JP6462432B2 - 光計測装置及び光計測方法 - Google Patents

Description

本発明は、光計測装置に関し、特に光断層観察を行うための光計測装置およびその方法に関する。

近年、光を用いて観測対象の表面構造や内部構造を反映した画像を取得する光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ：Optical Coherence Tomography）が注目を集めている。ＯＣＴは人体に対する侵襲性を持たないことから、特に医療分野や生物学分野への応用が期待されており、眼科分野においては眼底や角膜等の画像を形成する装置が実用化段階に入っている。ＯＣＴでは光源からの光を観測対象に照射して得られた信号光と、観測対象に照射せずに参照光ミラーで反射させる参照光とに２分岐し、観測対象から反射された信号光を参照光と合波させ干渉させることにより信号を得る。

ＯＣＴは測定位置の光軸方向への走査方法により、大きくタイムドメインＯＣＴとフーリエドメインＯＣＴとに分けられる。タイムドメインＯＣＴにおいては、光源として低コヒーレンス光源を使用し、測定時に参照光ミラーを走査することにより光軸方向への走査を行う。これにより信号光に含まれる参照光と光路長が一致する成分のみが干渉し、得られた干渉信号に対して包絡線検波を行うことにより、所望の信号が復調される。一方、フーリエドメインＯＣＴはさらに波長走査型ＯＣＴとスペクトルドメインＯＣＴとに分けられる。波長走査型ＯＣＴでは、出射光の波長を走査することが可能な波長走査型光源を使用し、測定時に波長を走査することにより光軸方向への走査がなされ、検出された干渉光強度の波長依存性（干渉スペクトル）をフーリエ変換することにより所望の信号が復調される。スペクトルドメインＯＣＴにおいては、光源に広帯域光源を用い、生成された干渉光を分光器により分光し、波長成分ごとの干渉光強度（干渉スペクトル）を検出することが光軸方向への走査を行うことに対応している。得られた干渉スペクトルをフーリエ変換することにより所望の信号が復調される。

このように、ＯＣＴでは基本的に信号光と参照光を干渉させることにより、観測対象の内部構造を反映した画像情報を取得することができる。「特許文献１」には信号光の位相を変化させながら取得した複数の画像を処理して、観測可能な到達深さを増加させる技術が開示されている。「特許文献２」にはフーリエドメインＯＣＴにおいて、光源の波長に基づいて参照光の位相を変調することで、実質的に参照光の強度調整を実施して光路長の微調整を不要とする技術が開示されている。「特許文献３」にはタイムドメインＯＣＴにおいて、複数のＳＬＤを用いると共に参照光の位相を変化させることにより、波長の差異による観測対象の吸収分布の差異を取得する技術が開示されている。「特許文献４」にはタイムドメインＯＣＴにおいて、白色光とＳＬＤを光源として、それらを切り替えることにより深さ方向の解像力を可変とする技術が開示されている。「特許文献５」にはタイムドメインＯＣＴにおいて、対物レンズを物理的に走査するとともに、信号光と干渉光の干渉を位相条件の異なる４つの検出器で受光することにより、ミラーの走査による参照光の位相調整を不要とする技術が開示されている。

US2014/0023255号 特開２０１１−１９６６９４号公報 特開２００７−２４０４５３号公報 WO2001/42735号 US2014/0204388号

ＯＣＴで生体を測定する場合、一般的に観測対象内部からの反射光は観測対象と培養容器等の境界で発生する反射光に比較して極めて小さい。ＯＣＴでは信号光として、これらの反射光の和と参照光を干渉させることによって、画像情報を取得するため、境界で発生する反射光（以下、境界反射光）は、観測対象の内部反射光の観測に対して、ノイズもしくはクロストークとして振る舞うため、観測精度を低下させる不要光成分である。こうした境界反射光による観測精度の低下は、培養中の細胞シートをガラスもしくはプラスチック製の培養容器越しに観測する場合の容器と細胞シートの境界、あるいは人の肌をＯＣＴで観測する場合の空気と肌表面の境界、等に発生する。

図２は培養液で満たされた透明な培養容器内の細胞シートを測定する場合を示す摸式図である。培養液または細胞質の屈折率を１．３３、細胞内組織として特に大きな細胞核の屈折率を１．３８としたとき、フレネルの式により細胞核の反射率は約０．０３４％となる。一方、典型的な培養容器の屈折率を１．５９としたとき、培養容器と培養液もしくは細胞質との境界の反射率は０．７９％となり、1桁以上大きな強度の不要光が境界反射光として発生することが判る。実際には、細胞核に代表される生体細胞内の構造体は３次元構造を有しているため、その表面の形状によって信号光が広がって反射されるため、１つの細胞組織により反射された光のうち信号光として検出されるものは、０．０３４％より小さくなり、境界反射光の影響はさらに大きくなる。

以下、本発明の記載においては図に記載したように、光軸方向をｚ軸にとる座標系に統一して説明を進める。

一般に、ＯＣＴで得られる検出信号Ｓは、信号光の複素振幅をＥ_ｓｉｇ、参照光の複素振幅をＥ_ｒｅｆとすると次式で表すことができる。

ここで、θｓｉｇおよびθｒｅｆはそれぞれ信号光と参照光の光路長に基づく位相である。

次に境界反射光の振る舞いを定量化する。光源の波長をλ、対物レンズの開口数をＮＡ、培養容器と観測対象の境界位置をｚ＝０、対物レンズの焦点位置をｚとして、信号光に含まれるデフォーカス波面収差を考慮し、位相ダイバーシティ検出方式を実施した場合の検出信号Ｓ（ｚ）は次式で表される。

図３は境界反射の影響の計算結果を示す。ここでは（式１）に基づいて、光源の波長λ＝７８０ｎｍ、対物レンズの開口数ＮＡ＝０．５２とし、上に示した各屈折率を用いて、観測対象がない（培養液だけが容器内に満たされている）条件で得られる検出信号Ｓを計算した。図の横軸は対物レンズの焦点位置ｚを表している。図に見られるように、境界反射光の影響は、境界だけにとどまらず、sinc関数に従って生体細胞からなる観測領域にも広がっており、生体細胞からの反射信号に対して大きなクロストークを生じることが判る。以下、特に断らない限り、光源の波長は７８０ｎｍ、対物レンズの開口数は０．５２として統一して説明を進める。

「特許文献１」〜「特許文献５」に開示された技術には、信号光および参照光の光路長に基づく位相を変化させる技術が開示されているが、観測対象からの反射光量に応じた検出信号を得るため、ここに指摘した境界反射光の影響を低減することはできなかった。

本発明は上記の課題を解決するために、観測対象が３次元形状を有する一方で境界が平面と近似できる点に着目して、参照光に光軸と直行する方向の位相分布を付与することによって、境界反射光を選択的に減衰、もしくは除去することが可能な光計測方法および装置を提供する。

本発明では以下、説明の簡素化のために「特許文献５」に記載のいわゆる位相ダイバーシティ検出方式によって検出信号を得る場合について記載するが、本発明の技術は参照光と信号光の光路差に基づく位相を考慮すれば、他の検出方式についても容易に拡張できる。

ＯＣＴ装置では信号光と参照光を合波した後、検出レンズで光検出器に集光する光学系をとる。上に述べたように光軸方向にｚ軸をとると、検出レンズの開口はｘ−ｙ平面上に形成される。対物レンズの焦点のｚ座標をｚ、検出レンズのｚ座標をｚ_０とし、信号光と参照光の干渉を検出レンズの開口上の各点（ｘ、ｙ、ｚ_０）における干渉の重ね合わせとして定式化すると、検出信号Ｓは次式で表すことができる。

（式３）は、検出レンズ開口における信号光の空間分布、および参照光の空間分布を扱うように一般化した表現をしている。「特許文献１」〜「特許文献５」において、参照光は平面波として光路長に基づく位相のみを考慮した技術であるため、振幅Ａ、光路長Ｌを定数、iを虚数単位として次式で表される参照光を用いている。

ここで、（２π／λ）Ｌは参照光の光路長に基づく位相である。

また、信号光は、境界反射光と複数の生体細胞からの反射光の和として次式で表される。

ここで、右辺第１項はデフォーカス波面収差を考慮した平面状の境界反射光を表しており、Ｅ_ｂは振幅反射率、Ｒは検出レンズの開口半径である。右辺第２項は生体内の各組織からの反射光の和を表しており、各組織が3次元形状をもつことを反映して、境界反射光に比較して多くの波数成分を有する波動である。（式４）（式５）において、位相ダイバーシティ方式で検出する場合には、Ｌ＝０とすることができる。このとき、（式５）の右辺第２項をゼロとして、（式4）、(式５)を(式３)に代入し、Ｅ_ｂをＥ_ｓｉｇに書き直して整理した結果は（式２）に一致する。

さて、（式３）に戻って、積分の中を吟味すると、これが信号光と参照光の相関係数を求めているものであることが判る。すなわち、「特許文献１」〜「特許文献５」に代表される従来のＯＣＴのように、参照光として平面波を用いる場合、信号光に含まれる平面波の成分のみを抽出して検出信号を得ていると言える。一方で、観測対象である生体細胞は3次元状の立体形状をもつため、反射光は光軸に垂直な平面からの反射成分だけでなく、光軸と傾斜をもった複数の平面からの反射と等価な成分も含んでいる。すなわち、参照光として平面波を用いる場合には、生体組織からの反射光の一部を抽出して検出していることになる。したがって、境界が光軸に垂直な平面であると近似できる場合、その反射光と相関が小さくなるように、参照光の光束内に位相分布を付与することによって、境界反射の影響を低減できる可能性があることが判る。

参照光の光束内に付与する位相分布を考察する場合、別な言い方をすれば参照光の波面を適宜制御する場合、具体的な波面の形状について吟味するためには、（式３）を数値的に解く手法が必要である。ここでは、（１）生体細胞の代表的サイズが１０から３０μｍ程度の立体であること、（２）光源として可視から近赤外の波長をもつレーザやＳＬＤを用いること、（３）可能な限り計算時間を短くすること、を考慮して、ここではモンテカルロ法を応用した光線追跡法を基本としたシミュレーション方法を開発した。基本的には、各光線に付随する情報として位置および速度情報に加えて、光路長に応じた位相情報および振幅に応じた強度情報を算出することによって、検出レンズの開口にて（式３）を数値的に解くことが可能となる。本方法では、物体の表面における屈折による光線ベクトルの変化と、フレネルの法則に従う入射角度と偏光に依存した振幅反射率と透過率を算出する。以下、本方法を波動的光線追跡法と呼ぶことにする。

波動的光線追跡法の計算精度を検証するため、「特許文献５」の図４と同じ光学系のＯＣＴ装置（波長７８０ｎｍ、対物レンズ開口数０．５２）と、測定サンプルとして市販のポリスチレン製の擬似血球（屈折率役１．５９）を用いた2種類の試料を準備した。疑似血球は、屈折率が異なるが上に述べた細胞核と同等の大きさをもっている。また、参照光は光束内に位相分布のない平面波である。

図４はＸ−Ｙ像に関してシミュレーション結果とＯＣＴ装置による測定結果を比較したものである。ここでは、試料としてガラス基板とカバーガラスの間に水と単層の疑似血球を分散させたものを用いた。シミュレーションは、疑似血球を直径１０μｍの球体として扱い、１３個の疑似血球を規則的に配置にした条件で実施したものであり、１００ｘ１００μｍの領域を０．５μｍ間隔のメッシュ点で対物レンズの焦点位置を変えながら検出信号強度を計算した結果を示している。各メッシュ点の計算に用いた光線数は１００万である。図に見られるように、計算結果と実験結果は概ね一致していることがわかる。

図５はＸ−Ｚ像に関してシミュレーション結果とＯＣＴ装置による測定結果を比較したものである。ここでは、試料としてガラス基板上に、疑似血球を体積分率１０％で分散させたＵＶ樹脂（屈折率１．５１）層を約１００μｍの厚さで形成したものを用いた。観測は図中の基板側からレーザ光を照射した場合の結果である。シミュレーションは１つの疑似血球をガラス基板の界面から１０μｍ離して配置した条件で実施したものであり、４０ｘ８０μｍの領域を０．５μｍ間隔のメッシュ点で対物レンズの焦点位置を変えながら計算した結果を示している。図に見られるように、計算結果と実験結果は概ね一致していることがわかる。

図４および図５に示した結果から、疑似血球の大きさのバラツキや走査平面と疑似血球の中心とのずれ等の影響を考慮すると、波動的光線追跡法は波長よりも大きな細胞核に代表される細胞組織のＯＣＴ測定に関して、必要十分な精度で解析が可能であると言える。

図６は検出レンズ開口における信号光の振幅分布を表すシミュレーション結果の一例である。ここでは、培養液中（屈折率１．３３）に単一の疑似血球を模擬した球体を配置し、中心から対物レンズの焦点がｘ方向にずれた場合について、信号光の実部の絶対値を濃淡情報として表している。観測対象である球体に対して、下側からレーザ光を照射した場合、球体の下半球で反射された信号光は１回の反射履歴を有し、球体の上半球で反射された信号光は１回の反射の他に２回の透過および屈折の履歴を有するため、それらを別の波動として分離することができる。図に見られるように、球体の上面と下面で反射した信号光は、物体表面の曲率に応じてことなる振幅分布を有しており、対物レンズが有限の直径をもつことから、検出される光は反射された信号光の一部であり、いわゆるケラレが生じていることがわかる。図中の濃淡の間隔は開口内（光束内）の位相が１／２波長ずれていることを示している。平面状の物体により反射された信号光は、検出レンズの開口で振幅が一定で、デフォーカス波面収差に応じた回転対象な位相分布を有することは周知のことであるから、球状の観測対象により反射された信号光は明らかに異なる開口内（光束内）の位相分布をもつことがわかる。実際の観測対象である生体細胞および内部組織構造は、さらに複雑な３次元形状を有することも周知であるから、上の議論に基づいて、参照光の光束内に位相分布を付与することにより、境界反射光の影響を低減することが可能となるが、これは検出レンズの開口内における位相の分布のみが、検出信号の品質向上に寄与するからである。

境界反射光の影響の低減に有効な参照光の光束内の位相分布の一例として、検出レンズの半径に比例した円錐型の位相分布を用いた場合の境界反射光に基づく検出信号についてのシミュレーション結果を図７に示す。円錐型の位相分布は、（式４）を拡張して次式で表される。

ここで、Φ_０は付与する位相の最大値、Ｒは検出レンズ開口の半径である。図中のシミュレーション結果は、Φ_０＝０（平面波）の場合と、Φ_０＝４π（円錐型の位相分布）の場合を比較したものである。図に見られるように、参照光の光束内の位相分布として円錐型の位相分布を用いることにより、境界反射光による検出信号は、ｚ＞０の観測対象領域と反対側に一定量だけシフトするとともに、sinc関数に基づいていた検出信号の周期的な強度変化の振幅も小さくなることがわかる。生体細胞をモデル化したシミュレーションによるｘ−ｚ像の結果については、実施例にて述べる。

図６と図７に示した結果によって、参照光の光束内に付与する位相分布を適宜選択することによって、境界反射光の影響を低減可能なことを示すことができた。

本発明によれば、生体組織を観測対象としたとき、観測対象を保持する基板や培養ケースとの境界、もしくは空気と人体との境界等の境界反射の影響を低減して、高精度に生体組織を観測可能な光計測方法および装置を提供することができる。上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

なお、「特許文献１」から「特許文献５」においても、参照光の位相を変調する技術に関する開示があるが、これらは（式４）に示した光軸方向の光路長に基づく位相であって、本発明で開示する参照光の位相とは（式３）、（式６）に示したように、主として光束内の位相分布であることに留意されたい。

本発明のＯＣＴ装置構成を示す模式図。 ＯＣＴ装置で測定される信号光を示す摸式図。 境界反射による検出信号の計算結果。 Ｘ−Ｙ像に関してシミュレーション結果とＯＣＴ装置による測定結果を比較した図。 Ｘ−Ｚ像に関してシミュレーション結果とＯＣＴ装置による測定結果を比較した図。 検出レンズ開口における信号光の振幅分布を表すシミュレーション結果の一例。 円錐型の位相分布をもつ参照光と平面波参照光による境界反射に基づく検出信号のシミュレーション結果。 円錐型の位相分布をもつ参照光と平面波参照光によるｘ−ｚ像を比較したシミュレーション結果。 反射光に含まれる位相成分のスペクトルを表す摸式図である。 検出レンズの半径に依存した位相分布をもつ複数の参照光を表す模式図。 検出レンズの半径に依存した位相分布をもつ複数の参照光による境界反射に基づく検出信号のシミュレーション結果。 光束内に回転対象な位相分布を有する参照光による境界反射に基づく検出信号の平均値と半径の次数との関係を示すシミュレーション結果。 光束内にステップ状の位相分布を有する参照光を示す模式図。 光束内にステップ状の位相分布を有する参照光と平面波参照光によるｘ−ｚ像の差異を示すシミュレーション結果。 光束内にステップ状の強度分布を有する参照光を示す模式図。 光束内に異なる位相分布を有する参照光を用いて観測した複数の画像情報から、画像を合成して表示する方法を示す流れ図。 参照光の光束内に位相分布を与える反射型の光学素子を示す模式図。 参照光の光束内に任意の位相分布を形成するための反射型空間位相変調器の構成を示す模式図。 本発明の参照光と従来の参照光の差異を摸式的に表した図。 参照光の光束内に半径の２乗に比例した位相分布を付与するための反射型の光学素子を示す摸式図。 本発明の参照光によるＯＴＦの計算結果。 参照光の光束内に任意の位相分布を付与した場合のｘ−ｙ方向に取得した観測画像を示す摸式図。 参照光の強度分布または位相分布を変化させながら所望の画像を取得する本発明の光計測方法を示す流れ図。 本発明のＯＣＴ装置構成を示す別の実施例。 本発明のＯＣＴ装置構成を示す別の実施例。 本発明のＯＣＴ装置構成を示す別の実施例。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

図８は本発明の円錐型の位相分布をもつ参照光と従来の平面波参照光によるｘ−ｚ像を比較したシミュレーション結果である。ここでは、培養容器（屈折率１．５９）の内部を培養液（屈折率１．３３）で満たし、細胞核を模擬した直径１０μmの球体（屈折率１．３７）を培養容器の底面に接するように配置することにより生体細胞をモデル化したものについて、波動的光線追跡法によるシミュレーションを実施して、対物レンズの焦点位置をｘ−ｚ方向に走査したときに得られる検出信号を算出して画像化した。画像のゲインは検出信号が反射率０．０５％相当の検出信号が最大輝度レベル２５５になるように規格化している。図８（ａ）は参照光として平面波を用いた場合の結果である。図５に示した疑似血球の場合には球体の屈折率が１．５９と大きいため境界反射の影響は相対的に小さいが、生体細胞を模擬した場合、細胞核をモデル化した球体の屈折率が１．３７、培養液の屈折率が１．３３であり両者の差異が小さいため、境界反射の影響が大きくなっていることが判る。図に見られるように、境界反射の影響は（式２）に示した結果を反映してｓｉｎｃ関数に従う振動を繰り返しており、観測対象である細胞核を模擬した球体から得られる検出信号に対して大きなクロストークとなっていることが判る。一方、図８（ｂ）は参照光の光束内に（式６）に示した円錐型の位相分布を付与した場合の結果である。前述の条件と同様に付与する位相の最大値はΦ_０＝４πとしている。境界反射光の影響は図７に示した結果を反映して、実際の境界位置よりも下側にシフトし、かつ観測対象である生体細胞領域でのｓｉｎｃ関数を起因とする強度の振動も小さくなっており、細胞核をモデル化した球体からの反射光による検出信号が明瞭になっていることが判る。図８（ａ）および（ｂ）は同じゲインで規格化しているため、細胞核をモデル化した球体からの反射光に基づく検出信号の大きさはほぼ一定であることも重要な結果である。これは、図６に示したように、観測対象が３次元形状を反映した反射光が平面の反射とは異なる位相分布を有しており、（式３）に示したように検出信号は、反射光（信号光）と参照光の相関をとる光学的操作であることにより得られた結果である。本発明に依れば、参照光が平面波でなくとも、光束内に付与する位相分布の値を適切に選択すれば、生体細胞核の反射光からの検出信号の強度の減衰を小さくするとともに、境界反射の影響を選択的に減衰させて、観測によって得られる結果の精度を向上することができることが示された。

図９は反射光に含まれる位相成分のスペクトルを表す摸式図である。境界面上に対物レンズの焦点が合っている場合、図に示すように、境界からの反射光は検出レンズの開口で平面波となるため、位相はｘ−ｙ面内に分布を持たないが、生体組織は3次元の構造を有するため位相分布は広がりをもつ。したがって、参照光が平面波でない場合、検出信号に含まれる境界反射の影響を選択的に低減することが可能となる。

図１０は検出レンズの半径に依存した位相分布をもつ複数の参照光を表す模式図である。参照光の光束内の位相分布を検出レンズの開口の半径の関数とすると、以下の形式で位相分布を与えることができる。

ここで、規格化半径ｒは、（式８）によって定義され、検出レンズの開口内の位置（ｘ、ｙ）と検出レンズの開口半径Ｒによって定められる。（式７）は規格化半径ｒを用いて（式６）を一般化したものであり、次数ａ＝０のとき参照光は平面波となり、ａ＝１のとき参照光は上に示した円錐型になる。図に示すように、ここではａ＝０．５、１、２、３、４の場合について考える。

図１１は検出レンズの半径に依存した位相分布をもつ複数の参照光による境界反射に基づく検出信号のシミュレーションした結果である。

結果検出レンズの半径に依存した位相分布をもつ複数の参照光を表す模式図である。参照光の光束内の位相分布を検出レンズの開口の半径の関数とすると、以下の形式で位相分布を与えることができる。図１１（ａ）はａ＝０（平面波）、（ｂ）ａ＝０．５、（ｃ）ａ＝１（円錐型参照光）、（ｄ）ａ＝２（デフォーカス波面収差型参照光））、（ｅ）ａ＝３、（ｆ）ａ＝４の場合をそれぞれ表している。シミュレーション条件は図７に示した結果と同じであり、Φ_０＝４πで一定とした。図１１（ａ）と（ｃ）を重ねたものは図７に一致している。ｚ＞０の生体試料領域におけるｓｉｎｃ関数に基づく振動に着目すると、次数ａ＝０．５、１の場合において、ａ＝０（平面波）の場合に比較して、明らかに検出信号の振動振幅が小さくなっており、観測される画像の振動成分が低減される利点を持つことが判る。また、検出信号のピーク値に着目すると、次数ａ＝３、４の場合において、ａ＝０（平面波）の場合に比較して、明らかに検出信号のピークが小さく、ピークの形状が平坦になっており、光検出器の出力飽和の発生条件を緩和することができ、アンプノイズや回路ノイズに対してＳ／Ｎ比の点で有利な条件を得られるという利点を持つことが判る。

図１２は図１１の結果において、生体試料の領域（ｚ＞０）における境界反射に基づく検出信号の平均値と次数ａの関係を整理した結果である。図に見られるように、生体試料の領域において、従来の平面波参照光（ａ＝０）に比較して、本発明の参照光（ａ＞０）の場合に、平均値が小さくなっており、境界反射の影響を低減していることが判る。図に見られるように、この平均値はａ＝０〜１の範囲に極小値を有しており、境界反射に基づく検出信号の品質を高くすることができるという利点を持つことが判る。

参照光の光束内に位相分布を付与するという本発明の光計測方法では、別の形式の位相分布を与えることもできる。図１３は、光束内にステップ状の位相分布を有する参照光を示す模式図である。図中ハッチングした領域は参照光の光束内でλ／２（＋π）の位相差を付与した領域を示している。図１３（ａ）は光束をｘ方向に２分割して左側に位相差を付与する場合を示しており、例えば対物レンズをｙ方向に走査しても検出レンズ開口上で参照光の位相分布が変化しないという特性をもつ。図１３（ｂ）は光束をｙ方向に２分割して下側に位相差を付与する場合を示しており、例えば対物レンズをｘ方向に走査しても検出レンズ開口上で参照光の位相分布が変化しないという特性をもつ。図１３（ｃ）は光束をｘ、ｙ方向に４分割して右下と左上の領域に位相差を付与する場合を示しており、例えば対物レンズをｘ、ｙ方向にそれぞれ走査しても検出レンズ開口上で参照光の位相分布が変化しないという特性をもつ。図１３（ｄ）は光束を内周側と外周側の２領域に分割し内周側の領域に位相差を付与する場合を示しており、良く知られた光学超解像と同じ位相分布を付与することを示しており、（式３）に従って信号光に含まれる光学超解像成分を相関積分によって抽出できるため、ｘ、ｙ方向の分解能を向上できるという特性をもつ。境界反射光の(式２)に示したように、基本的に検出レンズ開口内の半径のみの関数であり、回転対称な位相分布をもつ。ここに示したステップ状の位相分布は検出レンズ開口内において付与する位相がゼロ（複素振幅＋１）とλ／２（複素振幅−１）の領域の面積がほぼ等しくなっている。したがって、（式３）に基づけば境界反射を含む平面の反射光の検出信号はゼロとなる。

図１４は本発明のステップ状の位相分布をもつ参照光と従来の平面波参照光によるｘ−ｚ像を比較したシミュレーション結果である。シミュレーション条件は基本的に図８に示したものと同じであるが、ここでは、細胞核を模擬した直径１０μmの球体をｚ方向に２つ配置した場合の結果を示している。図１４（ａ）は従来の平面波参照光により得たｘ−ｚ像である。観測対象の生体核を模擬した２つの球体からの検出信号に対して、境界反射光の影響が大きくクロストークしていることが判る。図１４（ｂ）は図１３（ｃ）に示したステップ状の位相分布を光束内に有する参照光を用いた場合のｘ−ｚ像である。前述のように、境界反射光は完全にゼロとなり、２つの球体からの反射光に基づく検出信号が画像として得られていることが判る。図１４（ｂ）において、２つの球体の中心軸において、画像が暗くなっているのは、本参照光によって、検出レンズの開口内で信号光の複素振幅分布がレンズ中心に対して対称な場合に、検出信号がゼロとなることを反映した結果である。ここに示したステップ状の参照光の光束内の位相分布は、境界反射の影響低減の意味では（式７）に基づく半径に依存した位相分布に比較して優れているが、観測対象が球体のように対称性がある形状の場合、その中央部の検出信号が小さくなるという欠点がある。実際の生体細胞組織においては、ここに示した完全な球体ではなく非対称な構造を持つため、中央部分の検出信号の低下に関しては緩和されることが期待できるが、本発明の光計測方法においては、これらの特性を勘案して観測対象に応じて、参照光の光束内に付与する位相分布を適宜選択することが重要である。

以上、参照光の光束内に特定の位相分布を付与する本発明の光計測方法について述べた。しかしながら、（式３）に基づけば、参照光の光束内に特定の強度分布を付与することも可能である。図１５は、光束内にステップ状の強度分布を有する参照光を示す模式図である。図中黒塗りした領域は参照光の強度がゼロである領域を摸式的に示している。図６に示したように、細胞核を模擬した球体からの反射光は検出レンズの開口上で一部の領域に局在して分布するという特性をもつ。図１５（ａ）〜（ｅ）はこの事実に対応して、参照光を検出レンズの一部に分布させる場合を示している。このような参照光を用いることによって、生体組織からの反射光に基づく検出信号を相対的に強調して取得することが可能である。図１５（ｄ）では、特に検出レンズの外周側、すなわち観測対象による光の反射光が大きな角度で反射される場合を強調する効果があり、例えば、生体細胞内の小さな構造を強調して検出信号を取得する効果がある。図１５（ｅ）では、特に検出レンズの中周領域、すなわち図１５（ｄ）に示したものよりも、やや大きな構造からの反射光を強調して検出信号を取得する効果がある。これらの効果は一般的に光学超解像と呼ばれるものであり、ここに示した強度分布だけでなく、同様な位相分布を付与しても得られるため、用途に合わせて適宜選択することができる。

図２１は光学超解像の例として、図１５（ｄ）に示した強度分布を参照光に付与した場合に、光学分解能を表すＯＴＦ(Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ)を計算した結果である。ここでは、光束径の８０％以下の強度をゼロとしている。図に見られるように、参照光に強度分布を付与することによって、高周波側の信号強度を増幅させると同時に、低周波側の信号強度を低下させることができる。これによって、観測対象として、特にサイズの小さいものを明るく観測することが可能となる。一般的な光学超解像は、観測対象に照射する光に強度や位相分布を付与して、分解能を向上する技術である。しかしながら、ここではＯＣＴのように信号光と参照光を干渉させる計測系の場合、参照光に強度や位相分布を付与しても、同様に分解能を向上可能なことを示すものである。特に生体計測系においては、観測対象に照射可能な光エネルギーは安全上の配慮から厳格に上限を設けて制御されなければならない。従来のように、観測対象に照射する光の強度や位相分布を変化させる方法では、照射される光エネルギーの総量の変化、もしくは焦点における最大パワーの変化が発生するという問題がある。本発明のように、参照光に位相や強度分布を付与することによって、観測対象へ照射される光は一定となるので、安全上の観点からも、本発明の技術は優れていると言える。なお、ここでは参照光の光束内に強度分布を付与する例を示したが、良く知られているように、光束内に位相分布を付与する場合にも同様な効果を得ることができることを付記しておく。

図１６は、光束内に位相分布を有する参照光を用いて観測した複数の画像情報から、画像を合成して表示する本発明の光計測方法を示す流れ図である。ここではＮ回の画像取得をする場合を示している。まず初めに装置および測定条件の初期化を行い（Ｓ１１）参照光の光束内に定められた位相分布を与える（Ｓ１２）。当該の参照光の条件によって対物レンズの焦点を走査して検出信号から画像を取得する（Ｓ１３）。これをＮ回繰り返した（Ｓ１４）後、得られたＮ個の画像を適宜抽出・合成し（Ｓ１５）、表示する（Ｓ１６）。本方法においては、例えば、（１）図１０に示した６種類の半径依存の位相分布を用いてＮ＝６とし、得られた画像から画像処理によって例えばコントラスト比が最も大きくシャープな画像を抽出して表示する方法、（２）図１３に示した４種類の半径依存の位相分布を用いてＮ＝４とし、得られた画像を平均化処理により合成して表示する方法、（３）図８（ｂ）に示した円錐型の位相分布と図１４（ｂ）に示したステップ型の位相分布を選択し、Ｎ＝２として、ステップ型の位相分布で取得した画像に基づいて細胞核等の生体組織の形状を判定し、その中央部の検出信号が小さい領域を、円錐型の位相分布で取得した画像で置き換えて合成して表示する方法、（４）図１５（ｅ）に摸式的に示したように、輪帯状の強度分布をもつ参照光を複数用いて画像を取得し、着目する生体細胞内の組織を抽出する、もしくは所定の複数の構造を強調したものを合成して表示する等が有効である。

図１９は本発明の参照光と従来の参照光の差異を摸式的に表した図である。図１９（ａ）は従来の平面波参照光を表す摸式図であり、光源５０１から出射されたレーザ光はコリメートレンズ５０２によって平行光２０に変換される。実際の参照光は光束の一部を分離して用いられる。図に示すように、光束内の等位相面２１は平坦であり、光束内に位相分布をもたない。一方、図１９（ｂ）は本発明の参照光を示す摸式図である。上と同様に、光源５０１から出射されたレーザ光はコリメートレンズ５０２によって平行光２０に変換される。平行光２０は光学素子１００を透過することによって、光束内に位相分布が付与されるため、等位相面２１は光束内で一様でない分布をもつ。ここでは、参照光の光束内の位相分布を制御するための光学素子１００は透過型のものを示したが、これは透過型に限るものではなく、反射型の光学素子を用いてもよい。

図１７は参照光の光束内に位相分布を与える反射型の光学素子を示す模式図である。図において、反射型の光学素子１００は、基板１０１上に金属反射層１０２および透明誘電体層１０３を順次積層した後、半導体プロセスのエッチング技術やナノインプリント技術を用いて誘電体層１０３が特定の厚み分布を有するように加工したものである。こうした反射型の光学素子１００に参照光２０を照射すると、反射された参照光は誘電体層１０３の厚み分布に応じて位相分布が付与される。本素子では、図１７（ｂ）に概観を示すように、半径の関数とした表面形状を有しており、図１０に示した位相分布を参照光に付与することが可能である。

図１は、本発明による光計測装置の基本的な実施形態を示す模式図である。図において、光源５０１から出射されたレーザ光はコリメートレンズ５０２によって平行光に変換され、光学軸方向を調整可能なλ／２板５０３によって偏光を回転させられた後、偏光ビームスプリッタ５０４によって信号光と参照光に２分岐される。偏光ビームスプリッタ５０４によって反射された信号光は光学軸方向が水平方向に対して約２２．５°に設定されたλ／４板５０５を透過して偏光状態をｓ偏光から円偏光に変換された後、対物レンズ５０６によって観測対象５０８に集光して照射される。ここで、対物レンズ５０６はボイスコイル型の対物レンズアクチュエータ５０７に通電する電流量の制御によってｘ−ｚ方向に走査が可能であり、観測対象５０８は図示しない可動ステージによりｙ方向に移動可能である。こうした構成によって観測対象に対して対物レンズの焦点位置がｘ−ｙ−ｚ方向への走査がなされる。観測対象から反射された信号光は対物レンズ５０６を透過し、λ／４板５０５によって偏光状態を円偏光からｐ偏光に変換され、偏光ビームスプリッタ５０４へ入射する。一方、参照光はλ／４板５０９を透過し、偏光状態をｐ偏光から円偏光に変換され、反射型光学素子５１０に入射し反射され、光束内に位相もしくは強度分布を付与された後、λ／４板５０９によって偏光状態を円偏光からｓ偏光へ変換されて偏光ビームスプリッタ５０４へ入射する。信号光と参照光は偏光ビームスプリッタ５０４によって合波され、合成光が生成される。合成光はハーフビームスプリッタ５１２、λ／２板５１３、λ／４板５１４、集光レンズ５１５、５１６、ウォラストンプリズム５１７、５１８から成る干渉光学系５１１へ導かれる。干渉光学系５１１へ入射した合成光は、ハーフビームスプリッタ５１２によって透過光と反射光に２分岐される。透過光は光学軸が水平方向に対して約２２．５°に設定されたλ／２板５１３を透過した後、検出レンズ５１５によって集光され、ウォラストンプリズム５１７によって偏光分離されることにより互いに位相関係が１８０度異なる第一の干渉光と第二の干渉光が生成される。第一の干渉光と第二の干渉光は電流差動型の光検出器５１９によって検出され、それらの強度の差に比例した差動出力信号５２１が出力される。一方、反射光は光学軸が水平方向に対して約４５度に設定されたλ／４板５１４を透過した後、検出レンズ５１６によって集光され、ウォラストンプリズム５１８によって偏光分離されることにより互いに位相関係が約１８０度異なる第三の干渉光と第四の干渉光が生成される。ここで、第三の干渉光は第一の干渉光に対して位相が約９０度異なる。第三の干渉光と第四の干渉光は電流差動型の光検出器５２０によって検出され、それらの強度の差に比例した差動出力信号５２２が出力される。このようにして生成された差動出力信号５２１、５２２（以下、I、Qと称する）は信号処理部５２３に入力され、演算処理を施される。画像化信号５２４を元に形成された観測対象の断層画像が画像表示部５２５に表示される。図中仮想開口１５０は、偏光ビームスプリッタ５０４によって合波された信号光と参照光の光束に検出レンズ５１５および５１８の開口を投影した実体のない仮想的な検出レンズ開口を表しており、前述の検出レンズ開口と等価なものである。

干渉光学系５１１の動作原理は「特許文献５」に記載されたいわゆる位相ダイバーシティ検出法を実装したものであり、説明の簡略化のために詳細は省略するが、差動信号ＩおよびＱは以下の形式で表される。

ここで、ｘ、ｙは仮想開口１５０上の位置、Ｅ_ｓｉｇは観測対象５０８から反射された信号光の複素電場振幅、Ｅ_ｒｅｆは参照光の複素電場振幅、φ_ｓｉｇおよびφ_ｒｅｆは光源５０１から仮想開口１５０までの光路長に対応する信号光と参照光の位相をそれぞれ表しており、積分は仮想開口上の信号光と参照光の相関積分を意味している。

これらを用いると検出信号Ｓは、φ_ｓｉｇ、φ_ｒｅｆに依らず次式で求めることができる。

（式１１）が（式３）と等価であることは言うまでもない。

本実施例において、反射型光学素子１００として、図１７、または図２０に示したものを用いれば、生体試料に対して高品質な観測結果を得ることが可能である。

図２６は、信号測定部1101と検出系1104を、光ファイバ1107,1103,1108で繋いだ例である。信号測定部を小型化し、可動させたい場合に好適である。

実施例１は、参照光の光路内に所定の（一定の）位相分布もしくは強度分布を付与した場合の本発明の光検出方法について述べたが、ここでは、複数の位相分布もしくは強度分布を用いた別の実施例を示す。

図１８は参照光の光束内に任意の位相分布を形成するための反射型の光学素子を示す摸式図である。反射型の光学素子１００は、基板上１００上に２次元アレイ状に形成された反射型位相付与素子１１０から構成される。こうしたアレイ状の反射型位相付与素子としては、液晶マトリックスを利用した空間光変調器を利用することができる。こうした反射型の光学素子１００を用いることによって、図示しないアレイ状の制御信号に基づいて、参照光を反射させた場合に、光束内に任意の位相分布を与えることが可能である。

図２０は参照光の光束内に半径の２乗に比例した位相分布を付与する反射型の光学素子を示す摸式図である。図において反射型の光学素子１００は、レンズ１１０、アクチュエータ１１１、およびミラー１１２より構成される。本素子においてアクチュエータ１１１によりレンズ１１０をｘ方向に移動させることによって、ミラー１１２に集光する参照光のデフォーカス状態を制御することが可能である。良く知られているようにデフォーカスの波面収差は半径の２乗に比例する位相分布を有するので、これを利用することによって、ミラーで反射された参照光にデフォーカス収差を付与することができる。また、付与する位相の大きさはアクチュエータの移動量に比例して制御できる。これにより、図１８に示した空間位相変調器を用いなくても、安価な部品を利用して、参照光に付与する位相分布を可変とする反射型光学素子を提供することが可能となる。

図２２は参照光の光束内に任意の位相分布を付与した場合のｘ−ｙ方向に取得した観測画像を示す摸式図である。本発明では、空間光変調器等を用いて参照光の光束内に付与する位相分布を変更しながら対象物の観察をすることも有効である。図２２（ａ）は標準的な条件で取得した生体細胞のｘ−ｙ像を示す摸式図である。各細胞６００の中央部分の細胞核６０１の輝度が高くなる像が得られる。これは、光の波長（概略０．４〜２μｍ）に対して、細胞核のサイズが大きく（約１０μｍ）、正反射成分が拡散反射成分に比較して大きいためである。一方、図２２（ｂ）では、対物レンズ焦点での光スポットの空間分解能を高めるように、空間光変調器の条件を変えて、より微細な組織からの反射光を強調して取得したｘ−ｙ画像を示す摸式図である。図に見られるように、細胞核６０１よりも、細胞内小器官６０２（ミトコンドリア、ゴルジ体等）の輝度が相対的に高い画像を取得することができる。

図２３は参照光の強度分布または位相分布を変化させながら画像を取得する本発明の光計測方法を示す流れ図である。ここではＮ回の画像取得をする場合を示している。まず初めに装置および測定条件の初期化を行い（Ｓ２１）参照光の光束内に定められた位相分布を与える（Ｓ２２）。当該の参照光の条件によって対物レンズの焦点を走査して検出信号から画像を取得する（Ｓ２３）。これをＮ回繰り返した（Ｓ２４）後、得られたＮ個の画像を表示する（Ｓ２５）。本方法においては、図２２に示した画像等を自動的に複数取得することが可能である。また、例えば図２２（ｂ）に示したような、細胞内小器官を強調した画像を取得したい場合には、得られたｎ枚の画像の中から、最も優れたものを計測者が判断し、それを初期条件として別の位相や強度分布の付与のパラメータを支持して、計測を繰り返すことによって、最終的に最も優れた画像を得ることが可能となる。

また、図１の計測装置における反射型光学素子１００として図１８に示したものを用いることで、生体試料に対して、より適応的な観測結果を得ることが可能である。

前述のように，本発明においては，参照光の光束内に位相分布を付与することにより，境界反射の影響を低減することが可能（図８）であり，参照光の光束内に強度分布を付与することにより，測定分解能を制御することが可能である（図２１）。本発明では，これらを組み合わることも容易であり，参照光の光束内に位相分布と強度分布を付与することによって，上に示した効果を同時に得ることや，検出する光信号の大きさを所定の量に制御すること等も可能である。

実施例１、２は、図１に示した光計測装置について説明したが、光学系全体を駆動させる例について、図２４を用いて説明する。

図２４は本発明による光計測装置の実施形態を示す別の模式図である。図１の実施形態との差異は，本実施形態において，アクチュエータ５０７を用いずに，光学系５００をステッピングモータ６００によって移動しながら測定をする点にある。本実施例においては，図１の実施形態に比較して可動部の重量が増加し，測定時間が増加するという点で劣るが，光学系５００が一体となるため機械的な剛性が高く，かつ内部の光路長が変化しないため，Ｓ／Ｎ比に優れた高品質の画像を取得することができるという点で優れている。

ここでは，光学系５００を全体として移動しながら測定する例を示したが，光学系５００を固定し，観測対象５０８を同様に図示しないステッピングモータによって移動しながら測定をすることも容易である。測定対象が小さく軽い場合には，こちらの方が測定時間の短縮の点で優れている。

実施例１では、位相ダイバーシティホモダインを用いた例を説明したが、本実施例では、通常のOCT装置に適用した例を説明する。

図２５は本発明による光計測装置の実施形態を示す別の模式図である。図１の実施形態との差異は，本実施形態において，アクチュエータ５０７を用いずに，位相ダイバーシティホモダイン光学系の代わりに，レンズ５５０，５５２，５５３，光ファイバ５５１，光検出器５５４を用いて，信号光と参照光の干渉強度を直接測定する点にある。本構成では，光源５０１にレーザに比較してコヒーレンス長が短いＳＬＤ等の低コヒーレンス光源を用い，反射型光学素子１００を図示しないステッピングモータによって移動方向５５５に沿って位置調整をすることによって，測定を実施する。このとき，観測対象５０８からの反射光のうち，光検出器５５４上において参照光との光路長の差が所定の長さより短くなる成分が，干渉により強調される。信号処理部５２３では，光検出器５５４で電気信号に変換された干渉信号にエンベロープ検波処理を施すことによって，測定を実施することができる。本構成においては，位相ダイバーシティホモダイン法を用いないので，観測対象からの反射光の位相情報を得ることができない反面，光学系の構成が簡素になり，装置の低コスト化の点で優れている。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１００：反射型光学素子
１０１：基板
１０２：金属層
１０３：誘電体層
１１０：アレイ状に反射型位相付与素子
１５０：仮想開口
５００：光学系
５０１：光源
５０２：コリメートレンズ
５０３、５１３：λ／２板
５０４：偏光ビームスプリッタ
５０５、５０９、５１４：λ／４板
５０６：対物レンズ
５０７：対物レンズアクチュエータ
５０８：観測対象
５１１：干渉光学系
５１２：ハーフビームスプリッタ
５１５、５１６：集光レンズ
５１７、５１８：ウォラストンプリズム
５１９、５２０：電流差動型の光検出器
５２３：信号処理部
５２５：画像表示部

Claims (15)

1. レーザ光を出射する光源と、
   前記光源から出射されたレーザ光を信号光と参照光に分岐する光分岐部と、
   前記信号光を観測対象に集光する集光手段と、
   前記観測対象によって反射された信号光を前記参照光と合波して干渉光を生成する手段と、
   前記信号光と干渉し、１つの検出信号として検出される干渉光を生成する前記参照光の光束内に、前記参照光の進行方向とは垂直方向の所定の位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段と、
   前記干渉光を検出する検出器と、
   前記検出器からの信号に基づいて、前記観測対象の断層画像を生成する画像処理部と
   を有することを特徴とする光計測装置。
2. 前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段は、円錐型の位相分布を付与する手段であることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
3. 前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段は、
   

   

   （Φ０は付与する位相の最大値、Ｒは検出レンズ開口の半径、（２π／λ）Ｌは参照光の光路長に基づく位相、ｘとｙは検出レンズの開口上の各点）
   にて表される位相分布を付与する手段であることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
4. 前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段は、
   

   

   （Φ０は付与する位相の最大値、Ｒは検出レンズ開口の半径、（２π／λ）Ｌは参照光の光路長に基づく位相、Ａは振幅、ｒは検出レンズの開口内の位置（ｘ、ｙ）と検出レンズの開口半径Ｒによって定められた規格化半径）
   にて表される位相分布を付与する手段であることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
5. 前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段は、ステップ状の位相分布を付与する手段であることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
6. 前記ステップ状の位相分布を付与する手段は、前記参照光の光束を、内周側と外周側に分割し、前記内周側に位相差を付与したものであることを特徴とする請求項５記載の光計測装置。
7. 前記ステップ状の位相分布は、検出レンズ開口内において付与する位相がゼロの領域ととλ／２の領域の面積が、ほぼ等しいことを特徴とする請求項５記載の光計測装置。
8. 前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段は、ステップ状の強度分布を付与する手段であることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
9. 前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段は、複数の位相分布及び／又は強度分布を付与する空間光変調器であることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
10. 前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与する手段は、前記参照光のデフォーカス状態を変化させる手段であることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
11. 前記干渉光は、互いに位相関係が異なる４つの干渉光であり、それぞれの干渉光が前記検出器によって検出されることを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
12. 前記光源、前記光分岐部、前記集光手段、前記干渉光を生成する手段、前記検出器を、一体として駆動する駆動部を有することを特徴とする請求項１記載の光計測装置。
13. レーザ光を信号光と参照光に分岐し、
    前記信号光を、平面と見なせる境界面を介して三次元形状の観察対象に集光して照射し、
    前記観察対象から反射した信号光と、光束内に進行方向とは垂直方向の所定の位相分布又は強度分布の少なくとも一方が付与された前記参照光とを干渉させ、
    前記干渉させた干渉光を検出し、
    前記検出した１つの検出信号をもとに前記観察対象の断層像を生成する
    ことを特徴とする光計測方法。
14. 前記参照光に位相分布を付与するステップと、
    前記位相分布が付与された参照光を用いて生成された前記干渉光の検出信号から、画像を取得するステップと
    を、複数回繰り返して前記断層像を合成することを特徴とする請求項１３記載の光計測方法。
15. 前記参照光に位相分布又は強度分布の少なくとも一方を付与するステップと、
    前記位相分布又は強度分布の少なくとも一方が付与された参照光を用いて生成された前記干渉光の検出信号から、画像を取得するステップと
    を、前記位相分布又は強度分布を変化させながら複数回繰り返して前記断層像を合成することを特徴とする請求項１３記載の光計測方法。

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