JP6612905B2 - 薬剤のミトコンドリア輸送のためのナノ粒子 - Google Patents

Description

分野
本開示は、ミトコンドリアに薬剤を輸送するように構成されたナノ粒子、ならびに診断的および治療的使用を含む、その使用方法に関する。

政府支援に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ）からの助成金第Ｐ３０ＧＭ０９２３７８号の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

関連出願
本出願は、２０１２年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６００，０８８号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、本開示と矛盾しない範囲で、その内容全体が本明細書に組み込まれる。

ミトコンドリアの機能障害は、癌、神経変性および神経筋疾患、肥満症および糖尿病を含む、種々の障害に関与する可能性がある。そのような疾患の治療における主要な１つの課題は、有効な薬物の開発ではなく、むしろミトコンドリアへの薬物の分布である。毒性を回避しながら薬物をミトコンドリアに十分な量送達する能力が、依然として課題となっている。

概要
本開示は、とりわけ、ミトコンドリアに薬剤を輸送するように構成されたナノ粒子について記載する。細胞質または細胞の他の細胞小器官とは対照的に、ミトコンドリアに薬剤を輸送することにより、ミトコンドリア中の薬剤の相対濃度が増大して、他の部位における効果が低下する一方、ミトコンドリアに対する薬剤の効果が増強する可能性がある。したがって、副作用または毒性が低下する一方、効果が増強する可能性がある。ミトコンドリアに送達される薬剤は、治療薬、診断薬等であってもよい。

本明細書に記載するように、ナノ粒子のサイズおよび表面電荷密度は、ナノ粒子がミトコンドリアに標的化する能力に影響を及ぼす。例えば、約２００ナノメートル以下の直径を有するナノ粒子は、約２００ナノメートル超の直径を有するナノ粒子よりも、ミトコンドリアにより容易に蓄積することが見出されている。約０以上のゼータ電位を有するナノ粒子は、約０未満のゼータ電位を有するナノ粒子よりも、ミトコンドリアにより容易に蓄積することが見出されている。

実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、疎水性コアおよびこのコアを包囲する親水性層を含む。ナノ粒子はまた、ミトコンドリア標的化部分を含む。ナノ粒子は、約２００ナノメートル以下の直径を有し、かつ約０ｍＶ以上のゼータ電位、例えば、約１ｍＶ以上、約７ｍＶ以上、約２０ｍＶ以上、約２５ｍＶ以上、約３０ｍＶ以上、約３４ｍＶ以上、約３５ｍＶ以上等のゼータ電位を有する。そのようなナノ粒子は、ナノ粒子に結合した薬剤のミトコンドリアへの標的化を可能にすることができ、ナノ粒子が１つまたは複数の治療薬を含む実施形態では、ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患の治療を可能にすることができる。

先のナノ粒子、イメージング方法論、治療法等に関する、本明細書に提示の種々の実施形態の１つまたは複数における利点は、添付の図面と併せて読めば、以下の詳細な説明に基づいて、当業者には容易に明らかになろう。

ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨ、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ、およびＱＤ−コンジュゲートポリマーの合成に関する反応スキームを図示する概略図である。 ペイロードとして使用されるミトコンドリア作用治療薬を含む、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨおよびＰＬＧＡ−ＣＯＯＨとＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとのブレンドによる、標的化ナノ粒子および非標的化ナノ粒子の構築を図示する概略図である。 ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとＰＬＧＡ−ＣＯＯＨとのブレンドに由来するナノ粒子のサイズおよびゼータ電位の変動を示す棒グラフである。＊１００％ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨに由来するナノ粒子は不安定であり、ナノ粒子の直径は、バッチ調製に応じて、７００ｎｍ〜１０μｍの範囲を変動する。 ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨとのブレンドによるナノ粒子のサイズおよびゼータ電位の変動を示す棒グラフである。 標的化ブレンドナノ粒子および非標的化ブレンドナノ粒子のＴＥＭ画像である。ＱＤ−ブレンドナノ粒子を除くすべてのＴＥＭ試料は、画像化の前に、滅菌２％（重量／容量）酢酸ウラニル水溶液で１５分間染色した。 図６Ａは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおける、電荷が異なるナノ粒子（０．５ｍｇ／ｍＬ）に伴う、１２時間後における、培地中へのＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌を示す棒グラフであり、図６Ａは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおける、サイズが異なるナノ粒子（０．５ｍｇ／ｍＬ）に伴う、１２時間後における、培地中へのＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌を示す棒グラフである。 図７Ａは、赤い蛍光の標的化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ／ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤブレンドナノ粒子の細胞内局在を示す細胞の画像であり、図７Ｂは、赤い蛍光の非標的化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨ／ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤブレンドナノ粒子の細胞内局在を示す細胞の画像である。ＨｅＬａ細胞を、１０μＭの標的化ナノ粒子（直径７９ｎｍ；ゼータ電位２７．４ｍＶ）および非標的化ナノ粒子（直径７９ｎｍ；ゼータ電位−２６．５ｍＶ）に４時間曝露した。次いで、細胞をミトコンドリアマーカーのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して固定し、広視野蛍光顕微鏡により観察した。マージした画像およびより高倍率の画像では、ミトコンドリア染色（緑）と標的化ナノ粒子（赤）との効果的な重なりを示す。非標的化ナノ粒子では、顕著な重なりは観察されなかった。 図８Ａは、ＨｅＬａ細胞における、標的化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ／ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧＱＤブレンドナノ粒子の時間依存的取り込みの共焦点画像である。 図８Ｂは、ＨｅＬａ細胞における、非標的化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨ／ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤブレンドナノ粒子の時間依存的取り込みの共焦点画像である。リソソームは、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔリソソーム−ＧＦＰ、ＢａｃＭａｍ ２．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（緑）で染色した。 ＨｅＬａ細胞における、ＩＣＰ−ＭＳ分析による、標的化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧＴＰＰ／ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤブレンドナノ粒子のミトコンドリアおよびサイトゾルの分布を示す棒グラフである。図９Ａは、ナノ粒子の取り込みに対するサイズの効果を示す棒グラフである。図９Ｂは、サイズが異なるナノ粒子の全体的な細胞取り込みを示す棒グラフである。図９Ｃは、ナノ粒子の細胞輸送に対するゼータ電位の効果を示す棒グラフである。図９Ｄは、ゼータ電位が異なるナノ粒子の全体的な細胞取り込みを示す棒グラフである。 図１０は、Ａβ−誘導細胞毒性に対する、標的化クルクミンナノ粒子、非標的化クルクミンナノ粒子、および遊離クルクミンによる処理の後における、ＩＭＲ−３２神経芽細胞腫細胞の生存パーセントに関する効果を示す棒グラフである。アスタリスクは、Ｔｕｋｅｙの事後検定と一元配置分散分析による、標的化クルクミンナノ粒子、非標的化クルクミンナノ粒子、および遊離クルクミンの間の有意差（Ｐ＜０．００１）を表わす。 図１１Ａは、標的化ＬＮＤナノ粒子、非標的化ＬＮＤナノ粒子、遊離ＬＮＤの細胞毒性プロファイルを示す棒グラフであり、図１１Ｂは、ＨｅＬａ細胞における、標的化α−ＴＯＳナノ粒子、非標的化α−ＴＯＳナノ粒子、遊離α−ＴＯＳの細胞毒性プロファイルを示す棒グラフであり、図１１Ｃは、ＨｅＬａ細胞における、空の標的化ナノ粒子および空の非標的化ナノ粒子の細胞毒性プロファイルを示す棒グラフである。 図１２Ａは、マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞が、１μＭの標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、非標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、および遊離２，４−ＤＮＰの存在下、７日間で、脂肪細胞に分化したことを示す棒グラフであり、図１２Ｂは、マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞が、４μＭの標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、非標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、および遊離２，４−ＤＮＰの存在下、７日間で、脂肪細胞に分化したことを示す棒グラフであり、図１２Ｃは、マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞が、２５μＭの標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、非標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、および遊離２，４−ＤＮＰの存在下、７日間で、脂肪細胞に分化したことを示す棒グラフであり、図１２Ｄは、マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞が、１００μＭの標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、非標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子、および遊離２，４−ＤＮＰの存在下、７日間で、脂肪細胞に分化したことを示す棒グラフである。非分化細胞および完全分化細胞を、対照として使用した。細胞内脂質をＡｄｉｐｏＲｅｄ（Ｌｏｎｚａ）で染色し、脂質蓄積パーセントを算出した。７日目における、脂肪細胞分化の阻害を示す。Ｔｕｋｅｙの事後検定と一元配置分散分析を使用して、統計分析を行った。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。同様の結果が２つの独立した実験から得られた。ｎｓ、有意差なし。 図１２Ａ〜Ｄに提示する結果を異なる型式で示すグラフである。 図１４は、ラットにおける、標的化ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布および薬物動態を示すグラフである。 図１５は、ラットにおける、標的化ナノ粒子の薬物動態データを示す表である。

詳細な説明
概略図面では、尺度は必ずしも同じではない。図中で使用される同様の番号は、同様の構成要素、工程等を指す。しかしながら、所与の図で構成要素を指すための番号の使用は、同じ番号で標識した別の図の構成要素を限定することを意図するものではないことは、理解されよう。加えて、構成要素を指す異なる番号の使用は、異なる番号付けがなされた構成要素が同じかまたは同様でありえないことを示すことを意図するものではない。

以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成し、かつ装置、システム、および方法のいくつかの具体的な実施形態を図示する添付図面に言及する。他の実施形態が企図され、本開示の範囲または精神から逸脱することなくなされうることを理解されたい。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味に解釈されるべきではない。

本明細書で使用する科学用語および技術用語はすべて、特に明記されない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本明細書に提供する定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語についての理解を容易にするためであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他で明確に指示されない限り、複数の指示対象を有する実施形態も包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、用語「または」は、一般には、その内容が他で明確に指示されない限り、「および／または」を含めた意味で使用される。

本明細書で使用する場合、「有する（ｈａｖｅ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、オープンエンドの意味で使用され、一般には、「含むが、それに限定されない」を意味する。「から本質的になる」、「からなる」等は、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）に包含されることが理解されよう。

本明細書で使用する場合、「疾患」は、正常な機能を損なう、生物またはその１つまたは複数の部分の状態を意味する。本明細書で使用する場合、疾患という用語は、疾患、障害、症状、機能障害等の用語を包含する。

本明細書で使用する場合、「治療する」等は、疾患の１つまたは複数の徴候を治癒、予防、または寛解することを意味する。

本明細書で使用する場合、ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患とは、ミトコンドリア上またはその内部への治療的作用によって、例えば、ミトコンドリアに治療薬を送達し、その薬剤がミトコンドリア上またはその中の１つまたは複数の分子と相互作用することによって、治療することができる疾患である。

本明細書で使用する場合、「疎水性」化合物は、水に不溶であるか、１ミリグラム／リットル未満の水溶解性を有する化合物である。

本明細書で使用する場合、「親水性」化合物は、水溶性であるか、１ミリグラム／リットルを超える水溶解性を有する化合物である。

本明細書で使用する場合、「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合している（ｂｏｕｎｄ）」等は、化学実体が任意の適切なタイプの結合、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力等により連結されていることを意味する。「結合する」、「結合している」等は、本明細書において、「結合する（ａｔｔａｃｈ）」、「結合している（ａｔｔａｃｈｅｄ）」と互換的に使用される。

本明細書で使用する場合、ナノ粒子のコアに「結合している」分子または部分は、コア中に埋め込まれているか、コア内部に含有されているか、コアの少なくとも一部を形成する分子に結合しているか、コアに結合した分子に結合しているか、またはコアに直接結合している場合がある。

本明細書で使用する場合、化合物の「誘導体」は、それがその誘導体となる化合物に構造上類似している化合物である。多くの誘導体は、機能的誘導体である。すなわち、誘導体は、一般に、それがその誘導体となる化合物に類似した所望の機能を有する。例として、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）は、ミトコンドリア中に蓄積することができるか、またはそれが結合している化合物または複合体（ナノ粒子など）を蓄積させることができるため、ミトコンドリア標的化部分として本明細書に記載される。したがって、ＴＰＰの機能的誘導体は、ＴＰＰと同様の濃度で（例えば、約１０倍濃度範囲内など、約１００倍濃度範囲内で）、ミトコンドリア中に蓄積することができるか、それが結合している化合物または複合体を蓄積させることができる、ＴＰＰの誘導体である。

本明細書に記載するナノ粒子は、実施形態では、疎水性コア、コアを包囲する親水性層、および１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分、ならびに１つまたは複数の診断薬または１つまたは複数の治療薬を含む。実施形態では、造影剤または治療薬は、コア内に含有されているか埋め込まれている。ナノ粒子が治療薬を含む場合、好ましくは、薬剤は所望の速度でコアから放出される。実施形態では、コアは生分解性であり、コアが分解または侵食されるにつれて、薬剤が放出される。標的化部分は、好ましくは、細胞成分との相互作用に利用可能なように、またはナノ粒子の表面特性に影響を及ぼすように、コアから外側に向かって伸びており、この相互作用または表面特性は、ミトコンドリアに優先的に分布することを促進する。標的化部分は、コアに拘束されていても、またはコアと相互作用する成分に拘束されていてもよい。

Ｉ．コア
ナノ粒子のコアは、任意の適切な１つまたは複数の成分から形成することができる。好ましくは、コアは、疎水性ポリマーまたはポリマーの疎水性部分などの疎水性成分から形成される。コアは、加えてまたは代替的に、疎水性コアおよび親水性外表面を有する粒子に水性環境中で自己集合しうる、疎水性部分および親水性部分を有するブロックコポリマーを含むことができる。実施形態では、コアは１つまたは複数の生分解性ポリマーまたは生分解性部分を有するポリマーを含む。

任意の適切な合成または天然の生体吸収性ポリマーを使用することができる。そのようなポリマーは、当業者により認識可能であり、かつ同定可能である。合成の生分解性ポリマーの非限定例としては、ポリ（アミド）、例えば、ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）；ポリ（エステル）、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、およびポリ（カプロラクトン）；ポリ（無水物）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（カーボネート）；およびそれらの化学誘導体（置換、化学基（例えば、アルキル、アルキレン）の付加、水酸化、酸化、および当業者によりルーチン的になされる他の修飾）、フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲン、およびヒアルロン酸、コポリマー、ならびにそれらの混合物が挙げられる。これらおよび他の適切なポリマーの特性および放出プロファイルは公知であるか、または容易に確認可能である。

本明細書に記載する種々の実施形態では、コアはＰＬＧＡを含む。ＰＬＧＡは、送達および所望の速度での治療薬の放出に使用される、周知でかつ十分研究されている疎水性の生分解性ポリマーである。

好ましくは、コアを形成するために使用されるポリマーの少なくとも一部は、疎水性部分および親水性部分を有する両親媒性である。疎水性部分はコアを形成することができるが、一方、親水性領域は、ナノ粒子が免疫系による認識を回避し、かつ血液循環の半減期を増大させる助けとなる、コアの包囲層を形成することができる。両親媒性ポリマーの例としては、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを有するブロックコポリマーが挙げられる。実施形態では、コアは、ブロックコポリマーの疎水性部分、疎水性ポリマー、またはそれらの組合せから形成される。

疎水性ポリマー対両親媒性ポリマーの比を変えて、ナノ粒子のサイズを変えることができる。実施形態では、疎水性ポリマー対両親媒性ポリマーの比を大きくすると、より大きな直径を有するナノ粒子が得られる。疎水性ポリマー対両親媒性ポリマーの任意の適切な比を使用することができる。実施形態では、ナノ粒子は、両親媒性ポリマー対疎水性ポリマーの５０／５０重量比を含むか、または親水性ポリマーよりも多くの両親媒性ポリマーを含む比、例えば、約２０／８０比、約３０／７０比、約４０／６０比、約５５／４５比、約６０／４０比、約６５／４５比、約７０／３０比、約７５／３５比、約８０／２０比、約８５／１５比、約９０／１０比、約９５／５比、約９９／１比、または約１００％の両親媒性ポリマーを含む。

実施形態では、疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡ、例えば、ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨまたはＰＬＧＡ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ＴＰＰを含む。実施形態では、両親媒性ポリマーは、ＰＬＧＡおよびＰＥＧ、例えば、ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む。両親媒性ポリマーは、分枝した親水性部分を有する樹枝状ポリマーであってもよい。分枝状ポリマーは、２つ以上の末端を有するため、分枝した親水性ポリマー尾部の末端に２つ以上の部分が結合できる可能性がある。

本明細書に記載するように、直径が約２５０ｎｍ以下、例えば、約２００ｎｍ以下のナノ粒子は、一般に、直径が約２５０ｎｍ超または約２００ｎｍ超のナノ粒子よりも効率的に、ミトコンドリアに標的化される。実施形態では、ミトコンドリア標的化に有効なナノ粒子の直径は、約１９０ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、または約１０ｎｍ以下である。実施形態では、ナノ粒子の直径は、約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ等である。

ＩＩ．コアを包囲する親水性層
本明細書に記載するナノ粒子は、場合によっては、親水性コアを包囲する親水性層を含むことができる。親水性層は、ナノ粒子が免疫系による認識を回避するのを助けることができ、かつナノ粒子の血液循環半減期を増大させることができる。

上記に示すように、親水性層は、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを有するブロックコポリマーなどの両親媒性ポリマーの親水性部分によって、全体的にまたは部分的に形成することができる。

任意の適切な親水性ポリマーまたは両親媒性ポリマーの親水性部分は、親水性層またはその一部を形成することができる。親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分は、線状または分枝状または樹枝状のポリマーであってもよい。適切な親水性ポリマーの例としては、多糖類、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリメチレンオキシド等が挙げられる。

実施形態では、ブロックコポリマーの親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。実施形態では、ブロックコポリマーは、ＰＬＧＡを含む疎水性部分およびＰＥＧを含む親水性部分を含む。

親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分は、緩衝生理食塩水、例えば、ｐＨが約７．４のリン酸塩またはクエン酸塩の緩衝生理食塩水等により近似しうる生理的条件下で荷電する部分を含有することができる。そのような部分は、ナノ粒子の電荷密度またはゼータ電位に寄与することができる。ゼータ電位は、コロイド系における界面動電位に関する用語である。ゼータ電位は、直接測定可能ではないが、電気泳動度、動的電気泳動度等を使用して実験的に決定することができる。

本明細書に示すように、ゼータ電位は、ナノ粒子がミトコンドリアに蓄積する能力に関与し、ゼータ電位が高くなると、一般に、ミトコンドリア中の蓄積が増大する。実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、動的光散乱により測定すると、約０ｍＶ以上である。例えば、ナノ粒子のゼータ電位は、約１ｍＶ以上、約５ｍＶ以上、約７ｍＶ以上、約１０ｍＶ以上、約１５ｍＶ以上、約２０ｍＶ以上、約２５ｍＶ以上、約３０ｍＶ以上、約３４ｍＶ以上、約３５ｍＶ以上等でありうる。実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ〜約１００ｍＶ、例えば、約１ｍＶ〜５０ｍＶ、約２ｍＶ〜約４０ｍＶ、約７ｍＶ〜約３５ｍＶ等である。

生理的条件下で荷電しうる任意の適切な部分は、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分の一部であっても、またはそれに結合していてもよい。実施形態では、この部分は、ポリマーの末端またはポリマーの親水性部分の末端に存在する。当然、この部分は、末端以外の位置でポリマー骨格に直接的または間接的に結合していることもある。ミトコンドリア内膜を横切って維持される実質的な負の電気化学ポテンシャルにより、カチオンは、特に非局在化している場合、疎水性膜を横断し、ミトコンドリア基質中に蓄積するのに有効である。ミトコンドリア標的化を促進することが知られているカチオン性部分は、下記により詳細に論じられる。しかしながら、選択的なミトコンドリア標的化に特に有効ではないカチオン性部分が、ナノ粒子中に含まれていることも、または親水性ポリマーもしくはポリマーの親水性部分に結合していることもある。実施形態では、アニオン性部分が、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分の一部であることも、またはそれに結合していることもある。アニオン性部分またはアニオン性部分を含有するポリマーは、所望により、ゼータ電位を調整するためにナノ粒子中に含まれることがある。実施形態では、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分は、生理的水性環境中に置かれた場合、酸素アニオンを生じうるヒドロキシル基を含む。実施形態では、ポリマーは、ＯＨが生理的条件下で荷電部分として機能するＰＥＧ−ＯＨを含む。

ＩＩＩ．ミトコンドリア標的化部分
本明細書に記載するナノ粒子は、ミトコンドリアにナノ粒子を標的化する１つまたは複数の部分を含む。本明細書で使用する場合、ミトコンドリアへのナノ粒子の「標的化」は、ナノ粒子が実質的に同様の非標的化ナノ粒子よりも高濃度で、他の細胞小器官または細胞質に比較して、ミトコンドリアに蓄積することを意味する。実質的に同様の非標的化ナノ粒子は、標的化ナノ粒子と実質的に同じ相対濃度（例えば、約５％以内）で同じ成分を含むが、標的化部分を欠いている。

ミトコンドリア標的化部分は、コアの一部を形成する分子に、またはコアに結合している分子に結合させるなどの任意の適切な方法でコアに拘束することができる。実施形態では、標的化部分は、コアの一部を形成する疎水性ポリマーに結合している親水性ポリマーに結合する。実施形態では、標的化部分は、コアの一部を形成する疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの親水性部分に結合する。

標的化部分は、ポリマーの任意の適切な部分に結合してよい。実施形態では、標的化部分は、ポリマーの末端に結合している。実施形態では、標的化部分は、ポリマーの末端以外の位置で、ポリマーの骨格、または骨格に結合した分子に結合している。２つ以上の標的化部分が所与のポリマーに結合していることがある。実施形態では、ポリマーは、複数の末端を有する樹枝状ポリマーであり、標的化部分は、末端の２つ以上に結合することができる。

標的化部分が結合しているポリマーまたはその一部は、適切な官能基を有するか、または有するように修飾された標的化部分と反応して結合するための適切な官能基、例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−Ｎ₃、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｉ、−ＣＨ＝ＣＨ₂、Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨＯ等を含有することができるか、または含有するように修飾することができる。

反応タイプおよび生じうる拘束を説明するために、ポリマーに拘束された標的化部分の例を、本開示を通して提示した。しかしながら、ポリマーへの標的化部分の拘束は、いくつかの公知の化学反応プロセスのいずれかによって行うことができることを、当業者は理解するであろう。

標的化部分は、任意の適切な濃度でナノ粒子中に存在することができる。実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ試験または使用の前に最適化するために、最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に基づいて、濃度を容易に変化させることができる。実施形態では、標的化部分の表面被覆率は、約５％〜約１００％になる。

ミトコンドリア内へのナノ粒子の蓄積を容易にするための任意の適切な部分を使用することができる。ミトコンドリア内膜を横切って維持される実質的な負の電気化学ポテンシャルにより、非局在化した親油性カチオンは、疎水性膜を横断して、ミトコンドリア中に蓄積するのに有効である。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）含有化合物は、ミトコンドリア基質内に１０倍超蓄積することができる。任意の適切なＴＰＰ含有化合物は、ミトコンドリア基質標的化部分として使用することができる。ＴＰＰベースの部分の代表的な例は、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩで下記に示す構造を有しうる。

ここで、（記載の）アミンは、ナノ粒子中に組み込むためのポリマーまたは他の成分にコンジュゲートすることができる。

実施形態では、ミトコンドリア基質を標的化するための非局在親油性カチオンは、下記に記載する式ＩＶを有するローダミン１２３などのローダミンカチオンである。

ここで、（記載の）第二級アミンは、ナノ粒子中に組み込むためのポリマー、脂質等にコンジュゲートすることができる。

当然、非カチオン性化合物が、ミトコンドリア基質中に標的化し、蓄積するように機能してもよい。例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ミトコンドリア基質中にナノ粒子を標的化し蓄積するように機能することができる。任意の適切なＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、ミトコンドリア基質標的化部分として使用することができる。適切なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定例として、下記に記載する式Ｖおよび式ＶＩをそれぞれ有するＳＳ−０２およびＳＳ−３１が挙げられる。

ここで、（記載の）第二級アミンは、ナノ粒子中に組み込むためのポリマー、脂質等にコンジュゲートすることができる。

例として、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成のための反応スキームを、下記にスキームＩで示す。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＴＰＰを合成するために他のスキームを使用することができること、およびＰＬＧＡ−ＰＥＧに他のミトコンドリア標的化部分を拘束するために、またはナノ粒子の他のポリマーまたは成分に部分を拘束するために同様の反応スキームを使用することができることを理解されたい。

好ましくは、標的化部分は、ナノ粒子のコアから伸びて標的化部分の効果を促進するように、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分に結合している。

ミトコンドリア標的化部分がナノ粒子のゼータ電位を変化させうることを理解されよう。したがって、ナノ粒子のゼータ電位は、ナノ粒子に含まれる標的化部分の量を調節することにより調整することができる。ゼータ電位はまた、親水性ポリマーもしくはポリマーの親水性部分の荷電部分または親水性ポリマーもしくはポリマーに結合した荷電部分などの他の荷電部分を含めることにより調節することができる。

実施形態では、荷電部分は、ミトコンドリア標的化部分によってのみ、または実質的にミトコンドリア標的化部分によって提供される。実施形態では、荷電部分の約９５％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約９０％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約８５％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約８０％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約７５％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約７０％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約６５％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約６０％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約５５％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。実施形態では、荷電部分の約５％以上が、ミトコンドリア標的化部分により提供される。当然、ミトコンドリア標的化部分は、荷電部分の任意の適切な量またはパーセントを提供することができる。

実施形態では、ナノ粒子は、ミトコンドリア標的化部分を含む部分と、ミトコンドリア標的化部分以外の荷電部分を含むポリマーとをブレンドすることにより形成される。

ＩＶ．治療薬
本明細書に記載するナノ粒子は、任意の１つまたは複数の治療薬を含むことができる。治療薬は、ナノ粒子のコア中に埋め込まれることも、コア内に含有されることもある。好ましくは、治療薬は所望の速度でコアから放出される。コアがポリマー（ＰＬＧＡなど）または公知の放出速度を有するポリマーの組合せから形成される場合、放出速度は容易に制御することができる。

実施形態では、治療薬またはその前駆体は、標的化部分に関して上記に記載した方法で、ポリマーにまたはナノ粒子の他の成分にコンジュゲートされる。治療薬は、ナノ粒子がミトコンドリアなどの標的部位に到達したときに薬剤を放出しうるように、切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされてもよい。

治療薬は、任意の適切な濃度でナノ粒子中に存在することができる。例えば、治療薬は、ナノ粒子の約０．０１〜約３０重量％の濃度でナノ粒子中に存在することができる。

実施形態では、ナノ粒子は、ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患の治療に有用な１つまたは複数の治療薬を含む。そのような疾患には、神経変性疾患、肥満症、および癌が含まれる。ミトコンドリアの機能障害に関連しうる神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、虚血傷害、パーキンソン病、脳卒中等が挙げられる。ミトコンドリアの機能障害に関連しうる癌タイプの例としては、乳癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、リンパ腫等の癌が挙げられる。

実施形態では、ナノ粒子は、アミロイドベータの量を低減するように構成された１つまたは複数の治療薬を含む。例えば、治療薬は、クルクミン、他の抗酸化剤、葉酸、ラクモイド等であってもよい。

実施形態では、ナノ粒子は、酸化的リン酸化をＡＴＰ合成から分離するように作用する１つまたは複数のミトコンドリア脱共役剤を含む。例えば、治療薬は、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）等であってもよい。

実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数のミトコンドリア作用抗ガン剤を含む。例えば、治療薬は、（ｉ）ＢＣＬ−３タンパク質ファミリーの調節剤、例えば、ＢＣＬ−Ｘ_L、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｗ、ＭＣＬ１等に作用する化合物；（ｉｉ）代謝阻害剤、例えば、ＨＫに影響を及ぼす化合物、ＨＫ２−ＶＤＡＣ相互作用に影響を及ぼす化合物、ＰＤＫ阻害剤、ＬＤＨ−Ａに影響を及ぼす化合物、脂肪酸シンターゼに影響を及ぼす化合物、ＡＴＰシトレートリアーゼに影響を及ぼす化合物、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤等；（ｉｉｉ）ＶＤＡＣ標的化薬剤またはＡＮＴ標的化薬剤；（ｉｖ）ＲＯＳ調節因子、例えば、ＳＯＤ阻害剤、ＧＳＨ阻害剤、ＧＰＸ阻害剤等；（ｖ）ＨＳＰ９０阻害剤；または（ｖｉ）同種のもの、であってもよい。具体的なミトコンドリア作用抗ガン剤の例としては、ロニダミン（ＬＮＤ）、α−トコフェロールコハク酸エステル（α−ＴＯＳ）、ジクロロ酢酸、Ａ−３８５３５８、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、ＡＴ−１０１、２−アミノ−６−ブロモ−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈ−クロメン−３−カルボキシレート（ＨＡ１４−１）、オブリメルセン、オバトクラックス、ゴシポール、ジャスモン酸メチル、ジクロロ酢酸、ＨＫ２ペプチド、ＬＤＨ−Ａ ｓｈＲＮＡ、オリスタット、ＳＢ−２０４９９０、ソラフェンＡ、４−（Ｎ−（ｓ−グルタチオニルアセテート）アミノフェニルアルゼノキシド（ＧＳＡＯ）、クロドロネート、ＰＫ１１１９５、メナジオン、β−ラパコン、ＣＤ４３７、ガミトリニブス（ｇａｍｉｔｒｉｎｉｂｓ）、８−（２−クロロ−３，４，５−トリメトキシベンジル）−２−フルオロ−９−（ペンタ−４−ニル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵ２４Ｆｃｌ）、（８−（６−ブロモベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９−（ペンタ−４−イニル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵ−Ｈ５８）、８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９−（３−イソプロピルアミノ）プロピル−９Ｈ−プリン−６−アミン（ＰＵ−Ｈ７１）、シェファーディン（ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ）、レセルバトロール（ｒｅｓｅｒｖａｔｒｏｌ）、２−メトキシエストラジオール、テトラチオモリブダート（ＡＴＮ−２２４）、ブチオニン スルホキシイミン、ジメチルアミノ−パルテノライド（ＤＭＡＰＴ）、パルテノライド、イメキゾン類、マンガホジピール、メナジオン、モテクサフィンガドリニウム、ＰＥＩＴＣ、エレスクロモル（ｅｌｅｓｃｏｍｏｌ）（ＳＴＡ−４７８３）、全トランス型レチノイン酸、６−［３−（１−アダマンチル）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ナフタレンカルボン酸（ＣＤ４３７）、（Ｅ）−３−（４’−ヒドロキシ−３’−アダマンチルビフェニル−４イル）アクリル酸（ＳＴ１９２６）、３−ブロモピルベート、酪酸、リスベラトロール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、三酸化亜ヒ酸、ベツリン酸等が挙げられる。例えば、Ｆｕｌｄａ ｅｔ ａｌ．，ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ− Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｖｏｌｕｍｅ ９：４４７（Ｊｕｎｅ ２０１０）に記載される、１つまたは複数の化合物または化合物クラスを使用することができる。

Ｖ．造影剤
本明細書に記載するナノ粒子は、イメージング、視覚化、または診断を目的とする１つまたは複数の造影剤を含むことができる。実施形態では、治療用ナノ粒子がミトコンドリアに適切に輸送されていることを確認するためにイメージングを実施する。任意の適切な造影剤を使用することができる。実施形態では、造影剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に適しており、例えば、酸化鉄（ＩＯ）ナノ結晶またはガドリニウム錯体がある。実施形態では、造影剤は、ｅｘ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングに適しており、例えば、蛍光色素の量子ドット（ＱＤ）（蛍光）、ｃｄｏｔ、ｐｄｏｔ等がある。実施形態では、ナノ粒子は、ＭＲＩ用造影剤および蛍光光学イメージング用薬剤の両方を含む。

造影剤は、任意の適切な方法でナノ粒子に組み込むことができる。実施形態では、造影剤は、コア中に組み込まれるか、またはコア内に含有される。実施形態では、造影剤は、ポリマーまたはナノ粒子の他の成分に拘束される。そのような拘束は、標的化部分など、ナノ粒子の他の成分に関して上記に記載したように行うことができる。

造影剤は、任意の適切な量でナノ粒子中に存在することができる。実施形態では、造影剤は、ナノ粒子の約０．０５重量％〜約３０重量％で、ナノ粒子中に存在する。

ＶＩ．ナノ粒子の合成
本明細書に記載するナノ粒子は、任意の適切なプロセスにより合成または構築することができる。好ましくは、ナノ粒子はプロセスの変動を最小化するために単一工程で構築される。単一工程プロセスは、ナノ沈殿および自己集合を含むことができる。

一般に、有機溶媒、好ましくは沈殿用に使用される水性溶媒に混和性の溶媒の中に、疎水性成分を溶解または懸濁することによって、ナノ粒子を合成または構築することができる。実施形態では、有機溶媒としてアセトニトリルを使用するが、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン等の任意の適切な溶媒を使用してもよい。親水性成分は、例えば水、４重量％エタノール等の適切な水性溶媒中に溶解される。有機相溶液を水相溶液に滴下して加え、疎水性成分をナノ沈殿させ、水性溶媒中でナノ粒子の自己集合を可能にすることができる。

ナノ粒子を形成させる適切な条件を決定するためのプロセスは、以下のように行うことができる。手短に言えば、機能を有するポリマーおよび他の成分を、それが含まれている場合または適切な場合、有機溶媒混合物中に同時溶解させることができる。この溶液を、高温の（例えば、６５℃）水性溶媒（例えば、水、４重量％エタノール等）に滴下して加えることができ、その後、溶媒を蒸発させて、ＰＥＧなどの親水性ポリマー成分により包囲された疎水性コアを有するナノ粒子を生成させる。ひとたび、高（例えば、＞７５％）レベルの標的化部分表面負荷が達成される一連の条件が得られたならば、造影剤または治療薬をナノ粒子のナノ沈殿および自己集合に含めることができる。

マニュアル混合により所望どおりに結果を再現できない場合には、ミクロ流体チャネルを使用してもよい。

ナノ粒子は、周知または公開の方法を使用して、それらのサイズ、電荷、安定性、ＩＯおよびＱＤ負荷、薬物負荷、薬物放出動力学、表面形状、および安定性について特徴づけることができる。

（ａ）ポリマー溶液の組成を制御すること、および（ｂ）混合時間、温度、および水対有機溶媒比などの混合条件を制御することによって、ナノ粒子の特性を制御することができる。ナノ粒子の特性が変動する可能性は、合成に必要とされる処理の数と共に増大する。

生成するナノ粒子のサイズは、疎水性コア成分対両親媒性シェル成分の比を変更することによって、変化させることができる。ナノ粒子のサイズはまた、ポリマー長の変更により、混合時間の変更により、また有機対その相の比の調節により制御することができる。異なる長さのＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧに由来するナノ粒子に関する先の実験により、ナノ粒子のサイズは、短いポリマー（例えば、ＰＬＧＡ₃₀₀₀−ＰＥＧ₇₅₀）についての最小約２０ｎｍから、長いポリマー（例えば、ＰＬＧＡ_100,000−ＰＥＧ_10,000）ついての最大約１５０ｎｍまで増大することが示唆される。したがって、ポリマーの分子量は、サイズを調節するのに役立つ。

ナノ粒子の表面電荷は、適切に荷電した末端基を有するポリマーを混合することにより制御することができる。加えて、組成および表面化学は、異なる親水性ポリマー長のポリマー、分枝状親水性ポリマーを混合することによって、または疎水性ポリマーを加えることによって制御することができる。

ナノ粒子は、ひとたび形成されたならば、遠心分離、遠心限外濾過等により収集および洗浄することができる。凝集が生じる場合には、ナノ粒子について、透析による精製、低速で長時間の遠心分離による精製、界面活性剤の使用による精製等を行うことができる。

ひとたび収集されたならば、いかなる残存溶媒も除去することができ、また粒子を乾燥することができるが、これは、成分のいかなる時期尚早の分解または放出も最小化する助けとなる。ナノ粒子は、マンニトールなどの増量剤の使用により凍結乾燥しても、またはそうでなければ使用前の保存用に調製してもよい。

治療薬は、その溶解性に応じて、有機相中に置いても水相中に置いてもよいことは理解されよう。

本明細書に記載するナノ粒子は、ナノ粒子中への包含に適しているとして当技術分野で一般に知られているかまたは理解されている、リン脂質成分またはコレステロール成分など、任意の他の適切な成分を含むことができる。同時係属特許出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５３３０７号明細書は、ナノ粒子中に含まれうる、いくつかのさらなる成分ついて記載している。同時係属特許出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５３３０７号明細書は、本開示と矛盾しない範囲で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５３３０７号明細書に開示されたナノ粒子は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を標的化する部分など、アポトーシス細胞にナノ粒子を標的化する標的化部分を含む。標的化部分は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートしている。そのような部分には、種々のポリペプチドまたは亜鉛−２，２’−ジピコリルアミン（Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ）配位錯体が含まれる。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、アポトーシス細胞標的化部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートしたアポトーシス細胞標的化部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、ＰＳ標的化部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートしたＰＳ標的化部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、ＰＳ−ポリペプチド標的化部分またはＺｎ²⁺−ＤＰＡ部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートした、ＰＳ−ポリペプチド標的化部分またはＺｎ²⁺−ＤＰＡ部分を含まないか、または実質的に含まない。

ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５３３０７号明細書に開示されたナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートした、単糖などのマクロファージ標的化部分を含む。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、マクロファージ標的化部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、ナノ粒子またはその成分にコンジュゲートしたマクロファージ標的化部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、単糖部分を含まないか、または実質的に含まない。実施形態では、本明細書に記載するナノ粒子は、ナノ粒子またはその成分にコンジュゲートした単糖部分を含まないか、または実質的に含まない。

ＶＩＩ．使用および試験
一般に、本明細書に記載するナノ粒子は、ミトコンドリアに、特に特定のミトコンドリアに標的化することができる。ナノ粒子は、ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患を視覚化、イメージング、モニタリング、診断、または治療するために使用することができる。

本明細書で生成するナノ粒子の性能および特徴は、任意の適切な方法で試験または研究することができる。例として、細胞ベースのアッセイを使用して、治療効果を評価することができる。毒性、生体内分布、薬物動態、および効力試験は、細胞またはげっ歯類もしくは他の哺乳動物で試験することができる。ゼブラフィッシュまたは他の動物モデルを、イメージングと治療を合わせた試験のために使用することができる。げっ歯類、ウサギ、ブタ等は、ナノ粒子の診断能力または治療能力を評価するために使用することができる。ナノ粒子の性能または特徴を評価するために実施しうる試験のさらなる詳細の一部を、以下に記載するが、これらの試験は、ナノ粒子の特性を最適化する目的のために使用することができる。しかしながら、他のアッセイおよび手順も容易に実施できることを当業者ならば理解されよう。

蛍光性ＱＤを封入するナノ粒子の取り込みおよび結合特性は、ＲＡＷ２６４．７細胞、Ｊ７７４細胞、ｊｕｒｋａｔ細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞などの任意の適切な細胞株で評価することができる。ナノ粒子の免疫調節的役割は、これらの細胞を種々の濃度のナノ粒子に曝露したときのサイトカインの放出を測定することによりアッセイすることができる。オプソニン化されたナノ粒子を単離するためにカラムを使用して、補体活性化を試験し、いずれの経路が誘発されるかを同定することができる；これは、例えば、Ｓａｌｖａｄｏｒ−Ｍｏｒａｌｅｓ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ｆａｒｏｋｈｚａｄ ＯＣ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０：２２３１−２２４０，（２００９）に記載されている。蛍光測定は、プレートリーダー、ＦＡＣＳ等を使用して行うことができる。ナノ粒子のサイズが生体内分布を決定する重要な因子となるので、ナノ粒子を、種々のサイズ（例えば、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、および１５０〜３００ｎｍ）に分類し、サイズに応じて試験してもよい。

ナノ粒子中に用いる治療薬に適した任意の細胞タイプを、治療効果または適切な標的化を評価するために使用することができる。当技術分野で一般に理解されているか、または知られているように、治療アウトカムまたは薬理学的アウトカムに適したアッセイを使用することができる。

生体内分布（ｂｉｏＤ）および薬物動態（ＰＫ）の試験は、ラットまたは他の適切な哺乳動物で行うことができる。ＰＫおよびｂｉｏＤ分析については、ＱＤ標識した、アポトーシス標的化、マクロファージ標的化ナノ粒子または標的化基を含まない同様のナノ粒子を、スプラーグドーリーラットに外側尾静脈注射により投与することができる。注射１〜２４時間後に、蛍光イメージングによりｂｉｏＤを最初に追跡することができる。動物を屠殺することができ；脳、心臓、腸、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉、骨、肺、リンパ節、腸管、および皮膚を摘出し、秤量し、ホモジナイズすることができ、ＩＣＰ−ＭＳを使用してＱＤ由来のＣｄを定量することができる。組織中濃度は、組織１グラム当たりの注射用量の％（％ＩＤ／ｇ）として表現することができる。血中半減期は種々の時点での血中Ｃｄ濃度から算出することができる。

ヒト使用のために有効なナノ粒子の治療投与量は、表面積または体重基準のスケーリングなど、周知の手法により動物試験から評価することができる。

以下において、代表的なナノ粒子の種々の実施形態、ナノ粒子を生成するための方法、およびナノ粒子を使用するための方法について記載する非限定例を提示する。

方法
Ａ．ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成
ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成。ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（０．７５ｇ；０．２３ｍｍｏｌ）、ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（０．５０ｇ；０．１ｍｍｏｌ）、および４−ジメチルアミノピリジン（０．０１ｇ；０．０８ｍｍｏｌ）を、７ｍＬの乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０２ｇ；０．１ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂溶液２ｍＬを、０℃で撹拌しながら反応混合物に滴下して加えた。この混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。不溶性のジシクロヘキシル尿素を濾過し、混合物を５０ｍＬの５０：５０ジエチルエーテルおよびメタノールから沈殿させた。得られた固体を４℃で１５分間、１，４００×ｇで遠心分離した。最終的な精製として、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨのメタノール溶液を繰り返し沈殿させ、冷ジエチルエーテルで洗浄し、白色固体として３０％（０．２ｇ）の収率で単離した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＨＣｌ₃−ｄ）：δ５．３［ｍ，（ＯＣＨＣＨ₃Ｃ（Ｏ）］，４．９［ｍ，（ＯＣＨ₂Ｃ（Ｏ））］，３．６［ｓ，（ＯＣＨ₂）］，１．９［ｍ，（ＣＨ₃ＣＨ）］。₁₃Ｃ−ＮＭＲ（ＣＨＣｌ₃−ｄ）：δ１６９．６，１６６．５，６６．０，６１．１，６０．９，１６．８９，１５．４６。ゲル透過クロマトグラフィー：Ｍ_n＝６，９００ｇ／ｍｏｌ、Ｍ_W＝９，２００ｇ／ｍｏｌ、Ｍ_z＝１２，３００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．３３。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨ（０．２９ｇ；０．０３ｍｍｏｌ）。（５−カルボキシペンチル）トリフェニルホスホニウムカチオン（３１）（０．１１ｇ；０．２９ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（０．００７ｇ；０．０６ｍｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解した。ＤＣＣ（０．０６ｇ；０．２９ｍｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１ｍＬ）に溶解し、０℃で撹拌しながら反応混合物に滴下して加えた。この混合物を室温で一晩攪拌し、その後、形成したいずれのジシクロヘキシル尿素も濾去した。次いで、得られた混合物に５０ｍＬの冷ジエチルエーテルを加え、ポリマーを沈殿させた。固体を４℃で１５分間、１，４００×ｇで遠心分離した。溶媒を除去し、固体を凍結乾燥した。ポリマーを９９％（０．３ｇ）の収率で白色固体として単離した。₁Ｈ−ＮＭＲ（ＣＨＣｌ３−ｄ）：δ７．９−７．６［ｍ，１５Ｈ（Ａｒ）］，５．３［ｍ，（ＯＣＨＣＨ₃Ｃ（Ｏ）］，４．９［ｍ，（ＯＣＨ₂Ｃ（Ｏ））］，３．６［ｓ，（ＯＣＨ₂）］，１．９［ｍ，（ＣＨ₃ＣＨ）］。¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＨＣｌ３−ｄ）：δ１６６．５，１３５．３，１３３．９，１３０．７，６６．０，６１．０，１６．８９，１５．４６。ＩＲ：νｃｍ−１ ３，０２９（Ｃ−Ｈ ｓｐ２），２，９４４（Ｃ−Ｈ ｓｐ３），２，２００−２，０００（Ｃ−Ｈ Ａｒ），１，７４１（Ｃ＝Ｏ）。³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＨＣｌ３−ｄ）：δ２４．３７。

Ｂ．ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤの合成
ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（０．４ｇ；８０μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（１２．４ｍｇ；８０μｍｏｌ）、およびＮＨＳ（９ｍｇ；８０μｍｏｌ）を、３ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、８μＭ ＱＤ−ＰＥＧ−ＮＨ２の２５０μＬ溶液を加えた。この混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで１００ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。得られた固体をＨ２Ｏに溶解し、一晩凍結乾燥し、次いでＤＭＦ中に再懸濁した。動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤを特性評価し、１０．１±０．１ｎｍの流体力学的径および０．３のＰＤＩを得た。

Ｃ．標的化および非標的化ナノ粒子の合成
ナノ粒子は、Ｍａｒｒａｃｈｅ ａｎｄ Ｄｈａｒ（２０１２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：１６２８８−１６２９３；Ｋｏｌｉｓｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１７９３９−１７９４４；およびＤｈａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１８５０−１８５５に全般的に記載されているナノ沈殿法により合成した。手短に言えば、アセトニトリル中のＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰを、最終ポリマー濃度５ｍｇ／ｍＬに、一定に攪拌しながらナノ純水に滴下して加えた。次いで、ナノ粒子を２時間撹拌した。有機溶媒を３回の洗浄により除去し、１００ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。ナノ粒子をナノ純水に再懸濁し、次の使用まで４℃に保存した。ナノ粒子のサイズ、ＰＤＩ、およびゼータ電位を決定するためにＤＬＳ測定を行った。サイズが調整可能なＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰナノ粒子を、ナノ沈殿法に従い、所定の比のＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（０、１０％、２０％、３５％、５０％、７０％、および９０％）とＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとをブレンドすることにより合成した。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰナノ粒子の表面電荷は、前述のナノ沈殿法に従い、所定の比のＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ（０、１５％、３５％、５０％、６５％、８０％、９０％、および１００％）とＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨとをブレンドすることにより変動させた。ＱＤ−ブレンドナノ粒子は、このナノ沈殿法に従い、最終ポリマー濃度５ｍｇ／ｍＬで、ＤＭＦ：アセトニトリル（１：９比）中のＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤ（１０ｍｍｏｌのＤＭＦ溶液）とを使用して合成した。サイズ、ＰＤＩ、およびゼータ電位を決定するためにＤＬＳ測定を行った。ナノ粒子はすべてＴＥＭを使用して特性評価した。治療薬負荷ナノ粒子の合成の場合は、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ（ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍＬ）を、所定量の治療薬（ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、最終ポリマー濃度５ｍｇ／ｍＬにアセトニトリルで希釈した。この混合物を、ナノ沈殿法に従い、一定に攪拌しながら、ナノ純水に滴下して加えた。サイズ、ＰＤＩ、およびゼータ電位を決定するためにＤＬＳ測定を行った。ポリマーのコアを溶解し、ナノ粒子中の治療薬の量を定量するためにＨＰＬＣを使用することにより、薬物負荷および封入効率を決定した。

Ｄ．細胞内区画中のナノ粒子の定量
種々のサイズおよびゼータ電位のＱＤ−ブレンドナノ粒子（１０μＭ）を、ＨｅＬａ細胞（１．５×１０⁷細胞）に１２時間内部移行させた。内部移行させた後、哺乳動物細胞用のミトコンドリア単離キットを使用してミトコンドリアおよびサイトゾルを単離した。次いで、サイトゾル画分およびミトコンドリア画分について、ＩＣＰ−ＭＳによりＱＤ中のＣｄ濃度を分析した。単離したミトコンドリア画分およびサイトゾル画分についてビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを行い、単離したタンパク質１マイクログラム当たりのＣｄ量を算出した。

Ｅ．脂肪生成アッセイ
脂肪生成を誘導するために、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を１ウェル当たり５，０００細胞の密度で９６ウェルプレート上に播種し、コンフルエンスになるまで増殖させた。２，４−ＤＮＰを負荷した標的化および非標的化ナノ粒子ならびに遊離２，４−ＤＮＰの抗脂肪生成特性を、脂肪生成アッセイの１日目にナノ粒子を内部移行させることにより評価した。また、１日目に、０．５ｍｍｏｌ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．５μＭデキサメタゾン、および２０ｎＭインスリンを添加した、１０％ＦＢＳ含有分化ＤＭＥＭ培地中で細胞を分化誘導した。３日目に、誘導培地を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよび２０ｎＭインスリンを含有するインスリン培地と交換した。処理の６日後に、製造業者の説明書に従い、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（Ｌｏｎｚａ）アッセイを使用して、細胞についてトリグリセリド蓄積を分析した。

Ｆ．生体内分布および薬物動態分析
スプラーグドーリーラットにＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＱＤナノ粒子を静脈内投与した。血漿中のＣｄレベルの経時変動、臓器分布、および排泄特性を決定した。対照ラットには生理食塩水を注射した。

Ｇ．統計
データはすべて、平均±ＳＤとして表した。標的化、非標的化、および遊離薬物の間の差は、一元配置分散分析により評価した。Ｐ＜０．０５を、統計的有意性を示すとみなした。

結果および考察
Ａ．標的化ブレンドナノ粒子の開発
ミトコンドリア取り込みに対するＰＬＧＡベースのナノ粒子のサイズ、形状、および表面電荷の重要性の理解が進むと、ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患のための標的化送達ビヒクルを開発する機会が生み出される可能性がある。本発明者らは、得られるナノ粒子のサイズおよび表面電荷が変動するように、ミトコンドリア標的化の機能を有するポリマーであるＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとＰＬＧＡ−ＣＯＯＨまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨとをブレンドして、ミトコンドリア取り込みに対するこれらの特性の効果を試験し、最適な製剤を決定した。ナノ粒子の特性が変動する可能性は、合成に必要とされる処理工程の数と共に増大する。本発明者らは、ナノ粒子合成の前にＴＰＰ標的化部分をポリマー中に組み込むことがそのような変動を最小化するであろうと予想した。ミトコンドリア内部に治療薬を高効率に送達するために、本発明者らは、ＴＰＰのコンジュゲーションを可能にする末端ＯＨ基（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨ）を有する生分解性ポリマーを合成して、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰを得た（図１）。標的化リガンドのコンジュゲーションは、ゼータ電位、サイズ、細胞取り込み、および細胞内輸送を含む、ナノ粒子の基本特性に影響を及ぼした。本発明者らは、上記に記載したナノ沈殿法を使用して、ブレンドナノ粒子を合成し（図２）、４回以上の独立したナノ沈殿実験で、再現可能な直径および表面電荷を有する標的化および非標的化ナノ粒子を得た。

Ｂ．ミトコンドリア取り込みのためのサイズおよび電荷の調整
本発明者らは、ミトコンドリア取り込みに対するサイズおよび表面電荷の効果に取り組むために、代表的かつ包括的な試験に着手した。本発明者らは、サイズおよび表面電荷は異なるが、他の特性はすべて同一かまたは実質的に同一であるナノ粒子を作製することが重要であると考えた。本発明者らは、種々の量のＰＬＧＡ−ＣＯＯＨとＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとをブレンドして、種々のサイズおよび一定の表面電荷を有するナノ粒子のライブラリーを構築した。ブレンド技術を使用して、本発明者らは、一定の表面電荷により証明されるように（図３）、ＴＰＰ部分の数を一定に維持しながら、ナノ粒子サイズを約８０〜約４１０ｎｍに調整することができた（図３）。ミトコンドリア取り込みに対する表面電荷の効果を調べるために、本発明者らは、所定量のＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨとＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰとをブレンドした。主要なスキャフォールドおよびナノ粒子サイズを変化させることなく、表面電荷を変動させることに成功した（図４）。これらのナノ粒子ライブラリーは、同様の形状の均質集団を示し（ＴＥＭ画像；図５Ａ〜Ｆ）、ミトコンドリア取り込みに対するナノ粒子のサイズおよび電荷の効果を調べることを可能にした。

Ｃ．ミトコンドリア標的化特性
ナノ粒子系の細胞取り込みプロファイルは、系の効率およびバイオアベイラビリティを反映する。細胞取り込みの定量的評価と共に、細胞内局在は、目下のナノ粒子プラットフォームの有効性の評価にとって重要である。本発明者らは、ヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞中の標的化および非標的化ナノ粒子の分布を検討するために、強固な蛍光性レポーター量子ドット（ＱＤ）を使用した。本発明者らは、ＱＤ−コンジュゲートのアミン末端ＰＥＧであるＮＨ₂−ＰＥＧ−ＱＤを使用して、細胞内区画中のナノ粒子を追跡した。ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨをＮＨ₂−ＰＥＧ−ＱＤにコンジュゲートして、トリブロックコポリマーであるＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤを得た（図１）。本発明者らは、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤとＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ、ならびにＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤとＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨとをブレンドすることより、それぞれ標的化ならびに非標的化ナノ粒子の内部移行をモニターした。処理した細胞の共焦点顕微鏡分析により、非標的化ナノ粒子よりも、標的化ナノ粒子の細胞ミトコンドリアへの取り込みが顕著に多いことが示された（図７Ａ〜Ｂ）。蛍光強度を比較すると、非標的化ナノ粒子に比較して、正に荷電した標的化ナノ粒子の全体的な取り込みが顕著に多いことが示された。ＩｍａｇｅＪ「共局在ファインダー」プラグインを使用する定量分析により、細胞ミトコンドリア中での標的化ナノ粒子とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との有意な共局在（ピアソンの相関係数、ρ＝０．５３）が明らかになった。

非標的化ナノ粒子に関しては、ナノ粒子の赤色シグナルとミトコンドリア染色は、低いρ値（ρ＝０．０３）により実証されるように、位置が異なっていた。

Ｄ．エンドソームおよびリソソーム回避特性
ナノ粒子の取り込みおよび細胞内輸送は、いくつかの競合する経路に沿って起こる。ミトコンドリアを標的化するナノ粒子の使用は、多くの場合、ナノ粒子がエンドソーム経路に取り込まれるという事実、およびエンドソームがミトコンドリア輸送に対して障害として働くという事実により限定される。本発明者らは、標的化ナノ粒子の効率的なエンドソーム回避に必要な融合特性を検討するために、初期エンドソームマーカーのＥＡＡ−１を使用して、時間依存的な取り込み試験を行った。標的化ナノ粒子については、エンドソームとの共局在が最初の１時間に観察され、２時間までに減少した。時間経過と共に、標的化ナノ粒子は完全なエンドソーム回避を示し、細胞のミトコンドリアに局在した（図７Ａ〜Ｂ）；しかしながら、非標的化ナノ粒子では、初期エンドソームとの顕著な共局在が４時間後でも観察された。標的化ナノ粒子の高度に効率的なエンドソーム回避は、これらのナノ粒子を「プロトンスポンジ」として作用させうる高い緩衝能に帰することができる。正に荷電したＰＥＧの緩衝作用によるプロトンの吸収は、エンドソーム小胞の酸性化を防止し、それによって、プロトンおよび対イオンのＡＴＰアーゼ媒介流入が増大するはずであり、次には、浸透圧膨潤、エンドソーム膜の破裂、およびナノ粒子のサイトゾルへの最終的な漏出がもたらされ、ミトコンドリア取り込みにナノ粒子が利用可能になる。

本発明者らのナノ粒子が高いエンドソーム回避能を有するという発見および標的化ナノ粒子の一部がリソソームへの輸送に関与していないという発見をさらに支持するために、本発明者らは、ナノ粒子とリソソームとの時間依存的な共局在を検討した（図８Ａ〜Ｂ）。標的化ナノ粒子については、リソソームとの共局在は時間経過につれて減少し、リソソーム回避能が示唆されたが、非標的化ナノ粒子は、リソソームおよび細胞質の両方に分布した。

Ｅ．ナノ粒子の安定性および免疫効果
種々の正に荷電したナノ粒子は、血清タンパク質との相互作用を示し、負に荷電したタンパク質の表面吸着に起因する凝集が誘発される。血清タンパク質は、ＤＭＥＭ中の１０％（容量／容量）ＦＢＳまたはＨ₂Ｏ中の１０％（容量／容量）ＦＢＳとの７日間インキュベーションにおいて、本発明者らの標的化ナノ粒子のサイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）に対して効果がなかった。この発見は、標的化ナノ粒子のゼータ電位が、ＤＭＥＭ中の１０％ＦＢＳまたはＨ₂Ｏ中の１０％ＦＢＳとの７日間の接触の後に、最小限変化したのみであり、粒子の目に見える凝集もないという観察によってさらに支持される。これらの発見は、血清中の標的化ナノ粒子の優れた安定性が、それらをｉｎ ｖｉｖｏ用途に適したものにすることを示唆する。

この操作されたナノ粒子プラットフォームは、免疫応答を誘発しないならば、ｉｎ ｖｉｖｏ用途のための治療薬を輸送するために使用することができる。血流および組織中の免疫細胞は、正に荷電したナノ粒子を貪食および排除する傾向がある。本発明者らは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおいて、炎症促進性サイトカインのＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生の点から、サイズおよび電荷が変動したナノ粒子による免疫応答をＥＬＩＳＡにより評価した。また、対照としてＬＰＳを使用した。ナノ粒子は電荷が変動しても明白な免疫応答を示さなかった；しかしながら、直径が２００ｎｍ超のナノ粒子は、ＴＮＦ−αの産生を示した（図６Ａ〜Ｂ）。これらの発見により、適切なサイズおよび電荷のナノ粒子は非免疫原性であり、全身性のｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用できることが確認される。

Ｆ．細胞内区画中の標的化ナノ粒子の定量
ミトコンドリア膜を横断するために、ナノ粒子は、一般移入細孔を通って外膜を横切り輸送される。本発明者らは、管状クリステ、小胞状クリステ、および板状クリステの複雑な構造、ならびにミトコンドリア内膜へのそれらの弱い接続により、ナノ粒子の易動度が制約され、それらの拡散が極めて複雑でサイズ依存的なプロセスになる可能性があることを予測した。内膜電位（ΔΨｍ）は、内部が負であり、正に荷電した化学種に対して電気泳動効果を及ぼすことにより、移入において主要な機能を果たす。高い正電荷を有するナノ粒子は、低い正電荷を有するナノ粒子よりも、低いΔΨｍで移入されると期待される；したがって、ＨｅＬａモデル細胞株を使用して、本発明者らは、ミトコンドリア内膜の横断における、ナノ粒子のサイズおよび電荷の効果を比較評価した（図９Ａ〜Ｄ）。本発明者らは、サイズは異なるがゼータ電位は同様の標的化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ／ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤブレンドナノ粒子を用いてＨｅＬａ細胞を処理し、次いで誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用して定量的検討を行い、細胞により内部移行されたＱＤに由来するカドミウム（Ｃｄ）量を評価した。直径８０〜３３０ｎｍのナノ粒子のミトコンドリア取り込みを評価すると、直径８０〜１００ｎｍの粒子が最大の取り込みを示す傾向があることがわかった。ナノ粒子サイズに対するサイトゾル画分およびミトコンドリア画分中のナノ粒子数を示すヒストグラムにより、ナノ粒子の細胞取り込みは、粒子サイズに極度に依存することがわかる（図９Ａ〜Ｂ）。本発明者らは、表面電荷は異なるが流体力学的径は同様のナノ粒子ライブラリーを使用して、細胞およびミトコンドリアの取り込みに対するナノ粒子表面電荷の効果を検討し、負に荷電したナノ粒子のミトコンドリア取り込みを検出せず（図９Ｃ）、また全体的な細胞取り込み（図９Ｄ）もほとんど検出しなかった。細胞取り込みは、表面電荷が１．３ｍＶに達すると増大し、表面電荷が約２２ｍＶまで一定のままであったが、ミトコンドリア取り込みは増大した。本発明者らは、表面電荷が約３４ｍＶに増大し、飽和に達するときに、細胞取り込みのもう一つのジャンプを見出した。ミトコンドリア取り込みは、より正に荷電したナノ粒子によって顕著に増大した。ナノ粒子の直径および表面電荷の効果に関するこの系統的検討は、ミトコンドリア輸送のために最適化されたナノ粒子プラットフォームの設計に有用になりうる。

Ｇ．機能障害ミトコンドリアへの治療薬の送達
この系の多用途性の概念実証として、本発明者らは、神経変性、肥満症、および癌の管理のためのミトコンドリア作用治療薬の送達を検討した。本発明者らは、ナノ沈殿法を使用して、高い負荷および封入効率で治療薬を負荷した標的化および非標的化ナノ粒子を合成した。

Ｈ．神経変性疾患への適用
アミロイド様斑により、ＡＤの神経病理学が定義される。ベータアミロイド（Ａβ）ペプチドの凝集がアミロイド様病変を形成するため、Ａβ形成の防止によるアミロイド蓄積の低減は、ＡＤに対する治療薬蓄積を改善するための魅力的なアプローチである。クルクミンは、Ａβおよびそれに関連したミトコンドリア酸化ストレスを阻害することが知られている；しかしながら、その低いバイオアベイラビリティおよび光分解が主要な問題となっている。そのような問題を念頭において、本発明者らは、光安定性を提供し、かつミトコンドリア取り込みを増強するために、標的化クルクミン負荷ナノ粒子を製剤化した。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］アッセイを使用して、２０μＭ Ａβで処理されたヒト神経芽細胞腫ＩＭＲ−３２細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生存を評価すると、非標的化クルクミンナノ粒子または遊離クルクミンと比較して、標的化クルクミンナノ粒子によるＡβに対する神経保護が増強していることが実証され（図１０）、これにより、細胞ミトコンドリアへのクルクミンの標的化された送達が説明される。

Ｉ．癌化学療法への適用
ミトコンドリアが、癌治療の具体的な標的として浮上した。本発明者らの系が癌に適用可能であることを実証するために、ミトコンドリア作用ＬＮＤおよびα−ＴＯＳを選択した。癌細胞に対するＬＮＤおよびα−ＴＯＳの選択性および効率は、細胞ミトコンドリアを標的化するそれらの能力に依存する。ＬＮＤおよびα−ＴＯＳの送達における、本発明者らの標的化ナノ粒子の有効性を評価するために、ＨｅＬａ細胞のＭＴＴアッセイを行なった。標的化ＬＮＤナノ粒子のＩＣ５０値は、非標的化ナノ粒子の約１／５、遊離形態のＬＮＤの１／１０８であり（図１１Ａ）、細胞毒性効果がより高いことが示された。より高い細胞毒性効果はまた、標的化α−ＴＯＳナノ粒子に関して、非標的化α−ＴＯＳナノ粒子または遊離α−ＴＯＳと比較して観察された。（ＩＣ５０はそれぞれ、７５±２ｎＭ、２３０±４ｎＭ、および３８１±５ｎＭ）（図１１Ｂ）。標的細胞小器官への優先的な局在化により、標的化ナノ粒子中に封入されたＬＮＤおよびα−ＴＯＳの両方の細胞毒性が説明される。空のＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰナノ粒子が高濃度においても細胞毒性効果がないという本発明者らの発見により、いかなる細胞毒性に対しても送達系または高いゼータ電位の寄与は除外される（図１１Ｃ）。

Ｊ．肥満症への可能な適用
肥満症は、ＩＩ型糖尿病、心臓血管疾患、および特定の癌タイプを含む、種々の代謝障害と関連するために世界的な健康問題になっている。現在入手可能な抗肥満症薬に付随する、限定的な有効性および望ましくない副作用のために、エネルギー代謝を調節するために細胞内部位に薬物を直接送達することができる伝達ビヒクルの開発に注目が集まっている。ヒト肥満症の治療として、ミトコンドリア脱共役剤２，４−ＤＮＰが著しい成功を収めたことにより、エネルギー消費に対する脱共役の有益な効果が、熱量摂取量の代償的な増大により圧倒されないことが実証される。しかしながら、２，４−ＤＮＰの狭い治療濃度域により、その使用が中止された。最近の研究では、ＴＰＰに共有結合的に連結された２，４−ＤＮＰが、脱共役に効果がないことが見出されている。共有結合で連結した脱共役剤の狭い治療濃度域および失敗に関する事態が、細胞ミトコンドリアにこの脱共役剤を指向させることについてのミトコンドリア標的化ナノ粒子の評価に結びついた。標的化ナノ粒子中への２，４−ＤＮＰの封入が、細胞毒性を及ぼすには不十分な低濃度で、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の分化誘導を抑制することができるか否かを調べるために、本発明者らは、１μＭ、４μＭ、２５μＭ、および１００μＭの２，４−ＤＮＰナノ粒子（図１２Ａ〜Ｄおよび１３）に、７日間の分化期間の間、３Ｔ３−Ｌ１細胞を継続的に曝露し、細胞生存率および細胞内脂質蓄積を評価した。非標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子および遊離２，４−ＤＮＰを対照として使用した。分化期間の間、７日間の１μＭ、４μＭ、または１００μＭの標的化２，４−ＤＮＰの存在では、細胞生存率に影響はなかったが、非標的化２，４−ＤＮＰナノ粒子または遊離２，４−ＤＮＰと比較して、脂質蓄積の顕著な低下がもたらされた（図１２Ａ〜Ｄおよび１３）。遊離２，４−ＤＮＰは、１００μＭ濃度で細胞毒性を示した。これらの結果から、標的化ナノ粒子中の２，４−ＤＮＰは、低濃度（１または４μＭ）で、３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞分化を抑制することができ、かつこれらの細胞に対して細胞毒性効果を及ぼさないことがわかる。本発明者らは、標的化ポリマーナノ粒子系を使用して、細胞ミトコンドリアに２，４−ＤＮＰを送達し、肥満症の管理に適用可能な遊離形態と比較して低濃度で、脂質蓄積を低下させることができることを実証した。

Ｋ．生体内分布および薬物動態
静脈内投与後の、雄性スプラーグドーリーラットにおける標的化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＱＤナノ粒子（ＮＰ）の生体内分布および薬物動態および排泄を評価した。血漿中のＣｄレベルの経時変化、臓器分布、および排泄特性を、図１４に示す。これらの標的化ＮＰの血漿中でのＮＰ滞留が延長していることが観察された。試験した臓器の中で、最大のＣｄは肝臓で観察された。これらの高度に正に荷電したＮＰは、迅速な肝胆汁排泄を示す。これらのＮＰは、おそらく高い正電荷のために、肝臓内に通常隔離されたままである負に荷電したＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＰと比較して、肝臓から胃腸管の中に迅速に排泄される。

図１５は、薬物動態データに関するより詳細な情報を提示する表である。

結論
この概念実証研究において、本発明者らは、適切に操作されたミトコンドリア標的化生分解性ＰＬＧＡベースナノ粒子送達系を、ナノ粒子の表面電荷およびサイズを微調整することにより高効率で細胞ミトコンドリアに入るように作製することができることを実証した。すべてのタイプのナノ粒子がミトコンドリアに入る能力を有しているとは限らない。その理由は、表面電荷およびサイズのプログラミングに制限があるため、ナノ粒子が複雑な二重膜を横断することができないためである。以前の報告では、ミトコンドリアへの効率的な移入に対する、ナノ粒子のサイズおよび電荷の関係を検討していない。ＰＬＧＡベースのナノ粒子の細胞内輸送に対する表面電荷および直径の効果に取り組む、この合理的な試験により、ミトコンドリア送達に適用するための生分解性ナノ担体の設計への一般化されたアプローチが提供される。これらの標的化ナノ粒子は、ＡＤ、肥満症、および癌を含む、種々のミトコンドリア機能障害に関連した障害に使用することができる。この研究では、いくつかの例外的に有望な研究方向が強調されるが、イメージング用に統合することができる、ＰＬＧＡベースのナノ粒子の多様な適用のためのプラットフォームが提供される。

したがって、薬剤のミトコンドリア輸送のためのナノ粒子の実施形態が開示される。当業者は、開示されたもの以外の実施形態で本明細書に記載するナノ粒子および方法を実行することができることを認識するであろう。開示した実施形態は、説明の目的で提示したものであり、限定するものではない。

Claims (32)

1. ナノ粒子であって、
   疎水性ポリマーコアと、
   前記コアを包囲する親水性ポリマー層と、
   ミトコンドリア標的化部分と
   を含み、
   （i）前記疎水性ポリマーコア及び前記親水性ポリマー層が、PLGA-b-PEG-TPP（TPPはトリフェニルホスホニウムを示す）分子およびPLGA-COOHポリマー分子を含み、
   ここで、PLGA-b-PEG-TPP分子のPLGA-COOHポリマー分子に対する重量比は、１：１以上であり、
   PLGA-b-PEG-TPP分子およびPLGA-COOHポリマー分子のPLGAは、前記疎水性ポリマーコアを形成し、
   PLGA-b-PEG-TPP分子のPEG、およびPLGA-COOHポリマー分子のCOOHは、前記コアを包囲する親水性ポリマー層を形成し、
   PLGA-b-PEG-TPP分子のTPPは、ミトコンドリア標的化部分であり、
   前記ナノ粒子が、２００ナノメートル以下の直径および０ｍＶ以上のゼータ電位を有する；あるいは、
   （ii）前記疎水性ポリマーコア及び前記親水性ポリマー層が、PLGA-b-PEG-TPP分子およびPLGA-b-PEG-OHポリマー分子を含み、
   ここで、PLGA-b-PEG-TPP分子のPLGA-b-PEG-OHポリマー分子に対する重量比は、３５：６５以上であり、
   PLGA-b-PEG-TPP分子およびPLGA-b-PEG-OHポリマー分子のPLGAは、前記疎水性ポリマーコアを形成し、
   PLGA-b-PEG-TPP分子およびPLGA-b-PEG-OHポリマー分子のPEGは、前記コアを包囲する親水性ポリマー層を形成し、
   PLGA-b-PEG-TPP分子のTPPは、ミトコンドリア標的化部分であり、
   前記ナノ粒子が、２００ナノメートル以下の直径および０ｍＶ以上のゼータ電位を有する、ナノ粒子。
2. 前記ナノ粒子の直径が、８０ナノメートル〜１００ナノメートルである、請求項１に記載のナノ粒子。
3. 前記ナノ粒子のゼータ電位が、１ｍＶ以上である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
4. 前記ナノ粒子のゼータ電位が、７ｍＶ以上である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
5. 前記ナノ粒子のゼータ電位が、２０ｍＶ以上である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
6. 前記ナノ粒子のゼータ電位が、２５ｍＶ以上である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
7. 造影剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
8. 前記造影剤が、量子ドット、酸化鉄、およびそれらの組合せから選択される、請求項７に記載のナノ粒子。
9. 前記造影剤が、前記コア中に埋め込まれているか、または前記コア内に含有されている、請求項７または８に記載のナノ粒子。
10. 前記造影剤が、前記コアを包囲する親水性ポリマー層に結合している、請求項７または８に記載のナノ粒子。
11. 前記ナノ粒子が治療薬をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
12. 前記治療薬が、抗癌剤、ミトコンドリア脱共役剤、およびアミロイドベータを低減するように構成された薬剤からなる群から選択される、請求項１１に記載のナノ粒子。
13. 前記治療薬が、２，４−ＤＮＰ、ＬＮＤ、α−ＴＯＳ、およびクルクミンからなる群から選択される、請求項１１に記載のナノ粒子。
14. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む医薬組成物であって、当該ナノ粒子を必要とする患者を治療するための、医薬組成物。
15. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子を必要とする患者を治療するための薬剤を製造するための、該ナノ粒子の使用。
16. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患のリスクがあるか、またはそれに罹患している患者を治療するための医薬組成物であって、当該患者に投与される、医薬組成物。
17. 前記疾患が、神経変性、虚血傷害、脳卒中、肥満症、および癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記疾患が神経変性であり、前記治療薬がアミロイドベータの量を低減するように構成された薬剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
19. 前記治療薬がクルクミンである、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 前記疾患が肥満症であり、前記治療薬がミトコンドリア脱共役剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
21. 前記治療薬が２，４−ＤＮＰである、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 前記疾患が癌であり、前記治療薬が抗癌剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
23. 前記治療薬がＬＮＤまたはα−ＴＯＳから選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患を罹患しているか、またはそのリスクがある患者を治療するための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む医薬組成物。
25. ミトコンドリアの機能障害に関連した疾患を罹患しているか、またはそのリスクがある患者を治療するための薬剤を製造するための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子の使用。
26. 前記疾患が、神経変性、肥満症、虚血傷害、脳卒中、および癌からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用。
27. 前記疾患が神経変性であり、前記治療薬がアミロイドベータの量を低減するように構成された薬剤である、請求項２６に記載の使用。
28. 前記治療薬がクルクミンである、請求項２７に記載の使用。
29. 前記疾患が肥満症であり、前記治療薬がミトコンドリア脱共役剤である、請求項２６に記載の使用。
30. 前記治療薬が２，４−ＤＮＰである、請求項２９に記載の使用。
31. 前記疾患が癌であり、前記治療薬が抗ガン剤である、請求項２６に記載の使用。
32. 前記治療薬がＬＮＤおよびα−ＴＯＳから選択される、請求項３１に記載の使用。