図である。この画像処理装置１は、培地中で培養されたスフェロイド（細胞集塊）を被撮像物として断層撮像し、得られた断層画像を画像処理して、スフェロイドの立体像を作成する。なお、ここでは培地中のスフェロイドを被撮像物とした例を説明するが、被撮像物はこれに限定されない。以下の各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面を表す。また、Ｚ軸が鉛直軸を表し、より詳しくは（−Ｚ）方向が鉛直下向き方向を表している。

画像処理装置１は保持部１０を備えている。保持部１０は、ガラス製または樹脂製の透明で均質な平底を有する浅皿状のディッシュと呼ばれる容器１１を、その開口面を上向きにして略水平姿勢に保持する。容器１１には予め適宜の培地Ｍが所定量注入されており、培地中では容器１１の底部１１１にスフェロイドＳｐが培養されている。図１では１つのスフェロイドＳｐのみが記載されているが、１つの容器１１内で複数のスフェロイドＳｐが培養されていてもよい。

保持部１０により保持された容器１１の下方に、撮像ユニット２０が配置される。撮像ユニット２０には、被撮像物の断層画像を非接触、非破壊（非侵襲）で撮像することが可能な光干渉断層撮像（Optical Coherence Tomography；ＯＣＴ）装置が用いられる。詳しくは後述するが、ＯＣＴ装置である撮像ユニット２０は、被撮像物への照明光を発生する光源２１と、ビームスプリッタ２２と、物体光学系２３と、参照ミラー２４と、分光器２５と、光検出器２６とを備えている。

また、画像処理装置１はさらに、装置の動作を制御する制御ユニット３０と、撮像ユニット２０の可動機構を制御する駆動制御部４０とを備えている。制御ユニット３０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）３１、Ａ／Ｄコンバータ３２、信号処理部３３、３Ｄ復元部３４、インターフェース（ＩＦ）部３５、画像メモリ３６およびメモリ３７を備えている。

ＣＰＵ３１は、所定の制御プログラムを実行することで装置全体の動作を司り、ＣＰＵ３１が実行する制御プログラムや処理中に生成したデータはメモリ３７に保存される。Ａ／Ｄコンバータ３２は、撮像ユニット２０の光検出器２６から受光光量に応じて出力される信号をデジタルデータに変換する。信号処理部３３は、Ａ／Ｄコンバータ３２から出力されるデジタルデータに基づき後述する信号処理を行って、被撮像物の断層画像を作成する。３Ｄ復元部３４は、撮像された複数の断層画像の画像データに基づいて、撮像された細胞集塊の立体像（３Ｄ像）を作成する機能を有する。信号処理部３３により作成された断層画像の画像データおよび３Ｄ復元部３４により作成された立体像の画像データは、画像メモリ３６により適宜記憶保存される。

インターフェース部３５は画像処理装置１と外部との通信を担う。具体的には、インターフェース部３５は、外部機器と通信を行うための通信機能と、ユーザからの操作入力を受け付け、また各種の情報をユーザに報知するためのユーザインターフェース機能とを有する。この目的のために、インターフェース部３５には、装置の機能選択や動作条件設定などに関する操作入力を受け付け可能な例えばキーボード、マウス、タッチパネルなどの入力デバイス３５１と、信号処理部３３により作成された断層画像や３Ｄ復元部３４により作成された立体像など各種の処理結果を表示する例えば液晶ディスプレイからなる表示部３５２とが接続されている。

また、ＣＰＵ３１は駆動制御部４０に制御指令を与え、これに応じて駆動制御部４０は撮像ユニット２０の可動機構に所定の動作を行わせる。次に説明するように、駆動制御部４０により実行される撮像ユニット２０の走査移動と、光検出器２６による受光光量の検出との組み合わせにより、被撮像物であるスフェロイド（細胞集塊）の断層画像が取得される。

図２はこの画像処理装置における撮像原理を説明する図である。より具体的には、図２（ａ）は撮像ユニット２０における光路を示す図であり、図２（ｂ）はスフェロイドの断層撮像の様子を模式的に示す図である。前記したように、撮像ユニット２０は光干渉断層撮像（ＯＣＴ）装置として機能するものである。

撮像ユニット２０では、例えば発光ダイオードまたはスーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）などの発光素子を有する光源２１から、広帯域の波長成分を含む低コヒーレンス光ビームＬ１が出射される。光ビームＬ１はビームスプリッタ２２に入射して分岐し、破線矢印で示すように一部の光Ｌ２が容器１１に向かい、一点鎖線矢印で示すように一部の光Ｌ３が参照ミラー２４に向かう。

容器１１に向かった光Ｌ２は、物体光学系２３を経て容器１１に入射する。より具体的には、ビームスプリッタ２２から出射される光Ｌ２は、物体光学系２３を介して容器底部１１１に入射する。物体光学系２３は、ビームスプリッタ２２から容器１１に向かう光Ｌ２を容器１１内の被撮像物（この場合にはスフェロイドＳｐ）に収束させる機能と、被撮像物から出射される反射光を集光してビームスプリッタ２２に向かわせる機能とを有する。図では物体光学系２３は単一の対物レンズにより代表的に表されているが、複数の光学素子が組み合わされたものであってもよい。

物体光学系２３は、駆動制御部４０に設けられた焦点調整機構４１により、Ｚ方向に移動可能に支持されている。これにより、被撮像物に対する物体光学系２３の焦点位置がＺ方向に変更可能となっている。以下、深さ方向（Ｚ方向）における物体光学系２３の焦点位置を「焦点深さ」と称する。物体光学系２３の光軸は鉛直方向と平行であり、したがって平面状の容器底部１１１に垂直である。また、物体光学系２３への照明光の入射方向は光軸と平行であり、その光中心が光軸と一致するように、物体光学系２３の配置が定められている。

スフェロイドＳｐが光Ｌ２に対する透過性を有するものでなければ、容器底部１１１を介して入射した光Ｌ２はスフェロイドＳｐの表面で反射される。一方、スフェロイドＳｐが光Ｌ２に対してある程度の透過性を有するものである場合、光Ｌ２はスフェロイドＳｐ内まで進入してその内部の構造物により反射される。光Ｌ２として例えば近赤外線を用いることで、入射光をスフェロイドＳｐ内部まで到達させることが可能である。スフェロイドＳｐからの反射光は散乱光として種々の方向に放射される。そのうち物体光学系２３の集光範囲内に放射された光Ｌ４が、物体光学系２３で集光されてビームスプリッタ２２へ送られる。

参照ミラー２４は、駆動制御部４０に設けられたミラー駆動機構４２により、その反射面を光Ｌ３の入射方向に対し垂直姿勢に、しかも、該入射方向に沿った方向（図ではＹ方向）に移動可能に支持されている。参照ミラー２４に入射した光Ｌ３は反射面で反射されて、入射光路を逆向きに辿るように進む光Ｌ５としてビームスプリッタ２２に向かう。この光Ｌ５が参照光となる。ミラー駆動機構４２により参照ミラー２４の位置が変更されることにより、参照光の光路長が変化する。

スフェロイドＳｐの表面もしくは内部の反射面で反射された反射光Ｌ４と、参照ミラー２４で反射された参照光Ｌ５とは、ビームスプリッタ２２を介して光検出器２６に入射する。このとき、反射光Ｌ４と参照光Ｌ５との間で位相差に起因する干渉が生じるが、干渉光の分光スペクトルは反射面の深さにより異なる。つまり、干渉光の分光スペクトルは被撮像物の深さ方向の情報を有している。したがって、干渉光を波長ごとに分光して光量を検出し、検出された干渉信号をフーリエ変換することにより、被撮像物の深さ方向における反射光強度分布を求めることができる。このような原理に基づくＯＣＴ撮像技術は、フーリエドメイン（Fourier Domain）ＯＣＴ（ＦＤ−ＯＣＴ）と称される。

この実施形態の撮像ユニット２０は、ビームスプリッタ２２から光検出器２６に至る干渉光の光路上に分光器２５が設けられている。分光器２５としては、例えばプリズムを利用したもの、回折格子を利用したもの等を用いることができる。干渉光は分光器２５により波長成分ごとに分光されて光検出器２６に受光される。

光検出器２６が検出した干渉光に応じて光検出器２６から出力される干渉信号をフーリエ変換することで、スフェロイドＳｐのうち、光ビームＬ２の入射位置における深さ方向、つまりＺ方向の反射光強度分布が求められる。容器１１に入射する光ビームＬ２をＸ方向に走査することで、ＸＺ平面と平行な平面における反射光強度分布が求められ、その結果から当該平面を断面とするスフェロイドＳｐの断層画像を作成することができる。以下、本明細書では、Ｘ方向へのビーム走査によってＸＺ平面と平行な断面における１つの断層画像Ｉｔを取得する一連の動作を、１回の撮像と称することとする。

また、Ｙ方向におけるビーム入射位置を多段階に変更しながら、その都度断層画像の撮像を行うことで、図２（ｂ）に示すように、スフェロイドＳｐをＸＺ平面と平行な断面で断層撮像した多数の断層画像Ｉｔを得ることができる。Ｙ方向の走査ピッチを小さくすれば、スフェロイドＳｐの立体構造を把握するのに十分な分解能の画像データを得ることができる。Ｘ方向およびＹ方向へのビーム走査は、例えば図示しないガルバノミラー等の光路を変化させる光学部品を用いてビーム入射位置をＸＹ方向に変化させる方法、スフェロイドＳｐを担持する容器１１と撮像ユニット２０とのいずれかをＸＹ方向に移動させてこれらの相対位置を変化させる方法などにより実現可能である。

なお、上記の原理説明では、撮像ユニット２０において光源２１からの光を照明光と参照光とに分岐させる分波機能、および信号光と参照光とを合成して干渉光を生じさせる機能がビームスプリッタ２２により実現されている。一方、近年では、ＯＣＴ装置においてこのような分波・合波機能を担うものとして、以下に例示するような光ファイバカプラが用いられる場合がある。

図３はＯＣＴ装置の具体的構成例を示す図である。なお、理解を容易にするために、以下の説明では、上記した原理図の構成と同一のまたは相当する構成に同一符号を付すものとする。その構造および機能は、特に説明のない限り上記原理図のものと基本的に同じであり、詳しい説明は省略する。また、光ファイバカプラによる干渉光を検出するＯＣＴ撮像原理も基本的に上記と同じであるので、詳しい説明を省略する。

図３（ａ）に示す構成例では、撮像ユニット２０ａは、ビームスプリッタ２２に代わる分波・合波器として光ファイバカプラ２２０を備えている。光ファイバカプラ２２０を構成する光ファイバの１つ２２１は光源２１に接続されており、光源２１から出射される低コヒーレンス光は、光ファイバカプラ２２０により２つの光ファイバ２２２，２２３への光に分岐される。光ファイバ２２２は物体系光路を構成する。より具体的には、光ファイバ２２２の端部から出射される光はコリメータレンズ２２３を介して物体光学系２３に入射する。被撮像物からの反射光（信号光）は物体光学系２３、コリメータレンズ２２３を介して光ファイバ２２２に入射する。

他の光ファイバ２２４は参照系光路を構成する。より具体的には、光ファイバ２２４の端部から出射される光はコリメータレンズ２２５を介して参照ミラー２４に入射する。参照ミラー２４からの反射光（参照光）はコリメータレンズ２２５を介して光ファイバ２２４に入射する。光ファイバ２２２を伝搬する信号光と光ファイバ２２４を伝搬する参照光とが光ファイバカプラ２２０において干渉し、干渉光が光ファイバ２２６および分光器２５を介して光検出器２６に入射する。光検出器２６により受光された干渉光から被撮像物における反射光の強度分布が求められることは上記原理通りである。

図３（ｂ）に示す例でも、撮像ユニット２０ｂに光ファイバカプラ２２０が設けられる。ただし光ファイバ２２４は使用されず、光ファイバ２２２から出射される光の光路に対してコリメータレンズ２２３およびビームスプリッタ２２７が設けられる。そして、前述の原理通り、ビームスプリッタ２２７により分岐される２つの光路にそれぞれ物体光学系２３、参照ミラー２４が配置される。このような構成ではビームスプリッタ２２７により信号光と参照光とが合成され、それにより生じた干渉光が光ファイバ２２２，２２６を通って光検出器２６へ導かれる。

これらの例では、図１の原理図では空間中を進行する各光の光路の一部が光ファイバに置き換えられているが動作原理は同じである。これらの例においても、焦点調整機構４１が物体光学系２３を容器１１に対し接近・離間方向に移動させることにより、被撮像物に対する物体光学系２３の焦点深さを調整することが可能である。また、ミラー駆動機構４２が参照ミラー２４を光の入射方向に沿って移動させることにより、参照光の光路長を変更可能である。

以下、この画像処理装置１による撮像動作について説明する。撮像ユニットの構成は、上記したビームスプリッタを用いるもの、光ファイバカプラを用いるもののいずれであっても同じ撮像動作が可能である。

図４は物体光学系の焦点深さと参照基準面との位置関係を模式的に示す図である。また、図５は参照基準面の位置と反射光強度分布との関係を示す図である。ＯＣＴ撮像装置では、その原理上、信号光の光路長が参照光の光路長と同じになる位置が、画像における深さ方向の基準位置となる。

以下の説明では、図４に示すように、物体光学系２３を介して照明光Ｌ２および信号光Ｌ４が伝搬する物体系光路において、参照系光路における参照ミラー２４の反射面と対応する位置を参照基準面Ｓｒと称する。また、容器１１の底部１１１のうち被撮像物であるスフェロイドＳｐに近い側の表面（つまり培地と接触する内底面）を上部底面Ｓａ、容器１１の底部１１１のうち上部底面Ｓａとは反対側の外底面を下部底面Ｓｂと称する。さらに、物体光学系２３の焦点面、つまり物体光学系２３の物体側焦点ＦＰを含み物体光学系２３の光軸ＡＸに垂直な平面を符号Ｓｆにより表す。

また、後の説明のために、上部底面Ｓａと下部底面Ｓｂとの距離、つまり容器底部１１１の厚さを符号Ｔにより表す。また、上部底面Ｓａと焦点面Ｓｆとの距離、つまり容器１１の内底面から焦点ＦＰまでの距離を符号Ｄにより表す。この距離Ｄは、容器１１の内底面（上部底面Ｓａ）を起点としたときの物体光学系２３の焦点深さであるということもできる。

物体系光路において参照基準面Ｓｒに仮想的な反射面があるとき、当該反射面で反射される光の（光源２１から光検出器２６までの）光路長は、参照ミラー２４の反射面で反射される光の（光源２１から光検出器２６までの）光路長と等しくなる。被撮像物近傍にある各反射面の深さ方向位置は、参照基準面ＳｒからのＺ方向距離により表される。

被撮像物（スフェロイドＳｐ）が焦点面Ｓｆに反射面を有するとき、フーリエ変換後の反射光強度分布においては、当該反射面からの反射光強度に対応する大きさの信号が、参照基準面Ｓｒから当該反射面（すなわち焦点面Ｓｆ）までの距離に対応する深さの位置に現れる。実際の被撮像物においては、種々の深さにある反射面からの反射光に対応する信号が各位置に現れ、反射光強度分布はそれらの信号が重畳されたものなる。ただし、ここでは理解を容易にするために、焦点面Ｓｆにある反射面からの信号のみを考えることとする。

容器底部１１１の平坦な表面Ｓａ、Ｓｂも強い反射面であり、反射光強度分布においては、これらに対応する信号が参照基準面Ｓｒからの距離に応じた位置にそれぞれ現れる。例えば図５（ａ）に示すように、反射光強度分布においては焦点面Ｓｆに対応する信号Ｐ１ｆ、上部底面Ｓａに対応する信号Ｐ１ａ、下部底面Ｓｂに対応する信号Ｐ１ｂが、それぞれ参照基準面Ｓｒからの距離に応じた位置に現れる。これらの信号は、実空間において各反射面が離隔していれば反射光強度分布においても異なる位置に現れるため、画像処理装置１の分解能が十分に高ければ相互に分離が可能である。

一方、ＦＤ−ＯＣＴ撮像技術において得られる反射光強度分布では、参照基準面Ｓｒに関して各反射面と対称な位置に、各反射面からの信号と複素共役な信号が原理的に現れる。すなわち、焦点面Ｓｆに対応する信号Ｐ１ｆと共役な位置にその複素共役信号Ｐ２ｆが、上部底面Ｓａに対応する信号Ｐ１ａと共役な位置にその複素共役信号Ｐ２ａが、下部底面Ｓｂに対応する信号Ｐ１ｂと共役な位置にその複素共役信号Ｐ２ｂが、それぞれ現れる。以下では、実空間に存在する反射面からの信号を、複素共役信号と区別するために「実信号」ということがある。

図５（ａ）に示すように、参照基準面Ｓｒが容器１１の下部底面Ｓｂよりも下方にあるとき、複素共役信号Ｐ２ｆ，Ｐ２ａ，Ｐ２ｂは計算上の仮想空間である（−Ｚ）側に現れる。そのため、（＋Ｚ）側で検出される実空間における反射面からの反射光強度には影響を及ぼさない。しかしながら、図５（ｂ）および図５（ｃ）に示すように、参照基準面Ｓｒの設定によっては（−Ｚ）側に現れる信号の複素共役信号が（＋Ｚ）側の共役位置に現れることがある。

例えば図５（ｂ）に示す例では、焦点面Ｓｆと上部底面Ｓａとの間に参照基準面Ｓｒがあり、上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂに対応する複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂが（＋Ｚ）側に現れている。この場合でも、焦点面Ｓｆに対応する実信号Ｐ１ｆは他の複素共役信号からは離隔しているので検出可能である。しかしながら、参照基準面Ｓｆの設定が僅かに異なる図５（ｃ）に示す例では、焦点面Ｓｆに対応する実信号Ｐ１ｆと上部底面Ｓａに対応する複素共役信号Ｐ２ａとが（＋Ｚ）領域で重なってしまっており、焦点面Ｓｆに対応する信号Ｐ１ｆを検出することが不可能となっている。

このように、原理的には深さ方向の広い範囲を撮像可能なＦＤ−ＯＣＴ技術であっても、強い反射面として作用する容器底面を介した撮像においては、底面に対応する複素共役信号が被撮像物からの実信号と重なることで、実信号の検出が困難になる場合があり得る。特に底面が強い反射面として作用するとき、単なる画像ノイズのレベルを超えて、実信号自体を遮蔽してしまうことが起こり得る。したがって、容器底面に起因する複素共役ノイズの影響は、被撮像物自身に起因する複素共役ノイズよりも遥かに大きなものとなることがある。

その一方で、形状やサイズ、内部構造等が不特定であるスフェロイドＳｐ等の被撮像物とは異なり、被撮像物を担持する容器１１については、その底面の形状や寸法を予め把握することが可能である。すなわち、容器底部１１１において強い反射面となるのは上部底面Ｓａと下部底面Ｓｂとであり、両者の間に強い反射面は存在しない。したがって、現れる複素共役信号は上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂに起因するもののみであり、それらの間には他の複素共役信号は現れない。

また、上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂが平滑な面であれば、これに起因する複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂは鋭いピークとなって現れその広がりは小さい。そして、参照基準面Ｓｒがある位置に設定されるとき、上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂに起因する複素共役信号のピークが反射光強度分布においてどの位置に現れるかは事前に推定することが可能である。さらに、それらのピークの位置は参照基準面Ｓｒの設定に応じて変化するが、両ピーク間の距離は容器底部１１１の厚さＴにより決まり参照基準面Ｓｒの設定に対し不変である。

これらのことから、参照基準面Ｓｒを適宜に設定し複素共役信号の出現位置を管理することで、少なくとも撮像対象とする一部の領域については容器底面の影響が現れないようにすることができると期待される。具体的には、次に説明するように、物体光学系２３の焦点面Ｓｆおよびその近傍からできるだけ離れた位置に、容器底面に起因する複素共役信号が現れるようにすれば、少なくとも焦点深さおよびその近傍範囲で複素共役ノイズの影響を受けない反射光強度分布を取得することができる。

図６はこの撮像装置における撮像動作の原理を説明する図である。より具体的には、図６（ａ）はこの画像処理装置１における焦点位置と底面に起因する複素共役信号との位置関係を示す図であり、図６（ｂ）は一の断層画像を複数の部分画像から構成する方法を模式的に示す図である。図６（ａ）に示すように、深さ方向（Ｚ方向）の反射光強度分布においては、物体光学系２３の焦点深さＺｆの位置に、焦点面Ｓｆからの実信号Ｐ１ｆが現れる。容器１１の上部底面Ｓａに対応する複素共役信号Ｐ２ａのピークおよび下部底面Ｓｂに対応する複素共役信号Ｐ２ｂのピークは、参照基準面Ｓｒの設定に応じてＺ方向に位置を変えるがピーク間距離は不変である。

図６（ａ）に示すように、複素共役信号の２つのピークが焦点深さＺｆに対応する位置を挟むように出現するとき、これらのピークに挟まれる領域Ｒｅの内部においては、容器底面に起因する複素共役ノイズの影響を受けることがない。この領域Ｒｅは焦点深さＺｆに対応する位置を含んでおり、深さ方向においては最も良好な分解能が得られる領域でもある。したがって、この領域Ｒｅ内の反射光強度分布から得られる断層画像では、容器底面に起因する複素共役ノイズの影響がなく、しかも合焦状態で検出されているため画像品質も良好なものとなる。この意味において、この領域Ｒｅをここでは「有効領域」と称し、そのＺ方向の長さを「有効高さ」と称し符号Ｚｅにより表すこととする。

ＦＤ−ＯＣＴ撮像では原理的には深さ方向に広い範囲を一括して撮像することができる。しかしながら、図６（ａ）から明らかなように、複素共役ノイズの影響を受けない断層画像を得ることができるのは、そのうち複素共役信号の２つのピークＰ２ａ，Ｐ２ｂに挟まれた有効領域Ｒｅ内のみである。

撮像対象とされる範囲のＺ方向高さが有効高さＺｅよりも大きい場合には、図６（ｂ）に示すように、Ｚ方向に撮像位置を異ならせて撮像された複数の部分画像ＩｐをＺ方向に並べて合成することにより、撮像対象範囲の全体をカバーする断層画像Ｉｔを作成することが可能である。

被撮像物がスフェロイドＳｐであるとき、その高さは概ね数μｍから数百μｍ程度である。一方、容器底部１１１の厚さＴは、数百μｍないし数ｍｍのものが一般的である。したがって、１回の撮像で得られる断層画像に被撮像物の全体が収まる場合とそうでない場合とがあり得る。１回の撮像で得られる断層画像に被撮像物の全体が収まらない場合には、上記したようにＺ方向に撮像位置を異ならせて複数回撮像を行えばよい。

このとき、各部分画像Ｉｐにおいて画像品質を良好なものとするために、各部分画像Ｉｐの撮像ごとに、物体光学系２３の焦点深さＺｆを撮像範囲に合わせて変更することが望ましい。ここで、焦点深さＺｆの変更に連動させて、参照基準面Ｓｒの設定も変更されることがさらに望ましい。容器底面に起因する複素共役ノイズの影響をなくすためには焦点深さＺｆの変更に伴って有効領域ＲｅもＺ方向に位置をシフトさせることが望ましく、そのために複素共役信号のピーク出現位置を焦点位置に連動させる必要があるからである。

言い換えれば、撮像時の焦点深さＺｆに連動させて参照基準面Ｓｒの位置を変更することで、容器底面に起因する複素共役ノイズの影響がなく、しかも合焦状態で撮像された部分画像Ｉｐを取得することができる。そして、焦点深さＺｆを異ならせた複数の部分画像Ｉｐを合成することで、画像全体において容器底面に起因する複素共役ノイズの影響がなく、しかも各深さに合焦した優れた画像品質の断層画像Ｉｔを得ることができる。

次に、上記条件に合致する参照基準面の設定方法について説明する。上記したように、この画像処理装置１の撮像動作においては、物体光学系２３の焦点深さの設定に応じて参照基準面が設定される。参照基準面の設定は、参照光の光路長を設定することによってなされる。

図７は焦点深さに応じた参照基準面の設定原理を示す図である。図７左端に示すように、容器１１の上部底面Ｓａと下部底面Ｓｂとの距離が容器底部の厚さＴとして表され、物体光学系２３の焦点ＦＰを含む焦点面Ｓｆと容器１１の上部底面Ｓａとの距離が、焦点深さＤとして表される。

図７（ａ）に示されるように、フーリエ変換後の反射光強度分布においては、焦点面Ｓｆ、上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂに対応する実信号Ｐ１ｆ，Ｐ１ａ，Ｐ１ｂが、各面の深さ方向位置に応じた位置に現れる。実際にフーリエ変換を行って求められる反射光強度分布には、各信号の複素共役信号が重畳される。ここでは、焦点面Ｓｆに対応する実信号が容器底面に対応する複素共役信号のピーク間に挟まれるための条件を導出する。

焦点面Ｓｆに対応する実信号Ｐ１ｆが容器底面に起因する複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂに挟まれる条件を求めるために、図７（ｂ）に示すように焦点面Ｓｆに対応する実信号Ｐ１ｆが上部底面Ｓａに起因する複素共役信号Ｐ２ａと重なる条件と、図７（ｃ）に示すように実信号Ｐ１ｆが下部底面Ｓｂに起因する複素共役信号Ｐ２ｂと重なる条件とを考える。

まず、図７（ｂ）に示すように、焦点面Ｓｆに対応する実信号Ｐ１ｆと上部底面Ｓａに起因する複素共役信号Ｐ２ａとが重なる条件を考える。ここで、基準参照面ＳｒのＺ方向位置を符号Ｚｒで表し、容器１１の下部底面Ｓｂから基準参照面Ｓｒまでの距離を符号Ｒにより表すとする。そうすると、図７（ｂ）に示す位置関係から、次式：
Ｒ＝Ｄ／２＋Ｔ＝（Ｄ＋２Ｔ）／２ … （１）
の関係が得られる。値Ｄは撮像時の焦点深さが決まれば一意に決まる。値Ｔは容器１１が決まれば一意に決まる。

一方、図７（ｃ）に示すように、焦点面Ｓｆに対応する実信号Ｐ１ｆと下部底面Ｓｂに起因する複素共役信号Ｐ２ｂとが重なる条件を考える。このとき、図７（ｃ）に示す位置関係から、次式：
Ｒ＝（Ｄ＋Ｔ）／２ … （２）
の関係が得られる。

焦点面Ｓｆに対応する実信号Ｐ１ｆが容器底面に対応する複素共役信号のピークＰ２ａ，Ｐ２ｂの間に位置するための条件は、値Ｒが上記式（１）で表される値と式（２）で表される値との間にあることである。したがって、このための条件は次式：
（Ｄ＋Ｔ）／２＜Ｒ＜（Ｄ＋２Ｔ）／２ … （３）
により表される。したがって、値Ｒが上記式（３）の関係を満たすように、焦点深さに応じて参照基準面Ｓｒの位置Ｚｒを設定すればよいことがわかる。

特別な例として、図７（ｄ）に示すように、実信号Ｐ１ｆが２つの複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂのちょうど中間位置に現れる条件を考えると、図７（ｄ）に示す位置関係から、次式：
Ｒ＝Ｄ／２＋３Ｔ／４ … （４）
となるように、参照基準面Ｓｒの位置が設定されればよい。このような条件が満たされるとき、有効領域Ｒｅは焦点深さＺｆを中心として（＋Ｚ）方向および（−Ｚ）方向に同程度の広がりを有することになる。物体光学系２３が焦点位置ＦＰを中心として（＋Ｚ）方向および（−Ｚ）方向に同程度の合焦範囲（被写界深度内の範囲）を有する場合、上記式（４）の条件を満たすように参照基準面Ｓｒの位置を設定することで、物体光学系２３の合焦範囲を最も有効に活用して良好な画像品質で撮像を行うことが可能となる。

なお、上記の考察は複素共役信号のピークＰ２ａ，Ｐ２ｂの広がりが無視できる場合に成り立つものである。これらのピークＰ２ａ，Ｐ２ｂの広がりが大きいとき、式（３）で表される値Ｒの範囲のうち上限および下限に近い領域では、これらのピークＰ２ａ，Ｐ２ｂが実信号Ｐ１ｆと不可分に重なってしまうことがあり得る。ピークの広がりを考慮した場合の条件は次のようにして求めることができる。

図８は複素共役信号のピークが一定の広がりを有する場合の考え方を示す図である。図８（ａ）に示すように、複素共役信号のピークＰ２ａ，Ｐ２ｂがそれぞれ２Δ程度の広がりを有するものとする。値Δは例えばピークの半値半幅によって特定することができる。図８（ａ）は図７（ｂ）のケースにピーク幅の影響を加味した場合に相当する。すなわち、図８（ａ）は、実信号Ｐ１ｆが複素共役信号のピークＰ２ａと完全に一致せず、ピークＰ２ａの半値半幅Δ程度だけもう１つの複素共役信号のピークＰ１ａ側にシフトした位置に現れる条件を示している。このようなケースでは、実信号Ｐ１ｆが複素共役信号のピークＰ２ａによって遮蔽されてしまうことが回避される。

このとき、図８（ａ）に示す位置関係から次式：
Ｒ＝（Ｄ−Δ）／２＋Ｔ＝（Ｄ−Δ＋２Ｔ）／２ … （１ａ）
が成り立つ。

図示を省略するが、図７（ｃ）のケースについても同様にピーク幅を加味すると、次式：
Ｒ＝（Ｄ＋Δ＋Ｔ）／２ … （２ａ）
の関係が成り立つ。これらの式（１ａ）、（２ａ）から、複素共役信号のピーク幅を考慮したときでも実信号Ｐ１ｆが遮蔽されないための条件は、次式：
（Ｄ＋Δ＋Ｔ）／２＜Ｒ＜（Ｄ−Δ＋２Ｔ）／２ … （３ａ）
となる。値Ｒが取り得る範囲は式（３）で示される範囲より狭くなるが、複素共役信号のピークの広がりによって実信号Ｐ１ｆが遮蔽されてしまうことはより確実に防止される。

さらに実信号Ｐ１ｆと複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂとをより確実に分離可能とするために、図８（ｂ）に示されるように、実信号Ｐ１ｆが複素共役信号のピークＰ２ａの半値半幅Δの２倍程度シフトした位置に現れるようにしてもよい。このための条件は次式：
Ｒ＝（Ｄ−２Δ）／２＋Ｔ＝（Ｄ−２Δ＋２Ｔ）／２＝Ｄ／２−Δ＋Ｔ
… （１ｂ）
で表される。同様に、図７（ｃ）に対応するケースは次式：
Ｒ＝（Ｄ＋２Δ＋Ｔ）／２ … （２ｂ）
により表される。これらから、値Ｒが取り得る好ましい範囲は、次式：
（Ｄ＋２Δ＋Ｔ）／２＜Ｒ＜（Ｄ−２Δ＋２Ｔ）／２ … （３ｂ）
により表される。

被撮像物から得られる実信号と容器底面に起因する複素共役信号とをどの程度分離させる必要があるかに応じて、上記条件式（３）、（３ａ）、（３ｂ）を使い分けることができる。具体的には、複素共役信号のピークの幅がほぼ無視できる場合には式（３）を適用することができる。一方、複素共役信号のピークが比較的大きな広がりを有している場合や、実信号のレベルが複素共役信号に対して小さい場合等には、複素共役ノイズの影響をより確実に排除するために、式（３ｂ）が適用されることが好ましい。それらの中間的な場合には式（３ａ）が適用されればよい。

容器底面に起因する複素共役信号の広がりの程度は、容器底面の表面状態に依存する。すなわち、容器１１の上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂが高精度の平滑面である場合、複素共役信号のピークは鋭くなる。上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂの表面粗さが大きくなるほどピーク幅が広くなる。したがって、複素共役信号の広がりは容器底面の状態から見積もることが可能である。

なお、上記の条件式（３）、（３ａ）、（３ｂ）は焦点深さＤおよび容器底部厚さＴに対応する参照基準面の位置を表す値Ｒの好ましい範囲を示す式である。しかしながら、容器底部厚さＴおよび焦点深さＤに応じて参照基準面の位置を導出するに当たって、値Ｒにこのような幅を持たせることを要するものではない。すなわち、値Ｒは値Ｄ，Ｔを変数とする関数、すなわち次式：
Ｒ＝Ｆ（Ｄ，Ｔ） … （５）
を用いて一意に定められればよい。要するに、式（５）に示される関数Ｆ（Ｄ，Ｔ）が返す値Ｒが、任意の値Ｄ，Ｔに対して条件式（３）、（３ａ）、（３ｂ）のいずれかで表される範囲に入るように関数Ｆ（Ｄ，Ｔ）が定められていればよい。

この実施形態では、物体光学系２３の焦点位置近傍の合焦範囲からの信号を有効に活用するため、上記の式（４）を用いて参照基準面Ｓｒの位置が定められるものとする。すなわち、容器底部の厚さＴと、容器の上部底面Ｓａを基準としたときの物体光学系２３の焦点深さＤとが与えられたとき、容器の下部底面Ｓｂを基準としたときの参照基準面の位置を表す値Ｒが式（４）で示される値となるように、参照光の光路長を規定する参照ミラー２４の位置が設定される。

図９はこの撮像装置における撮像動作を示すフローチャートである。被撮像物となるスフェロイドＳｐを担持する容器１１が保持部１０にセットされると（ステップＳ１０１）、ＣＰＵ３１は当該容器１１の底部厚さＴに関する情報を取得する（ステップＳ１０２）。この情報については、ユーザが入力デバイス３５１を介して入力する態様であってもよく、また予めメモリ３７に登録されている容器に関するデータベースから、使用される容器１１に応じた情報が読み出される態様であってもよい。このようにしてＣＰＵ３１は容器１１の底部厚さＴに関する情報を取得する。

被撮像物の撮像は、焦点深さを多段階に変更設定しながら複数回実行される。すなわち、最初に物体光学系２３の焦点深さＤが、焦点調整機構４１により予め定められた初期値に設定される（ステップＳ１０３）。次に、ＣＰＵ３１は、設定された焦点深さＤが、容器底部厚さＴの半分以上であるか否かを判定する（ステップＳ１０４）。

焦点深さＤが容器底部厚さＴの半分以上であるときには（ステップＳ１０４においてＹＥＳ）、ＣＰＵ３１は上記した式（４）を用いて参照ミラー２４の位置を導出する。これに応じて、ミラー駆動部４２が参照ミラー２４を求められた位置に位置決めする（ステップＳ１０５）。一方、焦点深さＤが容器底部厚さＴの半分より小さいときには（ステップＳ１０４においてＮＯ）、ＣＰＵ３１は特殊なケースとして参照基準面の位置に対応する値Ｒが容器１１の底部厚さＴと一致するようにミラー駆動部４２を制御し、この条件を満たすように参照ミラー２４の位置が設定される（ステップＳ１０６）。このようにする理由については後述する。

こうして焦点深さおよび参照基準面が設定された状態で、光源２１から広帯域の低コヒーレンス光が出射され、被撮像物から出射される信号光と参照光との干渉光が検出される。干渉光は分光器２５により分光されて波長成分ごとの強度が光検出器２６により検出され、光検出器２６の出力信号がスペクトル情報としてＣＰＵ３１に与えられる。被撮像物への光照射および干渉光の検出は、光入射位置をＸ方向へ走査しながら複数回実行され、その都度反射光の分光スペクトル情報が取得される（ステップＳ１０７）。

信号処理部３３は、ＣＰＵ３１から与えられた分光スペクトル情報をフーリエ変換することで、焦点深さ付近に存在する反射面からの反射光強度分布を求める（ステップＳ１０８）。なお、反射光強度分布の導出は、全ての撮像が終了した後に行われてもよい。前記したように、被撮像物からの反射光強度を有効に求めることができるのは、容器底面に対応する複素共役信号のピークの間の有効領域Ｒｅ内である。有効領域Ｒｅの外側の領域については反射光強度分布の算出対象から除外されてもよく、また反射光強度分布の算出時点では処理対象に含まれた上で後の画像合成時に削除されてもよい。

焦点深さの設定値が所定の最終値に到達するまで（ステップＳ１０９）、焦点深さを１ステップずつ段階的に変更しながら（ステップＳ１１０）、撮像が繰り返される。焦点深さの変更ステップ幅については、予め定められていてもよく、また容器１１の底部厚さＴに応じてステップ幅が設定されてもよい。画像全体で合焦した断層画像を得るためには、変更ステップ幅は有効領域Ｒｅの高さＺｅ以下であることが望ましい。

なお、例えば物体光学系２３が高倍率である、開口数が大きいなどの理由により、物体光学系２３の被写界深度が、複素共役信号の間隔で決まる有効高さＺｅよりも小さい場合があり得る。この場合、有効領域Ｒｅの端部が物体光学系２３の合焦範囲から部分的に外れることを許容した上で上記の有効領域Ｒｅを維持してもよく、また有効領域Ｒｅを物体光学系２３の被写界深度で決まる深さの範囲に限定するようにしてもよい。

撮像が終了すると（ステップＳ１０９においてＹＥＳ）、信号処理部３３は、各焦点深さで取得された部分画像Ｉｐを合成することで、ＸＺ平面に平行な１つの断面における被撮像物の断層画像Ｉｔを作成する（ステップＳ１１１）。必要に応じて、Ｙ方向に位置を変えながら上記の撮像動作を繰り返せば、Ｙ方向に位置の異なる複数の断層画像Ｉｔが得られる。３Ｄ復元部３４は、これらの断層画像Ｉｔから被撮像物の立体像を作成することができる。

次に、設定された焦点深さＤが容器底部厚さの半分（Ｔ／２）よりも小さい場合に（ステップＳ１０４においてＮＯ）、Ｒ＝Ｔとして参照ミラー２４の位置を設定する理由について説明する。これまで述べてきたように、式（４）に基づいて参照ミラー２４の位置を設定する理由は、物体光学系２３の合焦範囲を有効に利用するために、容器底面に起因する２つの複素共役信号の中央に焦点位置が来るようにするためである。このとき、複素共役信号のピーク幅を無視すれば、有効領域Ｒｅの範囲は焦点深さを中心として（＋Ｚ）方向および（−Ｚ）方向にそれぞれ（Ｔ／２）ずつとなる（図７（ｄ）参照）。

図１０は焦点深さが容器底部厚さの半分未満であるときの反射光ピーク位置を示す図である。図１０（ａ）に示すように、焦点面Ｓｆが容器１１の上部底面Ｓａに近く、焦点深さＤが容器底部厚さＴの半分より小さい場合を考える。このとき、式（４）に従って２つの複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂの中央に実信号Ｐ１ｆが来るように参照基準面を設定すると、図１０（ｂ）に示すように、２つの複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂが、実信号Ｐ１ｆの位置からそれぞれ（Ｔ／２）ずつ離れた位置に出現する。

しかしながら、実信号Ｐ１ｆから距離Ｄだけ離れた位置に、容器１１の上部底面Ｓａに対応する実信号Ｐ１ａが現れている。Ｄ＜（Ｔ／２）であるから、このときの有効領域Ｒｅは、容器１１の上部底面Ｓａに対応する実信号Ｐ１ａと、下部底面Ｓｂに対応する複素共役信号Ｐ２ｂとに挟まれた領域に限定されてしまう。つまり、２つの複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂの中央に実信号Ｐ１ｆが来るように参照ミラー２４の位置を設定する意義がなく、むしろ有効領域Ｒｅを狭くしてしまうことがある。

そこで、図１０（ｃ）に示すように、容器１１の上部底面Ｓａに対応する実信号Ｐ１ａとこれに共役な複素共役信号Ｐ２ａとが重なるように、つまりＲ＝Ｔとなるように参照ミラー２４の位置Ｚｒが設定される。この場合の有効領域Ｒｅは、容器１１の上部底面Ｓａに対応する実信号Ｐ１ａまたはこれに共役で同じ位置に現れる複素共役信号Ｐ２ａと、もう１つの複素共役信号Ｐ２ｂとで挟まれた領域となり、図１０（ｂ）に示す場合よりも有効領域Ｒｅを広くすることができる。

これを可能とするために、図９の撮像動作においては、設定された焦点深さＤについてＤ＜（Ｔ／２）の関係が成立するとき、式（４）によらずＲ＝Ｔとなるように参照ミラー２４の位置Ｚｒが設定される。このことは、参照基準面Ｓｒを容器１１の上部底面Ｓａに一致させることと等価である。また、式（１）においてＤ＝０とした場合に相当する。

これにより、物体光学系２３の合焦範囲を有効に利用して撮像を行うことができる。複数の部分画像Ｉｐを合成して断層画像Ｉｔを作成する構成においては、各撮像における物体光学系２３の合焦範囲を最大限に利用することで必要な部分画像Ｉｐの数を削減し、画像の作成に要する時間を短縮することが可能になる。Ｄ＜（Ｔ／２）の関係がそれぞれ成立する複数の焦点深さで撮像が行われる際にも、参照ミラー２４は焦点深さの設定によらずＲ＝Ｔとなる位置に固定される。参照ミラー２４が移動する工程を省くことができるので、処理時間も短縮することが可能である。

なお、このように参照基準面Ｓｒと容器１１の上部底面Ｓａとが一致するように参照ミラー２４の位置を設定するとき、図１０（ｃ）に示されるように、断層画像においては、参照基準面Ｓｒに対応する位置に（実信号Ｐ１ａに重畳されて）現れる上部底面Ｓａの複素共役信号Ｐ２ａと、これから容器底部厚さＴに対応する距離だけ離れた位置に現れる下部底面Ｓｂの複素共役信号Ｐ２ｂとの間の領域が、複素共役信号を含まない有効領域Ｒｅである。したがって、焦点面Ｓｆに現れる実信号Ｐ１ｆが複素共役ノイズの影響を受けないようにするという観点からは、焦点面Ｓｆは、設定値Ｒにより決まる有効領域Ｒｅ内に含まれる限り、どの位置にあってもよいことになる。

言い換えれば、このように参照基準面Ｓｒを容器１１の上部底面Ｓａと一致させるような参照ミラー２４の位置設定方法は、焦点面Ｓｆと容器１１の上部底面Ｓａとの距離Ｄが底部厚さＴよりも小さくなるように焦点深さが設定される場合の全般において有効に機能する。したがって、参照ミラー２４の位置Ｚｒの決定を式（４）に基づいて行うかＲ＝Ｔとなるようにするかの場合分けについては、焦点深さの設定値Ｄと、底部厚さＴよりも小さい適宜の閾値との比較に基づき判断することができる。すなわち、設定された焦点深さＤが予め定められた閾値より大きければ式（４）に基づいて参照ミラー位置を決定し、小さければＲ＝Ｔとなるように決定すればよい。

なお、原理上は閾値は０より大きくＴより小さい数値範囲内の任意の値とすることができる。しかしながら、現実には複素共役信号Ｐ２ａ，Ｐ２ｂが深さ方向においてある程度の広がりを有する。このことを考慮すれば、閾値は、上記範囲のうち上限および下限のそれぞれにおいて複素共役信号の広がり量の半分程度が除外された範囲内で定められることが好ましい。

本実施形態では、有効領域Ｒｅが焦点面Ｓｆを含みかつその範囲が複素共役信号の広がりの影響を抑えてできるだけ広くなるようにするとの観点から、式（４）によって焦点面Ｓｆを有効領域Ｒｅの中央に位置させることのできる焦点深さＤの範囲、すなわちＤ≧（Ｔ／２）において式（４）を適用する一方、焦点深さＤがこれより小さい場合にはＲ＝Ｔとして参照ミラー位置が決まるように、ステップＳ１０４の判断工程が構成されている。これは、上記した閾値を底部厚さの半分（Ｔ／２）に設定した場合に相当している。

以上のように、この実施形態の画像処理装置１は、フーリエドメイン（ＦＤ）ＯＣＴ撮像原理を利用した撮像装置であるが、物体光学系２３の焦点深さを変更するための機能を有している。そして、容器１１底部を介して撮像が行われる際、焦点深さの設定に応じて、参照基準面を規定する参照光の光路長が参照ミラー２４の位置調整により設定される。参照基準面の位置を導出する計算式は、焦点深さＤおよび容器１１底部の厚さＴの関数として与えられる。

このような構成によれば、深さ方向の反射光強度分布において、容器１１の上部底面Ｓａと下部底面Ｓｂとに対応する複素共役信号が焦点深さに対応する位置を挟んで出現するようにすることができる。２つの複素共役信号の間隔は容器１１底部の厚さＴにより決まる一定値であるので、結果として、焦点位置およびその近傍の一定幅の範囲において複素共役ノイズの影響を排除した撮像を行うことが可能となる。

ただし、焦点深さが容器底部厚さの半分未満であるときには、その範囲における焦点位置の設定に関わらず、参照基準面が容器１１の上部底面Ｓａに対応する位置となるように、参照光の光路長が設定される。これにより、上部底面Ｓａに起因する複素共役信号は上部底面Ｓａに対応する位置に現れる一方、下部底面Ｓｂに起因する複素共役信号は上部底面Ｓａから容器底部厚さ分だけ離れた位置に現れることとなり、これらの間に現れる、焦点位置の近傍からの信号が複素共役ノイズの影響を受けることが防止される。

必要に応じて、深さ方向に焦点位置を異ならせた複数回の撮像で得られた結果を合成することで、深さ方向において２つの複素共役信号の間隔よりも広い範囲を含む断層画像を作成することが可能である。このとき、焦点位置の変更に伴って参照ミラー２４の位置を変更することにより、焦点位置の近傍では常に複素共役ノイズの影響を排除することができる。しかも合焦状態で撮像された比較的狭い範囲の部分画像を合成してより広範囲の断層画像を作成することで、断層画像全体の画像品質を良好なものとすることができる。

以上説明したように、この実施形態の画像処理装置１は、スフェロイドＳｐ等を「被撮像物」とする本発明の「撮像装置」に相当するものである。そして、撮像ユニット２０，２０ａ，２０ｂがそれぞれ本発明の「検出手段」として機能し、制御ユニット３０のうちＣＰＵ３１が本発明の「制御手段」として、また信号処理部３３が本発明の「信号処理手段」としてそれぞれ機能している。

また、上記実施形態においては、容器１１の底部１１１が本発明の「壁部」に相当し、その上部底面Ｓａおよび下部底面Ｓｂがそれぞれ本発明の「第１表面」および「第２表面」に相当している。また、値（Ｔ／２）が本発明の「閾値」に相当している。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態における参照基準面Ｓｒの位置の導出処理では、物体光学系２３の焦点深さが容器１１の上部底面Ｓａから起算した値Ｄによって、また参照基準面Ｓｒの位置が容器１１の下部底面Ｓｂから起算した値Ｒによって表されている。しかしながら、どの位置を基準として各位置を表すかは任意であり、基準位置に応じて各式を適宜改変することにより、上記技術思想と実質的に等価な処理を実現することが可能である。

また例えば、上記実施形態の被撮像物は浅皿型のディッシュと呼ばれる容器１１に担持されたスフェロイドＳｐであるが、被撮像物およびそれを担持する容器の種類はこれに限定されない。例えば、試料を担持可能な複数のウェルが１つのプレートに設けられたウェルプレートで培養された細胞等が被撮像物とされてもよい。

また例えば、上記実施形態の画像処理装置１は、容器１１の底部１１１を介して容器内の被撮像物を撮像する。しかしながら、撮像の方向はこれに限定されず、例えば被撮像物を収容する容器の側壁面を介して撮像を行う場合にも、本発明を好適に適用することが可能である。

また例えば、上記実施形態では、焦点深さＤが容器底部厚さＴの半分よりも大きいか小さいかによって値Ｒの求め方が変更される。しかしながら、式（４）による値Ｒの求め方は、焦点深さＤが容器底部厚さＴの半分よりも小さい場合にも有効である。例えば有効領域Ｒｅの範囲が狭くなることが許容される状況であれば、焦点深さＤの可変範囲の全体において一律に式（４）が適用されてもよい。

また例えば、上記実施形態では容器底面に起因する２つの複素共役信号のピークに挟まれる領域の中央に焦点位置が来るように式（４）が採用されているが、焦点位置が２つのピークのちょうど中間である必要は必ずしもない。例えば、２つのピークの間隔よりも物体光学系の被写界深度の方が大きければ、焦点位置が両ピークの中央からずれていても両ピーク間の領域全体を合焦範囲に含めることが可能であり、得られる画像の品質も上記実施形態と変わりないものとなる。式（４）に適宜のオフセットを加えた式、あるいは、図７（ｄ）の値「Ｔ／２」を適宜に改変して式（４）と同様にして求めた式を用いて、このような焦点位置と複素共役信号のピークとの位置関係を実現することが可能である。

また例えば、上記実施形態では、焦点深さを多段階に設定して撮像された部分画像Ｉｐを合成することで断層画像Ｉｔが得られる。しかしながら、例えば被撮像物の高さに対して容器底部厚さおよび物体光学系の被写界深度が十分に大きければ、１回の撮像で被撮像物の全体像を得ることが可能である。この場合にも、焦点位置の設定に応じて、上記した条件を満たすように参照光の光路長が設定されることにより、撮像結果に容器底面に起因する複素共役ノイズの影響が現れるのを効果的に防止することができる。

また、本発明において物体光学系の分解能は特に限定されないが、高倍率または高分解能での撮像を必要とする場合において本発明は特に有効である。その理由は以下の通りである。高倍率、高分解能を求めると物体光学系の被写界深度が浅くなるため、本来的には深さ方向に広く撮像可能なＦＤ−ＯＣＴ装置であっても、１回の撮像で得られる画像の深さ方向の範囲は限定される。したがって、本発明の技術思想とは直接関係のない理由で複数回の撮像が必要となる場合がある。このような場合に本発明を適用することで、１回の撮像で得られる画像は複素共役ノイズの影響がなく、また全体を合焦状態とすることができるので、良好な画像品質で撮像を行うことが可能となる。

また、上記実施形態の制御ユニット３０としては、パーソナルコンピュータやワークステーション等の一般的な構成の汎用処理装置を用いることも可能である。すなわち、撮像ユニット２０、駆動制御部４０およびこれらの動作させるための最小限の制御機能を有する撮像装置と、上記処理内容を記述した制御プログラムを実行することで制御ユニット３０として機能するパーソナルコンピュータ等との組み合わせにより、画像処理装置１が構成されてもよい。

以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、この発明においては、一の撮像において得られる反射光強度分布から求められる断層画像のうち第１表面の像と第２表面の共役像との間の領域が、有効な画像領域とされてもよい。このような構成によれば、第１表面および第２表面の共役像に起因するノイズを含まない画像領域を有効なものとして抽出することができる。

また、同一の被撮像物に対し焦点深さを互いに異ならせて複数回干渉光の検出が行われ、焦点深さを設定する度に参照光の光路長が設定され、得られた複数の検出結果から各々の焦点近傍における反射光強度分布が求められる構成であってもよい。本発明の原理によれば、一の撮像で複素共役ノイズを排除した反射光強度分布が得られる深さの範囲は容器壁部の厚さにより制限される。焦点深さを互いに異ならせた複数回の検出結果を重ね合わせれば、容器壁部の厚さを超える範囲を含む、画像品質の良好な断層画像を得ることが可能となる。

また、第１表面から物体光学系の焦点までの距離が閾値より大きくなるように焦点深さが設定されるときには、壁部の厚さをＴ、第１表面から物体光学系の焦点までの距離をＤ、第２表面から、照明光の光路に垂直な仮想的な平面であって当該平面までの照明光の光路長が参照光の光路長と等しい参照基準面までの距離をＲとするとき、
（Ｄ＋Ｔ）／２＜Ｒ＜（Ｄ＋２Ｔ）／２
の関係が成立するように、参照光の光路長が設定されてもよい。値Ｒがこのような条件を満たすように参照基準面が設定されるとき、第１表面および第２表面の共役像の出現位置を、確実に物体光学系の焦点を挟む位置として、焦点近傍における複素共役ノイズの影響を排除することができる。このように焦点の深さと壁部の厚さとの関係に応じて参照基準面を設定することで、任意の焦点深さにおいて壁部に起因する複素共役ノイズの影響をなくすことができる。

また、この発明にかかる撮像装置は、検出手段が参照光の光路に配置されて参照光の光路長を規定する参照ミラーを備え、制御手段が、参照ミラーの位置を変化させて参照光の光路長を調整するミラー駆動機構と、物体光学系を駆動して焦点深さを調整する焦点調整機構とを備えるものであってもよい。このような構成は、物体光学系の焦点深さに応じて参照ミラーの位置を変化させることで参照光の光路長を変更設定することができるものであり、上記発明を実施するのに好適なものである。

また、この発明にかかる撮像方法は、参照光の光路長を設定する前に、壁部の厚さに関する情報を取得する工程を備えるものであってもよい。このような構成によれば、焦点深さの設定値と壁部の厚さに関する情報とに基づき、参照光の光路長を上記条件に合致するように調整することが容易となる。

この発明は、ＦＤ−ＯＣＴ撮像技術全般に適用することができる。特に、ディッシュ等の容器中で培養された細胞や細胞集塊を撮像する医学・生化学・創薬の分野において好適に適用することができる。

１ 画像処理装置（撮像装置）
１１ 容器
２０，２０ａ，２０ｂ 撮像ユニット（検出手段）
２２ ビームスプリッタ
２３ 物体光学系
２４ 参照ミラー
３０ 制御ユニット
３１ ＣＰＵ（制御手段）
３３ 信号処理部（信号処理手段）
４０ 駆動制御部
４１ 焦点調整機構
４２ ミラー駆動機構
１１１ （容器１１の）底部（壁部）
２２０ 光ファイバカプラ
Ｓａ （容器１１の）上部底面（第１表面）
Ｓｂ （容器１１の）下部底面（第２表面）
Ｓｆ 焦点面
Ｓｐ スフェロイド（被撮像物）
Ｓｒ 基準参照面

Claims (13)

1. 光透過性の壁部を有する容器内に収容された被撮像物を断層撮像する撮像装置において、
   光源から出射される広帯域の低コヒーレンス光が分岐された一の分岐光を照明光として前記壁部を介して前記被撮像物に入射させ、前記壁部を介して出射される前記被撮像物の反射光を物体光学系により集光した信号光と、他の一の分岐光から生成された参照光とが干渉して生じる干渉光を検出し、検出された前記干渉光に応じた干渉信号を出力する検出手段と、
   前記干渉信号に基づき、前記干渉光のスペクトルをフーリエ変換して前記照明光の入射方向における前記被撮像物の反射光強度分布を求め、該反射光強度分布から断層画像を作成する信号処理手段と、
   前記被撮像物に対する前記物体光学系の焦点深さおよび前記参照光の光路長を変更設定する制御手段と
   を備え、
   前記制御手段は、前記壁部の表面のうち前記被撮像物側の第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離が前記壁部の厚さより小さい所定の閾値よりも小さくなるように前記焦点深さを設定するとき、前記参照光の光路長を、前記第１表面までの前記照明光の光路長と等しい値に設定する撮像装置。
2. 前記制御手段は、前記壁部の表面のうち前記被撮像物とは反対側の第２表面から、前記照明光の光路に直交する仮想的な平面であって当該平面までの前記照明光の光路長が前記参照光の光路長と等しい参照基準面までの距離と、前記壁部の厚さとが等しくなるように、前記参照光の光路長を設定する請求項１に記載の撮像装置。
3. 前記信号処理手段は、前記反射光強度分布から求められる前記断層画像のうち前記第１表面の像と前記第２表面の共役像との間の領域を有効な画像領域とする請求項２に記載の撮像装置。
4. 前記信号処理手段は、同一の前記被撮像物に対し前記焦点深さを互いに異ならせて得られた複数の検出結果から各々の焦点近傍における前記反射光強度分布を求める請求項２または３に記載の撮像装置。
5. 前記制御手段は、前記第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離が前記閾値より大きくなるように前記焦点深さを設定するとき、
   前記壁部の厚さをＴ、
   前記第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離をＤ、
   前記第２表面から、前記照明光の光路に垂直な平面であって当該平面までの前記照明光の光路長が前記参照光の光路長と等しい参照基準面までの距離をＲとするとき、
   （Ｄ＋Ｔ）／２＜Ｒ＜（Ｄ＋２Ｔ）／２
   の関係が成立するように前記参照光の光路長を設定する請求項４に記載の撮像装置。
6. 前記閾値は、前記壁部の厚さの半分である請求項１ないし５のいずれかに記載の撮像装置。
7. 前記検出手段は、前記参照光の光路に配置されて前記参照光の光路長を規定する参照ミラーを備え、
   前記制御手段は、前記参照ミラーの位置を変化させて前記参照光の光路長を調整するミラー駆動機構と、前記物体光学系を駆動して前記焦点深さを調整する焦点調整機構とを備える請求項１ないし６のいずれかに記載の撮像装置。
8. 光透過性の壁部を有する容器内に収容された被撮像物を断層撮像する撮像方法において、
   光源から出射される広帯域の低コヒーレンス光が分岐された一の分岐光を照明光として前記壁部を介して前記被撮像物に入射させ、前記壁部を介して出射される前記被撮像物の反射光を物体光学系により集光した信号光と、他の一の分岐光から生成された参照光とが干渉して生じる干渉光を検出し、検出された前記干渉光に応じた干渉信号を出力する工程と、
   前記干渉信号に基づき、前記干渉光のスペクトルをフーリエ変換して前記照明光の入射方向における前記被撮像物の反射光強度分布を求め、該反射光強度分布から断層画像を作成する工程と
   を備え、
   前記被撮像物に対する前記物体光学系の焦点深さおよび前記参照光の光路長を変更設定可能であり、
   前記壁部の表面のうち前記被撮像物側の第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離が前記壁部の厚さより小さい所定の閾値よりも小さくなるように前記焦点深さを設定するとき、前記参照光の光路長を、前記第１表面までの前記照明光の光路長と等しい値に設定する撮像方法。
9. 前記壁部の表面のうち前記被撮像物とは反対側の第２表面から、前記照明光の光路に直交する仮想的な平面であって当該平面までの前記照明光の光路長が前記参照光の光路長と等しい参照基準面までの距離と、前記壁部の厚さとが等しくなるように、前記参照光の光路長を設定する請求項８に記載の撮像方法。
10. 前記反射光強度分布から求められる前記断層画像のうち前記第１表面の像と前記第２表面の共役像との間の領域を有効な画像領域とする請求項９に記載の撮像方法。
11. 同一の前記被撮像物に対し前記焦点深さを多段階に互いに異ならせて複数回前記干渉光の検出を行い、前記焦点深さを設定する度に前記参照光の光路長を設定する請求項９または１０に記載の撮像方法。
12. 前記第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離が前記閾値よりも大きくなるように前記焦点深さを設定するとき、
    前記壁部の厚さをＴ、
    前記第１表面から前記物体光学系の焦点までの距離をＤ、
    前記第２表面から、前記照明光の光路に垂直な平面であって当該平面までの前記照明光の光路長が前記参照光の光路長と等しい参照基準面までの距離をＲとするとき、
    （Ｄ＋Ｔ）／２＜Ｒ＜（Ｄ＋２Ｔ）／２
    の関係が成立するように前記参照光の光路長を設定する請求項１１に記載の撮像方法。
13. 前記参照光の光路長を設定する前に、前記壁部の厚さに関する情報を取得する工程を備える請求項９ないし１２のいずれかに記載の撮像方法。

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