JP6629993B2 - Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ効率を向上させる方法及び装置 - Google Patents

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Description

この出願は、それぞれその全体を参照により本明細書に組み込む２０１８年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／９２２，７８７号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１２，６３２号、２０１７年４月２５日に出願された米国仮出願第６２／４８９，６１０号及び２０１７年６月２９日に出願された米国仮出願第６２／５２６，５１４号の利益を主張する。
本開示は、一般的に分子分析及び診断に関し、核酸配列決定に対する特定の利用可能性を有する。
ヒトゲノムを配列決定するために必要な時間は、最近１０年間で急激に減少した。数年間及び数百万ドルをかけて実施されていた手法は、今や数日間及び数千ドルで完了することができる。改善の速度は衝撃的であり、急速な技術革新の先導である半導体作製を実際に凌ぐものであるが、現在の商業的方法は、多くの臨床用途にとって依然として不十分である。
配列決定に対する重要な臨床上の希望は、患者が致命的疾患を有するかどうかについて確実な診断を明らかにする重要な情報を提供すること、さらには、高価な又は一生を変える処置選択肢の間で選択を行うときの指針を提供することである。例えば、配列決定は、予備的ながんの診断を確認し、手術、化学療法又は放射線療法のような処置選択肢についての患者の決定を支援する上で重要な役割を果たすことができる。このような確認について数日間の遅延が臨床成績に有害な影響を与えることはおそらくないが、遅延に耐える患者の感情的及び心理的状態に重大かつ有害な影響がある。
他の状況では、臨床成績は、迅速な診断に強く依存している。一握りの事例であるが、配列決定は、新生児集中治療室において使用され、新生児の未解明の疾患を同定し、配列決定がなければ認識されていなかった処置選択肢に医師を導き、それによって命を救ってきた。それでも、あまりにも多くの新生児が、適時の診断が無いために毎年死亡している。
したがって、核酸配列決定の精度、速さ及びコストの改善のための必要性が存在している。本発明は、これらの必要性を満たし、さらに関連する利点を提供する。
（発明の要旨）
本開示は、（ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物が、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドが、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドが、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完（ｉｍｐｕｔｅ）される工程を含む、核酸検出方法を提供する。
また、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、少なくとも２つの別個の混合物がそれぞれ、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、ここで順次接触は、三元複合体の安定化条件下、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触しているプライミングされたテンプレート核酸をもたらす工程；（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドが、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドが、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法が提供される。
本開示はさらに、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程を含む、核酸検出方法を提供する。任意選択的に、曖昧性を解消するために、（ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関しており、（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関している。
また、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ、テンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む第１の混合物と接触させる工程であって、接触は、（ｉ）プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体を安定化し、（ｉｉ）次の正しいヌクレオチドのプライマーへの取り込みを防止する、結合反応で起こる工程；（ｂ）結合反応を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸を、工程（ａ）及び（ｂ）に繰り返しかける工程であって、第１の混合物が第２の混合物で置き換えられ、第２の混合物は、ポリメラーゼ、テンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；並びに（ｄ）結合反応又はその生成物の検査を使用して、プライミングされたテンプレート核酸の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、（ｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出され、かつ工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出されるが工程（ｂ）の反復で不検出である場合、次の正しいヌクレオチドは、第２の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で不検出であるが工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第３の塩基タイプのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法が提供される。
特定の実施形態では、本明細書に示される核酸検出方法の工程は、テンプレート核酸におけるいくつかの異なる位置を調べるために繰り返すことができる。したがって本開示は、（ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物は、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程；（ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｅ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む、核酸を配列決定するための方法を提供する。
また本開示は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を形成するための一連の混合物と接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びテンプレート核酸の次のテンプレート位置に存在すると疑いのある少なくとも２つの異なる塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）一連の混合物によって形成される三元複合体について次のテンプレート位置を監視する工程であって、シグナル状態が、それぞれの個々の混合物によって次のテンプレート位置で形成される三元複合体の存在又は非存在を示し、それにより、次のテンプレート位置についての塩基呼び出しを符号化する一連のシグナル状態を決定する工程；（ｃ）一連のシグナル状態を復号して、次のテンプレート位置についての正しい塩基呼び出しと、塩基呼び出しにおける誤りとを区別する工程を含む、核酸配列を決定する方法をさらに提供する。
特定の実施形態では、本明細書に示される核酸検出方法の工程は、テンプレート核酸におけるいくつかの異なる位置を調べるために繰り返すことができる。したがって本開示は、（ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物は、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含み、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのそれぞれのヌクレオチドコグネイトは、異なって検出可能である三元複合体を形成することができる（つまり、第１、第２又は第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトで形成された三元複合体が、それぞれそのようなものとして同定され、第２若しくは第３の、第１若しくは第３の又は第１若しくは第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトで形成された三元複合体とはそれぞれ異なるものとして同定されうる）工程；（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程；（ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｅ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む、核酸を配列決定する方法を提供する。
また、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、少なくとも２つの別個の混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、ここで順次接触は、三元複合体の安定化条件下、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触しているプライミングされたテンプレート核酸をもたらす工程；（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程；（ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｅ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む、核酸を配列決定するための方法も本開示によって提供される。
さらなる実施形態では、核酸配列決定方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程；（ｅ）工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｆ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程を含むことができる。
さらに、核酸配列決定方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ、テンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む第１の混合物と接触させる工程であって、接触は、（ｉ）プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体を安定化し、（ｉｉ）次の正しいヌクレオチドのプライマーへの取り込みを防止する、結合反応で起こる工程；（ｂ）結合反応を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸を、工程（ａ）及び（ｂ）に繰り返しかける工程であって、第１の混合物が第２の混合物で置き換えられ、第２の混合物は、ポリメラーゼ、テンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｄ）結合反応又はその生成物の検査を使用して、プライミングされたテンプレート核酸の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、（ｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出され、かつ工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出されるが工程（ｂ）の反復で不検出である場合、次の正しいヌクレオチドは、第２の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で不検出であるが工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第３の塩基タイプのコグネイトとして同定される工程；（ｅ）工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｆ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程を含むことができる。
複数の実施形態では、三元複合体が工程（ｂ）において検出／不検出であり、かつ工程（ｂ）の反復において検出／不検出であるとき、三元複合体は、工程（ｂ）の第１のイテレーション（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）で検出／不検出であり、工程（ｂ）の反復（つまり、第２のイテレーション）において検出／不検出である。
本開示はさらに、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも４つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）少なくとも４つの別個の混合物を検査して、三元複合体を検出する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、三元複合体が混合物の少なくとも２つで検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法を提供する。
特定の実施形態では、核酸検出方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；（ｂ）第１及び第２の混合物を別個に検査して、三元複合体を検出する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、三元複合体が２つの混合物で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含むことができる。
特定の実施形態では、核酸検出方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；（ｂ）第１及び第２の混合物を別個に検査して、三元複合体を検出する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、三元複合体が第１の混合物で検出されるが第２の混合物で不検出である場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含むことができる。
特定の実施形態では、核酸検出方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；（ｂ）第１及び第２の混合物を別個に検査して、三元複合体を検出する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、三元複合体が第２の混合物で検出されるが第１の混合物で不検出である場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含むことができる。
特定の実施形態では、核酸検出方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；（ｂ）第１及び第２の混合物を別個に検査して、三元複合体を検出する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程を含み、三元複合体が２つの混合物で不検出である場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含むことができる。
また、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第３の混合物と接触させる工程であって、第３の混合物は、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｄ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第４の混合物と接触させる工程であって、第４の混合物は、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｃ）の生成物について取得されたシグナルは、第２及び第４の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｄ）の生成物について取得されたシグナルは、第３及び第４の塩基タイプについて曖昧である工程；（ｆ）工程（ｅ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程を含む、核酸検出方法が提供される。
本開示は、核酸中のヌクレオチドを同定するための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、複数のヌクレオチドは、反復配列決定反応を介して同定する。プライマーがポリメラーゼに基づく合成を介してテンプレートに従って伸長されるとき、様々な配列決定技術を、１度にテンプレート核酸の１つの位置を読み取るために使用することができる。このような技術の一つであるＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）（ＳＢＢ（商標））方法論は、一般的に、コグネイトヌクレオチドのプライマーへの共有結合取り込みを防ぐ条件下、テンプレートに沿ってそれぞれの位置で形成する安定化複合体（例えば、プライミングされたテンプレート、ポリメラーゼ及びその位置のコグネイトヌクレオチドを含む三元複合体）を検出することと、次いでテンプレートに沿って次の位置の検出を可能にするためにプライマーを伸長させることとを含む、反復サイクルに基づく。ＳＢＢ（商標）方法では、テンプレートの各位置でのヌクレオチドの検出は、次の位置へのプライマーの伸長の前に起こる。
一般的に、ＳＢＢ（商標）方法論は、核酸テンプレートに沿った位置に存在しうる４つの異なるヌクレオチドタイプを区別するために使用される。それぞれの位置でのヌクレオチドのタイプは、三元複合体のそれぞれのタイプ（つまり、含まれるヌクレオチドのタイプが異なる、異なる三元複合体のタイプ）をユニークに標識することによって又はそれぞれのタイプの三元複合体を形成するために必要な試薬を別個に送達することによって区別されうる。２つの構成は、相互に比較するとき、異なる利点を提供する。例えば、前者の構成は、４つの別個の検出チャネルを有する複雑な検出ハードウェアを必要とするという相対的欠点がある（その代わり、後者の構成では使用されうるチャネルは１つのみである）。後者の構成は、４つの異なる試薬送達に適応するためにより多くの時間及び試薬を消費するという相対的欠点がある（その代わり、前者の構成では１回の試薬送達が可能である）。
本開示は、上記の欠点を最小化又は回避することができる代替的反応構成及び試薬組成物を提供する。特定の実施形態では、ＳＢＢ（商標）反応サイクルは、配列決定されるテンプレートにあると予測される多様な塩基タイプについてのコグネイトとして機能することができる、考えられるヌクレオチドタイプのサブセットのみで行われる。この実施形態では、省略されたヌクレオチドの正体は、補完することができる。例えば、ＤＮＡテンプレートは、３つのヌクレオチドタイプのみでＳＢＢ（商標）反応サイクルにかけてもよい。３つのヌクレオチドのタイプのコグネイトの存在は、それぞれのタイプのヌクレオチドを含む安定化三元複合体の検出に従って、テンプレートの個々の位置で区別することができ、一方で、特定の位置の第４のヌクレオチドタイプのコグネイトの存在は、その位置で三元複合体の形成について任意のシグナルが存在しないことに基づいて補完することができる。この実施形態は、４つ全てのヌクレオチドタイプが別個に送達される場合に必要とされる場合よりも、要求される試薬送達が少ないという利点を提供する。別の利点は、この実施形態では、４つのヌクレオチドタイプのそれぞれについてユニークなシグナルが区別される場合に使用される検出チャネルよりも、より少なくてすむということである。補完を利用する例示的実施形態は、下記実施例の節に表１、２及び５の場面で示されている。
いくつかの実施形態では、区別されるヌクレオチドタイプの数より少ない試薬送達及び標識タイプを用いるＳＢＢ（商標）方法が提供される。例えば、３回より少ない試薬送達及び３タイプより少ない標識を、ＳＢＢ（商標）サイクルで使用することができ、それでもなお、テンプレート核酸における３つの異なる塩基タイプをユニークに同定する情報が提供される。より詳細な例では、２回の試薬送達及び２つの検査は、以下の順序で実施されうる：（１）第１の送達は、第１のヌクレオチドタイプを有する第１の安定化三元複合体及び第２のヌクレオチドタイプを有する第２の安定化三元複合体（例えば、ｄＧＴＰ−三元複合体及びｄＣＴＰ−三元複合体）を形成することができる試薬を含む；（２）第１の送達の生成物を第１の検査にかける；（３）第２の送達は、第１のヌクレオチドタイプを有する第１の安定化三元複合体及び第３のヌクレオチドタイプを有する第３の安定化三元複合体（例えば、ｄＧＴＰ−三元複合体及びｄＴＴＰ−三元複合体）を形成することができる試薬を含む；並びに（４）第２の送達の生成物を第２の検査にかける。異なる三元複合体は、任意の種々の方式で標識しうるが、標識は、三元複合体の一タイプと別のタイプを区別する必要はない。換言すると、上記の検査工程で検出される任意のシグナルが、三元複合体の形成に関与するヌクレオチドのタイプに関して曖昧であってもよい。第２の検査の結果は、第１の検査の結果の曖昧性を解消するために使用することができ、逆も同様である。より具体的には、曖昧性の解消は、以下の比較によって達成することができる：ｄＧＴＰが第１及び第２の検査の両方のシグナルの存在から同定され、又はｄＣＴＰが第１の検査におけるシグナルの存在及び第２の検査におけるシグナルの非存在から呼び出され、又はｄＴＴＰが第１の検査におけるシグナルの非存在及び第２の検査におけるシグナルの存在から呼び出される。さらに、この例では、両方の検査におけるシグナルの非存在は、ｄＡＴＰを、たとえ存在しなかった場合でも、存在していたかのように呼び出すことができる。曖昧性の解消を利用する例示的実施形態は、実施例の節に表２〜５の場面で示されている。
さらなるＳＢＢ（商標）実施形態は、代替的試薬送達工程において、１つ以上のヌクレオチドタイプについてスイッチングする標識を用いることができる。このように、安定化三元複合体の同じタイプについて検出されるシグナルの変化は、三元複合体におけるヌクレオチドの正体の曖昧性を解消するための基礎として使用することができる。より詳細には、異なるタイプの安定化三元複合体は、複数の異なる試薬送達を比較するとき、シグナル状態の異なる組合せを生ずることができる。複数の試薬送達にわたるシグナル状態のユニークな組合せは、テンプレート核酸における異なる塩基タイプをユニークに同定するシグネチャー（本明細書で「符号語」とも称される）を提供する。ユニークなシグネチャーとして、変化するシグナル状態を利用する例示的実施形態は、実施例の節に表３、４、５、７及び８の場面で示されている。
上記の例から明らかなように、本明細書に示される方法は、検出ハードウェアの複雑さ及びコストを低減するという利点を提供することができ、従前のＳＢＢ（商標）方法と比較してサイクル時間及び試薬コストを低減するという利点を提供することもできる。
本開示の特定の実施形態は、改善された精度を提供する。本明細書に示される方法を使用して、三元複合体を形成し、プライミングされたテンプレートの特定の位置で検査を複数回行うことができる。これは、配列決定方法において、プライマーの伸長により次のサイクルに進める前に、プライミングされたテンプレートの特定の位置に対して複数の試薬送達及び検査工程を含むサイクルを実行することにより達成されうる。これにより、所与のテンプレート位置での特定のコグネイトヌクレオチドタイプの逐次的又は反復検査に効果的に至ることができる。これらの逐次的又は反復検査を組み合わせて、所与のテンプレート位置での特定のコグネイトヌクレオチドタイプの１回の検査から取得しうるものよりも、正確なヌクレオチド呼び出しを提供することができる。さらに、このタイプの逐次的又は反復検査は、プライミングされたテンプレートにおける個々の位置で呼び出されるヌクレオチドについての統計分析又は分散手段を提供することができる。このような情報は、次いで、配列決定のための全体的な精度を評価するために使用することができる。
反復検査は、典型的なＳＢＢ（商標）サイクル内で工程を単に反復することによって達成することができる。例えば、反復される工程は、三元複合体の４つのユニークに標識されたタイプを形成するための試薬を送達すること及び混合物における三元複合体の異なるタイプを区別する検出器を使用して三元複合体を検査することを含むことができる。別の例として、反復される工程は、三元複合体の４つの異なるタイプそれぞれを形成するための試薬を別個に送達すること及びそれぞれの送達の生成物を別個に検出することを含むことができる。前者の構成は、より複雑な検出ハードウェアを必要とする相対的な欠点を有し、後者の構成は、比較的多くの時間及び試薬を消費する相対的な欠点を有する。本明細書に示される曖昧性の解消方法に従って、プライミングされたテンプレートにおける位置を、三元複合体を形成するための異なる試薬の混合物で順次処理することができ、得られる混合物を検査することができる。コンビナトリアル混合物にわたるヌクレオチドタイプの適切な選択により、この位置を、同じ試薬の反復送達のみを使用するときに必要とされるよりも少ない回数及び／又は少ない標識タイプで処理し、検査することを可能にする。曖昧性の解消を利用し、改善された精度を提供する例示的実施形態は、実施例の節に表３、９及び１０の場面で示されている。
本明細書に示される方法の特定の実施形態は、誤り検出及び誤り訂正を提供する符号化スキームを利用する。逐次的検査は、一連のシグナル状態をそれぞれ生ずる。例えば、三元複合体の異なるタイプが異なる色の発光団で標識され、一連の検査から放射される一連の色は、一連の三元複合体が形成されたテンプレート核酸の位置に存在するヌクレオチドのタイプを符号化することができる。それぞれの異なるヌクレオチドタイプは、ユニークな一連のシグナル状態によって符号化される。説明のために、符号を、長さの符号語ｎを形成する一連の数字として表すことができるが、ここで各数字はシグナル状態を表し（例えば、発光色に基づく二進数字の場合に第１の色又は第２の色）、符号語の長さは検査の数と同じである。可能な符号語の数が予測されるヌクレオチドタイプの数を超えるとき、誤り検出が可能である。より詳細には、塩基呼び出しは、ヌクレオチドタイプの１つについて予測される符号語から誘導されるとき有効として同定することができ、又はいずれのヌクレオチドタイプにも割り当てられていない符号語から誘導されるとき無効として同定することができるため、誤り検出が提供される。さらには、有効な塩基呼び出しについての符号間の符号の複雑さ及び距離を適切に選択することによって、誤り訂正が提供されうる。例えば、それぞれの有効な塩基呼び出しについての符号語は、少なくとも３つの数字による他の全ての有効な塩基呼び出しについての符号語と異なることができる。結果として、符号語あたり２つまでの誤りが検出され、一方で１つの誤りを訂正することができる。電気通信、情報理論又は符号化理論で使用される任意の様々な誤り検出又は誤り訂正符号を、本明細書に示される方法で使用するために適合させることができ、符号には、限定されないが、反復符号、パリティ符号、誤り検出符号、誤り訂正符号、線形符号又はハミング符号が含まれる。誤り検出符号を利用する例示的実施形態は実施例８で示され、誤り訂正符号を利用する例示的実施形態は実施例９で示される。
配列決定の実施形態では、異なるサイクルについて検査技術を変化させることが有利でありうる。例えば、後の配列決定サイクルが、先行のサイクルよりも誤りやすい状況では、配列決定が進行するにつれて、サイクルあたりの検査工程の数を増加させることが有利でありうる。先行の配列決定サイクルの間は、相対的に検査工程の数を少なくし、そして／又は標識の数を少なくする方が試薬コスト及び配列決定時間を最小化するために有利である場合があり、次いで、後続のサイクルでは精度を向上させるために検査工程及び／又は標識の数を増加させてもよい。したがって、誤り検出符号又は誤り訂正符号は、たとえ先行のサイクルで使用されていなくても、配列決定プロトコルにおける後続のサイクルで使用することができる。本明細書に示される任意の複数の検査及び／又は符号化スキームは、配列決定技術が１０、２５、５０、１００、２００、５００サイクル以上行われた後に開始することができる。
種々のＳＢＢ（商標）技術は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む共有米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号又は米国特許出願第６２／４４７，３１９号の優先権を主張する米国特許出願公開第２０１８／００４４７２７Ａ１号；又は米国特許出願第６２／４４０，６２４号の利益を主張する米国特許出願第１５／８５１，３８３号；又は米国特許出願第６２／４５０，３９７号の優先権を主張する米国特許出願第１５／８７３，３４３号に記載のものを含む、本明細書に示される教示に従って改変することができる。
さらに、補完及び曖昧性の解消を利用する方法は、反復サイクルを利用する配列決定反応に関連して本明細書で例示されているが、サイクルの反復は必要ではない。例えば、安定化三元複合体の形成を介してテンプレート核酸における単一のヌクレオチド位置をプロービングする遺伝子型判定方法は、遺伝子型判定されるテンプレートとコグネイトを形成することが予測される可能なヌクレオチドタイプのサブセットのみで実施することができ、省略されたヌクレオチドの正体を補完することができる。別の例では、３つより少ない試薬送達及び３つより少ないタイプの標識を、遺伝子型判定反応で使用することができ、それにもかかわらず、曖昧性の解消及び／又は代替的シグナル状態を使用して３つ又は４つの異なるヌクレオチドタイプをユニークに同定するための情報が提供される。遺伝子型判定の実施形態でプロービングされている位置は、誤り検出又は誤り訂正を可能にする符号化スキームを使用して同定することができる。本明細書に示される補完及び／又は曖昧性の解消技術を活用するように改変することができる遺伝子型判定技術の例には、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国仮出願第６２／４４８，６３０号の利益を主張する共有米国特許出願第１５／７０１，３７３号に示されているものが挙げられる。
本明細書において使用される用語は、特に断りのない限り、関連する技術分野における通常の意味をとることが理解される。本明細書に示されるいくつかの用語及びそれらの意味は下記に示される。
本明細書で使用されるとき、用語「曖昧」は、シグナルに関連して使用される場合、シグナルが明らかに１つを超える潜在的起源を有することを意味する。例えば、配列決定反応のサイクルで取得される曖昧なシグナルは、シグナルを生ずるサイクルに関与しうる２つ以上のヌクレオチドタイプ間を区別できない場合がある。核酸表現（例えば、核酸配列）に関連して使用されるとき、用語「曖昧」は、２つ以上のヌクレオチドタイプが占有候補として同定される、核酸表現における位置を指す。曖昧な位置は、占有候補として、例えば、少なくとも２、３又は４つのヌクレオチドタイプを有しうる。代替的に又は付加的に、曖昧な位置は、占有候補として、４、３又は２つ以下のヌクレオチドタイプを有しうる。
本明細書で使用されるとき、用語「アレイ」は、１つのフィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅ）の分子と他のフィーチャの分子とが区別されるように１つ以上の固相基板に付着されている分子の集団を指す。アレイは、異なったアドレス可能なフィーチャで固相基板上にそれぞれ配置された異なる分子を含むことができる。代替的に、アレイは、異なる分子を備えるフィーチャとしてそれぞれ機能する別個の固相基板を含むことができ、ここで異なる分子は、固相基板が付着されている表面上の固相基板の場所に従って又は流体ストリームのような液体中の固相基板の場所に従って同定することができる。アレイの分子は、例えば、ヌクレオチド、核酸プライマー、核酸テンプレート、プライミングされたテンプレート、プライミングされた核酸テンプレート、プライミングされたテンプレート核酸又はポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼのような核酸酵素又はそれらの組合せでありうる。
本明細書で使用されるとき、用語「二元複合体」は、ポリメラーゼとプライミングされたテンプレート核酸との分子間会合を指し、プライミングされたテンプレート核酸の次の正しいヌクレオチドなどのヌクレオチド分子は含まない。
本明細書で使用されるとき、用語「ブロッキング部分」は、ヌクレオチドアナログに関連して使用される場合、核酸ポリマー化反応の取り込み工程の間に、ヌクレオチドが次の正しいヌクレオチドへ共有結合連結を（例えば、プライマーヌクレオチドの３’−酸素を介して）形成することを阻害又は防止するヌクレオチドアナログの一部を指す。「可逆的終結因子」ヌクレオチドのブロッキング部分は、ヌクレオチドアナログから除去することができるか、又は他の方法で改変して、ヌクレオチドの３’−酸素が次の正しいヌクレオチドへ共有結合連結することを可能にする。このようなブロッキング部分は、本明細書で「可逆的終結部分」と称される。例示的な可逆的終結部分は、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第７，４２７，６７３号、同第７，４１４，１１６号、同第７，０５７，０２６号、同第７，５４４，７９４号又は同第８，０３４，９２３号又はＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６６７８又はＷＯ０７／１２３７４４に示されている。
本明細書で使用されるとき、用語「呼び出し（ｃａｌｌ）」は、ヌクレオチド又は塩基に関連して使用される場合、核酸配列の特定の位置に存在するヌクレオチド又は塩基のタイプを決定することを指す。呼び出しは、エラー又は信頼性の尺度に関連付けることができる。「Ｎ」、「ｎｕｌｌ」、「不明」などの呼び出しは、明らかに誤りであるとき又は信頼性が所与の閾値未満であるときの配列中の特定の位置について使用することができる。呼び出しは、塩基又はヌクレオチドの個別のタイプ（例えばＩＵＰＡＣ一文字コードを使用するＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はＵ）を指定することができ、呼び出しは縮重を指定することができる。ＩＵＰＡＣ記号を例にとると、単一の位置を、Ｒ（つまりＡ若しくはＧ）、Ｍ（つまり、Ａ若しくはＣ）、Ｗ（つまり、Ａ若しくはＴ）、Ｓ（つまり、Ｃ若しくはＧ）、Ｙ（つまり、Ｃ若しくはＴ）、Ｋ（つまり、Ｇ若しくはＴ）、Ｂ（つまり、Ｃ、Ｇ若しくはＴ）、Ｄ（つまり、Ａ、Ｇ若しくはＴ）、Ｈ（つまり、Ａ、Ｃ若しくはＴ）又はＶ（つまり、Ａ、Ｃ若しくはＧ）として呼び出すことができる。呼び出しは最終的である必要はなく、例えば、不完全な情報又は展開中の情報に基づいて提案される呼び出しである。いくつかの場合では、呼び出しは、参照に対する実験データの比較に基づいて有効又は無効とみなすことができる。例えば、シグナルデータが符号化されるとき、特定の塩基タイプについて所定の符号語と一致する呼び出しは、有効な呼び出しとして同定し、あらゆる塩基タイプの符号語と一致しない呼び出しは、無効な呼び出しとして同定することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「触媒金属イオン」は、核酸（例えば、プライマー）の３’酸素と、次に来るヌクレオチドの５’リン酸との間のポリメラーゼによるホスホジエステル結合の形成を促進する金属イオンを指す。「二価触媒金属カチオン」は、２の原子価を有する触媒金属イオンである。触媒金属イオンは、ポリメラーゼとヌクレオチドとプライミングされたテンプレート核酸との間の複合体の形成を安定化する濃度で存在することができ、この濃度は、ホスホジエステル結合形成が生じない限り、金属イオンの非触媒濃度と称される。金属イオンの触媒濃度は、ポリメラーゼが、核酸（例えば、プライマー）の３’酸素基と次に来るヌクレオチドの５’ホスフェート基との間の反応を触媒するために十分な、金属イオンの量を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「符号」は、検出装置から得られるシグナルのような情報を、塩基呼び出し又は核酸配列のような別の形式又は表現に変換するための、基準のシステムを意味する。例えば、結合したヌクレオチドの特定のタイプを有する１つ以上の三元複合体によって生じるシグナルは、数字で符号化されうる。数字はいくつかの潜在的値を有することができ、各値は異なるシグナル状態を符号化している。例えば、二進数字は、第１のシグナル状態についての第１の値と第２のシグナル状態についての第２の値を有する。数字は、例えば、３つの潜在的値を有する三進数字、４つの潜在的値を有する四進数字などのより高い基数を有しうる。一連の数字は符号語を形成することができる。例えば、一連の数字は、一連の三元複合体の検査工程から取得される一連のシグナル状態を符号化することができる。符号語の長さは、実施される検査工程の数と同じである。例示的な符号としては、限定されないが、反復符号、パリティ符号、誤り検出符号、誤り訂正符号、線形符号又はハミング符号が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、列挙された要素だけでなく、任意の追加的要素をさらに包含することを含む開放型であることが意図されている。
本明細書で使用されるとき、用語「不安定化する（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」は、存在すること又は特定の様式で作用することを継続できないようにするするために何かをすることを意味する。二元複合体の「不安定化」は、二元複合体の溶解又は分解を促進するプロセスを指す。また「不安定化」は、二元複合体の形成を阻害又は抑制するプロセスを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）」は、確認、確立又は推定する作用を指すために使用することができる。決定は確率的であってもよい。例えば、決定は、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％以上の見かけ上の尤度を有しうる。いくつかの場合では、決定は、１００％の見かけ上の尤度を有しうる。例示的決定は、最尤分析又は最尤レポートである。
本明細書で使用されるとき、用語「曖昧性を解消する（ｄｉｓａｍｂｉｇｕａｔｅ）」は、ヌクレオチドの正体に関連して使用される場合、少なくとも２つの候補ヌクレオチドタイプについて曖昧であるシグナルから、候補ヌクレオチドタイプの１つである単一のヌクレオチドタイプを同定することを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「それぞれ（各）」は、項目の集団に関して使用される場合、集団内の個々の項目を同定することを意図するが、集団内の全ての項目を必ずしも指していない。明示的な開示がある場合又は文脈が明らかに他を示している場合、例外があってもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「誤り訂正符号」は、有効又は無効であるとして情報を同定し、さらに有効な情報の回復を提供する、符号を意味する。例えば、誤り訂正符号は、有効なシグナルを無効なシグナルから回復するか又は有効な塩基呼び出しを無効なシグナル若しくは誤りのあるシグナルから作成するための十分な情報を有しうる。誤り訂正符号は、誤り検出符号として機能することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「誤り検出符号」は、有効又は無効であるとして情報を同定する符号を意味する。例えば、誤り検出符号は、有効なシグナルと無効なシグナルとを区別するための又は有効な塩基呼び出しと無効な塩基呼び出しとを区別するための十分な情報を有しうる。
本明細書で使用されるとき、用語「外因性」は、分子の部分に関連して使用される場合、分子の天然のアナログに存在しない化学的部分を意味する。例えば、ヌクレオチドの外因性標識は、天然に存在するヌクレオチドに存在しない標識である。同様に、ポリメラーゼに存在する外因性標識は、天然の環境のポリメラーゼには見出されない。
本明細書で使用されるとき、用語「伸長」は、核酸に関連して使用される場合、核酸の３’端へ少なくとも１つのヌクレオチドを加えるプロセスを指す。伸長により核酸に加えられるヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、核酸に取り込まれるといえる。したがって、用語「取り込む」は、ホスホジエステル結合の形成によって核酸の３’末端へヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを連結するプロセスを指すために使用することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「フィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅ）」は、アレイに関連して使用される場合、特定の分子が存在するアレイ内の場所を意味する。フィーチャは、単一の分子のみを含むことができる又は同じ種のいくつかの分子の集団（つまり、分子のアンサンブル）を含むことができる。代替的に、フィーチャは、異なる種である分子の集団（例えば、異なるテンプレート配列を有する三元複合体の集団）を含むことができる。アレイのフィーチャは典型的に個別である。個別のフィーチャは連続的であってもよく、互いの間にスペースを有していてもよい。本明細書で有用なアレイは、例えば、１００ミクロン、５０ミクロン、１０ミクロン、５ミクロン、１ミクロン又は０．５ミクロン未満で分離されているフィーチャを有しうる。代替的に又は付加的に、アレイは、０．５ミクロン、１ミクロン、５ミクロン、１０ミクロン、５０ミクロン又は１００ミクロンを超えて分離されているフィーチャを有しうる。フィーチャはそれぞれ１平方ミリメートル未満、５００平方ミクロン、１００平方ミクロン、２５平方ミクロン、１平方ミクロン以下の面積を有しうる。
本明細書で使用されるとき、用語「同定する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）」は、事物に関連して使用される場合、事物の認識、事物と少なくとも１つの他の事物との区別又は事物と少なくとも１つの他の事物との分類を指すために使用することができる。認識、区別又は分類は、確率的でありうる。例えば、事物は、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％以上の見かけ上の尤度で同定することができる。事物は、最尤分析の結果に基づいて同定することができる。いくつかの場合では、事物は、１００％の見かけ上の尤度で同定することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「補完する（ｉｍｐｕｔｅ）」は、ヌクレオチドの正体に関連して使用される場合、ヌクレオチドに起因する検出可能な事象の観察が存在しない核酸の位置で、特定のタイプのヌクレオチドの存在を推定することを意味する。例えば、核酸のある位置での第１のヌクレオチドタイプの存在は、第１のヌクレオチドタイプについて観察されるシグナルの非存在に基づいて補完することができる。任意選択的に、その位置での第１のヌクレオチドタイプの存在の補完は、その位置での１つ以上の他のヌクレオチドタイプについてのシグナル（複数可）の観察によってさらに影響される場合がある。
本明細書で使用されるとき、用語「標識」は、検出可能な特徴を提供する分子又はその部分を意味する。検出可能な特徴は、例えば、放射線の吸光、蛍光放射、発光放射、蛍光寿命、蛍光偏光などのような光学的シグナル；Ｒａｙｌｅｉｇｈ及び／又はＭｉｅ散乱；リガンド又は受容体に対する結合親和性；磁気特性；電気的特性；電荷；質量；放射活性などでありうる。例示的な標識としては、限定されないが、発蛍光団、発光団、発色団、ナノ粒子（例えば、金、銀、カーボンナノチューブ）、重原子、放射性同位元素、質量標識、電荷標識、スピン標識、受容体、リガンドなどを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「混合物」は、複数のヌクレオチドタイプに関連して使用される場合、同時に一緒に、例えば、液体中に若しくは表面上に又はそれらの組合せとして存在する２つ以上のヌクレオチドタイプの組合せを意味する。例示的な組合せは、液相成分に接触している表面結合反応成分である。混合物は、２つ以上の異なる事物が必ずしも一定の割合で存在する必要はなく、個々の特性を失っている必要はなく及び／又は物理的手段によって分離することができるという点で化学化合物と区別することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「次の正しいヌクレオチド」は、プライマーの３’端に結合し及び／又は取り込まれて、プライマーがハイブリダイズするテンプレート鎖における塩基を補完するヌクレオチドタイプを指す。テンプレート鎖における塩基は「次のテンプレートヌクレオチド」と称され、プライマーの３’端にハイブリダイズされるテンプレートの塩基のすぐ５’にある。次の正しいヌクレオチドは、次のテンプレートヌクレオチドの「コグネイト」と称することができ、逆も同様である。三元複合体において又は二本鎖核酸において互いに相互作用するコグネイトヌクレオチドは互いに「ペア」といわれる。次のテンプレート塩基に相補的ではない塩基を有するヌクレオチドは、「正しくない」、「ミスマッチ」又は「非コグネイト」ヌクレオチドと称される。指定された塩基タイプの「ヌクレオチドコグネイト」（例えば、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト又は第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト）は、指定された塩基タイプに相補的でありかつ／又は選択的にペアリングすることができる（例えば、テンプレート鎖における全ての他の候補塩基タイプに対して単一の指定された塩基タイプに優先的にペアリングする）ヌクレオチドである。例えば、第１の塩基のタイプ（例えば、４つの可能なタイプ）のヌクレオチドコグネイトは、第１の塩基タイプに相補的であり及び／又はペアリングすることができ、異なる塩基タイプ（例えば、第２の、第３の又は第４の塩基タイプ）には相補的でなく及び／又はペアリングすることができない。同様に、例えば、第２の塩基のタイプ（例えば、４つの可能なタイプ）のヌクレオチドコグネイトは、第２の塩基タイプに相補的であり及び／又はペアリングすることができ、異なる塩基タイプ（例えば、第１の、第３の又は第４の塩基タイプ）には相補的でなく及び／又はペアリングすることができない。ヌクレオチドコグネイトは、次の正しいヌクレオチドであってもよく、又はそうでなくてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドコグネイトは、次の正しいヌクレオチド（つまり、次のテンプレートヌクレオチドの塩基タイプにペアリングすることができるヌクレオチド）である。代替的実施形態では、ヌクレオチドコグネイトは、次の正しいヌクレオチドではない（つまり、ヌクレオチドは、次のテンプレートヌクレオチド塩基タイプとペアリングすることはできないが、代わりに次のテンプレートヌクレオチド位置に存在しない別のタイプのヌクレオチドとペアになる）。複数の実施形態では、第１、第２、第３又は第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトは、それぞれ第１、第２、第３又は第４の塩基タイプとペアリングすることができ、他の３つの塩基タイプとはペアリングできない。複数の実施形態では、第１、第２、第３及び第４の塩基タイプは、それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ；Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ；Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ；Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ；Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ；Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ；Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｃ、Ｔ、Ｇ、Ａ；Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｇ；Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｃ；Ｃ、Ａ、Ｃ、Ｇ；Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｃ；Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ａ；Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ；Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ；Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ；Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ；Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｃ、Ｔ、Ｇ、Ａ；Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｇ；Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ；又はＣ、Ａ、Ｔ、Ｇであり、これらは全て、ＤＮＡ塩基タイプについて一般的に使用される一文字標識である。複数の実施形態では、第１、第２、第３及び第４の塩基タイプは、それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ；Ａ、Ｃ、Ｕ、Ｇ；Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ；Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ；Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ；Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ；Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａ；Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｕ；Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａ；Ｃ、Ｕ、Ａ、Ｇ；Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｃ；Ｃ、Ａ、Ｃ、Ｇ；Ｇ、Ｕ、Ａ、Ｃ；Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ａ；Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｕ；Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃ；Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ａ；Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｕ；Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａ；Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｕ；Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ａ；Ｃ、Ｕ、Ａ、Ｇ；Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｕ；又はＣ、Ａ、Ｕ、Ｇである。
本明細書で使用されるとき、用語「非触媒金属イオン」は、ポリメラーゼ酵素の存在下、ヌクレオチドのプライマーへの共有結合取り込みに必要なホスホジエステル結合形成を促進しない金属イオンを指す。非触媒金属イオンは、ポリメラーゼと、例えば、触媒金属イオンとを比較する競合的結合を介して相互作用しうる。「二価非触媒金属イオン」は、２の原子価を有する非触媒金属イオンである。二価非触媒金属イオンの例としては、限定されないが、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋及びＳｒ２＋が挙げられる。三価のＥｕ３＋及びＴｂ３＋イオンは、３の原子価を有する非触媒金属イオンである。
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、天然のヌクレオチド又はそのアナログを指すために使用することができる。例としては、限定されないが、リボヌクレオチドトリホスフェート（ｒＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）のようなヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）又はジデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）若しくは可逆的に終結されたヌクレオチドトリホスフェート（ｒｔＮＴＰ）のようなその非天然アナログが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリメラーゼ」は、限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーゼ及びトランスフェラーゼを含む核酸合成酵素を指すために使用される。典型的に、ポリメラーゼは、ヌクレオチド結合及び／又はヌクレオチドポリマー化の触媒作用が起こりうる１つ以上の活性部位を有する。ポリメラーゼは、二本鎖核酸分子の第１の鎖の３’端へのヌクレオチドのポリマー化を触媒しうる。例えば、ポリメラーゼは、次の正しいヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して二本鎖核酸分子の第１鎖の３’酸素基へ付加することを触媒し、それによりヌクレオチドを、二本鎖核酸分子の第１鎖へ共有結合的に取り込ませる。任意選択的に、ポリメラーゼは、本明細書に示される方法で使用される１つ以上の条件下でヌクレオチド取り込みができる必要はない。例えば、変異ポリメラーゼは、三元複合体を形成することができるが、ヌクレオチド取り込みを触媒することはできない場合がある。
本明細書で使用されるとき、用語「プライミングされたテンプレート」、「プライミングされたテンプレート核酸」又は「プライミングされた核酸テンプレート」は、鎖の１つが、任意選択的にポリメラーゼによって延長される鎖のデブロッキングの後に、ポリメラーゼによって（例えば、次の正しいヌクレオチドを鎖の３’端に共有結合的に付着させることにより）伸長されうる３’端を有するように、二本鎖領域を有する核酸ハイブリッドを指す。二本鎖は、連続した核酸分子（例えば、ヘアピン構造）の一部であってもよく又は二本鎖は互いに共有結合的に付着していない分離可能な分子であってもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「プライマー」は、テンプレート配列で又はその近くで核酸に結合する（例えば、相補的である）配列を有する核酸を意味する。一般的に、プライマーは、テンプレートの複製を、例えばプライマーのポリメラーゼ伸長を介して可能にする構成で結合する（例えば、プライマーは、複製の前にデブロッキング（ｄｅｂｌｏｃｋ）を必要としうる）。複数の実施形態では、テンプレート配列にハイブリダイズするとき、プライマーは、ポリメラーゼに結合することができる（例えば、プライマー伸長を可能にする）。プライマーは、任意の適切な長さであってよい。プライマーは、核酸分子の第２の部分に結合する核酸分子の第１の部分でありえ、第１の部分はプライマー配列であり、第２の部分はプライマー結合配列でありうる（例えば、ヘアピンプライマー）。代替的に、プライマーは、テンプレート配列を有する第２の核酸分子に結合する第１の核酸分子でありうる。プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログから構成することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「シグナル」は、バックグラウンドエネルギー又は情報のような他のエネルギー又は情報にわたって選択的に観察されうる，エネルギー又は符号化情報を指す。シグナルは、望ましい又は予め定義された特徴を有することができる。例えば、光学的シグナルは、強度、波長、エネルギー、周波数、電力、輝度等の１つ以上によって特徴付けるか又は観察することができる。他のシグナルは、電圧、電流、電界強度、磁界強度、周波数、電力、温度のような特性に従って定量することができる。光学的シグナルは、特定の強度、波長又は色で検出することができる；電気的シグナルは、特定の周波数、電力又は電界強度で検出することができる；又は他のシグナルは、分光法及び分析学的検出に関連する当技術分野で公知の特性に基づいて検出することができる。シグナルの非存在は、シグナルのレベルがゼロであること又はシグナルのレベルがノイズと有意に区別されないことと理解される。
本明細書で使用されるとき、用語「シグナル状態」は、検出器から得られるシグナルのモード又は特徴を指す。例示的なモード又は特徴には、限定されないが、エネルギー吸収の波長、発光励起の波長、発光放射の波長、エネルギー吸収の強度、発光励起の強度、発光放射の強度、偏光状態、発光寿命、色が含まれる。シグナル状態は、複数の潜在的値を有しうる。例えば、シグナル状態は、２つの潜在的状態（二元）、３つの潜在的状態（三元）、４つの潜在的状態（四元）などを有しうる。二元シグナル状態の一例は、特定の波長で検出されるシグナルの存在又は非存在である。二元シグナル状態の別の例は、第１の波長又は第２の波長で検出される発光放射である。
本明細書で使用されるとき、用語「三元複合体」は、ポリメラーゼと二本鎖核酸とヌクレオチドとの間の分子間会合を指す。典型的に、ポリメラーゼは、次の正しいヌクレオチドとプライミングされた核酸のテンプレート鎖との間の相互作用を容易にする。次の正しいヌクレオチドは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合を介してテンプレート鎖と相互作用することができる。用語「安定化三元複合体」は、存在が促進又は延長されている三元複合体又は破壊が抑制されている三元複合体を意味する。一般的に、三元複合体の安定化は、三元複合体のプライミングされた核酸成分への、三元複合体のヌクレオチド成分の共有結合的取り込みを防止する。
本明細書で使用されるとき、用語「タイプ」は、同じ化学構造を共有する分子を同定するために使用される。例えば、ヌクレオチドの混合物は、いくつかのｄＣＴＰ分子を含むことができる。ｄＣＴＰ分子は互いに同じタイプであるが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどと比較して異なるタイプであると理解される。同様に、同じヌクレオチド配列を有する個々のＤＮＡ分子は同じタイプであるが、一方で、異なる配列を有するＤＮＡ分子は、異なるタイプである。用語「タイプ」は、同じ化学構造を共有する部分も同定することができる。例えば、テンプレート核酸のシトシン塩基は、テンプレート配列におけるそれらの位置とは独立して、互いに同じタイプの塩基であると理解される。
下記に示され、特許請求の範囲に記載される実施形態は、上記の定義を考慮して理解することができる。
本開示は、核酸の１つ以上の位置で塩基タイプを同定するための方法を提供する。プライミングされたテンプレート核酸とポリメラーゼと次の正しいヌクレオチドとの間の安定化三元複合体を形成するための反応を行うことができ、この反応では、テンプレート内の塩基とコグネイトを形成する候補である、見込みのあるヌクレオチドタイプのサブセットのみが存在する又は検出可能である。ヌクレオチドのサブセットにおけるヌクレオチドの正体は、検出されたシグナルから決定しうる一方、反応に関与しない（又は少なくとも反応において検出シグナルを生じない）ヌクレオチドは、補完によって同定することができる。核酸内の位置におけるコグネイト塩基の正体は、その位置で形成される安定化三元複合体に存在するヌクレオチドのタイプの正体から、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成規則に従って、容易に決定することができると理解される。
いくつかの実施形態では、可能なヌクレオチドタイプのサブセットは、三元複合体形成反応中に同時に存在することができる。したがって、本開示は、（ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物は、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法を提供する。
代替的に、候補のサブセットにおける異なるヌクレオチドタイプは、ポリメラーゼと共に三元複合体を形成する条件下、テンプレート核酸と逐次的に反応させることができる。したがって、本開示は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、少なくとも２つの別個の混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、順次接触は、三元複合体の安定化条件下、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触しているプライミングされたテンプレート核酸をもたらす工程；（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法を提供する。
本明細書において、核酸を検出するための、ポリメラーゼに基づく方法が記載される。本方法の実施形態は、ポリメラーゼが、プライミングされたテンプレート核酸及び次の正しいヌクレオチドと共に安定化三元複合体を形成することができる特異性を利用する。特定の実施形態では、次の正しいヌクレオチドは、専ら非共有結合的相互作用を介して複合体の他のメンバーと相互作用し、非共有結合的に安定化三元複合体に結合する。安定化三元複合体を形成するために有用な方法及び組成物は、下記のさらなる詳細及びそれぞれ参照により本明細書に組み込む共有米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号又は米国特許出願第６２／４４７，３１９号の優先権を主張する米国特許出願公開第２０１８／００４４７２７Ａ１号；又は米国特許出願第６２／４４０，６２４号の利益を主張する米国特許出願第１５／８５１，３８３号；又は米国特許出願第６２／４５０，３９７号の優先権を主張する米国特許出願第１５／８７３，３４３号に示されている。
特定の触媒金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋）の非存在下、ポリメラーゼとプライミングされたテンプレート核酸と次の正しいヌクレオチドとの間で三元複合体が形成されうる一方で、ヌクレオチドの化学的付加は、触媒金属イオンの非存在下で阻害される。触媒金属イオンの低い又は欠乏レベルにより、安定化三元複合体における次の正しいヌクレオチドの非共有結合的隔離が引き起こされる。本明細書に開示される他の方法も、安定化三元複合体を生成するために使用することができる。
任意選択的に、安定化三元複合体は、プライミングされたテンプレート核酸のプライマーが、次に来るヌクレオチドのプライマーへの酵素的取り込みを妨げるブロッキング部分（例えば、可逆的終結部分）を含むときに形成されうる。相互作用は、安定化剤の存在下で生ずることができ、ここでポリメラーゼ−核酸相互作用は、次の正しいヌクレオチド（つまり、三元複合体を安定化する安定化剤）の存在下で安定化される。プライミングされたテンプレート核酸のプライマーは、任意選択的に、伸長可能なプライマー又はその３’端で伸長を阻止された（例えば、可逆的終結部分の存在による）プライマーのいずれかでありうる。プライミングされたテンプレート核酸とポリメラーゼとコグネイトヌクレオチドとは、コグネイトヌクレオチドの塩基がプライミングされたテンプレート核酸の次の塩基（例えば、次のテンプレートヌクレオチド）に相補的であるとき、安定化三元複合体を形成することができる。
上述したように、三元複合体に有利な又は三元複合体を安定化する条件は、次に来るヌクレオチドのプライマーへの酵素的取り込みを妨げるブロッキング基（例えば、プライマーの３’ヌクレオチド上の可逆的終結部分）の存在又は触媒金属イオンの非存在によって提供されうる。他の有用な条件には、ヌクレオチドの取り込み又はポリマー化を阻害する非触媒イオン（例えば、二価又は三価の非触媒金属イオン）のような三元複合体安定化剤の存在が含まれる。非触媒金属イオンとしては、限定されないが、カルシウム、ストロンチウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ロジウム、ユーロピウム及びテルビウムイオンが挙げられる。任意選択的に、二元複合体（つまりコグネイトヌクレオチド（例えば、次の正しいヌクレオチド）を欠いている、ポリメラーゼとプライミングされた核酸との複合体）に不利であるか又は二元複合体を不安定化する条件が、１つ以上の一価カチオン及び／又はグルタメートアニオンの存在によって提供される。さらなる選択肢として、二元複合体形成のための触媒活性を減少又は二元複合体を形成する傾向を減少させるように改変されたポリメラーゼを使用することができる。
上述したように、三元複合体安定化条件は、様々なヌクレオチドの存在下でのプライミングされたテンプレート核酸に対するポリメラーゼの親和性の差異を、例えば二元複合体を不安定化することによって強調しうる。任意選択的に、条件は、様々なヌクレオチドの存在下におけるプライミングされたテンプレート核酸へのポリメラーゼの差異のある親和性を生じさせる。一例として、条件には、高塩及びグルタメートイオンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、塩は、水溶液に溶解して、一価金属カチオン（例えば、ナトリウムイオン又はカリウムイオン）のような一価のカチオンを生じうる。任意選択的に、一価のカチオン（例えば、一価の金属カチオン）を提供する塩は、さらに、グルタメートイオンを提供する。任意選択的に、グルタメートイオンの供給源は、グルタミン酸カリウムでありうる。いくつかの例では、プライミングされたテンプレート核酸のポリメラーゼ親和性を変化させるために使用されうるグルタミン酸カリウムの濃度は、グルタミン酸カリウム１０ｍＭから１．６Ｍにわたり、つまり１０ｍＭと１．６Ｍとの間の任意の量でありうる。上述のように、高塩は、５０〜１，５００ｍＭ塩の濃度の塩を指す。
三元複合体を安定化するために本明細書に示される選択肢は、相互に排他的である必要はなく、代わりに様々な組合せで使用することができることが理解される。例えば、三元複合体は、ポリメラーゼドメインの架橋、ポリメラーゼの核酸への架橋、三元複合体を安定化するポリメラーゼ変異、小分子によるアロステリック阻害、不競合的阻害因子、競合的阻害因子、非競合的阻害因子、プライマー上のブロッキング部分の存在、他の本明細書に示される手段を含むがこれらに限定されない手段の１つ又は組合せにより安定化することができる。
特定の用途又は方法の構成に合わせて所望されるように、安定化三元複合体は、天然のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ又は改変ヌクレオチドを含むことができる。任意選択的に、ヌクレオチドアナログは、含窒素塩基、５炭糖及びリン酸基を有し、ヌクレオチドの任意の部分は、天然のヌクレオチドと比較して改変、除去及び／又は置換されていてもよい。ヌクレオチドアナログは、取り込み不可のヌクレオチド（つまり、プライマーの３’酸素と反応して共有結合を形成することができないヌクレオチド）であってもよい。取り込みできないこのようなヌクレオチドとしては、例えば、一リン酸及び二リン酸ヌクレオチドが挙げられる。別の例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドを取り込みできなくする修飾を三リン酸基に含んでいてもよい。取り込み不可のヌクレオチドの例は、参照により本明細書に組み込む米国特許第７，４８２，１２０号に見出すことができる。いくつかの実施形態で、取り込み不可のヌクレオチドは、取り込み可能となるように後で改変されてもよい。取り込み不可のヌクレオチドアナログには、限定されないが、α−ホスフェート改変ヌクレオチド、α−βヌクレオチドアナログ、β−ホスフェート改変ヌクレオチド、β−γヌクレオチドアナログ、γ−ホスフェート改変ヌクレオチド又はケージヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドアナログの例は、参照により本明細書に組み込む米国特許第８，０７１，７５５号に記載されている。
安定化三元複合体に関与するヌクレオチドアナログは、アナログが取り込まれた後に、ヌクレオチドがプライマーの３’端に取り込まれることを可逆的に防ぐ終結因子を含んでいてもよい。例えば、米国特許第７，５４４，７９４号及び同第８，０３４，９２３号（これらの特許の開示は参照により本明細書に組み込む）は、３’−ＯＨ基が３’−ＯＮＨ２部分により置き換えられている可逆的終結因子を記載する。可逆的終結因子の別のタイプは、例えば、米国特許第８，８０８，９８９号（その開示は参照により本明細書に組み込む）に示されるように、ヌクレオチドの含窒素塩基に連結される。同様に本明細書に記載された方法に関連して使用することができる他の可逆的終結因子には、本明細書で先に引用した参照文献又は米国特許第７，９５６，１７１号、同第８，０７１，７５５号及び同第９，３９９，７９８号（これらの米国特許の開示は参照により本明細書に組み込む）に記載のものが含まれる。ある特定の実施形態では、可逆的ブロッキング部分は、後続のヌクレオチド取り込みを可能にする「デブロッキング（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）」として知られるプロセスにおいて、プライマーから除去することができる。デブロッキングのための組成物及び方法は、本明細書で引用した参照文献に可逆的終結因子の場面で示されている。
代替的に、ヌクレオチドアナログは、それらが取り込まれたプライマーの３’端で、不可逆的にヌクレオチド取り込みを防止する。不可逆的ヌクレオチドアナログには、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰのようなｄｄＮＴＰ）が含まれる。ジデオキシヌクレオチドは、さもなければポリメラーゼ媒介プライマー伸長に関与するｄＮＴＰの３’−ＯＨ基を欠いている。不可逆的に終結されたヌクレオチドは、遺伝子型判定用途のために特に有用でありうる。
いくつかの実施形態では、三元複合体の形成に関与するヌクレオチドは、外因性標識を含むことができる。例えば、外因性標識ヌクレオチドは、可逆的又は不可逆的終結因子部分を含むことができ、外因性標識ヌクレオチドは取り込み不可でありえ、外因性標識ヌクレオチドは終結因子部分を欠くことができ、外因性標識ヌクレオチドは取り込み可能でありえ又は外因性標識ヌクレオチドは取り込み可能かつ非終結性でありうる。外因性標識ヌクレオチドは、安定化三元複合体を非標識ポリメラーゼと共に形成するために使用されるとき、特に有用でありうる。代替的に、ヌクレオチド上の外因性標識は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペアの一パートナーを提供することができ、ポリメラーゼ上の外因性標識はペアの第２のパートナーを提供することができる。このように、ＦＲＥＴ検出は、両方のパートナーを含む安定化三元複合体を同定するために使用することができる。代替的に、三元複合体の形成に関与するヌクレオチドは、外因性標識を欠いてもよい（つまり、ヌクレオチドは「非標識」でありうる）。例えば、非標識ヌクレオチドは、可逆的又は不可逆的終結部分を含むことができ、非標識ヌクレオチドは取り込み不可でありえ、非標識ヌクレオチドは終結因子部分を欠くことができ、非標識ヌクレオチドは取り込み可能でありえ又は非標識ヌクレオチドは取り込み可能かつ非終結性でありうる。非標識ヌクレオチドは、ポリメラーゼ上の標識が、安定化三元複合体を検出するために使用されるときに有用でありうる。非標識ヌクレオチドは、ＳＢＢ（商標）方法の伸長工程においても有用でありうる。ヌクレオチドについての部分又は機能の非存在は、このような機能又は部分を有していないヌクレオチドを指すと理解されよう。しかしながら、ヌクレオチド又はそのアナログについて本明細書に示される１つ以上の機能若しくは部分又はヌクレオチド若しくはそのアナログについて当技術分野で公知の他の機能若しくは部分は、本明細書に示される方法又は組成物において、詳細が省略されている場合があることも理解されよう。
任意選択的に、ヌクレオチド（例えば、天然ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ）は、安定化三元複合体の形成の間に混合物中に存在する。例えば、少なくとも１、２、３、４つ又はより多くのヌクレオチドタイプが存在しうる。代替的に又は付加的に、４、３、２又は１つ以下のヌクレオチドタイプが存在しうる。同様に、存在する１つ以上のヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸における少なくとも１、２、３又は４つの塩基タイプに相補的でありうる。代替的に又は付加的に、存在する１つ以上のヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸における４、３、２又は１つ以下の塩基タイプに相補的でありうる。
三元複合体におけるポリメラーゼを安定化させる任意のヌクレオチド改変が、本明細書に開示の方法で使用されうる。ヌクレオチドは、ポリメラーゼに恒久的又は一過性に結合されてよい。任意選択的に、ヌクレオチドアナログは、例えば、共有結合リンカーを介して、ポリメラーゼに融合される。任意選択的に、複数のヌクレオチドアナログが、複数のポリメラーゼに融合され、ここでそれぞれのヌクレオチドアナログが異なるポリメラーゼに融合される。任意選択的に、安定化三元複合体に存在するヌクレオチドは、三元複合体を安定化させる手段ではない。したがって、任意の様々な他の三元複合体安定化方法を、ヌクレオチドアナログを利用する反応において組み合わせてもよい。
特定の実施形態では、安定化三元複合体に存在するプライミングされたテンプレート核酸分子のプライマー鎖は、本明細書に示される方法の１つ以上の工程に存在するポリメラーゼによって化学的に変化しない。例えば、プライマーは、新たなホスホジエステル結合の形成によって伸長される必要はなく、安定化三元複合体を形成するための工程の間又は安定化三元複合体を検査する工程の間に核酸分解により短縮される必要はない。
任意の種類のポリメラーゼを、本明細書に示される方法における安定化三元複合体を形成するために使用することができる。使用しうるポリメラーゼとしては、天然に存在するポリメラーゼ及びその改変されたバリエーション、例えば、限定されないが、変異体、組み換え体、融合体、遺伝子修飾体、化学修飾体、合成物及びアナログが挙げられる。天然に存在するポリメラーゼ及びその改変されたバリエーションは、ポリマー化反応を触媒することができる能力を有するポリメラーゼに限定されていない。任意選択的に、天然に存在する及び／又はその改変されたバリエーションは、安定化三元複合体の形成又は検査中に使用されない少なくとも１つの条件のポリマー化反応を触媒する能力を有する。任意選択的に、安定化三元複合体に関与する天然に存在する及び／又はその改変されたバリエーションは、改変された特性、例えば、核酸への強化された結合親和性、核酸への減少した結合親和性、ヌクレオチドへの強化された結合親和性、ヌクレオチドへの減少した結合親和性、次の正しいヌクレオチドへの強化された特異性、次の正しいヌクレオチドへの減少した特異性、減少した触媒反応速度、触媒不活性などが挙げられる。変異体ポリメラーゼとしては、例えば、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置き換えられたポリメラーゼ又は１つ以上のアミノ酸が挿入若しくは欠失しているポリメラーゼが挙げられる。
改変ポリメラーゼは、ポリメラーゼを検出するために使用することができる外因性標識部分（例えば、外因性蛍光団）を含むポリメラーゼが含まれる。任意選択的に、標識部分は、ポリメラーゼが、タンパク質単離技術を使用して少なくとも部分的に精製された後に付着されてもよい。例えば、外因性標識部分は、ポリメラーゼの遊離のスルフヒドリル又は遊離のアミン部分を使用してポリメラーゼに化学的に連結されてもよい。この連結には、システイン残基の側鎖を通じた又はＮ末端の遊離アミノ基を通じたポリメラーゼとの化学的連結を含むことができる。外因性標識部分は、タンパク質融合を介してポリメラーゼに付着されてもよい。タンパク質融合を介して付着できる例示的標識部分としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコビリタンパク質（例えば、フィコシアニン及びフィコエリスリン）又はＧＦＰ若しくはフィコビリタンパク質の波長シフト変化体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ上の外因性標識は、ＦＲＥＴペアのメンバーとして機能することができる。ＦＲＥＴペアの他のメンバーは、安定化三元複合体中のポリメラーゼに結合するヌクレオチドに付着されている外因性標識でありうる。このように、安定化三元複合体は、ＦＲＥＴを介して検出又は同定されうる。
代替的に、安定化三元複合体に関与するポリメラーゼは、外因性標識に付着されている必要はない。例えば、ポリメラーゼは、外因性標識に共有結合的に付着されている必要はない。代わりに、ポリメラーゼは、標識ヌクレオチド及び／又は標識核酸（例えば標識プライマー及び／又は標識テンプレート）と会合するまで、任意の標識を欠いていてもよい。
本開示に従って作製又は使用される三元複合体は、任意選択的に、１つ以上の外因性標識（複数可）を含んでいてもよい。標識は、三元複合体の形成の前に、三元複合体の成分に付着させる（例えば、ポリメラーゼ、テンプレート核酸、プライマー及び／又はコグネイトヌクレオチドに付着させる）ことができる。例示的な付着には、本明細書に示されているもの、本明細書で引用された参照文献におけるもの又は当技術分野で公知のもののような共有結合的付着又は非共有結合的付着が含まれる。いくつかの実施形態では、標識成分は、標識されていない成分に付着された固体支持体に溶液中で送達され、ここで標識は安定化三元複合体を形成することによって固体支持体に動員される。このように、支持体付着成分は、動員された標識の観察に基づいて検出又は同定することができる。溶液相中で使用される場合でも又は固体支持体上で使用される場合でも、外因性標識は、検査工程の間に安定化三元複合体又はその個々の成分を検出するために有用でありうる。外因性標識は、成分が安定三元複合体を形成していた他の成分から解離した後、その成分に付着されたままでもよい。例示的な標識、標識を付着するための方法及び標識成分を使用するための方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込む共有米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号又は米国特許出願第６２／４４７，３１９号の優先権を主張する米国特許出願公開第２０１８／００４４７２７Ａ１号又は米国特許出願第６２／４４０，６２４号の利益を主張する米国特許出願第１５／８５１，３８３号又は米国特許出願第６２／４５０，３９７号の優先権を主張する米国特許出願第１５／８７３，３４３号に示されている。
有用な外因性標識の例としては、限定されないが、放射性標識部分、発光団部分、蛍光団部分、量子ドット部分、発色団部分、酵素部分、電磁スピン標識部分、ナノ粒子光散乱部分及び当技術分野で公知の任意の他の様々なシグナル生成部分が挙げられる。適切な酵素部分は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。例示的なフルオロフォア部分としては、限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー（商標）、カスケードブルー（商標）、テキサスレッド（商標）、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、フィコシアニン、ユーロピウム及びテルビウムのような蛍光ランタニド錯体、Ｃｙ３、Ｃｙ５並びにＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ Ｃｏｒｐ、第２版（１９９９年７月）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈｏａｇｌａｎｄの第６版に記載されているような当技術分野で公知の他のものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、特定のシグナル特徴が、異なる標識から検出されうることが理解される。換言すれば、異なる化学的構造を有する標識は、同様のシグナル状態を生じる目的のために使用することができる。異なる標識の使用は、所望の検出能力を達成しながら、化学的挙動を最適化するのに有利でありうる。例えば、検査工程は、ヌクレオチドアナログの混合物によって形成される三元複合体のアンサンブルを観察することができ、ここでヌクレオチドアナログは全て同じ塩基タイプを含むが、混合物の個々のアナログは異なる標識を有する。ヌクレオチド混合物は、全て所望の波長で発光を発するが、混合物中の標識の分布は、ポリメラーゼについて混合物の平均結合親和性を最適化するように選択することができる標識を含むことができる。したがって、本明細書に示される方法は、共通のシグナル生成特徴を有する異なる標識からの同じシグナル状態を検出することができる。
第２の標識を、本開示の方法で使用することができる。第２の標識は、標識パートナー部分に特異的に結合することができる結合部分である。例えば、リガンド部分は、ポリメラーゼ、核酸又はヌクレオチドに付着されて、標識受容体への特異的な親和性を介した検出を可能にすることができる。使用することができる結合部分の例示的なペアには、限定されないが、抗原と免疫グロブリン又はＦＡｂのようなそれらの活性断片、免疫グロブリンと免疫グロブリン（若しくはそれぞれその活性断片）、アビジンとビオチン（若しくはアビジンに対する特異性を有するそのアナログ）、ストレプトアビジンとビオチン（若しくはストレプトアビジンに対する特異性を有するそのアナログ）又は炭水化物とレクチンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、第２の標識は、化学的に改変可能な部分でありうる。この実施形態では、反応性官能基を有する標識は、安定化三元複合体に組み込むことができる。その後、官能基を、一次標識部分と共有結合的に反応させうる。適切な官能基としては、限定されないが、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基及びチオール基が挙げられる。
代替的実施形態では、三元複合体は、外因性標識を欠いてもよい。例えば、三元複合体及び三元複合体に関与する全ての成分（例えばポリメラーゼ、テンプレート核酸、プライマー及び／又はコグネイトヌクレオチド）は、本明細書に記載の又は上述の組み込まれる参照文献に記載の外因性標識の１個、数個又は全てを欠いていてもよい。このような実施形態では、三元複合体は、質量、変化、固有の光学的特性などの安定化三元複合体の固有の特性に基づいて検出することができる。非標識三元複合体を検出するための例示的方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込む共有米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／６８９１６（ＷＯ２０１７／１１７２４３として公開）又は米国特許出願第６２／３７５，３７９号の優先権を主張する米国特許出願公開第２０１８／００４４７２７Ａ１号に示されている。
本開示の方法は、検査工程を含むことができる。一般的に、検出は、三元複合体又はそれに付着された標識部分に固有の特性を認識する方法による検査工程で達成することができる。検出が基づくことができる例示的な特性としては、質量、電気伝導度、エネルギー吸収、発光（例えば、蛍光）などが含まれるが、これらに限定されない。発光の検出は、核酸アレイに関連する当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。発光団は、例えば、放射波長、励起波長、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）強度、クエンチング、異方性又は寿命などの様々な発光特性のいずれかに基づいて検出することができる。本明細書に示される方法で使用することができる他の検出技術には、例えば、質量を検知するために使用することができる質量分析法、表面への結合を検知するために使用することができる表面プラズモン共鳴、標識が吸収するエネルギーの波長を検知するために使用することができる吸光度、標識の存在による温度の変化を検知するために使用することができる熱量、標識の電気的特性を検知するために使用することができる電気伝導度又はインピーダンス又は他の公知の分析技術が挙げられる。安定化三元複合体を作製、操作及び検出するために使用することができる試薬及び条件の例は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む共有米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／６８９１６（ＷＯ２０１７／１１７２４３として公開）又は米国特許出願第６２／４４７，３１９号の優先権を主張する米国特許出願公開第２０１８／００４４７２７Ａ１号；又は米国特許出願第６２／４４０，６２４号の利益を主張する米国特許出願第１５／８５１，３８３号；又は米国特許出願第６２／４５０，３９７号の優先権を主張する米国特許出願第１５／８７３，３４３号に示されているものを含む。
特定の実施形態では、シグナルは、特定のヌクレオチドタイプで形成される安定化三元複合体を検出せず、ヌクレオチドの正体は、補完される。このような実施形態では、プライミングされたテンプレート核酸は、方法の任意又は全ての検査又は検出工程の間、その特定のヌクレオチドと接触させる必要はない。代替的に、特定のヌクレオチドは、検査工程の間に存在しうるが、使用条件下で検出できない場合がある。例えば、ヌクレオチドは、検出できない安定化三元複合体を形成する場合がある。検出性の欠如は、安定化三元複合体におけるヌクレオチド若しくはポリメラーゼに結合する外因性標識の非存在に由来する場合があり又は検出性の欠如は安定化三元複合体におけるヌクレオチド若しくはポリメラーゼ上に存在する結合する標識を検出するように構成されていない検出条件の使用に由来する場合がある。さらに下記に詳細に示されるように、検査工程の間に存在しない１つ以上のヌクレオチドタイプが、それにもかかわらず、伸長工程の間に提供されうる。
混合物が、三元複合体タイプのサブセットのみについて検査される場合であっても、混合物の４つの異なるヌクレオチドのタイプ全てを含むことが有利でありうる。例えば、混合物は、４つの塩基タイプ全てを有するヌクレオチドを含むことができ、ここでヌクレオチドの第１のサブセット（例えば、Ａ及びＧ）は検出される標識を有し、ヌクレオチドの第２のサブセット（例えば、Ｃ及びＴ）は検出される標識を有しない。混合物中に４つのヌクレオチドタイプが全て存在することは、コグネイトでないヌクレオチドを有する三元複合体の形成防止に役立ちうるが、この理由は、正しいヌクレオチドが存在すると、結合混合物中の正しくないヌクレオチドに競り勝つことになるからである。したがって、４つ全てのヌクレオチドタイプの存在が、正しく結合したコグネイトヌクレオチドを有する三元複合体を形成し、配列決定結果の精度を改善するために有利でありうる。
本明細書に示される方法の特定の実施形態は、いくつかの成分を含む混合物を形成する工程を含む。例えば、混合物は、プライミングされたテンプレート核酸とポリメラーゼと１つ以上のヌクレオチドタイプとの間で形成されうる。混合物の成分は、任意の所望の順序で容器に送達することができ又は同時に送達することができる。さらに、成分の一部は互いに混合されて第１の混合物を形成することができる。第１の混合物は続けて他の成分と接触し、より複雑な混合物を形成する。一例として、プライミングされたテンプレート核酸とポリメラーゼと複数の異なるヌクレオチドタイプを含む混合物を形成する工程を考慮すると、複数の異なるヌクレオチドタイプは、プライミングされたテンプレート核酸と接触する前に、互いに接触しうると理解される。代替的に、２つ以上のヌクレオチドタイプが、プライミングされたテンプレート核酸及び／又はポリメラーゼに別個に送達されうる。このように、第１のヌクレオチドタイプは、第２のヌクレオチドタイプと接触する前に、プライミングされたテンプレート核酸に接触してもよい。代替的に又は付加的に、第１のヌクレオチドタイプは、第２のヌクレオチドタイプと接触する前に、ポリメラーゼに接触してもよい。
本明細書に示される方法のいくつかの実施形態では、２つ以上の区別可能なシグナルを利用して、安定化三元複合体を互いに区別する及び／又はテンプレート核酸中の１つの塩基タイプを別の塩基タイプと区別する。例えば、２つ以上の発光団は、ユニークな励起波長又はユニークな放射波長のようなユニークな光学特性に基づいて、互いに区別することができる。特定の実施形態では、方法は、発光強度の差異に基づいて異なる安定化三元複合体を区別することができる。例えば、第１の三元複合体は、第２の三元複合体よりも小さい強度で発光する条件で検出することができる。このような強度スケーリング（「グレイスケーリング」と呼ばれることもある）には、任意の識別可能な強度差を利用することができる。例示的な差異には、検出される別の安定化三元複合体の強度と比較して、１０％、２５％、３３％、５０％、６６％又は７５％である強度を有する特定の安定化三元複合体が挙げられる。
強度差は、それぞれ異なる吸光係数（つまり、異なる励起特性を生じる）及び／又は異なる発光量子収率（つまり、異なる放射特性を生じる）を有する異なる発光団を使用して達成することができる。代替的に、同じ発光団の種類を使用し、異なる量で存在させてもよい。例えば、三元複合体の第１の集団の全てのメンバーを特定の発光団で標識することができ、一方で第２の集団は発光団で標識されたそのメンバーの半分のみを有する。この例では、第２の集団は、第一の集団の半分のシグナルを生成することが予測される。第２の集団は、例えば、標識されたヌクレオチドと標識されていないヌクレオチドとの混合物（標識されたヌクレオチドを主に含む第１の集団とは対照的）を使用して製造することができる。同様に、第２の集団は、例えば、標識されたポリメラーゼと標識されていないポリメラーゼとの混合物（最初に標識されたポリメラーゼを含む第１の集団とは対照的）を使用して、製造することができる。代替的標識スキームでは、三元複合体の第１の集団は、特定の発光シグナルを生じる複数の標識を有するポリメラーゼ分子を含むことができ、三元複合体の第２の集団は、発光シグナルを生ずる標識の１種のみをそれぞれ有するポリメラーゼ分子を含むことができる。
本開示は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程を含む、核酸検出方法を提供する。任意選択的に、曖昧性を解消するために、（ｉ）第１の塩基タイプは、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関しており、（ｉｉ）第２の塩基タイプは、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、（ｉｉｉ）第３の塩基タイプは、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関している。
また、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ、テンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む第１の混合物と接触させる工程であって、接触は、（ｉ）プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体を安定化し、（ｉｉ）次の正しいヌクレオチドのプライマーへの取り込みを防止する、結合反応で起こる工程；（ｂ）結合反応を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸を、工程（ａ）及び（ｂ）に繰り返しかける工程であって、第１の混合物が第２の混合物で置き換えられ、第２の混合物は、ポリメラーゼとテンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとテンプレートの第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；並びに（ｄ）結合反応又はその生成物の検査を使用して、プライミングされたテンプレート核酸の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、（ｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出され、かつ工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出されるが工程（ｂ）の反復で不検出である場合、次の正しいヌクレオチドは、第２の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で不検出であるが工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第３の塩基タイプのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法が提供される。
特定の実施形態では、プライミングされたテンプレート核酸は、三元複合体の安定化条件下、２つ以上の混合物と接触させてもよい。プライミングされたテンプレート核酸は、混合物と順次接触させてもよい。例えば、プライミングされたテンプレート核酸は、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させ、次いでポリメラーゼが、三元複合体の安定化条件下、別のポリメラーゼと置き換えられてもよい。代替的に又は付加的に、１つ以上のヌクレオチドが、三元複合体の安定化条件下、１つ以上の他のヌクレオチドと置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ及び第１の混合物の全てのヌクレオチドが、別のポリメラーゼ及び他のヌクレオチドと置き換えられる。代替的実施形態では、２つ以上の混合物を、三元複合体の安定化条件下、プライミングされたテンプレート核酸と同時接触させてもよい。
多くの実施形態では、プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、２つ以上の混合物と接触させることができ、ここで第１の混合物は、プライミングされたテンプレート核酸と、第２の混合物に存在する少なくとも１つのヌクレオチドタイプとは異なる少なくとも１つのヌクレオチドタイプを用いて形成される。このような場合、同じタイプのポリメラーゼが、第１及び第２の混合物の両方に存在しうるが、この理由は、ポリメラーゼが第２の混合物が形成されたときに第１の混合物から除去されていないため、又はポリメラーゼが第１の混合物から除去され、同じタイプのポリメラーゼに置き換えられているためである。第２の混合物を形成するとき、第１の混合物のポリメラーゼを別のタイプのポリメラーゼと置き換えることも可能である。ポリメラーゼ置き換えは、例えば、異なる特性又は活性を活用するために使用することができる。例えば、第１の混合物は、第１のヌクレオチドタイプ及び第１のヌクレオチドタイプに対して比較的高い親和性又は特異性を有する第１のポリメラーゼを含むことができ、第２の混合物は、第２のヌクレオチドタイプ及び第２のヌクレオチドタイプに対して比較的高い親和性又は特異性を有する第２のポリメラーゼを有することができる。この実施例では、第１のポリメラーゼは、第２のヌクレオチドタイプと比較して、第１のヌクレオチドに対してより高い親和性又は特異性を有することができる。代替的に又は付加的に、第２のポリメラーゼは、第１のヌクレオチドタイプと比較して、第２のヌクレオチドタイプに対してより高い親和性又は特異性を有することができる。別の例では、第２の混合物が、三元複合体安定化状態からプライマー伸長状態へより都合よく変換されるポリメラーゼ（第１の三元複合体を形成するために使用されるポリメラーゼと比較して）を含むことが好ましい場合がある。
プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、２つ以上のポリメラーゼ−ヌクレオチド混合物と順次接触させる複数の実施形態では、検査は、順次の接触それぞれの後に行ってもよい。例えば、プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させて第１の混合物を形成し、次いで第１の混合物を三元複合体の形成について検査してもよく、その後、プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させて第２の混合物を形成し、次いで第２の混合物を三元複合体の形成について検査してもよい。代替的に、２つ以上の混合物が、検査工程を実施する前に形成されてもよい。このように、検査は、安定化三元複合体を形成するためにプライミングされたテンプレート核酸を試薬と接触させる２つ以上の連続的工程を介在させる必要はない。
１つ以上の洗浄工程が、三元複合体の安定化条件下でプライミングされたテンプレート核酸と接触させた他の試薬から、プライミングされたテンプレート核酸を分離するために、有用でありうる。このような洗浄は、１つ以上の試薬が、混合物の検査を妨害すること又は以前に第１混合物と接触していた基板上（又は容器内）に形成される第２の混合物に混入することを避けることができる。例えば、プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及び少なくとも１つのヌクレオチドタイプと接触させて第１の混合物を形成させてもよく、さらに第１の混合物を検査してもよい。任意選択的に、検査の前に洗浄を行って、安定化三元複合体の形成に関係しない試薬を除去してもよい。代替的に又は付加的に、洗浄を検査工程の後に行って、プライミングされたテンプレート核酸から第１の混合物の１つ以上の成分を除去してもよい。次いで、プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及び少なくとも１つの他のヌクレオチドと接触させて第２の混合物を形成してもよく、三元複合体の形成について第２の混合物を検査してもよい。前述のように、任意選択的な洗浄を、第２の検査の前に行って、安定化三元複合体の形成に関係しない試薬を除去してもよい。
本明細書に示される方法は、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ、テンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む混合物を検査する工程を含むことができ、ここで混合物から取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧である。曖昧性は、例えば、標識を介して検出される安定化三元複合体に存在するヌクレオチドタイプを区別しないようなシグナルが、ポリメラーゼに付着された外因性標識から取得されるときに生じうる。曖昧性は、混合物中のヌクレオチドが外因性標識を有しないとき又は異なるヌクレオチドがユニークな標識を有しないときに生じうる。例えば、混合物中の２つ以上のヌクレオチドが同じタイプの外因性標識（又は重複するシグナルを生じる異なる外因性標識）に付着されるとき、混合物から生じるシグナルは、三元複合体の存在を示しているが、ヌクレオチドの１つを有する三元複合体と他のヌクレオチドを有する三元複合体とを区別するために十分な情報を提供していない場合がある。しかしながら、曖昧なシグナルを生ずるいくつかの実施形態では、ヌクレオチドの正体は、三元複合体の安定化条件下、第２の混合物の存在下に同じプライミングされたテンプレート核酸を検査することによって曖昧性を解消することができる。具体的には、第２の混合物は、第１の混合物にあったヌクレオチドタイプの１つを欠いている場合がある。両方の混合物で存在したヌクレオチドタイプは、シグナルが両方の混合物で検出されたという事実に基づいて同定することができ、一方で第１の混合物に存在し、第２の混合物に存在しなかったヌクレオチドタイプは、第１の混合物におけるシグナルの存在及び第２の混合物におけるシグナルの欠如に基づいて同定することができる。曖昧性の解消を利用する幾つかの具体的な例は、下記の実施例に示されている（表２〜５参照）。特に有用な曖昧性の解消方法は符号化スキームを利用し、ここで一連の混合物から検出される一連のシグナルは符号語を生じ、符号語は塩基呼び出しをなすように復号化される。曖昧性の解消のために符号語を使用する例示的実施形態は、下記に実施例８及び９で示されている。
本明細書に示される曖昧性の解消方法の利点は、ユニークに同定する異なるヌクレオチドタイプの数が、検出されるユニークなシグナルの数（又は使用される標識の数）を上回ることができるということである。例えば、２つ以上のヌクレオチドタイプが、両方に共通するシグナルの検出に基づいて、本明細書に示される方法で区別することができる。さらなる例として、プライミングされたテンプレート核酸とポリメラーゼと２つ以上のヌクレオチドとを有する第１の混合物からのシグナルは、プライミングされたテンプレート核酸とポリメラーゼと２つ以上のヌクレオチドとを有する第２の混合物からのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得されうる。この例では、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含むことができ、一方で第２の混合物は第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含むことができる。この実施例のさらなる選択肢として、第１の混合物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であってもよく、第２の混合物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧であってもよい。
本明細書に示されるいくつかの実施形態で例証されるように、プライミングされたテンプレート核酸の特定の位置での３つの塩基タイプは、わずかに２つの結合反応及びわずかに１タイプの標識を使用して区別することができる。このような実施形態では、第１の結合反応は、第１及び第２のヌクレオチドタイプを含み、第２の結合反応は、第１のヌクレオチドタイプ及び第３のヌクレオチドタイプを含む。最終的な結果は、第１のヌクレオチドタイプは、シグナルが両方の反応で形成された安定化三元複合体から観察されるとき決定され、第２のヌクレオチドタイプは、シグナルが第１の反応で形成される三元複合体について観察されるときのみに決定され、第３のヌクレオチドタイプは、シグナルが第２の反応で形成される三元複合体について観察されるときのみに決定される。この例において、第４のヌクレオチドタイプは、プライミングされたテンプレートとの結合反応に関与している必要はなく又は、第４のヌクレオチドが存在する場合であってさえ、それまでに検出されている必要はない。むしろ、第４のヌクレオチドは補完によって同定されうる。より具体的には、テンプレートが天然に存在する核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）である場合にヌクレオチドの４つのタイプのみがテンプレートに存在することは公知であり、両方の結合反応におけるシグナルの非存在は、第４の塩基タイプが検査下でテンプレート位置に存在したことを補完するために使用することができる。
上記の例での第４のヌクレオチドタイプの補完を代替するものとして、第３の結合反応が第４の塩基タイプを使用して実行されてもよく、第４の塩基タイプを含む安定化三元複合体が検出されてもよい。この代替は、一貫した結果の観察（例えば、第４のヌクレオチドタイプが第３の結合反応のみで観察される）に基づいた第１の２つの結合反応の結果の確認又は一貫しない結果が得られたとき（例えば、第４のヌクレオチドタイプが第３の結合反応と第１又は第２の結合反応とで観察される）の潜在的誤りの同定という利点を提供する。この代替はさらに、わずかに１つの標識タイプを使用し、区別されるヌクレオチドタイプの数よりも少ない試薬送達工程しか必要としない（つまり、４つのヌクレオチドタイプが３回の試薬送達工程で区別される）という利点を提供する。
本明細書に示される実施例で実証されるように、４つの塩基タイプは、第１及び第２のヌクレオチドタイプを有する検出可能な三元複合体を含むが第３及び第４のヌクレオチドタイプを有する検出可能な三元複合体は欠如している第１の結合反応の生成物を検査することにより並びに第１のヌクレオチドタイプ及び第３のヌクレオチドタイプを有する検出可能な三元複合体を含むが、第２及び第４のヌクレオチドタイプを有する検出可能な三元複合体は欠如している第２の結合反応の生成物を検査することにより、プライミングされたテンプレート核酸の特定の位置で区別されうる。第３の結合反応は、実施又は検査される必要はない。この場合、第４のヌクレオチドタイプの同定に補完を用いることにより、速度が向上し及び／又はコストが減少されうる。しかしながら、所望であれば、例えば、配列決定の精度を改善するために、第４のヌクレオチドタイプのみを有する検出可能な三元複合体を含む又は第４のヌクレオチドタイプを有する検出可能な三元複合体に加えて１つの他のヌクレオチドタイプ（ただし１つを超えない他のヌクレオチドタイプ）を有する検出可能な三元複合体を含む第３の結合反応について検査を行ってもよい。
一般的に、精度は、プライミングされたテンプレート核酸における特定の位置を評価するとき、本明細書に示される方法の試薬送達及び検査工程を反復することによって改善しうる。このように、一位置が、ヌクレオチドの特定のタイプの三元複合体を形成する能力について複数回検査されてもよい。実際に、ヌクレオチドの４つ全てのタイプが、プライミングされたテンプレートにおける特定の位置で三元複合体を形成するための能力について逐次的に又は反復的に評価されうる。Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）実施形態では、逐次的又は反復された検査工程後にプライマー伸長工程を実行することにより、プライミングされたテンプレートの後続の位置で評価を進めさせることができる。
したがって、この開示は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも４つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトと含む工程；（ｂ）少なくとも４つの別個の混合物を検査して、三元複合体を検出する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、混合物の少なくとも２つで三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法を提供する。
一態様では、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも４つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物はそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトの異なる組合せを含む工程；（ｂ）少なくとも４つの別個の混合物を検査して三元複合体を検出する工程；並びに（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、混合物の少なくとも２つで三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法が提供される。
また、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第３の混合物と接触させる工程であって、第３の混合物は、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｄ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第４の混合物と接触させる工程であって、第４の混合物は、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｃ）の生成物について取得されたシグナルは、第２及び第４の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｄ）の生成物について取得されたシグナルは、第３及び第４の塩基タイプについて曖昧である工程；（ｆ）工程（ｅ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程を含む、核酸検出方法が提供される。
本明細書に示される方法の特定の実施形態は、塩基呼び出し、誤り検出、さらに誤り訂正を提供しうる符号化スキームを使用する。異なる塩基タイプが、いくつかの検査にわたる一連のシグナル状態によって符号化され、この一連の復号により塩基が呼び出されるだけでなく、無効な塩基呼び出しが同定され、誤りを検出することができる。誤り訂正は、十分に複雑な符号化スキームについて可能である。
したがって本開示は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を形成するための一連の混合物と接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びテンプレート核酸の次のテンプレート位置に存在する疑いのある少なくとも２つの異なる塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）一連の混合物によって形成される三元複合体について次のテンプレート位置を監視する工程であって、シグナル状態は、それぞれの個々の混合物により次のテンプレート位置で形成される三元複合体の存在又は非存在を示し、それにより、次のテンプレート位置についての塩基呼び出しを符号化する一連のシグナル状態を決定する工程；並びに（ｃ）一連のシグナル状態を復号して、次のテンプレート位置についての正しい塩基呼び出しと、塩基呼び出しにおける誤りとを区別する工程を含む、核酸配列を決定する方法を提供する。
特定の実施形態では、符号化スキームを使用して、有効な塩基呼び出しを同定し、無効な塩基呼び出しと有効な塩基呼び出しとを区別する。このように、符号化スキームは、誤り検出符号を提供する。有用な符号化スキームは、参照により本明細書に組み込むＨａｍｍｉｎｇ、Ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ、第２版 Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ、ＮＪ（１９８６）に示されているような、電気通信、符号化理論及び情報理論について開発された符号化スキームを含む。
比較的単純な誤り検出符号は、反復符号である。このスキームでは、一連の検査が、それぞれの検査から取得されるシグナル状態が三元複合体のそれぞれのタイプについて別個であると予測されるように、テンプレート核酸の特定の位置で実行される。例えば、コグネイトヌクレオチドのそれぞれの異なるタイプによって形成される三元複合体は、ユニークな標識を有することができ、同じ標識を各検査の三元複合体のそれぞれのタイプについて使用することができる。一連の検査から検出されるシグナル状態は、符号語を形成する一連の数字として表すことができる。塩基呼び出しは、反復された数字のみを符号語が含むときに有効と同定され、一方で符号語に数字間の差異が存在することは誤りを示している。
有用な符号化スキームは、パリティ符号を利用することができる。このスキームでは、それぞれの検査から取得されるシグナル状態は、二進数字によって表され、例えば「１」は三元複合体の存在を示すシグナルを表し、「０」はシグナルの非存在を表す。一連の検査から検出されるシグナル状態は、符号語を形成する一連の数字として表すことができ、符号語は検査の数と同等の長さを有することができる。符号語は、有効な塩基呼び出しについての符号語における「１」の数字の合計数が偶数又は奇数であるように割り当てることができる。したがって、選択されたパリティを有する符号語は、有効な呼び出しとして同定され、一方で他のパリティを有する符号語は、無効な呼び出しとして同定される。
反復符号又はパリティ符号を使用する符号化スキームは、誤りを検出することはできるが、誤りの訂正になると、能力が限られている。例えば、３つ以上の二進数字を有する反復符号が使用されるとき、誤りは多数決を介して訂正することができ、ここで１つの数字についての異常値は、符号語における数字の大多数と同じ値に戻される。これは３つのシステムがプロセスを実行するコンピューティングにおけるトリプルモジュラ冗長のように動作し、その結果は、多数決方式によって処理されて単一の出力を生成する。いくつかの実施形態では、符号化スキームからの情報は、他の実験的観察又は理論的予測と組み合わせて、誤りを訂正することができる。例えば、符号語の数字についての誤った値の存在は、数字を生成するために使用される手順、試薬又は装置の異常と相関させることができ、数字の値はこの異常を補うように変化させることができる。訂正することができる異常の例には、限定されないが、所定の閾値を下回るシグナル対ノイズ比、所定の閾値を下回るシグナル強度、所定の閾値を上回るシグナル強度、所定の閾値を上回るノイズ、検出器不具合、流体送達不具合、温度制御不具合又は所定の閾値を下回る試薬の品質が挙げられる。
特に有用な符号化スキームは、ハミング符号を使用する。ハミング符号は、誤り検出を提示することができ、いくつかの実施形態では、誤り訂正も提示することができる。このスキームでは、一連の検査から検出されるシグナル状態は、符号語を形成する一連の数字として表すことができ、符号語は検査の数と同等の長さを有することができる。数字は、二進数であってもよく（例えば、シグナルの存在について１の値を有し、シグナルの非存在について０の値を有する）又は数字は、より高い基数を有してもよい（例えば、第１の波長の発光について１の値を有し、第２の波長の発光について２の値を有し、これらの波長で発光がない場合に０の値を有する三進数字）。有効な符号間の適切なハミング距離により、無効な符号が特定の有効な符号に明確に変化できるとき、誤り訂正能力が与えられる。ハミング符号及び誤り訂正のためのそれらの使用の例は、下記実施例９に示されている。
本開示の符号化スキームは、２つのシグナル状態を表すために二進数字を使用することができる。シグナル状態は、三元複合体について得られるシグナルについての任意の様々な区別可能な特徴に基づくことができる。例えば、二進数字には、以下についての値（例えば、数字、文字などのような記号によって表される値）を割り当てることができる：（ｉ）シグナルの存在及び非存在；（ｉｉ）２つの異なる波長で放射されるシグナル；（ｉｉｉ）２つの異なる強度を有するシグナル；又は（ｉｖ）２つの異なる波長での励起に起因するシグナル。代替的に、符号化スキームは、３つのシグナル状態を表すために三進数字を使用することができる。三進数字によって表すことができる例示的なシグナル状態には、限定されないが、（ｉ）３つの異なる波長で放射されるシグナル；（ｉｉ）２つの異なる波長で放射されるシグナルがあり、それらの波長の両方でのシグナルは不存在；（ｉｉｉ）３つの異なる強度を有するシグナル（このうちの１つはゼロの強度でありうる）；又は（ｉｖ）３つの異なる波長での励起に起因するシグナルが含まれる。
特定の実施形態では、テンプレートの特定の位置での一連の検査から取得される一連のシグナル状態は、誤り訂正符号を含むように符号化することができる。例えば、検査される一連の混合物は３つの混合物からなるものでもよく、一連のシグナル状態は３つの数字で表すことができ、それぞれの数字は、混合物から得られたシグナル状態を表す。先に説明したように、シグナル状態はそれぞれ二進数字によって表すことができ、誤り訂正符号は反復符号でありうる。この場合、無効な塩基呼び出しは、無効な符号により同定することができ、無効な呼び出しは、３つの数字間の多数決によって訂正することができる。
誤り訂正符号の第２の例では、一連の混合物は４つの混合物からなり、一連のシグナル状態は４つの数字で表され、それぞれの数字は混合物から得られたシグナル状態を表す。さらに、シグナル状態はそれぞれ三進数字によって表すことができる。誤り訂正符号はハミング符号でありえ、有効な塩基呼び出し間のハミング距離は３でありうる。無効な塩基は、無効な塩基呼び出しの符号に最も近いハミング距離を有する符号を持つ有効な塩基呼び出しに訂正することができる。
誤り訂正符号の第３の例では、一連の混合物は５つの混合物からなり、一連のシグナル状態は５つの数字で表され、それぞれの数字は混合物から得られたシグナル状態を表す。それぞれのシグナル状態が二進数字によって表され、ここで誤り訂正符号はハミング符号を含み、それぞれの有効な塩基呼び出しは、他の有効な塩基呼び出しと３つの数字で異なる。再度、無効な塩基は、無効な塩基呼び出しの符号に最も近いハミング距離を有する符号を持つ有効な塩基呼び出しに訂正することができる。
特定の実施形態では、本明細書に示される核酸検出方法の工程は、テンプレート核酸におけるいくつかの異なる位置を調べるために繰り返すことができる。いくつかの場合には、テンプレートに従って一連の連続的位置を調べることができる。したがって、本開示は、（ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物は、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程；（ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｅ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む、核酸を配列決定するための方法を提供する。
また本開示によって、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、少なくとも２つの別個の混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、順次接触は、三元複合体の安定化条件下、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触しているプライミングされたテンプレート核酸をもたらす工程；（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程；（ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｅ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含む、核酸を配列決定するための方法も提供される。
さらなる実施形態では、核酸配列決定方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程；（ｅ）工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｆ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程を含むことができる。
さらに、核酸配列決定方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ、テンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む第１の混合物と接触させる工程であって、接触は、（ｉ）プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体を安定化し、（ｉｉ）次の正しいヌクレオチドのプライマーへの取り込みを防止する、結合反応で起こる工程；（ｂ）結合反応を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸を、工程（ａ）及び（ｂ）に繰り返しかける工程であって、第１の混合物が第２の混合物で置き換えられ、第２の混合物は、ポリメラーゼ及びテンプレートの第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及びテンプレートの第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｄ）結合反応又はその生成物の検査を使用して、プライミングされたテンプレート核酸の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、（ｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出され、かつ工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で検出されるが工程（ｂ）の反復で不検出である場合、次の正しいヌクレオチドは、第２の塩基タイプのコグネイトとして同定され、（ｉｉｉ）三元複合体が工程（ｂ）で不検出であるが工程（ｂ）の反復で検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第３の塩基タイプのコグネイトとして同定される工程；（ｅ）工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｆ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程を含むことができる。
いくつかの実施形態では、核酸配列決定方法は、（ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を形成するための一連の混合物と接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びテンプレート核酸の次のテンプレート位置に存在する疑いのある少なくとも２つの異なる塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；（ｂ）一連の混合物によって形成される三元複合体について次のテンプレート位置を監視する工程であって、シグナル状態は、それぞれの個々の混合物により次のテンプレート位置で形成される三元複合体の存在又は非存在を示し、それにより、次のテンプレート位置についての塩基呼び出しを符号化する一連のシグナル状態を決定する工程；（ｃ）一連のシグナル状態を復号して、次のテンプレート位置についての正しい塩基呼び出しと、塩基呼び出しにおける誤りとを区別する工程；（ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程；並びに（ｅ）伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程を含むことができる。
配列決定方法においてプライマーに加えられる次の正しいヌクレオチドは、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成するために、可逆的に終結されてもよい。可逆的に終結されたヌクレオチドをプライマーの３’端に付加することは、伸長工程の間にプライマーに２つ以上のヌクレオチドが付加されることを防止し、さらにその後の検査工程におけるプライマーの不要な伸長を防止するための手段を提供する。したがって、テンプレート内の各位置を順次検査することができる。さらに、安定化三元複合体がそれぞれの位置で形成され、伸長された可逆的に終結されたプライマーにハイブリダイズされるテンプレートについて次の正しいヌクレオチドを検出するように検査されてもよい。方法は、伸長プライマーを生成するために、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去又は改変することにより、段階的に繰り返すことができる。
典型的に、本明細書に示される方法においてプライマーに付加される可逆的に終結されたヌクレオチドは、外因性標識を有しない。この理由は、伸長プライマーは、本明細書に示される方法で検出される必要はないからである。しかしながら、所望の場合、本明細書に示される方法で使用される可逆的に終結されたヌクレオチドの１つ以上のタイプが、ヌクレオチドに付着された外因性標識を介して検出されてもよい。可逆的終結部分、プライマーにそれらを取り込むための方法及びさらなる伸長のためにプライマーを改変するための方法（しばしば「デブロッキング」と称される）の例は、米国特許第７，５４４，７９４号；同第７，９５６，１７１号；同第８，０３４，９２３号；同第８，０７１，７５５号；同第８，８０８，９８９号；又は同第９，３９９，７９８号に示される。さらなる例は、それぞれ参照により本明細書に組み込むＢｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３−５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７；米国特許第７，０５７，０２６号；ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０７／１２３７４４；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許第７，２１１，４１４号；米国特許第７，３１５，０１９号；米国特許第７，４０５，２８１号及びＵＳ２００８／０１０８０８２に示される。
本明細書に示される配列決定方法における工程の反復を容易にするための他の技術としては、例えば、伸長が可能な形態に改変することができる安定化三元複合体を形成することが挙げられる。例えば、伸長可能なプライマーは安定化三元複合体中に存在しうるが、伸長は反応混合物の組成によって防止することができる。この場合、伸長は、安定化三元複合体を三元複合体不安定化剤と接触させて三元複合体におけるヌクレオチドの取り込みを可能にすること、三元複合体安定化剤を除去して三元複合体におけるヌクレオチドの取り込みを可能にすること又はヌクレオチド及び／若しくはポリメラーゼを安定化三元複合体から除去してプライマーの伸長を容易にする条件下で別のポリメラーゼ及び／若しくはヌクレオチドを導入することによって容易にすることができる。
プライマー伸長工程は、プライミングされたテンプレート核酸を伸長反応混合物と接触させることにより実施することができる。いくつかの場合では、検査工程に存在した流体は、除去され、伸長反応混合物で置き換えられる。代替的に、伸長反応混合物は、検査工程に存在した流体に１つ以上の試薬を加えることによって形成することができる。任意選択的に、取り込み反応混合物は、検査工程とは異なるヌクレオチドの組成物を含む。例えば、検査工程は、取り込み反応に存在しない１つ以上のヌクレオチドタイプを含むことができ、逆も同様である。より具体的な例として、検査工程は、少なくとも１タイプのヌクレオチドを省くことができ、プライマー伸長工程は、少なくとも４つのタイプのヌクレオチドを用いることができる。任意選択的に、１つ以上のヌクレオチドタイプが、プライマー伸長工程のために検査混合物に加えられる。
検査工程に存在するヌクレオチドは、伸長工程に持ち越された場合に所望しないヌクレオチド取り込みを生じさせる可能性がある。したがって、洗浄工程は、プライマー伸長工程の前にヌクレオチドを除去するために利用しうる。任意選択的に、遊離ヌクレオチドを、ホスファターゼのような酵素によって、化学的修飾によって又は物理的分離技術によって、除去してもよい。
任意選択的に、検査工程の安定化三元複合体内に封入されるヌクレオチドは、その後のプライマー伸長工程の間にプライマーの３’端に取り込まれる。代替的に、プライマー伸長工程は、先の検査工程からヌクレオチドを置き換えること及びプライマーの３’端に別の（同一である又は異なるタイプの）ヌクレオチドを取り込むことを含む。
任意選択的に、検査工程の間に存在するポリメラーゼは除去され、次のプライマー伸長工程のための異なるポリメラーゼで置き換えられる。代替的に、検査工程の間に存在するポリメラーゼは保持され、その後の取り込み工程のために改変される。任意選択的に、検査工程の間に存在する１つ以上のヌクレオチドは、その後のプライマー伸長工程のために改変される。検査工程の間に存在する流体、試薬又は条件は、その後のプライマー伸長工程において使用するために任意の様々な技術によって変化させてもよい。例示的な技術としては、限定されないが、試薬を除去すること、試薬を錯体化すること、試薬を希釈すること、試薬を加えること、温度、イオン強度、導電率若しくはｐＨのような反応条件を変更させること又はそれらの任意の組合せが含まれる。ポリメラーゼとプライミングされたテンプレート核酸とヌクレオチドとの任意の組合せを含む反応混合物の試薬は、検査工程及び／又はプライマー伸長工程の間に改変させてもよい。
典型的に、本明細書に示される方法で利用される伸長工程は、テンプレート核酸に存在することが予測される任意の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトの付加をもたらす。例えば、プライマー伸長は、ＤＮＡ（例えば、アデニン、チミン、グアニン及びシトシン）又はＲＮＡ（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン及びシトシン）中に存在する４つの塩基タイプ全てについてのコグネイトヌクレオチドの取り込みをもたらす条件下で行ってもよい。異なるヌクレオチドタイプが、伸長反応に同時に存在してもよく又は逐次的に伸長反応に関与してもよい。例えば、ヌクレオチドタイプの一部又は全てが、単一の伸長反応で同時に送達されてもよい。代替的に、異なるヌクレオチドタイプは、組み合わされて単一の伸長反応になるように又は逐次的に伸長反応が生ずるように、逐次的に（個々に又はサブセットで）送達されてもよい。
伸長は、テンプレート内の４つの塩基タイプのコグネイトの使用に関して上記に例示されているが、ヌクレオチドのより大きなレパートリーを使用してもよいことが理解される。ヌクレオチドタイプの数は、例えば、非天然塩基対の一つ又は両方のメンバーを有するテンプレートを使用するとき、増加しうる。いくつかの実施形態では、テンプレート内に存在することが予想される塩基タイプのサブセットのみについてプライマーをコグネイトで伸長させることが望ましい場合がある。したがって、６、５、４、３又は２つより少ない塩基タイプのコグネイトを含めることができる。代替的に又は付加的に、本明細書に示される方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６つ以上の塩基タイプのコグネイトを有するプライマーを伸長させるために使用することができる。
配列決定方法は、本明細書に示される工程の複数の反復を含むことができる。例えば、検査及び伸長工程は複数回繰り返すことができ、同様に、プライマーをデブロッキングする、又は様々な工程間で不要な反応物若しくは生成物を洗浄する任意選択的工程を複数回繰り返すことができる。したがって、プライミングされたテンプレート核酸は、本明細書に示される方法の少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００以上の工程にかけることができる。工程の全てが反復される必要はなく、反復される工程が各反復において同じ順序で行われる必要もない。例えば、テンプレートのそれぞれの位置での次の正しいヌクレオチドは、リアルタイム分析を使用して（つまり、配列決定方法の流体及び検出工程と並行して）同定することができる。しかしながら、リアルタイム分析が必要ということではなく、代わりに、流体及び検出工程の一部又は全てが完了した後で次の正しいヌクレオチドが同定されてもよい。したがって、流体工程を行っている間に、少なくとも一部のＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）サイクルからのシグナルは曖昧性が解消されてもよく及び／又は少なくとも一部のサイクルについてのヌクレオチドタイプの正体が補完されてもよい。任意選択的に、流体及び検出サイクルの一部又は全てが完了した後に、シグナルは曖昧性が解消され及び／又は不検出ヌクレオチドタイプの正体が補完されてもよい。
プライマー伸長工程は、標識ポリメラーゼを使用する必要はない。例えば、伸長工程に使用されるポリメラーゼは、外因性標識に（例えば、共有結合的に又は他の方法で）付着されている必要はない。しかしながら、プライマー伸長のために使用されるポリメラーゼは、外因性標識、例えば、先の検査工程で使用された標識を含むことができる。
上述したように、ポリメラーゼの様々な活性を本明細書に示される方法で活用することができる。様々な活性は、構造の（例えば、天然活性、変異又は化学修飾による）差異に従うものでありうる。それにもかかわらず、ポリメラーゼは、公知の種々の供給源から得ることができ、本明細書に示される教示及びポリメラーゼの認識される活性に従って適用されうる。有用なＤＮＡポリメラーゼには、限定されないが、細菌ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ及びファージＤＮＡポリメラーゼが含まれる。細菌ＤＮＡポリメラーゼには、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片、クロストリジウム・ステルコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）（Ｃｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（Ｃｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ及びスルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓｏ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。真核生物ＤＮＡポリメラーゼにはＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δ、ユーロ、η、ζ、λ、σ、μ及びκ並びにＲｅｖｌポリメラーゼ（末端デオキシシチジルトランスフェラーゼ）及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が含まれる。ウイルスＤＮＡポリメラーゼには、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＧＡ−ｌ、ｐｈｉ−２９様ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＺＡ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−１５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ポリメラーゼが含まれる。他の有用なＤＮＡポリメラーゼには、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・フィルホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｔｆｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ジリギ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉ）（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓｕ）（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｕｒｂｏ ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス属種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＧＢ−Ｄポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス属種（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＪＤＦ−３（ＪＤＦ−３）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・アシドフィリウム（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｕｍ）ＤＮＡポリメラーゼ；スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ；サーモコッカス属種ｇｏ Ｎ−７ＤＮＡポリメラーゼ；ピロディクティウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）ＤＮＡポリメラーゼ；メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）ＤＮＡポリメラーゼ；メタノコッカス・サーモオートトロピカム（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＤＮＡポリメラーゼ；メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）株ＴＯＫ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ． Ｔｏｋ Ｐｏｌ）；ピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；ピロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；ピロコッカス・イスランディカム（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）ＤＮＡポリメラーゼ；サーモコッカス・フミコランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ；アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）ＤＮＡポリメラーゼ及びヘテロ二量体ＤＮＡポリメラーゼＤＰ１／ＤＰ２のような熱安定性及び／又は好熱性ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。操作及び改変されたポリメラーゼも、開示された技術に関連して有用である。例えば、極限好熱性海洋古細菌の改変バージョンサーモコッカス属種９°Ｎ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡポリメラーゼ）を使用することができる。３ＰＤＸポリメラーゼを含む他の有用なＤＮＡポリメラーゼも、参照によりその開示を本明細書に組み込む米国特許第８，７０３，４６１号に開示されている。
有用なＲＮＡポリメラーゼには、限定されないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ及びＫｌｌポリメラーゼのようなウイルスＲＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ及びＲＮＡポリメラーゼＶのような真核生物ＲＮＡポリメラーゼ；並びに古細菌ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
ポリメラーゼの別の有用なタイプは、逆転写酵素である。例示的な逆転写酵素は、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＰＤＢ １ＨＭＶ）由来のＨＩＶ−１逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス２型由来のＨＩＶ−２逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ逆転写酵素及び真核生物の染色体のテロメアを維持するテロメラーゼ逆転写酵素が挙げられる。
固有の３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが一部の実施形態で有用でありうる。３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くポリメラーゼも、いくつかの実施形態、例えば、ほとんどの遺伝子型判定及び配列決定の実施形態で有用である。エキソヌクレアーゼ活性の非存在は、野生型の特徴又はバリアント若しくは操作されたポリメラーゼ構造によって付与された特徴でありうる。例えば、エキソマイナスＫｌｅｎｏｗ断片は、３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠くＫｌｅｎｏｗ断片の変異型である。Ｋｌｅｎｏｗ断片及びそのエキソマイナスバリアントは、本明細書に示される方法及び組成物において有用でありうる。
ポリメラーゼに基づくプライマー伸長工程のために使用することができる試薬及び条件の例には、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む共有米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号又は米国特許出願第６２／４４７，３１９号の優先権を主張する米国特許出願公開第２０１８／００４４７２７Ａ１号又は米国特許出願第６２／４４０，６２４号の利益を主張する米国特許出願第１５／８５１，３８３号又は米国特許出願第６２／４５０，３９７号の優先権を主張する米国特許出願第１５／８７３，３４３号に示されるものが含まれる。ポリメラーゼに基づくプライマー伸長のための他の有用な試薬及び条件は、それぞれ参照により本明細書に組み込むＢｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３−５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７；ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０７／１２３７４４；米国特許第７，０５７，０２６号；同第７，３２９，４９２号；同第７，２１１，４１４号；同第７，３１５，０１９号又は同第７，４０５，２８１号及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２Ａ１号に示されている。
任意選択的に、提示されている方法は、さらに１つ以上の洗浄工程を含む。洗浄工程は、方法における任意の他の工程の前又は後に行いうる。例えば、本明細書に示される方法は、１つ以上の安定化三元複合体を形成した後に、固体支持体を洗浄する工程を任意選択的に含むことができる。洗浄は、安定化三元複合体の１つ以上の成分が由来する混合物の成分のような混入物を除去する利点を与えることができる。特定の実施形態では、洗浄工程は、三元複合体を安定化する条件下で行う。例えば、本明細書の他の箇所に示される１つ以上の安定化条件又は安定化剤が、洗浄工程の間に用いられうる。任意選択的に、洗浄溶液は、安定化三元複合体の形成の間に使用される次の正しいヌクレオチド（複数可）と同じタイプのヌクレオチド（複数可）を含む。次の正しいヌクレオチド（複数可）を十分な濃度で含むことは、以前に形成された三元複合体を望ましくない解離から安定化させるという利点を提供しうる。このことはさらに、以前に形成された三元複合体を洗浄することによる望ましくない検出感度の減少を防ぐ。任意選択的に、三元複合体は半減期を有し、洗浄工程は、三元複合体の半減期より短い期間のために行われる。洗浄工程は、検査又はプライマー伸長工程後に実施することもできる。
安定化三元複合体又は三元複合体を形成することのできる（つまり三元複合体の形成に関与する）成分を、固体支持体に付着させることができる。固体支持体は、本明細書に示される任意の様々な材料から作製されうる。適切な材料には、ガラス、ポリマー材料、シリコン、石英（溶融シリカ）、ボロフロートガラス、シリカ、シリカ系材料、炭素、金属、光ファイバ若しくは光ファイバの束、サファイア又はプラスチック材料が含まれうる。特定の材料が、特定の使用のために所望される特性に基づいて選択されうる。例えば、放射線の所望の波長に対して透過性がある材料は、その波長の放射を利用する分析技術のために有用である。逆に、特定の波長の放射線を通さない（例えば、不透明である、吸収性又は反射性である）材料を選択することが望ましい場合がある。利用することができる材料の他の特性は、本明細書に示されるような下流のプロセスで使用される特定の試薬に対する不活性若しくは反応性、操作の容易性又は製造コストの安さである。
特定の有用な固体支持体は、ビーズ又はマイクロスフェアのような粒子である。ビーズの集団は、安定化三元複合体又は複合体を形成することができる成分（例えばポリメラーゼ、テンプレート、プライマー又はヌクレオチド）の集団の付着のために使用することができる。いくつかの実施形態では、それぞれのビーズが、安定化三元複合体の単一のタイプ又は複合体を形成することができる成分の単一のタイプを有する構成を使用することが有用でありうる。例えば、個々のビーズは、三元複合体の単一タイプ、テンプレート対立遺伝子の単一タイプ、対立遺伝子特異的プライマーの単一タイプ、遺伝子座特異的プライマーの単一タイプ又はヌクレオチドの単一タイプに付着させることができる。代替的に、異なるタイプの成分がビーズ毎の基準で分離されている必要はない。このように単一のビーズが、複数の異なる種類の三元複合体、テンプレート核酸、プライマー、プライミングされたテンプレート核酸及び／又はヌクレオチドに結びつくことができる。ビーズの組成は、例えば、使用するフォーマット、化学及び／又は付着方法に応じて変化させてもよい。例示的なビーズの組成は、タンパク質及び核酸捕捉方法で使用される、固体支持体とそれに付与される化学官能基を含む。このような組成には、例えば、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メラミン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のような架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル及びＴｅｆｌｏｎ（商標）並びに参照により本明細書に組み込む「Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ」、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｄ．に示される他の材料が含まれる。
粒子、ビーズ又はマイクロスフェアの幾何学的形状は、多種多様な異なる形態及び形状に対応することができる。例えば、それらは対称形状（例えば、球形若しくは円筒形）又は不規則形状（例えば、孔制御ガラス）でありうる。さらにビーズは多孔性であってもよく、したがって、三元複合体又はその成分の捕捉に利用可能な表面積を増加させることができる。本明細書で使用されるビーズの例示的なサイズは、ナノメートルからミリメートルまで又は約１０ｎｍ〜１ｍｍの範囲とすることができる。
特定の実施形態では、ビーズは、整列されてもよく又は他の方法で空間的に区別されてもよい。使用することができる例示的なビーズ系アレイとしては、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能なＢｅａｄＣｈｉｐ（商標）アレイ又はそれぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第６，２６６，４５９号；同第６，３５５，４３１号；同第６，７７０，４４１号；同第６，８５９，５７０号；若しくは同第７，６２２，２９４号；又はＰＣＴ公開番号ＷＯ００／６３４３７に記載のもののようなアレイが含まれる。ビーズは、ウェルのような固相支持体上の別個の場所に、それぞれの場所に単一のビーズを収容させて配置することができる。代替的に、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２００４／０２６３９２３Ａ１号、同第２００４／０２３３４８５Ａ１号、同第２００４／０１３２２０５Ａ１号又は２００４／０１２５４２４Ａ１号に記載されているように、ビーズが存在する別個の場所にそれぞれ複数のビーズを含むことができる。
上記ビーズアレイの実施形態から理解されるように、本開示の方法は、マルチプレックス形式で行うことができ、それにより核酸の複数の異なるタイプが本明細書に示される方法で並列に検出される。本明細書に示される方法の１つ以上の工程を使用して異なるタイプの核酸を逐次的に処理することもできるが、並列処理により、コストの節約、時間の節約及び状態の均一性が提供されうる。本開示の装置又は方法は、少なくとも２、１０、１００、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０９又はより多くの異なる核酸を含むことができる。代替的に又は付加的に、本開示の装置又は方法は、多くとも１×１０９以下、１×１０６、１×１０５、１×１０４、１×１０３、１００、１０、２又はより少ない異なる核酸を含むことができる。したがって、装置又は方法に有用であるとして本明細書に示される様々な試薬又は生成物（例えば、プライミングされたテンプレート核酸又は安定化三元複合体）は、これらの範囲の異なるタイプ又は種を有するように多重化することができる。
使用できる市販のアレイのさらなる例には、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）アレイを含まれる。スポットされたアレイもいくつかの実施形態に従って使用することができる。例示的なスポットされたアレイは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）アレイである。有用な別のアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから利用可能なＳｕｒｅＰｒｉｎｔ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのようなインクジェット印刷法を用いて製造されたものである。
他の有用なアレイには、核酸配列決定用途において使用されるものが含まれる。例えば、ゲノム断片のアンプリコンに付着するために使用されるアレイ（しばしばクラスタと称される）が特に有用でありうる。本明細書で使用することができる核酸配列決定アレイの例は、それぞれ参照により本明細書に組み込むＢｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３−５９（２００８）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０４／０１８４９７又はＷＯ０７／１２３７４４；米国特許第７，０５７，０２６号；同第７，２１１，４１４号；同第７，３１５，０１９号；同第７，３２９，４９２号又は同第７，４０５，２８１号；又は米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載のものが含まれる。
核酸は、単一分子レベルで又はアンサンブルレベルでの検出を提供する様式で支持体に付着させることができる。例えば、支持体上のある核酸分子上に形成する個々の安定化三元複合体が、支持体の核酸分子上に形成する全ての隣接する三元複合体から区別されうる様式で、複数の異なる核酸を、固体支持体に付着させることができる。このように、１つ以上の異なるテンプレートが、それぞれの単一の分子テンプレートが物理的に単離され、単一の分子が固体支持体上の全ての他の分子から分離される様式で検出されるフォーマットで固体支持体に付着されてもよい。
代替的に、本開示の方法は、共通のテンプレート配列を有する核酸の集団である核酸アンサンブルの１つ以上について実施することができる。クラスタ方法を使用して、１つ以上のアンサンブルを固体支持体に付着させることができる。このように、アレイは、複数のアンサンブルを有することができ、アンサンブルのそれぞれは、そのフォーマットにおいてクラスタ又はアレイフィーチャと称される。クラスタは、ブリッジ増幅又はエマルジョンＰＣＲのような当技術分野で公知の方法を用いて形成することができる。有用なブリッジ増幅方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号又は同第７，１１５，４００号；又は米国特許公開第２００２／００５５１００Ａ１号；同第２００４／０００２０９０Ａ１号；同第２００４／００９６８５３Ａ１号；同第２００７／０１２８６２４Ａ１号又は同第２００８／０００９４２０Ａ１号に記載されている。エマルジョンＰＣＲ方法としては、例えば、それぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込むＤｒｅｓｓｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００：８８１７−８８２２（２００３）、ＷＯ０５／０１０１４５又は米国特許公開第２００５／０１３０１７３Ａ１号又は同第２００５／００６４４６０Ａ１号に記載されている方法が挙げられる。表面上の核酸を増幅するための別の有用な方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込むＬｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９：２２５−２３２（１９９８）又はＵＳ２００７／００９９２０８Ａ１に記載されているローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。
特定の実施形態では、安定化三元複合体、ポリメラーゼ、核酸又はヌクレオチドがフローセル表面又はフローセルの固体支持体に付着される。フローセルは、支持体が結合された三元複合体に接触する流体チャンバーの中及び外へ溶液を通過させることにより、都合のよい流体操作を可能にする。またフローセルは、流体操作成分の検出も提供する。例えば、検出器は、安定化三元複合体の形成により固体支持体に動員される標識からのシグナルのような固体支持体からのシグナルを検出するように配置することができる。使用されうる例示的フローセルは、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８Ａ１号、ＷＯ０５／０６５８１４又は米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５Ａ１号に記載されている。
１つ以上の画像がアレイから取得されてもよい。例えば、一連の画像が、特定の配列決定サイクルの間に行われる一連の検査について取得されうる。各画像は、フィーチャの場所を決定するために画像レジストレーションが行われてもよく、シグナル強度は、画像から抽出することができ、シグナル強度は、必要に応じて正規化することができる。各画像において、強度は、Ｏｔｓｕ法のようなバイナリセグメンテーション方法を使用してオン・オフ強度に分離することができる。いくつかの実施形態では、複数の発光色が検出され、異なる画像がそれぞれの色について取得される。各画像からの発光強度は、ｋ平均又はガウス混合モデルのようなクラスタリングアルゴリズムを用いて分析し、いくつかの状態（例えば、青色発色、赤色発色又は暗）のどれにフィーチャが属するかを決定することができる。各フィーチャについて、これらのシグナル処理技術は、一連の画像から一連のシグナル状態を得る。それぞれのフィーチャは、一連の画像からのシグナル状態を表す一連の数字からなる符号語として表されうる。符号語が、有効な塩基について認められた４つの符号語のうちの１つと一致する場合、適切な塩基呼び出しがなされる。それ以外の場合には、ｎｕｌｌの塩基呼び出しがなされうる。しかしながら、誤り訂正符号が使用される場合、特定のフィーチャについての無効な符号語が有効な符号語に変化されて塩基呼び出しの訂正が行われうる。
本明細書における方法又は組成物で使用される核酸は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのようなＤＮＡでありうる。また、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡなどのようなＲＮＡが使用されうる。核酸アナログは、本明細書におけるテンプレートとしても使用されうる。したがって、本明細書で使用されるテンプレート核酸は、生物学的供給源、合成源又は増幅産物に由来しうる。本明細書で使用されるプライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらのアナログでありうる。
特に有用な核酸テンプレートは、ゲノムの一部と同一の配列を含むゲノムフラグメントである。ゲノムフラグメントの集団は、ゲノムの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％又は４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含むことができる。ゲノムフラグメントは、例えば、ゲノムの少なくとも約２５、５０、７０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００以上のヌクレオチドと実質的に同一である配列を有することができる。ゲノムフラグメントは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのアナログでありうる。
核酸が由来しうる例示的な生物には、例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄類、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒト又はヒト以外の霊長類のような哺乳類；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トウモロコシ、モロコシ、オーツムギ、コムギ、イネ、キャノーラ又はダイズのような植物；クラミドモナス・レインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のような海藻類；カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のような線虫類；ドロソフィア・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、蚊、ショウジョウバエ、ミツバチ又はクモのような昆虫類、ゼブラフィッシュのような魚類；爬虫類；カエル又はキセノポス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）のような両生類；ディクチオステリウム・ディスコイディウム（ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）；ニューモシスチス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、タキフグ・ルブリプス（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒａｍｏｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）のような菌類；又はプラスモジウム・ファルシパルム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）が挙げられる。また核酸は、細菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッシ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）又はマイコプラズマ・ニューモニアエ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスのようなウイルス；又はウイロイドのような原核生物に由来しうる。核酸は、上記生物の均質な培養物若しくは集団に由来することができ又は代替的に、例えばコミュニティ若しくは生態系における、いくつかの異なる生物の集団に由来することができる。核酸は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）又はＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９８）に記載のものを含む当技術分野で公知の方法を使用して単離することができる。
テンプレート核酸は、ゲノム単離、ゲノム断片化、遺伝子クローニング及び／又は増幅のような分取方法から得ることができる。テンプレートは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）などのような増幅技術から得ることができる。アレイ上で分析するためのテンプレートを生成するために核酸を単離、増幅及び断片化するための例示的方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許第６，３５５，４３１号又は同第９，０４５，７９６号に示されている。また増幅は、それぞれ参照により本明細書に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）又はＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９８）に示される方法を使用して行うこともできる。
本開示は、例えば、本明細書に示される方法を使用して、核酸を検出するためのシステムを提供する。例えば、システムは、テンプレート核酸配列における次の塩基を同定するためのヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼとプライミングされたテンプレート核酸との間の相互作用の検査に関わる遺伝子型判定反応又はＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）反応のために構成されてもよい。任意選択的に、システムは、プライミングされたテンプレート核酸とポリメラーゼと次の正しいヌクレオチドとの間で少なくとも１つの安定化三元複合体を形成する工程；安定化三元複合体（複数可）を検出する工程；各プライミングされたテンプレートのプライマーを次の正しいヌクレオチドで延長する工程；及び／又はヌクレオチド又はテンプレートに存在するヌクレオチドの配列を同定する工程を含むがこれらに限定されない、本明細書に示される１つ以上の工程を実施するための成分及び試薬を含む。
本開示のシステムは、核酸検出方法を実施するための容器又は固体支持体を含むことができる。例えば、システムは、アレイ、フローセル、マルチウェルプレート又は他の便利な装置を含むことができる。容器又は固体支持体は取り外し可能であってもよく、それによりシステムに取り付ける又はシステムから取り外すことが可能であってもよい。このように、システムは、複数の容器又は固体支持体を順次処理するように構成されてもよい。システムは、本明細書に示される１つ以上の試薬（例えば、三元複合体形成のためのポリメラーゼ、プライマー、テンプレート核酸、ヌクレオチド（複数可）、プライマー伸長のためのヌクレオチド、デブロッキング試薬又はこのような成分の混合物）を含むためのリザーバーを有する流体システムを含んでもよい。流体システムは、例えば、チャネル又は液滴移送装置（例えば、エレクトロウェッティング装置）を介して、容器又は固体支持体に試薬を送達するように構成されてもよい。任意の様々な検出装置が、試薬が相互作用する容器又は固体支持体を検出するように構成されてもよい。例としては、発光検出器、表面プラズモン共鳴検出器及び当技術分野で公知の他の検出装置が挙げられる。本明細書におけるシステムで使用するために容易に改変できる流体及び検出成分を有する例示的システムとしては、限定されないが、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許出願第６２／４８１，２８９号又は同６２／５４５，６０６号；米国特許第８，２４１，５７３号；同第７，３２９，８６０号又は同第８，０３９，８１７号；又は米国特許出願公開第２００９／０２７２９１４Ａ１号又は同第２０１２／０２７０３０５Ａ１号に示されるものが挙げられる。
任意選択的に、本開示のシステムは、システム・コンポーネントを動作させるように構成されたコンピュータ処理ユニット（ＣＰＵ）をさらに含む。同一である又は異なるＣＰＵは、シグナル（例えば、本明細書に示される方法で検出されるシグナル）を取得、保存及び処理するようにシステムと対話することができる。特定の実施形態では、ＣＰＵは、テンプレート核酸における特定の場所に存在するヌクレオチドをシグナルから決定し、同定するために使用することができる。いくつかの場合では、ＣＰＵは、検出されるシグナルから、テンプレートについてのヌクレオチドの配列を同定する。特定の実施形態では、ＣＰＵは、様々な結合反応から得られたシグナルを比較して、シグナルの曖昧性を解消し、それによりテンプレート核酸の１つ以上の位置でヌクレオチドを同定するようにプログラムされている。代替的に又は付加的に、ＣＰＵは、異なる結合反応から得られたシグナルを比較して、テンプレート核酸の１つ以上の位置で補完によりヌクレオチドを同定するようにプログラムされてもよい。したがって、ＣＰＵは、誤り検出符号を復号する、誤り訂正符号を復号する又は本明細書に示される方法から得られた符号語における誤りを訂正するようにプログラムされてもよい。
有用なＣＰＵには、パーソナルコンピュータシステム、サーバ・コンピュータ・システム、シンクライアント、シッククライアント、ハンドヘルド又はラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサを基礎とするシステム、セットトップボックス、プログラマブル家電、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータシステム、メインフレーム・コンピュータ・システム、スマートフォンの１つ以上及び上記システム若しくはデバイスのいずれかを含む分散型クラウドコンピューティング環境などを挙げることができる。ＣＰＵは、１つ以上のプロセッサ又はプロセシングユニット、ＲＡＭ及び不揮発性メモリを含みうるメモリ・アーキテクチャを含むことができる。メモリ・アーキテクチャはさらに、リムーバブル／非リムーバブル、揮発性／不揮発性のコンピュータシステム記憶媒体を含むことができる。さらに、メモリ・アーキテクチャは、ハードドライブのような非リムーバブル不揮発性磁気媒体からの読み取り及びそれへの書き込みのための１つ以上のリーダー、リムーバブル不揮発性磁気ディスクからの読み取り及びそれへの書き込みのための磁気ディスクドライブ及び／又はＣＤ−ＲＯＭ若しくはＤＶＤ−ＲＯＭのようなリムーバブル不揮発性光学ディスクからの読み取り又はそれへの書き込みのための光学ディスクドライブを含んでいてもよい。ＣＰＵは、様々なコンピュータシステム可読媒体を含んでいてもよい。このような媒体は、揮発性媒体及び不揮発性媒体、リムーバブル及び非リムーバブル媒体のような、クラウドコンピューティング環境によってアクセス可能な任意の利用可能な媒体であってもよい。
メモリ・アーキテクチャは、本明細書に示される方法の１つ以上の工程を実行するように構成された実行可能な命令として実装された少なくとも１つのプログラムモジュールを有する少なくとも１つのプログラム製品を含んでもよい。例えば、実行可能な命令は、オペレーティングシステム、１つ以上のアプリケーションプログラム、他のプログラムモジュール及びプログラムデータを含んでいてもよい。一般的に、プログラムモジュールは、本明細書で示される方法で検出されるシグナルを処理すること、シグナルの曖昧性を解消してヌクレオチドを同定すること又は他のタイプのヌクレオチドについてのシグナルが検出される場合にはヌクレオチドの正体を補完することのような特定のタスクを実行するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、ロジック、データ構造などを含んでいてもよい。
ＣＰＵのコンポーネントは、メモリバス又はメモリコントローラを含むバス構造のいくつかのタイプのいずれかの１つ以上として実装されうる内部バス、周辺バス、加速グラフィックポート及びプロセッサ又は様々なバスアーキテクチャのいずれかを使用するローカルバスによって結合されてもよい。一例として、限定されないが、このようなアーキテクチャは、業界標準アーキテクチャ（ＩＳＡ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＣＡ）バス、拡張ＩＳＡ（ＥＩＳＡ）バス、ビデオエレクトロニクス規格協会（ＶＥＳＡ）ローカルバス及びペリフェラルコンポーネントインターコネクト（ＰＣＩ）バスを含む。
ＣＰＵは、キーボード、ポインティングデバイス（例えば、マウス）のような１つ以上の外部デバイス、グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）のようなディスプレイ又は核酸検出システムとの使用のインターアクションを容易にする他のデバイスと任意選択的に通信してもよい。同様に、ＣＰＵは、（例えば、ネットワークカード、モデム等を介して）他のデバイスと通信してもよい。このような通信は、Ｉ／Ｏインタフェースを介して行うことができる。またさらに、本明細書のシステムのＣＰＵは、適切なネットワークアダプターを介して、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、一般的なワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）及び／又は公衆ネットワーク（例えば、インターネット）のような１つ以上のネットワークと通信してもよい。
本開示はさらに、核酸テンプレート中のヌクレオチドを区別するためのキットを提供する。キットは、本明細書に示される１つ以上の方法を実施するための試薬を含むことができる。例えば、キットは、１つ以上のプライミングされたテンプレート核酸と混合されるとき、安定化三元複合体を製造するための試薬を含むことができる。より具体的に、キットは、本明細書に示される方法、例えば下記の実施例のセクションで示される方法で使用される１つ以上のヌクレオチドの混合物を含むことができる。ヌクレオチド混合物に加えて、キットは、安定化三元複合体を形成することができるポリメラーゼを含むことができる。ヌクレオチド、ポリメラーゼ又はその両方は、例えば本明細書で種々の方法の場面において示されるような、外因性標識を含むことができる。
いくつかの実施形態では、キットは、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ（商標）方法のような反復方法を支援するように構成することができる。したがって、キットは、プライマー伸長を行うための試薬をさらに含むことができる。プライマー伸長のための例示的試薬は、ポリメラーゼ及び４つのヌクレオチドタイプの混合物を含むことができる。伸長のために使用されるヌクレオチドタイプは、任意選択的に可逆的終結基を含むことができる。この選択肢では、キットは、可逆的に終結されたヌクレオチドを取り込んだプライマーをデブロッキングするための試薬をさらに含むことができる。
したがって、本明細書に示される方法を実行するために使用される任意の成分又は物品はいずれもキットに有用にパッケージングされることができる。例えば、キットは、本明細書に示される方法を実行するために使用される成分又は物品の一部、大部分又は全てを含むように詰めることができる。例示的な成分としては、例えば、本明細書及び本明細書で引用される参照文献に示されるヌクレオチド、ポリメラーゼ、終結因子部分、デブロッキング試薬などが挙げられる。このような試薬のいずれかは、例えば、プライミングされたテンプレート核酸の分析のための後続の工程の１つ以上を実行するために使用されるバッファー、成分及び／又は物品の一部、大部分又は全てを含むことができる。キットは、プライマー又はテンプレート核酸を含む必要はない。むしろ、キットの使用者が、キットの成分と組み合わせる予定のプライミングされたテンプレート核酸を提供しうる。
１つ以上の補助試薬もキットに含めることができる。このような補助試薬は、上記に例示の試薬及び／又は本明細書に示される方法の実行に有用な他の種類の試薬を含むことができる。さらに指示書がキットに含まれてもよい。指示書は、例えば、本明細書に示される方法に使用される任意の成分若しくは物品を作製するための手法、本明細書に示される方法のいずれかの実施形態の１つ以上の工程を実行するための手法及び／又はプライミングされたテンプレート核酸を利用する後続の分析工程のいずれかを実行するための指示を含むことができる。
特定の実施形態では、キットは、試薬を含むリザーバーを有し、さらにリザーバーから検出機器へ試薬を移すための流体成分を有するカートリッジを含む。例えば、流体成分は、安定化三元複合体が検出されるフローセルに試薬を移すように構成することができる。本開示のキット（又はシステム）に含めうる例示的流体カートリッジは、参照により本明細書に組み込む米国特許出願第６２／４８１，２８９号に記載されている。
番号を付した実施形態
実施形態１ （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；
（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程
を含む、核酸検出方法。
実施形態２ プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｃ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態１に記載の方法。
実施形態３ （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関している、実施形態２に記載の方法。
実施形態４ 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態３に記載の方法。
実施形態５ （ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関している、実施形態４に記載の方法。
実施形態６ 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ａ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ａ）の生成物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じ、
工程（ａ）の生成物の検査が、第１のシグナルと第２のシグナルとを区別する、実施形態１に記載の方法。
実施形態７ 第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ｂ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じる、実施形態６に記載の方法。
実施形態８ （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第１のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第２のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関している、実施形態７に記載の方法。
実施形態９ 第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ｂ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についてのシグナルを生じない、実施形態６に記載の方法。
実施形態１０ （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第１のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第２のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第２のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関している、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１ 工程（ｃ）で取得されたシグナルが、ポリメラーゼに付着された外因性標識によって生じる、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１２ 工程（ａ）の生成物についてのシグナルが、工程（ｂ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、実施形態１又は１１に記載の方法。
実施形態１３ 工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についてのシグナルが発光シグナルを含む、実施形態１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１４ 第１の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１５ 第２の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６ 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１７ 第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８ 工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態１〜１７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９ 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０ 工程（ａ）〜（ｃ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｆ）、をさらに含む、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１ 工程（ｅ）が、工程（ｄ）の前に行われる、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２２ 工程（ａ）のポリメラーゼが、工程（ｂ）のポリメラーゼで置き換えられる、実施形態１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２３ 同じタイプのポリメラーゼが、工程（ａ）及び（ｂ）に存在する、実施形態１〜２２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２４ プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触させるさらなる工程を含み、工程（ｃ）が、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて、さらなる工程の生成物を検査することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態２５ （ｉｖ）第４の塩基タイプが、さらなる工程の生成物についてのシグナルの存在と相関している、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６ 工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２７ 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８ 工程（ｂ）の前に、プライミングされたテンプレート核酸から第１の混合物を除去する工程をさらに含む、実施形態１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２９ 工程（ａ）の生成物の検査が、工程（ｂ）の前に行われる、実施形態１〜２８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３０ （ｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第３の混合物と接触させる工程であって、第３の混合物は、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第４の混合物と接触させる工程であって、第４の混合物は、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第２及び第４の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｉｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第３及び第４の塩基タイプについて曖昧である工程
をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３１ 第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２ 第２の混合物が、第２又は第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第４の混合物が、第１又は第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３ 第１の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３４ 第２の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第２又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５ 第３の混合物が、第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６ 第４の混合物が、第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第４の混合物が、第１又は第２の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７ （ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物は、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態３８ プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｂ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９ ポリメラーゼが、外因性標識に付着されている、実施形態３７又は３８に記載の方法。
実施形態４０ ヌクレオチドコグネイトが、外因性標識を含まない、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１ ヌクレオチドコグネイトが、第１、第２及び第３の塩基タイプのコグネイトを互いに区別する外因性標識を含む、実施形態３７又は３８に記載の方法。
実施形態４２ 工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｄ）、をさらに含む、実施形態３７〜４１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４３ 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４ 工程（ａ）及び（ｂ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５ 工程（ｄ）が、工程（ｃ）の前に行われる、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４６ 工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態３７〜４５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４７ 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８ （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、少なくとも２つの別個の混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、順次接触は、三元複合体の安定化条件下、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触しているプライミングされたテンプレート核酸をもたらす工程；
（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態４９ プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｂ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０ ポリメラーゼが、外因性標識に付着されている、実施形態４８又は４９に記載の方法。
実施形態５１ ヌクレオチドコグネイトが、外因性標識を含まない、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２ ヌクレオチドコグネイトが、第１、第２及び第３の塩基タイプのコグネイトを互いに区別する外因性標識を含む、実施形態４８〜５０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５３ 工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｄ）、をさらに含む、実施形態４８〜５２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５４ 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５ 工程（ａ）及び（ｂ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６ 工程（ｄ）が、工程（ｃ）の前に行われる、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５７ 工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態４８〜５６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５８ 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９ プライミングされたテンプレート核酸を、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させることが、
（ｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程を含む、実施形態４８に記載の方法。
実施形態６０ 工程（ｂ）が、三元複合体からのシグナルを検出することを含み、シグナルが、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体と、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体とを区別しない、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６１ シグナルが、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体と、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体とを区別しない、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２ 第１の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６３ 第２の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４ 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６５ 第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６ 検査が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識について検出されたシグナルと同じである第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識からのシグナルを検出することを含む、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６７ 検査が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識について検出されたシグナルと同じである第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識からのシグナルを検出することを含む、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８ 同じタイプのポリメラーゼが、（ｉ）及び（ｉｉ）で使用される、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６９ （ｉ）におけるポリメラーゼのタイプが、（ｉｉ）におけるポリメラーゼのタイプと異なる、実施形態５９に記載の方法。
実施形態７０ （ｉ）の生成物についてのシグナルが、（ｉｉ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、実施形態５９に記載の方法。
実施形態７１ （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；
（ｂ）第１及び第２の混合物又はその生成物を別個に検査して、三元複合体を検出する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、２つの混合物で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態７２ 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３ 第３の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第３の混合物が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４ 第４の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第４の混合物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７５ 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第３の混合物が、第１及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第４の混合物が、第１及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６ 第１の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７７ 第２の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第２又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８ 第３の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第３の混合物が、第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９ 第４の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第４の混合物が、第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトと第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第４の混合物が、第１又は第２の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態７８に記載の方法。
実施形態８０ 工程（ａ）が、三元複合体の安定化条件下、プライミングされたテンプレート核酸を、少なくとも４つの混合物と順次接触させることを含み、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、ここで混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている、実施形態７１に記載の方法。
実施形態８１ 混合物の少なくとも２つで三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２ 混合物はそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３ 混合物はそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ２つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８４ 混合物はそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも３つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態８１に記載の方法。
以下の実施例は、核酸の個々の位置でヌクレオチドを同定するために曖昧性の解消及び／又は補完を利用する、いくつかの異なる構成を記載する。いくつかの実施形態は、塩基呼び出しの誤りの検出又は無効な塩基呼び出しの訂正を提供する符号化スキームを利用する。
プライミングされたテンプレート核酸は、フローセルの固体支持体に付着されている。プライミングされたテンプレートとポリメラーゼと次の正しいヌクレオチドとの間の三元複合体の形成を安定化する条件下、試薬がフローセルに送達される。下記表は、試薬送達を「フロー」として参照する。試薬フローの数及び各試薬フローの組成は、下記の各構成に詳述されるように変えることができる。さらに、各フローについて列挙される試薬は、同時又は連続的に送達することができる。
固体支持体上に形成される安定化三元複合体は、下記の個々の構成で具体化されるような、ポリメラーゼ又はヌクレオチドのいずれかの上の蛍光標識を含んでもよい。検査は、固体支持体上の蛍光シグナルを検出するために行われる。フローセルは、任意選択的に、それぞれのフローと検査の間で洗浄して、固体支持体上で形成される安定化三元複合体の検出におけるバックグラウンド標識を除去し、シグナル対ノイズをより良好にさせてもよい。三元複合体は、それぞれ参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号又は米国特許出願第６２／４４７，３１９号；同第６２／４４０，６２４号又は同第６２／４５０，３９７号に示される技術及び装置を使用して安定化及び検査される。
各構成についての例示的な利点を下記に示す。検出チャネルの数を減少させることは、一般的に、より手頃な検出装置の使用、より速い画像取得時間、さらにいくつかの場合にはより高い解像度を可能にすることが理解される。フローの数を減少させることは、より速い全サイクル時間（つまり、現行の例ではそれぞれの位置を調べるための累積的流体及び検出時間）、試薬の全体的コストの低減及び流体廃棄物の量の減少を提供しうる。異なるヌクレオチドの数を減少させることは、サイクルを完了させるためのコストの低減、出荷及び貯蔵中の試薬の全体積の減少並びに流体廃棄物の体積減少を提供することができる。
［実施例１］
１つの色、３つのヌクレオチドタイプ、３回の送達
表１の第１の列に示されるように、ポリメラーゼ及び１つのヌクレオチドタイプをプライミングされたテンプレートへそれぞれ送達する３つのフローを行うことができる。それぞれの場合に、ポリメラーゼ又はヌクレオチドのいずれかは、蛍光標識に付着されてもよい。検査は、各フロー後に実施される。蛍光標識は、全てのフローで同じであってもよい。それぞれのヌクレオチドタイプＡ、Ｇ、Ｃ及びＴで形成される安定化三元複合体について予測されるシグナルを、最後の４つのカラムに示す。正の符号は、蛍光シグナルが検出されることを示し、負の符号は有意なシグナルが存在しないことを示す。表１から明らかなように、次の正しいヌクレオチドがＡ、Ｇ又はＣである三元複合体の存在は、それぞれのヌクレオチドが送達されたフローの後に検出されるシグナルから決定することができる。送達されなかったヌクレオチド（つまり、この実施例ではＴヌクレオチド）は、３つ全ての検査工程における有意なシグナルの非存在から補完される。Ｔ又は任意の他のヌクレオチドについてのシグナルの非存在は、フローにおけるヌクレオチドの非存在によるものでありうることに留意されたい。代替的に、三元複合体が検出できない（例えば、そのヌクレオチドで形成された三元複合体に標識が存在しないことによる）にもかかわらず、不検出ヌクレオチドが、フローに存在し、三元複合体を形成しうる。
Figure 0006629993
表１における構成の利点は、４つのヌクレオチドが、１つのみの標識、１つの検出チャネル（つまり全てのフローの生成物について同じ波長での励起及び放射収集）、３回のみの試薬送達工程、３回のみの検査工程及び３つのみのヌクレオチドタイプを使用して区別できるということである。
［実施例２］
１つの色、３つのヌクレオチドタイプ、２回の送達
表２の第１の列に示されるように、２つのフローを実施して、合計で３つのヌクレオチドタイプをプライミングされたテンプレートに送達することができる。ポリメラーゼ又はヌクレオチドのいずれかは、蛍光標識に付着されてもよい。検査は、各フロー後に実施される。蛍光標識は、両方のフローで同じであってもよい。第１のフローで形成される（及び１回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＧを含むかどうかに関して曖昧である。第２のフローで形成される（及び２回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＣを含むかどうかに関して曖昧である。２つの検査についての表２のシグナルの比較から明らかなように、次の正しいヌクレオチドがＡ、Ｇ又はＣである三元複合体の存在は、曖昧性を解消することによって決定することができ、Ａは両方の検査でのシグナルによって示され、Ｇは１回目の検査でのシグナル及び２回目の検査での有意なシグナルの非存在によって示され、Ｃは１回目の検査での有意なシグナルの非存在及び２回目の検査でのシグナルの検出によって示される。送達されなかったヌクレオチド（つまり、この実施例ではＴヌクレオチド）は、検査の両方における有意なシグナルの非存在から補完する。Ｔ又は任意の他のヌクレオチドについてのシグナルの非存在は、フローにおけるヌクレオチドの非存在によるものでありうることに留意されたい。代替的に、三元複合体が検出できない（例えば、そのヌクレオチドで形成された三元複合体に標識が存在しないことによる）にもかかわらず、不検出ヌクレオチドが、フローに存在し、三元複合体を形成できる可能性がある。
Figure 0006629993
表２の構成の利点は、４つのヌクレオチドが、１つのみの標識、単一の検出チャネル、２回のみの試薬送達工程、２回のみの検査工程及び３つのみの異なるヌクレオチドを使用して区別できることである。
［実施例３］
２つの色、６つのヌクレオチドタイプ、２回の送達
表３は、４つの異なる塩基を有するヌクレオチドタイプを送達するために２つのフローが行われる構成を示す。ただし塩基のうち２つで形成される三元複合体が、いずれかのフローで代替的標識を有する。具体的に、Ｇヌクレオチドで形成される三元複合体は、第１のフローで赤色であり、第２のフローで青色である。Ｔヌクレオチドで形成される三元複合体は、第１のフローで青色であり、第２のフローで赤色である。そのように、この構成は、６つの異なるヌクレオチドタイプを使用して実施される。ヌクレオチドは、表３の第１の列に例示される混合物中の異なる蛍光標識に付着されてもよい。検査は、各フロー後に実施される。第１のフローで形成される（及び１回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、赤色チャネルで検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＧを含むかどうかに関して曖昧であり、青色チャネルで検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＣ又はＴを含むかどうかに関して曖昧である。第２のフローで形成される（及び２回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、赤色チャネルで検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＴを含むかどうかに関して曖昧であり、青色チャネルで検出されるシグナルは、複合体がＧ又はＣヌクレオチドを含むかどうかに関して曖昧である。２つの検査についての表３のシグナルの比較から明らかなように、次の正しいヌクレオチドは曖昧性を解消することによって同定することができ、Ａは両方の検査での赤色シグナルによって示され、Ｇは１回目の検査での赤色シグナル及び２回目の検査での青色シグナルによって示され、Ｃは１回目の検査での青色シグナル及び２回目の検査での青色シグナルによって示され、Ｔは１回目の検査での青色シグナル及び２回目の検査での赤色シグナルによって示される。
Figure 0006629993
表３における構成の利点は、４つのヌクレオチドが、２つのみの標識、２つのみの検出チャネル、２回のみの試薬送達工程及び２回のみの検査工程を使用して区別できることである。６つの異なるヌクレオチドがこの構成で使用されるが、テンプレートの特定の位置で次の正しいヌクレオチドのそれぞれのタイプについて２つの異なる正のシグナルが検出されるという事実により、テンプレートにおける全てのタイプのヌクレオチドについて誤りチェックが向上されていることが、さらなる利点である。
表３における構成は、安定化三元複合体を区別するために、波長の差異の代わりに、強度スケーリングを使用するように改変されてもよい。例えば、赤色標識が保持され、青色標識が保持される赤色標識の強度の割合を有する赤色標識で置き換えられてもよい。この改変の利点は、２つのチャネル検出が、（シグナル強度が単一のチャネルで区別できる限り）より単純で安価な単一チャネル検出で置き換えられうることである。
［実施例４］
２つの色、４つのヌクレオチドタイプ、２回の送達
表４は、２つのフローを実施して、合計で４つのヌクレオチドタイプをプライミングされたテンプレートに送達する構成を示す。ヌクレオチドは、表４の第１の列に例示される混合物中の異なる蛍光標識に付着されてもよい。検査は、各フロー後に実施される。第１のフローで形成される（及び１回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、赤色チャネルで検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＧを含むかどうかに関して曖昧であり、青色チャネルで検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＣ又はＴを含むかどうかに関して曖昧である。２回目の検査で検出される赤色シグナルは、Ａが三元複合体の次の正しいヌクレオチドであることを示し、青色シグナルは、Ｃが三元複合体の次の正しいヌクレオチドであることを示す。２つの検査についての表４のシグナルの比較から明らかなように、次の正しいヌクレオチドは曖昧性を解消することによって同定することができ、Ａは両方の検査での赤色シグナルによって示され、Ｇは１回目の検査での赤色シグナル及び２回目の検査での有意なシグナルの非存在によって示され、Ｃは両方の検査での青色シグナルによって示され、Ｔは１回目の検査での青色シグナル及び２回目の検査での有意なシグナルの非存在によって示される。
Figure 0006629993
表４における構成の利点は、４つのヌクレオチドが、２つのみの標識、２つのみの検出チャネル、２回のみの試薬送達工程及び２回のみの検査工程を使用して区別できることである。４つのヌクレオチドタイプがこの構成で使用されるが、テンプレートの特定の位置で２つの次の正しいヌクレオチドタイプについて２つの異なる正のシグナルが検出されるという事実により、テンプレートにおける２つのヌクレオチドタイプについて誤りチェックが提供される。
表４における構成は、安定化三元複合体を区別するために、波長の差異の代わりに、強度スケーリングを使用するように改変されてもよい。例えば、赤色標識が保持され、青色標識が、保持される赤色標識の強度の割合を有する赤色標識で置き換えられてもよい。この改変の利点は、２つのチャネル検出が、（シグナル強度が単一のチャネルで区別できる限り）より単純で安価な単一チャネル検出で置き換えられうることである。
［実施例５］
２つの色、３つのヌクレオチドタイプ、２回の送達
表５は、２つのフローを実施して合計で３つのヌクレオチドタイプをプライミングされたテンプレートに送達する構成を示す。ヌクレオチドは、表５の第１の列に例示される混合物中の異なる蛍光標識に付着されてもよい。検査は、各フロー後に実施される。第１のフローで形成される（及び１回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、赤色チャネルで検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＧを含むかどうかに関して曖昧である。１回目の検査での青色シグナルは、Ｃが次の正しいヌクレオチドであることを示す。２回目の検査で検出される赤色シグナルは、Ａが三元複合体の次の正しいヌクレオチドであることを示し、青色シグナルは、Ｃが三元複合体の次の正しいヌクレオチドであることを示す。２つの検査についての表４のシグナルの比較から明らかなように、次の正しいヌクレオチドは曖昧性を解消することによって同定することができ、Ａは両方の検査での赤色シグナルによって示され、Ｇは、１回目の検査での赤色シグナル及び２回目の検査での有意なシグナルの非存在によって示され、Ｃは、両方の検査での青色シグナルによって示される。送達されなかったヌクレオチド（つまり、この実施例ではＴヌクレオチド）は、検査の両方における有意なシグナルの非存在から補完される。Ｔ又は任意の他のヌクレオチドについてのシグナルの非存在は、フローにおけるヌクレオチドの非存在によるものでありうることに留意されたい。代替的に、三元複合体が検出できない（例えば、そのヌクレオチドで形成された三元複合体に標識が存在しないことによる）にもかかわらず、不検出ヌクレオチドが、フローに存在し、三元複合体を形成できる可能性がある。
Figure 0006629993
表５における構成の利点は、４つのヌクレオチドが、２つのみの標識、２つのみの検出チャネル、２回のみの試薬送達工程、２回のみの検査工程及び３つのみのヌクレオチドタイプを使用して区別できることである。テンプレートの特定の位置で２つの次の正しいヌクレオチドタイプについて２つの異なる正のシグナルが検出されるという事実により、テンプレートにおける２つのヌクレオチドタイプについて誤りチェックが提供される。
表５における構成は、安定化三元複合体を区別するために、波長の差異の代わりに、強度スケーリングを使用するように改変されてもよい。例えば、赤色標識が保持され、青色標識が、保持される赤色標識の強度の割合を有する赤色標識で置き換えられてもよい。この改変の利点は、２つのチャネル検出が、（シグナル強度が単一のチャネルで区別できる限り）より単純で安価な単一チャネル検出で置き換えられうることである。
［実施例６］
３色検出スキーム
表６〜８は、３つの異なるチャネルで検出される３つの異なる標識を活用するいくつかの構成を示す。表６における構成は、３つのみのヌクレオチドタイプ、３つのみの標識及び１つの未使用のヌクレオチドタイプの補完を使用し、それにより、必要とされる構成が、１つ以下のフローと、区別されるヌクレオチドの数より少ない標識（及び検出チャネル）であるという利点を提供する。Ｔについてのシグナルの非存在は、フローにおけるＴヌクレオチドの非存在によるものでありうることに留意されたい。代替的に、Ｔヌクレオチドが、フローに存在し、検出できない（例えば、そのＴヌクレオチドで形成された三元複合体に標識が存在しないことによる）三元複合体を形成できる可能性がある。
Figure 0006629993
表７における構成は４つのヌクレオチドタイプ、２つのフロー及び３つのみの標識を使用し、それにより区別されるヌクレオチドの数に対して必要な標識（及び検出チャネル）がより少ないという利点を提供する。さらなる利点として、テンプレートの任意の位置で３つの異なる正のシグナルが検出されるという事実により、テンプレートにおける３つのヌクレオチドタイプについて誤りチェックが提供される。
Figure 0006629993
表８は、２つのフロー及び３つのみの標識を使用する構成を示し、それにより、この構成は、区別されるヌクレオチドよりも必要な標識（及び検出チャネル）が少ないという利点を提供する。５つのヌクレオチドタイプが使用されるが、テンプレートの任意の位置で４つの異なる正のシグナルが検出可能であるという事実により、テンプレートにおける４つのヌクレオチドタイプ全てについて誤りチェックが提供される。
Figure 0006629993
表６〜８における構成は、安定化三元複合体を区別するために、波長の差異の代わりに、強度スケーリングを使用するように改変されてもよい。例えば、赤色標識が保持され、青色及び黄色標識が、保持される赤色標識の強度のそれぞれ３分の１及び３分の２の強度を有する赤色標識で置き換えられてもよい。この改変の利点は、３つのチャネル検出が、（シグナル強度が単一のチャネルで区別できる限り）より単純で安価な単一チャネル検出で置き換えられうることである。
［実施例７］
コグネイトヌクレオチドの反復検査
表１〜８に示されるフロー及び検査は、伸長工程を実行する前に繰り返すことができる。反復は、サイクルあたり少なくとも２、３、４、５回以上実施されるフロー及び伸長を導くことができる。したがって、テンプレートの特定の位置は、特定のヌクレオチドタイプでの三元複合体の形成能力について繰り返しサンプリングすることができる。この反復により、反復せずに得られるものよりも、より正確なヌクレオチド同定を得ることができる。反復は、テンプレート核酸の個々の位置でなされるヌクレオチド呼び出しの結果の統計学的分析及び統計学的分散又は統計学的信頼性の報告の基礎も提供する。
表９に示されるように、それぞれ２つの異なるヌクレオチドタイプの異なる組合せを送達する４つのフローを行うことができ、このコンビナトリアルアプローチは、４つのヌクレオチドタイプのそれぞれを２回評価する結果となる。ポリメラーゼ又はヌクレオチドのいずれかは、蛍光標識に付着されてもよい。検査は、各フロー後に実施される。蛍光標識は、両方のフローで同じであってもよい。
第１のフローで形成される（及び１回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＧを含むかどうかに関して曖昧である。２回目の検査で検出される安定化三元複合体について予測されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ又はＣを含むかどうかに関して曖昧である。３回目の検査で検出される安定化三元複合体について予測されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＧ又はＴを含むかどうかに関して曖昧である。４回目の検査で検出される安定化三元複合体について予測されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＣ又はＴを含むかどうかに関して曖昧である。
Figure 0006629993
４つの検査についての表９のシグナルの比較から明らかなように、次の正しいヌクレオチドがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴである三元複合体の存在は、曖昧性を解消することによって決定することができ、ここでＡは１回目及び２回目の検査でシグナルによって示され、Ｇは１回目及び３回目の検査でシグナルによって示され、Ｃは２回目及び４回目の検査でシグナルによって示され、Ｔは３回目及び４回目の検査でシグナルによって示される。
この構成の利点は、それぞれのヌクレオチドタイプがテンプレートの位置あたり２回（つまり配列決定サイクルあたり２回）観察されることである。このことは、次いで、サイクルあたりの各ヌクレオチドタイプについて１回の観察のみがなされる構成と比較して、精度を向上させる。１度に２つのヌクレオチドを流すことは、サイクルあたり８個の個々の三元複合体の別個の検出を達成するために、８つのフロー及び８回の検査が行われる構成と比較して、速度が改善し、試薬コストが減少する。
表１０に示されるように、それぞれ３つのヌクレオチドタイプの混合物を送達する４つのフローを、４つのヌクレオチドタイプ全てがそれぞれ３回評価されるように行うことができる。再度、ポリメラーゼ又はヌクレオチドが蛍光標識に付着されてもよく、検査は各フロー後に行われる。蛍光標識は、両方のフローで同じであってもよい。第１のフローで形成される（及び１回目の検査で検出される）安定化三元複合体についての予測されるシグナルは、三元複合体が形成されていることを示すが、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ、Ｇ又はＣを含むかどうかに関して曖昧である。２回目の検査で検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＧ、Ｃ又はＴを含むかどうかに関して曖昧である。３回目の検査で検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ、Ｃ又はＴを含むかどうかに関して曖昧である。４回目の検査で検出されるシグナルは、複合体が次の正しいヌクレオチドとしてＡ、Ｇ又はＴを含むかどうかに関して曖昧である。
Figure 0006629993
４つの検査についての表１０のシグナルの比較から明らかなように、次の正しいヌクレオチドがＡ、Ｇ、Ｃ又はＴである三元複合体の存在は、曖昧性を解消することによって決定することができ、ここでＡは１回目、３回目及び４回目の検査でシグナルによって示され、Ｇは１回目、２回目及び４回目の検査でシグナルによって示され、Ｃは１回目、２回目及び３回目の検査でシグナルによって示され、Ｔは２回目、３回目及び４回目の検査でシグナルによって示される。
この構成の利点は、それぞれのヌクレオチドタイプがテンプレートの位置あたり３回（つまり配列決定サイクルあたり２回）観察されることである。このことは、次いで、サイクルあたりの各ヌクレオチドタイプについて１回又は２回の観察のみがなされる構成と比較して、精度を向上させる。１度に３つのヌクレオチドを流すことは、サイクルあたり１２個の個々の三元複合体の別個の検出を達成するために、１２のフロー及び１２回の検査が行われる構成と比較して、速度が改善し、試薬コストが減少する。
表９及び１０に示す実施例の変形では、検出される三元複合体は、複合体に存在するヌクレオチドのタイプに基づいて各検査で区別可能になりうる。表９を一例にとると、Ａ及びＴヌクレオチドは、赤色標識を有する三元複合体を形成することができ、一方でＧ及びＣヌクレオチドは、青色標識を有する三元複合体を形成することができる。このように２つの標識を使用すると、各フローから生じる２つの三元複合体が、各検査で互いに区別できるようになる。同様に、強度スケーリングを使用して、それぞれの検査で異なるタイプの三元複合体を区別することができる。このように、曖昧性の解消は必要でなく、代わりに三元複合体の１つのタイプをそれぞれの検査で他の三元複合体と区別して、データ分析の精度と容易さを改善させてもよい。
それぞれの検査の間の不検出ヌクレオチド（例えば、表９の１回目の検査におけるＣ及びＴ）についてのシグナルの非存在は、フローにおけるこれらのヌクレオチドの非存在によるものでありうることに留意されたい。代替的に、不検出ヌクレオチドがフローに存在し、検出できない（例えば、そのヌクレオチドで形成された三元複合体に標識が存在しないことによる）三元複合体を形成できる可能性がある。
［実施例８］
誤り検出符号
この実施例では、誤りを検出することを目的とするＳＢＢ（商標）方法のユニークな能力を活用する。これはＳＢＢ（商標）方法論が、配列の次のヌクレオチドを決定するときに不可逆的取り込みを必要としないことから可能である。検査は可逆的であるので、ヌクレオチドとヌクレオチド上の蛍光標識とのユニークな組合せを用いて検査を複数回行い、いつ誤りが起こったかを検出することができる。
誤り検出は、各サイクルについて一連の３つの検査及び２つのシグナル状態を使用するＳＢＢ（商標）方法について実証される。この例では、２つのヌクレオチドがそれぞれの検査でフローされ、ヌクレオチドの３つのユニークな組合せが使用され、１つのヌクレオチドが導入されることはない。表１１Ａは、例示的な検査の順序及びそれぞれのヌクレオチドタイプを用いて形成される三元複合体について予測されるシグナル状態を示す。ここで、シグナル状態は、シグナルの存在について（＋）であり、シグナルの非存在について（−）である。表１１Ｂは、各ヌクレオチドについて予測される符号語（数字のストリームとも称される）を示す。
塩基呼び出しは、表１１Ｂに示される有効な符号語の認識に基づいて、サイクル毎に行うことができる。テンプレートについての配列決定サイクルが無効な符号語（つまり、表１１Ｂに示されていないもの）を生じる場合は、誤りがなされていることが分かる。しかしながら、この符号は、誤り訂正のために十分複雑であるとはいえない。
Figure 0006629993
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表１１Ａ及び１１Ｂに示される例では、Ｔヌクレオチドは全てのフローから省略され（又は存在する場合、検出可能でなく）、それゆえ、その存在が補完される「暗ヌクレオチド」として機能する。この例又は暗塩基を利用する本明細書の他の実施形態で省略されるヌクレオチドは、ヌクレオチドの特徴に基づいて選択されうる。例えば、省略されるヌクレオチドは、最も高価なヌクレオチド又は三元複合体の形成若しくは検出において最も性能の劣ることが実証されるヌクレオチドでありうる。それぞれ一度に１つのヌクレオチドをフローする標準的なＳＢＢ（商標）実施の４回の検査に対して、この符号化スキームは、１回のフロー／検査が除かれ、時間及び試薬コストが節約され、シグナル復号を介して誤り検出を提供するという利点を提供する。
別の選択肢は、検査あたり２つのヌクレオチドを含む４回の検査を、二元シグナル状態で実行することである。この構成の利点は、全サイクルにわたって暗であるヌクレオチドがないことである。この構成は実施例７に記載されており、表９にまとめられている。表９の構成から生じるそれぞれの有効な塩基タイプについての符号語は表１２に示される。
Figure 0006629993
部分的な誤り訂正又は誤りからの回復は、１つ又は１つのみの検査が誤りであるとの疑いがある又は誤りであることが分かっているとき、表９及び１２のスキームのもとで可能である。検査は、例えば、強度が決定的に高くなく若しくは低くない、画像の焦点が合っていないなどの多くの理由で、疑いのあるものを除外することができる。表１３は、表９に示されるサイクルからの、１つの疑いのある検査のイベントにおいて各塩基呼び出しについて生じる符号語を示す。各符号語の疑問符は、疑いのあるサイクルの結果を示している。１つの疑いのあるサイクルのイベントにおいて、４つの塩基全てがユニークに呼び出されうることが表１３から明らかである。
Figure 0006629993
この実施例の例示的構成では、ポリメラーゼ又はヌクレオチドのいずれかは、蛍光標識に付着されてもよい。任意のヌクレオチドについてのシグナルの非存在は、フローにおけるヌクレオチドの非存在によるものでありうる。代替的に、不検出ヌクレオチドが、三元複合体が検出できない（例えば、そのヌクレオチドで形成された三元複合体に標識が存在しないことによる）にもかかわらず、フローに存在し、三元複合体を形成できる可能性がある。
表１１Ａ、１１Ｂ、１２及び１３の例示的構成は、検出可能なシグナル状態（＋）及び暗状態（−）を使用し、単一の検出チャネルを使用して４つの塩基タイプを区別するという利点を提供する。この変形は、２つの検出可能なシグナル状態を使用すること、例えば、２つの発光波長を使用することである。第２の検出チャネルは、検出装置に複雑さを加えることになるが、各フローの各ヌクレオチドの肯定的同定により、塩基呼び出しの信頼性を改善する利点を提供することができる。
［実施例９］
誤り訂正符号
この実施例では、誤りを検出するだけでなく、誤りを訂正することを目的として、ＳＢＢ（商標）方法のユニークな能力をさらに活用する。検査は可逆的であるので、ヌクレオチド及びヌクレオチド上の蛍光標識のユニークな組合せを用いて検査を複数回行い、いつ誤りが起こったかを検出するだけでなく、誤りを訂正することができる。
誤り検出及び訂正は、フロー／検査あたり２つのヌクレオチドを用いた５回の検査を含むＳＢＢ（商標）サイクルを使用して提供される。表１４Ａは、例示的な検査の順序及びそれぞれのヌクレオチドタイプを用いて形成される三元複合体について予測されるシグナル状態を示す。ここで、シグナル状態は、シグナルの存在について（＋）であり、シグナルの非存在について（−）である。表１４Ｂは、それぞれのヌクレオチドについて予測される符号語を示す。
Figure 0006629993
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有効な符号語のそれぞれ１つが、任意の他の有効な符号語から離れた少なくとも３つの修正である。１数字の誤りがなされている場合、最も近い有効な符号語を見い出すことができ、そのヌクレオチドがそのサイクルのための塩基呼び出しとして選択される。
表１４Ａ及び１４Ｂの例示的構成は、検出可能なシグナル状態（＋）及び暗状態（−）を使用し、単一の検出チャネルを使用して４つの塩基タイプを区別するという利点を提供する。変形は、２つの検出可能なシグナル状態を使用すること、例えば、２つの発光波長を使用することである。第２の検出チャネルは、検出装置に複雑さを加えることになるが、各フローの各ヌクレオチドの肯定的同定は、塩基呼び出しの信頼性を改善するための利点を提供することができる。
表１４Ａに示すサイクルは誤り訂正を提供しているが、不利な点は、解明すべきヌクレオチドの数より多くの検査を実行することから、時間及び試薬が増加することである。検査の数の観点から、より効率的な誤り訂正及び検出のための別の選択肢は、第２の色素を導入することである。導入の結果は、符号の三進数字によって表される三元シグナル状態（第１の色、第２の色及び暗）を使用する符号化スキームである。
Figure 0006629993
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表１５Ａの構成は、２チャネルの検出（赤色及び青色発光）を使用し、１サイクルあたりに使用される合計８つの標識ヌクレオチドに対して４つのヌクレオチドそれぞれが２つの形態で提供される（１つ目は赤色色素を有し、２つ目は青色色素を有する）。２色アプローチに対する改変は、検査にわたってヌクレオチドの色を保存することである。これにより、先のアプリケーションは、Ａ及びＧが常に青色であり、Ｃ及びＴが常に赤色であるように変更される。サイクルの構成が表１６Ａに示され、それぞれの有効な塩基呼び出しについて得られる符号語が表１６Ｂに示される。
Figure 0006629993
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この実施例の例示的構成では、ポリメラーゼ又はヌクレオチドのいずれかは、蛍光標識に付着されてもよい。任意のヌクレオチドについてのシグナルの非存在は、フローにおけるヌクレオチドの非存在によるものでありうる。代替的に、不検出ヌクレオチドが、三元複合体が検出できない（例えば、そのヌクレオチドで形成された三元複合体に標識が存在しないことによる）にもかかわらず、フローに存在し、三元複合体を形成できる可能性がある。表１５Ａ及び１６Ａにおける構成は、安定化三元複合体を区別するために、波長の差異の代わりに、強度スケーリングを使用するように改変されてもよい。例えば、赤色標識が保持され、青色標識が、保持される赤色標識の強度の割合を有する赤色標識で置き換えられてもよい。この改変の利点は、２つのチャネル検出が、（シグナル強度が単一のチャネルで区別できる限り）より単純で安価な単一チャネル検出で置き換えられうることである。
表１５Ａ及び１６Ａの例示的構成は、２つの検出可能なシグナル状態（赤色及び青色）及び暗状態（−）を使用し、２つの検出チャネルのみを使用して４つの塩基タイプを区別するという利点を提供する。この変形は、３つの検出可能なシグナル状態を使用すること、例えば、３つの発光波長を使用することである。第３の検出チャネルは、検出装置に複雑さを加えることになるが、各フローの各ヌクレオチドの肯定的同定により、塩基呼び出しの信頼性を改善する利点を提供することができる。
この出願を通して、様々な刊行物、特許及び／又は特許出願が参照されている。これらの文献の開示はその全体で参照により本出願に組み込む。
いくつかの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、様々な改変がなされうることが理解される。したがって、他の実施形態が、以下の特許請求の範囲内にある。
実施形態
実施形態Ｐ１． （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；
（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程を含む、核酸検出方法。
実施形態Ｐ２． プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｃ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ３． （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関している、実施形態Ｐ２に記載の方法。
実施形態Ｐ４． 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態Ｐ３に記載の方法。
実施形態Ｐ５． （ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関している、実施形態Ｐ４に記載の方法。
実施形態Ｐ６． 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ａ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じ、
ここで、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物の検査が、第１のシグナルと第２のシグナルとを区別する、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ７． 第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ｂ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じる、実施形態Ｐ６に記載の方法。
実施形態Ｐ８． （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第１のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第２のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関している、実施形態Ｐ７に記載の方法。
実施形態Ｐ９． 第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ｂ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じる、実施形態Ｐ６に記載の方法。
実施形態Ｐ１０． （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第１のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第２のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関している、実施形態Ｐ９に記載の方法。
実施形態Ｐ１１． 工程（ｃ）で取得されたシグナルが、ポリメラーゼに付着された外因性標識によって生じる、実施形態Ｐ１〜Ｐ１０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ１２． 工程（ａ）の生成物についてのシグナルが、工程（ｂ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、実施形態Ｐ１又はＰ１１に記載の方法。
実施形態Ｐ１３． 工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についてのシグナルが発光シグナルを含む、実施形態Ｐ１〜Ｐ１２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ１４． 第１の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｐ１〜Ｐ１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ１５． 第２の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｐ１４に記載の方法。
実施形態Ｐ１６． 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｐ１〜Ｐ１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ１７． 第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｐ１６に記載の方法。
実施形態Ｐ１８． 工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態Ｐ１〜Ｐ１７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ１９． 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態Ｐ１８に記載の方法。
実施形態Ｐ２０． 工程（ａ）〜（ｃ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｆ）、をさらに含む、実施形態Ｐ１９に記載の方法。
実施形態Ｐ２１． 工程（ｅ）が、工程（ｄ）の前に行われる、実施形態Ｐ１９に記載の方法。
実施形態Ｐ２２． 工程（ａ）のポリメラーゼが、工程（ｂ）のポリメラーゼで置き換えられる、実施形態Ｐ１〜Ｐ２１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ２３． 同じタイプのポリメラーゼが、工程（ａ）及び（ｂ）に存在している、実施形態Ｐ１〜Ｐ２２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ２４． プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触させるさらなる工程を含み、工程（ｃ）が、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて、さらなる工程の生成物を検査することをさらに含む、実施形態Ｐ１に記載の方法。
実施形態Ｐ２５． （ｉｖ）第４の塩基タイプが、さらなる工程の生成物についてのシグナルの存在と相関している、実施形態Ｐ２４に記載の方法。
実施形態Ｐ２６． 工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態Ｐ１〜Ｐ２５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ２７． 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態Ｐ２６に記載の方法。
実施形態Ｐ２８． 工程（ｂ）の前に、プライミングされたテンプレート核酸から第１の混合物を除去する工程をさらに含む、実施形態Ｐ１〜Ｐ２７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ２９． 工程（ａ）の生成物の検査が、工程（ｂ）の前に行われる、実施形態Ｐ１〜Ｐ２８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ３０． （ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物は、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程を含み、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される、核酸検出方法。
実施形態Ｐ３１． プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｂ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態Ｐ３０に記載の方法。
実施形態Ｐ３２． ポリメラーゼが、外因性標識に付着されている、実施形態Ｐ３０又はＰ３１に記載の方法。
実施形態Ｐ３３． ヌクレオチドコグネイトが、外因性標識を含まない、実施形態Ｐ３２に記載の方法。
実施形態Ｐ３４． ヌクレオチドコグネイトが、第１、第２及び第３の塩基タイプのコグネイトを互いに区別する外因性標識を含む、実施形態Ｐ３０又はＰ３１に記載の方法。
実施形態Ｐ３５． 工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｄ）、をさらに含む、実施形態Ｐ３０〜Ｐ３４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ３６． 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態Ｐ３５に記載の方法。
実施形態Ｐ３７． 工程（ａ）及び（ｂ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態Ｐ３６に記載の方法。
実施形態Ｐ３８． 工程（ｄ）が、工程（ｃ）の前に行われる、実施形態Ｐ３５に記載の方法。
実施形態Ｐ３９． 各工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態Ｐ３０〜Ｐ３８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ４０． 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態Ｐ３９に記載の方法。
実施形態Ｐ４１． （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、少なくとも２つの別個の混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、順次接触は、三元複合体の安定化条件下、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触しているプライミングされたテンプレート核酸をもたらす工程；
（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程を含み、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態Ｐ４２． プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｂ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態Ｐ４１に記載の方法。
実施形態Ｐ４３． ポリメラーゼが、外因性標識に付着されている、実施形態Ｐ４１又はＰ４２に記載の方法。
実施形態Ｐ４４． ヌクレオチドコグネイトが、外因性標識を含まない、実施形態Ｐ４３に記載の方法。
実施形態Ｐ４５． ヌクレオチドコグネイトが、第１、第２及び第３の塩基タイプのコグネイトを互いに区別する外因性標識を含む、実施形態Ｐ４１〜Ｐ４３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ４６． （ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程をさらに含む、実施形態Ｐ４１〜Ｐ４５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ４７． 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態Ｐ４６に記載の方法。
実施形態Ｐ４８． （ｅ）工程（ａ）及び（ｂ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程をさらに含む、実施形態Ｐ４７に記載の方法。
実施形態Ｐ４９． 工程（ｄ）が、工程（ｃ）の前に行われる、実施形態Ｐ４６に記載の方法。
実施形態Ｐ５０． 各工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態Ｐ４１〜Ｐ４９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｐ５１． 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態Ｐ５０に記載の方法。
実施形態Ｐ５２． プライミングされたテンプレート核酸を、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させることが、
（ｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼとヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程を含む、実施形態Ｐ４１に記載の方法。
実施形態Ｐ５３． 工程（ｂ）が、三元複合体からのシグナルを検出することを含み、シグナルは、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体と第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体とを区別しない、実施形態Ｐ５２に記載の方法。
実施形態Ｐ５４． シグナルが、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体と第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体とを区別しない、実施形態Ｐ５３に記載の方法。
実施形態Ｐ５５． 第１の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｐ５２に記載の方法。
実施形態Ｐ５６． 第２の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｐ５５に記載の方法。
実施形態Ｐ５７． 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｐ５２に記載の方法。
実施形態Ｐ５８． 第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｐ５７に記載の方法。
実施形態Ｐ５９． 検査が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識について検出されたシグナルと同じである第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識からのシグナルを検出することを含む、実施形態Ｐ５２に記載の方法。
実施形態Ｐ６０． 検査が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識について検出されたシグナルと同じである第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識からのシグナルを検出することを含む、実施形態Ｐ５９に記載の方法。
実施形態Ｐ６１． 同じタイプのポリメラーゼが（ｉ）及び（ｉｉ）で使用される、実施形態Ｐ５２に記載の方法。
実施形態Ｐ６２． （ｉ）におけるポリメラーゼのタイプが、（ｉｉ）におけるポリメラーゼのタイプと異なる、実施形態Ｐ５２に記載の方法。
実施形態Ｐ６３． （ｉ）の生成物についてのシグナルが、（ｉｉ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、実施形態Ｐ５２に記載の方法。
実施形態Ｒ１． （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；
（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程を含む、核酸検出方法。
実施形態Ｒ２． プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｃ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態Ｒ１に記載の方法。
実施形態Ｒ３． （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関している、実施形態Ｒ２に記載の方法。
実施形態Ｒ４． 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態Ｒ３に記載の方法。
実施形態Ｒ５． （ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関している、実施形態Ｒ４に記載の方法。
実施形態Ｒ６． 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ａ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じ、
ここで、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物の検査が、第１のシグナルと第２のシグナルとを区別する、実施形態Ｒ１に記載の方法。
実施形態Ｒ７． 第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ｂ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体について及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じる、実施形態Ｒ６に記載の方法。
実施形態Ｒ８． （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第１のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第２のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関している、実施形態Ｒ７に記載の方法。
実施形態Ｒ９． 第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトをさらに含み、
工程（ｂ）の生成物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第１のシグナルを生じ、
工程（ｂ）の生成物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む安定化三元複合体についての第２のシグナルを生じる、実施形態Ｒ６に記載の方法。
実施形態Ｒ１０． （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第１のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第１のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についての第２のシグナルの存在と相関しており、
（ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についての第２のシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関している、実施形態Ｒ９に記載の方法。
実施形態Ｒ１１． 工程（ｃ）で取得されたシグナルが、ポリメラーゼに付着された外因性標識によって生じる、実施形態Ｒ１〜Ｒ１０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ１２． 工程（ａ）の生成物についてのシグナルが、工程（ｂ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、実施形態Ｒ１又はＲ１１に記載の方法。
実施形態Ｒ１３． 工程（ａ）及び（ｂ）の生成物についてのシグナルが発光シグナルを含む、実施形態Ｒ１〜Ｒ１２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ１４． 第１の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｒ１〜Ｒ１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ１５． 第２の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｒ１４に記載の方法。
実施形態Ｒ１６． 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｒ１〜Ｒ１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ１７． 第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｒ１６に記載の方法。
実施形態Ｒ１８． 工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態Ｒ１〜Ｒ１７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ１９． 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態Ｒ１８に記載の方法。
実施形態Ｒ２０． 工程（ａ）〜（ｃ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｆ）、をさらに含む、実施形態Ｒ１９に記載の方法。
実施形態Ｒ２１． 工程（ｅ）が、工程（ｄ）の前に行われる、実施形態Ｒ１９に記載の方法。
実施形態Ｒ２２． 工程（ａ）のポリメラーゼが、工程（ｂ）のポリメラーゼで置き換えられる、実施形態Ｒ１〜Ｒ２１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ２３． 同じタイプのポリメラーゼが、工程（ａ）及び（ｂ）に存在している、実施形態Ｒ１〜Ｒ２２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ２４． プライミングされたテンプレート核酸を、ポリメラーゼ及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触させるさらなる工程を含み、工程（ｃ）が、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて、さらなる工程の生成物を検査することをさらに含む、実施形態Ｒ１に記載の方法。
実施形態Ｒ２５． （ｉｖ）第４の塩基タイプが、さらなる工程の生成物についてのシグナルの存在と相関している、実施形態Ｒ２４に記載の方法。
実施形態Ｒ２６． 各工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態Ｒ１〜Ｒ２５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ２７． 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態Ｒ２６に記載の方法。
実施形態Ｒ２８． 工程（ｂ）の前に、プライミングされたテンプレート核酸から第１の混合物を除去する工程をさらに含む、実施形態Ｒ１〜Ｒ２７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ２９． 工程（ａ）の生成物の検査が、工程（ｂ）の前に行われる、実施形態Ｒ１〜Ｒ２８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ３０． （ｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第３の混合物と接触させる工程であって、第３の混合物は、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第４の混合物と接触させる工程であって、第４の混合物は、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第２及び第４の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｉｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第３及び第４の塩基タイプについて曖昧である工程
をさらに含む、実施形態Ｒ１に記載の方法。
実施形態Ｒ３１． 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態Ｒ３０に記載の方法。
実施形態Ｒ３２． 第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態Ｒ３１に記載の方法。
実施形態Ｒ３３． 第１の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ３０に記載の方法。
実施形態Ｒ３４． 第２の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第２又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ３３に記載の方法。
実施形態Ｒ３５． 第３の混合物が、第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトと第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ３４に記載の方法。
実施形態Ｒ３６． 第４の混合物が、第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトと第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第４の混合物が、第１又は第２の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ３５に記載の方法。
実施形態Ｒ３７． （ａ）三元複合体の安定化条件下で混合物を形成する工程であって、混合物が、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ並びにテンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態Ｒ３８． プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｂ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態Ｒ３７に記載の方法。
実施形態Ｒ３９． ポリメラーゼが、外因性標識に付着されている、実施形態Ｒ３７又はＲ３８に記載の方法。
４０． ヌクレオチドコグネイトが、外因性標識を含まない、実施形態３９に記載の方法。
４１． ヌクレオチドコグネイトが、第１、第２及び第３の塩基タイプのコグネイトを互いに区別する外因性標識を含む、実施形態３７又は３８に記載の方法。
実施形態Ｒ４２． 工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｄ）、をさらに含む、実施形態Ｒ３７〜Ｒ４１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ４３． 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態Ｒ４２に記載の方法。
実施形態Ｒ４４． 工程（ａ）及び（ｂ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態Ｒ４３に記載の方法。
実施形態Ｒ４５． 工程（ｄ）が、工程（ｃ）の前に行われる、実施形態Ｒ４２に記載の方法。
実施形態Ｒ４６． 各工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態Ｒ３７〜Ｒ４５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ４７． 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態Ｒ４６に記載の方法。
実施形態Ｒ４８． （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させる工程であって、少なくとも２つの別個の混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、順次接触は、三元複合体の安定化条件下、テンプレートの第１、第２及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触しているプライミングされたテンプレート核酸をもたらす工程；
（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を検査して、三元複合体が形成されたかどうかを決定する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、工程（ｂ）で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２又は第３の塩基タイプのコグネイトとして同定され、工程（ｂ）における三元複合体の非存在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトであると補完される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態Ｒ４９． プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｂ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態Ｒ４８に記載の方法。
実施形態Ｒ５０． ポリメラーゼが、外因性標識に付着されている、実施形態Ｒ４８又はＲ４９に記載の方法。
実施形態Ｒ５１． ヌクレオチドコグネイトが、外因性標識を含まない、実施形態Ｒ５０に記載の方法。
実施形態Ｒ５２． ヌクレオチドコグネイトが、第１、第２及び第３の塩基タイプのコグネイトを互いに区別する外因性標識を含む、実施形態Ｒ４８〜Ｒ５０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ５３． 工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｄ）、をさらに含む、実施形態Ｒ４８〜Ｒ５２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ５４． 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態Ｒ５３に記載の方法。
実施形態Ｒ５５． 工程（ａ）及び（ｂ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態Ｒ５４に記載の方法。
実施形態Ｒ５６． 工程（ｄ）が、工程（ｃ）の前に行われる、実施形態Ｒ５３に記載の方法。
実施形態Ｒ５７． 各工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態Ｒ４８〜Ｒ５６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｒ５８． 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態Ｒ５７に記載の方法。
実施形態Ｒ５９． プライミングされたテンプレート核酸を、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させることが、
（ｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程を含む、実施形態Ｒ４８に記載の方法。
実施形態Ｒ６０． 工程（ｂ）が、三元複合体からのシグナルを検出することを含み、シグナルは、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体と、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体とを区別しない、実施形態Ｒ５９に記載の方法。
実施形態Ｒ６１． シグナルが、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体と第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む三元複合体とを区別しない、実施形態Ｒ６０に記載の方法。
実施形態Ｒ６２． 第１の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｒ５９に記載の方法。
実施形態Ｒ６３． 第２の混合物中のヌクレオチドが、外因性標識を含まない、実施形態Ｒ６２に記載の方法。
実施形態Ｒ６４． 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｒ５９に記載の方法。
実施形態Ｒ６５． 第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態Ｒ６４に記載の方法。
実施形態Ｒ６６． 検査が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識について検出されたシグナルと同じである第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識からのシグナルを検出することを含む、実施形態Ｒ５９に記載の方法。
実施形態Ｒ６７． 検査が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識について検出されたシグナルと同じである第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識からのシグナルを検出することを含む、実施形態Ｒ６６に記載の方法。
実施形態Ｒ６８． 同じタイプのポリメラーゼが（ｉ）及び（ｉｉ）で使用される、実施形態Ｒ５９に記載の方法。
実施形態Ｒ６９． （ｉ）におけるポリメラーゼのタイプが、（ｉｉ）におけるポリメラーゼのタイプと異なる、実施形態Ｒ５９に記載の方法。
実施形態Ｒ７０． （ｉ）の生成物についてのシグナルが、（ｉｉ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、実施形態Ｒ５９に記載の方法。
実施形態Ｒ７１． （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；
（ｂ）第１及び第２の混合物又はその生成物を別個に検査して、三元複合体を検出する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、２つの混合物で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態Ｒ７２． 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ７１に記載の方法。
実施形態Ｒ７３． 第３の混合物が、プライミングされたテンプレートと接触し、第３の混合物が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ７２に記載の方法。
実施形態Ｒ７４． 第４の混合物が、プライミングされたテンプレートと接触し、第４の混合物は、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ７２に記載の方法。
実施形態Ｒ７５． 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第３の混合物が、第１及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態Ｒ７４に記載の方法。
実施形態Ｒ７６． 第１の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ７１に記載の方法。
実施形態Ｒ７７． 第２の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第２又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ７６に記載の方法。
実施形態Ｒ７８． 第３の混合物が、プライミングされたテンプレートと接触し、第３の混合物が、第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ７７に記載の方法。
実施形態Ｒ７９． 第４の混合物が、プライミングされたテンプレートと接触し、第４の混合物が、第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第４の混合物が、第１又は第２の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ７８に記載の方法。
実施形態Ｒ８０． 工程（ａ）が、プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも４つの混合物と順次接触させることを含み、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている、実施形態Ｒ７８に記載の方法。
実施形態Ｒ８１． 混合物の少なくとも２つで三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される、実施形態Ｒ８０に記載の方法。
実施形態Ｒ８２． 混合物はそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ８１に記載の方法。
実施形態Ｒ８３． 混合物はそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ２つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ８１に記載の方法。
実施形態Ｒ８４． 混合物はそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも３つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態Ｒ８１に記載の方法。
実施形態１ （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；
（ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程を含む、核酸検出方法。
実施形態２ プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｃ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、実施形態１に記載の方法。
実施形態３ （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関しており、
（ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
（ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関している、実施形態２に記載の方法。
実施形態４ 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態３に記載の方法。
実施形態５ （ｉｖ）第４の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関している、実施形態４に記載の方法。
実施形態６ 工程（ｃ）で取得されたシグナルが、ポリメラーゼに付着された外因性標識によって生じる、実施形態１に記載の方法。
実施形態７ 工程（ａ）の生成物についてのシグナルが、工程（ｂ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、実施形態１に記載の方法。
実施形態８ 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まず、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、実施形態１に記載の方法。
実施形態９ 工程（ｃ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態１０ 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１ 工程（ａ）〜（ｃ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｆ）、をさらに含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２ 工程（ｅ）が、工程（ｄ）の前に行われる、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１３ 各工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、実施形態１に記載の方法。
実施形態１４ 複数のプライミングされたテンプレート核酸がアレイに付着されている、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５ 工程（ａ）の生成物の検査が、工程（ｂ）の前に行われる、実施形態１に記載の方法。
実施形態１６ （ｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第３の混合物と接触させる工程であって、第３の混合物は、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｉｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第４の混合物と接触させる工程であって、第４の混合物は、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第２及び第４の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｉｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第３及び第４の塩基タイプについて曖昧である工程
をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態１７ （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、ここで混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；
（ｂ）第１及び第２の混合物又はその生成物を別個に検査して三元複合体を検出する工程；並びに
（ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、２つの混合物で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程を含む、核酸検出方法。
実施形態１８ 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９ 第３の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第３の混合物が第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０ 第４の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第４の混合物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２１ 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第３の混合物が、第１及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第４の混合物が、第１及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２ 第１の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態１７に記載の方法。
実施形態２３ 第２の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第２又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４ 第３の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第３の混合物が、第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５ 第４の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第４の混合物が、第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第４の混合物が、第１又は第２の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６ 工程（ａ）が、三元複合体の安定化条件下、プライミングされたテンプレート核酸を、少なくとも４つの混合物と順次接触させることを含み、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている、実施形態１７に記載の方法。
実施形態２７ 混合物の少なくとも２つで三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８ 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９ 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ２つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態２７に記載の方法。
実施形態３０ 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも３つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態２７に記載の方法。
実施形態３１ （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を形成するための一連の混合物と接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びテンプレート核酸の次のテンプレート位置に存在すると疑いのある少なくとも２つの異なる塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
（ｂ）一連の混合物によって形成される三元複合体について次のテンプレート位置を監視する工程であって、シグナル状態が、それぞれの個々の混合物により次のテンプレート位置で形成される三元複合体の存在又は非存在を示し、それにより、次のテンプレート位置についての塩基呼び出しを符号化する一連のシグナル状態を決定する工程；並びに
（ｃ）一連のシグナル状態を復号して、次のテンプレート位置についての正しい塩基呼び出しと塩基呼び出しにおける誤りとを区別する工程
を含む、核酸配列を決定する方法。
実施形態３２ 一連のシグナル状態が、誤り訂正符号を含む、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３ 一連の混合物が３つの混合物からなり、一連のシグナル状態が３つの数字で表され、それぞれの数字が混合物から得られたシグナル状態を表している、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４ シグナル状態がそれぞれ二進数字によって表され、誤り訂正符号が反復符号を含む、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５ ３つの数字間の多数決によって無効な塩基呼び出しを訂正することをさらに含む、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６ 一連の混合物が４つの混合物からなり、一連のシグナル状態が４つの数字で表され、それぞれの数字が混合物から得られたシグナル状態を表している、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３７ シグナル状態がそれぞれ三進数字によって表され、誤り訂正符号がハミング符号を含み、有効な塩基呼び出し間のハミング距離は３である、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８ 無効な塩基呼び出しを、無効な塩基呼び出しの符号に最も近いハミング距離を有する符号を持つ有効な塩基呼び出しに訂正することをさらに含む、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９ 一連の混合物が５つの混合物からなり、一連のシグナル状態が５つの数字で表され、それぞれの数字が混合物から得られたシグナル状態を表している、実施形態３２に記載の方法。
実施形態４０ シグナル状態がそれぞれ二進数字によって表され、誤り訂正符号がハミング符号を含み、それぞれの有効な塩基呼び出しが他の有効な塩基呼び出しと３つの数字で異なる、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１ 無効な塩基呼び出しを、無効な塩基呼び出しの符号に最も近いハミング距離を有する符号を持つ有効な塩基呼び出しに訂正することをさらに含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２ 一連のシグナル状態の復号が、塩基呼び出しを無効な塩基呼び出しとして同定する、実施形態３１に記載の方法。
実施形態４３ 無効な塩基呼び出しを、次のテンプレート位置のための有効な塩基呼び出しとなるように訂正することをさらに含む、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４ 誤りの訂正が、工程（ａ）又は（ｂ）において、一連のシグナル状態における疑いのあるシグナル状態を、異常と相関させること及び疑いのあるシグナル状態に変化を有する予測される一連のシグナル状態を有する塩基呼び出しを選択することを含む、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５ 工程（ｂ）の異常が、所定の閾値を下回るシグナル対ノイズ比、所定の閾値を下回るシグナル、所定の閾値を上回るシグナル、所定の閾値を上回るノイズ、及び検出器不具合からなる群から選択される、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６ 工程（ａ）の異常が、流体送達不具合、温度制御不具合及び所定の閾値を下回る試薬の品質からなる群から選択される、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４７ 一連のシグナル状態が、反復符号、ハミング符号、線形符号又はパリティ符号を含む、実施形態１〜４６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４８ シグナル状態がそれぞれ二進数字によって表される、実施形態３１に記載の方法。
実施形態４９ 二進数字は、（ｉ）シグナルの存在及び非存在についての記号；（ｉｉ）２つの異なる波長で放射されるシグナルについての記号；（ｉｉｉ）２つの異なる強度を有するシグナルについての記号；又は（ｉｖ）２つの異なる波長での励起に起因するシグナルについての記号を含む、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０ シグナル状態がそれぞれ三進数字によって表される、実施形態３１に記載の方法。
実施形態５１ 二進数字は、（ｉ）３つの異なる波長で放射されるシグナルについての記号；（ｉｉ）３つの異なる強度を有するシグナルについての記号；又は（ｉｉｉ）３つの異なる波長での励起に起因するシグナルについての記号を含む、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２ 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸中にある疑いのある４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態１〜５１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５３ 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸中にある疑いのある４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ２つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、実施形態１〜５２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５４ 混合物が、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトの存在又は非存在で異なっている、実施形態１〜５３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５５ 混合物が、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識の数又はタイプで異なっている、実施形態１〜５４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５６ 工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長プライマーを生成する工程（ｄ）、をさらに含む、実施形態１〜５５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５７ 伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８ プライマーに加えられる次の正しいヌクレオチドが、可逆的に終結されたヌクレオチドである、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５９ 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含む、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０ 工程（ａ）〜（ｄ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｅ）、をさらに含む、実施形態５９に記載の方法。

Claims (60)

  1. （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第１の混合物と接触させる工程であって、第１の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
    （ｂ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第２の混合物と接触させる工程であって、第２の混合物は、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
    （ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ａ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第２の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｂ）の生成物について取得されたシグナルは、第１及び第３の塩基タイプについて曖昧である工程；
    （ｄ）工程（ｃ）で取得されたシグナルの曖昧性を解消して、次の正しいヌクレオチドに結合する塩基タイプを同定する工程
    を含む、核酸検出方法。
  2. プライミングされたテンプレート核酸が、工程（ｃ）の間に、第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと接触していない、請求項１に記載の方法。
  3. （ｉ）第１の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関しており、
    （ｉｉ）第２の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの非存在と相関しており、
    （ｉｉｉ）第３の塩基タイプが、工程（ａ）の生成物についてのシグナルの非存在及び工程（ｂ）の生成物についてのシグナルの存在と相関している、請求項２に記載の方法。
  4. 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、請求項３に記載の方法。
  5. （ｉｖ）工程（ａ）の生成物についてのシグナルが存在せず、かつ工程（ｂ）の生成物についてのシグナルが存在しない場合、第４の塩基タイプが補完される、請求項４に記載の方法。
  6. 工程（ｃ）で取得されたシグナルが、ポリメラーゼに付着された外因性標識によって生じる、請求項１に記載の方法。
  7. 工程（ａ）の生成物についてのシグナルが、工程（ｂ）の生成物についてのシグナルを検出するためにも使用される検出器によって取得される、請求項１に記載の方法。
  8. 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まず、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトと第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトとを区別する標識を含まない、請求項１に記載の方法。
  9. 工程（ｃ）後、プライミングされたテンプレート核酸のプライマーに、可逆的に終結された次の正しいヌクレオチドを加えることにより、伸長された可逆的に終結されたプライマーを生成する工程（ｅ）、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 工程（ａ）〜（ｃ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｆ）、をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 工程（ｅ）が、工程（ｄ）の前に行われる、請求項１０に記載の方法。
  13. 各工程が、異なる配列を有する複数のプライミングされたテンプレート核酸について行われる、請求項１に記載の方法。
  14. 複数のプライミングされたテンプレート核酸が、アレイに付着されている、請求項１３に記載の方法。
  15. 工程（ａ）の生成物の検査が、工程（ｂ）の前に行われる、請求項１に記載の方法。
  16. （ｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第３の混合物と接触させる工程であって、第３の混合物は、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
    （ｉｉ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を安定化する条件下、テンプレートのあるヌクレオチド位置で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの第４の混合物と接触させる工程であって、第４の混合物は、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；並びに
    （ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）の生成物を、プライミングされたテンプレート核酸、ポリメラーゼ及び次の正しいヌクレオチドを含む三元複合体によって生成されたシグナルについて検査する工程であって、工程（ｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第２及び第４の塩基タイプについて曖昧であり、工程（ｉｉ）の生成物について取得されたシグナルは、第３及び第４の塩基タイプについて曖昧である工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  17. （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、第１及び第２の混合物と順次接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている工程；
    （ｂ）第１及び第２の混合物又はその生成物を別個に検査して、三元複合体を検出する工程；並びに
    （ｃ）プライミングされたテンプレート核酸分子の次の正しいヌクレオチドを同定する工程であって、２つの混合物で三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドは、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される工程
    を含む、核酸検出方法。
  18. 第１の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第１の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 第３の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第３の混合物が、第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 第４の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第４の混合物が、第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項１８に記載の方法。
  21. 第１の混合物が、第３及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第２の混合物が、第２及び第４の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第３の混合物が、第１及び第３の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠き、第４の混合物が、第１及び第２の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを欠く、請求項２０に記載の方法。
  22. 第１の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、及び第１の混合物が、第３又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、請求項１７に記載の方法。
  23. 第２の混合物が、第１の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第２の混合物が、第２又は第４の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 第３の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第３の混合物が、第２の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第３の混合物が、第１又は第３の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 第４の混合物が、プライミングされたテンプレート核酸と接触し、第４の混合物が、第３の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイト及び第４の塩基タイプの標識ヌクレオチドコグネイトを含み、第４の混合物が、第１又は第２の塩基タイプの非標識ヌクレオチドコグネイトを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 工程（ａ）が、プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体の安定化条件下、少なくとも４つの混合物と順次接触させることを含み、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びプライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプの少なくとも２つについてのヌクレオチドコグネイトを含み、混合物は、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトで異なっている、請求項１７に記載の方法。
  27. 混合物の少なくとも２つで三元複合体が検出される場合、次の正しいヌクレオチドが、４つの異なる塩基タイプのうちの１つのコグネイトとして同定される、請求項２６に記載の方法。
  28. 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ２つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項２７に記載の方法。
  30. 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸の４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも３つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項２７に記載の方法。
  31. （ａ）プライミングされたテンプレート核酸を、三元複合体を形成するために一連の混合物と接触させる工程であって、混合物はそれぞれ、ポリメラーゼ及びテンプレート核酸の次のテンプレート位置に存在する疑いのある少なくとも２つの異なる塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む工程；
    （ｂ）一連の混合物によって形成される三元複合体について次のテンプレート位置を監視する工程であって、シグナル状態は、それぞれの個々の混合物により次のテンプレート位置で形成される三元複合体の存在又は非存在を示し、それにより、次のテンプレート位置についての塩基呼び出しを符号化する一連のシグナル状態を決定する工程；並びに
    （ｃ）一連のシグナル状態を復号して、次のテンプレート位置についての正しい塩基呼び出しと、塩基呼び出しにおける誤りとを区別する工程
    を含む、核酸配列を決定する方法。
  32. 一連のシグナル状態が、誤り訂正符号を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 一連の混合物が３つの混合物からなり、一連のシグナル状態が３つの数字で表され、それぞれの数字が混合物から得られたシグナル状態を表している、請求項３２に記載の方法。
  34. シグナル状態がそれぞれ二進数字によって表され、誤り訂正符号が反復符号を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. ３つの数字間の多数決によって無効な塩基呼び出しを訂正することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 一連の混合物が４つの混合物からなり、一連のシグナル状態が４つの数字で表され、それぞれの数字が混合物から得られたシグナル状態を表している、請求項３２に記載の方法。
  37. シグナル状態がそれぞれ三進数字によって表され、誤り訂正符号がハミング符号を含み、有効な塩基呼び出し間のハミング距離が３である、請求項３６に記載の方法。
  38. 無効な塩基呼び出しを、無効な塩基呼び出しの符号に最も近いハミング距離を有する符号を持つ有効な塩基呼び出しに訂正することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 一連の混合物が５つの混合物からなり、一連のシグナル状態が５つの数字で表され、それぞれの数字が混合物から得られたシグナル状態を表している、請求項３２に記載の方法。
  40. シグナル状態がそれぞれ二進数字によって表され、誤り訂正符号がハミング符号を含み、それぞれの有効な塩基呼び出しが他の有効な塩基呼び出しと３つの数字で異なる、請求項３９に記載の方法。
  41. 無効な塩基呼び出しを、無効な塩基呼び出しの符号に最も近いハミング距離を有する符号を持つ有効な塩基呼び出しに訂正することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 一連のシグナル状態の復号が、塩基呼び出しを無効な塩基呼び出しとして同定する、請求項３１に記載の方法。
  43. 無効な塩基呼び出しを、次のテンプレート位置のための有効な塩基呼び出しとなるように訂正することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 誤りの訂正が、工程（ａ）又は（ｂ）において、一連のシグナル状態における疑いのあるシグナル状態を、異常と相関させること及び疑いのあるシグナル状態に変化を有する予測される一連のシグナル状態を有する塩基呼び出しを選択することを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 工程（ｂ）の異常が、所定の閾値を下回るシグナル対ノイズ比、所定の閾値を下回るシグナル、所定の閾値を上回るシグナル、所定の閾値を上回るノイズ、及び検出器不具合からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 工程（ａ）の異常が、流体送達不具合、温度制御不具合及び所定の閾値を下回る試薬の品質からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  47. 一連のシグナル状態が、反復符号、ハミング符号、線形符号又はパリティ符号を含む、請求項３１に記載の方法。
  48. シグナル状態がそれぞれ二進数字によって表される、請求項３１に記載の方法。
  49. 二進数字が、（ｉ）シグナルの存在及び非存在についての記号；（ｉｉ）２つの異なる波長で放射されるシグナルについての記号；（ｉｉｉ）２つの異なる強度を有するシグナルについての記号；又は（ｉｖ）２つの異なる波長での励起に起因するシグナルについての記号を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. シグナル状態がそれぞれ三進数字によって表される、請求項３１に記載の方法。
  51. 三進数字が、（ｉ）３つの異なる波長で放射されるシグナルについての記号；（ｉｉ）３つの異なる強度を有するシグナルについての記号；又は（ｉｉｉ）３つの異なる波長での励起に起因するシグナルについての記号を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸中にある疑いのある４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ３つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項３１に記載の方法。
  53. 混合物がそれぞれ、プライミングされたテンプレート核酸中にある疑いのある４つの異なる塩基タイプのうちの少なくとも２つでありかつ２つ以下の塩基タイプのヌクレオチドコグネイトを含む、請求項３１に記載の方法。
  54. 混合物が、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトの存在又は非存在で異なっている、請求項３１に記載の方法。
  55. 混合物が、少なくとも１タイプのヌクレオチドコグネイトに付着された標識の数又はタイプで異なっている、請求項３１に記載の方法。
  56. （ｄ）工程（ｂ）後のプライミングされたテンプレート核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを加え、それにより伸長プライマーを生成する工程
    をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  57. 伸長プライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  58. プライマーに加えられる次の正しいヌクレオチドが、可逆的に終結されたヌクレオチドである、請求項５６に記載の方法。
  59. 伸長された可逆的に終結されたプライマーを含むプライミングされたテンプレート核酸について工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 工程（ａ）〜（ｄ）が繰り返された後に、伸長された可逆的に終結されたプライマーから可逆的終結部分を除去する工程（ｅ）、をさらに含む、請求項５９に記載の方法。
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