BRPI0615974A2 - uso de choque térmico para tratar uma doença ocular em um indivìduo, método para recrutar uma célula-tronco para um tecido ocular de um indivìduo com necessidade da mesma, uso de choque térmico para tratar uma doença ou um distúrbio ocular em um indivìduo com necessidade do mesmo, uso de choque térmico para regenerar a retina em um indivìduo com necessidade do mesmo, uso de choque térmico para reparar os danos ao epitélio pgmentar da retina em um indivìduo com necessidade do mesmo, uso de choque térmico para tratar a degeneração macular em um indivìduo com necessidade do mesmo, composição farmacêutica para o recrutamento de células-tronco, composição farmacêutica para recrutamento de células-tronco em um tecido ocular, kit e método para identificar um agente que aumenta o recrutamento de células-tronco em um tecido ocular - Google Patents

Abstract

USO DE CHOQUE TéRMICO PARA TRATAR UMA DOENçA OCULAR EM UM INDIVìDUO, MéTODO PARA RECRUTAR UMA CéLULA- TRONCO PARA UM TECIDO OCULAR DE UM INDIVìDUO COM NECESSIDADE DA MESMA, USO DE CHOQUE TéRMICO PARA TRATAR UMA DOENçA OU UM DISTúRBIO OCULAR EM UM INDIVìDUO COM NECESSIDADE DO MESMO, USO DE CHOQUE TéRMICO PARA REGENERAR A RETINA EM UM INDIVìDUO COM NECESSIDADE DO MESMO, USO DE CHOQUE TéRMICO PARA REPARAR OS DANOS AO EPITéLIO PIGMENTAR DA RETINA EM UM INDIVìDUO COM NECESSIDADE DO MESMO, USO DE CHOQUE TéRMICO PARA TRATAR A DEGENERAçAO MACULAR EM UM INDIVìDUO COM NECESSIDADE DO MESMO, COMPOSIçAO FARMACêUTICA PARA O RECRUTAMENTO DE CéLULAS-TRONCO, COMPOSIçAO FARMACêUTICA PARA O RECRUTAMENTO DE CéLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR, KIT E MéTODO PARA IDENTIFICAR UM AGENTE QUE AUMENTA O RECRUTAMENTO DE CéLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR A invenção apresenta de maneira geral métodos para recrutar células-tronco para um tecido ocular. Os métodos envolvem a indução de choque térmico no tecido ocular utilizando um laser sublimiar e/ou um agente. Em algumas realizações, o choque térmico é induzido depois da administração de um agente que mobiliza HSCs.

Description

USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA TRATAR UMA DOENÇA OCULAREM UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARA RECRUTAR UMA CÉLULA-TRONCO PARAUM TECIDO OCULAR DE UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DA MESMA,USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA TRATAR UMA DOENÇA OU UM DISTÚRBIOOCULAR EM UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DO MESMO, USO DECHOQUE TÉRMICO PARA REGENERAR A RETINA EM UM INDIVÍDUO COMNECESSIDADE DO MESMO, USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA REPARAR OSDANOS AO EPITÉLIO PIGMENTAR DA RETINA EM UM INDIVÍDUO COMNECESSIDADE DO MESMO, USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA TRATAR ADEGENERAÇÃO MACULAR EM UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DO MESMO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O RECRUTAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O RECRUTAMENTO DECÉLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR, KIT E MÉTODO PARAIDENTIFICAR UM AGENTE QUE AUMENTA O RECRUTAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) éa causa mais comum de Cegueiraj no mundo ocidental.

Conseqüentemente, a DMRI é importante um probléma de saúdepública. Aproximadamente 8 5 a 90% dos pacientes têm a formanão-exsudativa (seca) de DMRI. Isto consiste na atrofia doepitélio pigmentar da retina (RPE), despigmentação e perda doepitélio pigmentar da retina. A DMRI seca afeta a populaçãoidosa, comprometendo seriamente a qualidade de suas vidas. Asopções de tratamento são limitadas. Excetuando os suplementosnutricionais e vitamínicos, não há nenhum tratamentoespecífico eficaz para a forma da doença. As abordagensterapêuticas atuais para o tratamento da DMRI são ineficazes.

Desse modo, métodos terapêuticos aperfeiçoados sãourgentemente requeridos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Conforme descrito abaixo, a presente invençãoapresenta métodos para o tratamento de uma doença ocularatravés da indução de uma resposta ao choque térmico querecruta células-tronco para o olho para reparar o tecidodanificado.

Em um primeiro aspecto, a invenção apresenta ummétodo para eliminar uma doença ocular em um indivíduo. 0método envolve a indução de choque térmico em pelo menos umacélula de um tecido ocular; e o recrutamento de uma célula-tronco para o tecido ocular, eliminando desse modo odistúrbio ocular. Em uma realização, o choque térmico éinduzido no tecido ocular utilizando a estimulação a laservisível sublimiar (SVL, sigla em inglês) . Em uma outrarealização, o choque térmico é induzido utilizando umcomposto pequeno selecionado do grupo que consiste emgeldanamicina, celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, EC102, radicicol,geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8 e H-71. Contudo,em uma outra realização, o choque térmico é induzidoutilizando um polipeptídeo de choque térmico ou um vetor deexpressão que contém um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo de choque térmico (por exemplo, HsplOO, Hsp90,Hsp7 0, Hsp60 e Hsp4 0) . Contudo, em um outro aspecto, opolipeptídeo de choque térmico é Hsp70 ou Hsp90. Contudo, emuma outra realização, a célula-tronco é uma célula derivadada medula óssea, tal como uma célula-tronco hematopoiética.

Contudo, em uma outra realização, o método reduz pelo menosum sintoma da doença ou do distúrbio ocular. Em realizaçõesadicionais, a doença ou o distúrbio ocular é qualquer um oumais dentre retinopatia diabética, neovascularizaçãocoroidal, glaucoma retinite pigmentosa, degeneração macularrelacionada à idade, glaucoma, distrofias corneais,retinosquise, mal de Stargardt, drusas autossômicasdominantes e distrofia macular de Best, edema macularcistóide, descolamento da retina, danos fóticos, retinopatiasisquêmicas, doença degenerativa da retina induzida porinflamação, retinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma,Malattia Leventinese (ML), e distrofia retiniana em favo demel de Doyne.

Contudo, em um outro aspecto, a invenção apresentaum método para o recrutamento de uma célula-tronco para umtecido ocular de um indivíduo com necessidade da mesma. 0método envolve a estimulação do tecido ocular com um lasersublimiar, em que o nível de estimulação é suficiente pararecrutar pelo menos uma célula-tronco para o tecido. Emvárias realizações, o tratamento a laser caracteriza um ciclode operação utilizado de 10% ou 15%; o laser sublimiar tem umcomprimento de onda de pelo menos aproximadamente 100 nm a2000 nm (por exemplo, 100, 200, 250, 300, 500, 750, 1000,1250, 1500, 1750, 2000) . Contudo, em outras realizações, apotência do laser sublimiar é de aproximadamente 5 mW a 200mW (por exemplo, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200mW) e é administrada em um micropulso que tem uma duração deaproximadamente 0,001 milissegundo a 1,0 milissegundo (porexemplo, 0,001, 0,005, 0,01, 0,025, 0,5, 0,75 ou 1,0milissegundo). Em outras realizações, a energia do laser ficacompreendida entre aproximadamente 10 mW a 100 mW, e aduração do micropulso é de 0,1 milissegundo. Além disso, emoutras realizações, a estimulação aumenta a expressão ou aatividade biológica de uma proteína de choque térmicoselecionada do grupo que consiste em HsplOO, Hsp90, Hsp70,Hsp60 e Hsp4 0. Em outras realizações, o aumento é de pelomenos aproximadamente 5, 10, 20, 25, 50, 75 ou 100%, ou mais.Além disso, em outras realizações, a estimulação altera aexpressão ou a atividade de uma proteína selecionada do grupoque consiste em SDF-1, VEGF, HIF-Ia , cristalina, fator detranscrição induzível por hipóxia 1-alfa (HIF-Ia) e CXCR-4.Além disso, em outras realizações, o método aumenta aexpressão de um polipeptídeo de Hsp70 ou de Hsp90 em pelomenos 10 vezes, 20 vezes, 40 vezes, 50 vezes, ou mais.

Contudo, em um outro aspecto, a invenção apresentaum método para o recrutamento de uma célula-tronco para umtecido ocular de um indivíduo com necessidade da mesma. Ométodo envolve a administração de um agente a um indivíduo emuma quantidade suficiente para induzir choque térmico em umtecido ocular; e o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular.

Contudo, em um outro aspecto, a invenção apresentaum método para a eliminação de uma doença ou um distúrbioocular em um indivíduo com necessidade do mesmo. 0 métodoenvolve a administração de um agente a um indivíduo em umaquantidade suficiente para induzir choque térmico em umtecido ocular; e o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular, desse modo eliminando a doença ou o distúrbioocular.

Em um aspecto correlacionado, a invenção apresentaum método para a regeneração da retina em um indivíduo comnecessidade do mesmo. 0 método envolve a administração de umagente a um indivíduo em uma quantidade suficiente parainduzir choque térmico em um tecido ocular; e o recrutamentode uma célula-tronco para o tecido ocular, regenerando dessemodo a retina.

Em um outro aspecto correlacionado, a invençãoapresenta um método para reparar danos do epitélio pigmentarda retina em um indivíduo com necessidade do mesmo. O métodoenvolve a administração de um agente a um indivíduo em umaquantidade suficiente para induzir choque térmico em umtecido ocular; e o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular, reparando desse modo o epitélio do pigmento daretina.

Contudo, em um outro aspecto, a invenção apresentaum método para a melhora de uma doença ou um distúrbio ocularem um indivíduo com necessidade do mesmo. 0 método envolve aadministração ao indivíduo de um agente que mobiliza umacélula-tronco derivada da medula óssea no indivíduo; aindução de choque térmico em um tecido ocular; e orecrutamento da célula-tronco para o tecido ocular, dessemodo melhorando a doença ou o distúrbio ocular.

Em um aspecto correlacionado, a invenção apresentaum método para melhorar a degeneração macular em um indivíduocom necessidade do mesmo. O método envolve a administração aoindivíduo de GM-CSF e/ou Fator de Células-tronco, em que aadministração mobiliza uma célula-tronco derivada da medulaóssea no indivíduo; a indução de choque térmico em um tecidoocular por meio da administração de um tratamento de lasersublimiar ou um agente farmacológico; e recrutamento decélulas-tronco derivada da medula óssea para o tecido ocular,melhorando desse modo a degeneração macular.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta umacomposição farmacêutica para o recrutamento de células-tronco, sendo que a composição contém uma quantidade eficazde um composto pequeno selecionado do grupo que consiste emgeldanamicina, celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, EC102, radicicol,geranilageranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8 e H-71,formulado em um excipiente farmaceuticamente aceitável para aaplicação ocular.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta umacomposição farmacêutica para o recrutamento de células-troncoem um tecido ocular, sendo que a composição contém um vetorde expressão que contém um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo de choque térmico (por exemplo, HsplOO, Hsp90,Hsp70, Hsp60 e Hsp4 0) formulado em um excipientefarmaceuticamente aceitável para a aplicação ocular.Em um outro aspecto, a invenção apresenta umacomposição farmacêutica para o recrutamento de células-troncoem um tecido ocular, sendo que a composição contém umpolipeptídeo (por exemplo, Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 ouHsp40) formulado em um excipiente farmaceuticamente aceitávelpara a aplicação ocular.

Contudo, em um outro aspecto, o kit contém umaquantidade eficaz de um agente (por exemplo, um polipeptídeo,um polinucleotídeo ou um composto pequeno) que induz umaresposta ao choque térmico em um tecido ocular e instruçõespara o uso do kit para aumentar o recrutamento de células-tronco. Em várias realizações, o polipeptídeo é HsplOO,Hsp90, Hsp70, Hsp60 e Hsp40. Contudo, em outras realizações,o polinucleotídeo codifica Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 eHsp40. Além disso, em outras realizações, o composto pequenoé selecionado do grupo que consiste em geldanamicina,celastrol, 17-alilamino-l7-demetoxigeldanamicina, EC102,radicicol, geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8 e H-71.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza ummétodo para a identificação de um agente que aumenta orecrutamento de células-tronco em um tecido ocular, sendo queo método envolve a colocação de uma célula ocular em contatocom um composto de teste; a identificação de um aumento naexpressão ou na atividade de um polipeptídeo de choquetérmico em relação a uma célula ocular não-tratada,identificando desse modo um composto que aumenta orecrutamento de células-tronco.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta um métodopara a identificação de um agente que aumenta o recrutamentode células-tronco em um tecido ocular, sendo que o métodoenvolve a colocação de uma célula ocular em contato com umcomposto do teste; e a identificação de um aumento no númerode célula-tronco no tecido.

Em várias realizações de qualquer um dos aspectosacima, o indivíduo tem uma doença ou distúrbio ocularselecionado do grupo que consiste em retinopatia diabética,neovascularização coroidal, glaucoma retinite pigmentosa,degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, distrofiascorneais, retinosquise, mal de Stargardt, drusas autossômicasdominantes e distrofia macular de Best, edema macularcistóide, descolamento da retina, danos fóticos, retinopatiasisquêmicas, doença degenerativa da retina induzida porinflamação, retinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma,Malattia Leventinese (ML) e distrofia retiniana em favo demel de Doyne. Em outras realizações de qualquer um dosaspectos acima, o agente aumenta a expressão ou a atividadebiológica de uma proteína de choque térmico selecionada dogrupo que consiste em HsplOO, Hsp90, Hsp70, Hsp60 e Hsp40.

Contudo, em outras realizações, o agente altera a expressãoou a atividade de qualquer uma ou mais das seguintesproteínas: SDF-1, VEGF, HIF-Ia , cristalina, fator detranscrição induzível por hipóxia 1-alfa (HIF-Ia) e CXCR-4.

Além disso, em outras realizações dos aspectos acima, ométodo aumenta a expressão de um polipeptídeo de Hsp70 ou deHsp90 em pelo menos aproximadamente 10 vezes ou pelo menos 4 0vezes. Contudo, em outras realizações de qualquer um dosaspectos acima, um agente que aumenta a mobilização dascélulas-tronco hematopoiéticas (por exemplo, GM-CSF e/ouSCF) é administrado ao indivíduo antes da indução da respostaao choque térmico. Além disso, em outras realizações dequalquer um dos aspectos acima, o método envolveadicionalmente a administração de um agente antiinflamatórioou de um agente antiangiogênico. Além disso, em outrasrealizações, o método envolve adicionalmente a administraçãode um agente que suporta a sobrevivência, a proliferação ou atransdiferenciação de uma célula-tronco hematopoiética. Alémdisso, em outras realizações de qualquer um dos aspectosacima, o método envolve adicionalmente a administração dequalquer ácido trans-retinóico para intensificar atransdiferenciação da célula-tronco em uma célula epitelialpigmentar da retina. Além disso, em outras realizações dequalquer um dos aspectos acima, o agente que mobiliza acélula-tronco é um fator estimulante de colônias demacrófagos de granulócitos ou um fator de células-tronco.

Contudo, em outras realizações de qualquer um dos aspectosacima, o choque térmico é induzido utilizando um tratamentode laser sublimiar ou utilizando um agente que é um compostopequeno, um polipeptídeo ou uma molécula de ácido nucléicoposicionada para a expressão em uma célula. Contudo, emoutras realizações de qualquer um dos aspectos acima, opolipeptídeo é um polipeptídeo de choque térmico. Contudo, emoutras realizações, a molécula de ácido nucléico codifica umpolipeptídeo de choque térmico (por exemplo, Hsp70, Hsp90) oucodifica um polipeptídeo terapêutico (por exemplo, umpolipeptídeo antiinflamatório ou um modulador deangiogênese). Além disso, em outras realizações de qualquerum dos aspectos acima, o agente farmacológico é selecionadodo grupo que consiste em geldanamicina, celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, EC102, radicicol,geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8 e H-71. Emvárias realizações de qualquer um dos aspectos acima, oagente é administrado por meio de injeção intravitral ouretro-orbital. Além disso, em outras realizações de qualquerum dos aspectos acima, a administração induz o reparo celularda camada do RPE. Além disso, em outras realizações dequalquer um dos aspectos acima, o método envolveadicionalmente a administração de um vetor que codifica umpolipeptídeo terapêutico. Além disso, em outras realizações,o método envolve adicionalmente a administração de umacélula-tronco substancialmente purificada (por exemplo, umacélula derivada de medula óssea ou célula-troncohematopoiética ao indivíduo). Contudo, em outras realizaçõesde qualquer um dos aspectos acima, a célula-tronco éadministrada localmente por meio de injeção intravitral ouretro-orbital, ou sistemicamente.

A invenção apresenta métodos para o tratamento devárias doenças oculares. Outras características e vantagensda invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhadae das reivindicações.

Por "agente" entenda-se qualquer composto químicode molécula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucléico oupolipeptídeo, ou fragmentos químicos dos mesmos.

Por "alteração" entenda-se uma mudança (aumento oudiminuição) nos níveis de expressão de um gene ou de umpolipeptídeo tal como detectado pelos métodos conhecidos noestado da técnica tais como aqueles descritos acima. Tal comoutilizado na presente invenção, uma alteração inclui umamudança de 10% nos níveis de expressão, preferencialmente umamudança de 25%, mais preferencialmente uma mudança de 40%, emais preferencialmente ainda 50% ou uma mudança maior de 10%nos níveis de expressão.

Por "melhorar" entenda-se a diminuição, asupressão, a atenuação, o decréscimo, a manutenção ou aestabilização do desenvolvimento ou da progressão de umadoença.

Por "análogo" entenda-se uma molécula depolipeptídeo ou de ácido nucléico estruturalmente relacionadaque tem a função de uma molécula de polipeptídeo ou de ácidonucléico de referência.

Por "atividade biológica de uma proteína de choquetérmico" entenda-se uma atividade protetora ou atividade derecrutamento de células-tronco.

Por "composto" entenda-se qualquer composto químicode molécula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucléico oupolipeptídeo, ou fragmentos químicos dos mesmos.

Nesta descrição, "compreende", "que compreende","que contém" e "que tem", e outros do gênero, podem ter osignificado atribuído a eles na Lei de Patentes dos EstadosUnidos e pode significar "inclui" "que inclui" e outros dogênero; "que consiste essencialmente em" ou "consisteessencialmente" tem do mesmo modo o significado atribuído naLei de Patentes dos Estados Unidos e o termo é "open-ended",permitindo a presença de mais do que aquilo que é recitado,contanto que as características básicas ou novas daquilo queé recitado não seja alterado pela presença de mais do queaquilo que é recitado, mas exclui realizações do estado datécnica.

Por "etiqueta detectável" entenda-se uma composiçãoque, quando ligada a uma molécula de interesse, resulta no"latter detectable", através de meios espectroscópicos,fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Porexemplo, as etiquetas úteis incluem isótopos radioativos,grânulos magnéticos, grânulos metálicos, partículascoloidais, tinturas fluorescentes, reagentes densos deelétrons, enzimas (por exemplo, tal como utilizado geralmenteem um ensaio ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos.

Um "ácido nucléico ou polipeptídeo etiquetado" éaquele que é ligado, tanto covalentemente, através de umligante ou de uma ligação química, quanto não-covalentemente,através de ligações iônicas, forças de van der Waals,atrações eletrostáticas, interações hidrofóbicas ou ligaçõesde hidrogênio, a uma etiqueta de modo que a presença do ácidonucléico ou da sonda possa ser detectada pela detecção dapresença da etiqueta ligada ao ácido nucléico ou à sonda.Por "vetor de expressão" entenda-se um construto deácido nucléico, gerado de modo recombinante ou sintético, quecarrega uma série de elementos de ácidos nucléicosespecificados que permitem a transcrição de um geneparticular em uma célula hospedeira. Tipicamente, a expressãodo gene é colocada sob o controle de determinados elementosreguladores, que incluem promotores constitutivos ouindutíveis, elementos reguladores de tecido preferidos eintensificadores.

Por "fragmento" entenda-se uma porção de umamolécula de polipeptídeo ou de ácido nucléico. Essa porçãocontém, preferencialmente, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 8 0% ou 90% do comprimento inteiro da moléculade ácido nucléico ou do polipeptídeo de referência. Umfragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 OU 1.000nucleotídeos ou aminoácidos.

Por "choque térmico" entenda-se qualquer respostacelular à resistência térmica. Tipicamente, as célulasrespondem ao choque térmico aumentando a transcrição ou atradução de um polipeptídeo de choque térmico (por exemplo,Hsp70 ou 90).

Por "polipeptídeo de choque térmico" entenda-sequalquer polipeptídeo expresso em uma célula em resposta àresistência térmica. Exemplos de polipeptídeos de choquetérmico incluem, mas sem ficar a eles limitados, HsplOO,Hsp90, Hsp70, Hsp60 e Hsp40. Exemplos de uma seqüência deaminoácidos de Hsp70 é fornecida no Acesso N0 . AAA02807 doGenBank. Um exemplo da seqüência de aminoácidos Hsp90 éfornecida nos Acessos N°. 08238, NP 005339, NP 001017963 eP07900 do GenBank.

Por "ativador da resposta ao choque térmico"entenda-se um composto que aumenta a atividade protetora ou aexpressão de um componente do trajeto de choque térmico. Oscomponentes do trajeto de choque térmico incluem, mas semficar a eles limitados, Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 emembros pequenos da família Hsp. Agentes ou tratamentos queinduzem o choque térmico tipicamente aumentam a expressão oua atividade de pelo menos um entre Hsp70 e Hsp90.

Por "célula-tronco hematopoiética" entenda-se umacélula derivada de medula óssea capaz fazer surgir uma oumais células diferenciadas da linhagem hematopoiética.

Por "mobilização das células-troncohematopoiéticas" entenda-se o aumento do número de células-tronco derivadas da medula óssea disponíveis para orecrutamento para um órgão ou para um tecido com necessidadedo mesmo.

Por "doença ou distúrbio ocular" entenda-se umapatologia que afeta a função normal do olho.

Por "ligado de modo operável" entenda-se que umprimeiro polinucleotídeo é posicionado de modo adjacente a umsegundo polinucleotídeo que dirige a transcrição do primeiropolinucleotídeo quando as moléculas apropriadas (por exemplo,as proteínas transcricionais ativadoras) são ligadas aosegundo polinucleotídeo.

Por "polipeptídeo" entenda-se qualquer cadeia deaminoácidos, não obstante o comprimento ou a modificação pós-translacional.

Por "posicionado para a expressão" entenda-se que opolinucleotídeo da invenção (por exemplo, uma molécula deDNA) é posicionado de modo adjacente a uma seqüência de DNAque dirige a transcrição e a tradução da seqüência (isto é,facilita a produção de, por exemplo, um polipeptídeorecombinante da invenção ou uma molécula de RNA).

Por "promotor" entenda-se um polinucleotídeosuficiente para dirigir a transcrição. Exemplos de promotoresincluem seqüências de ácido nucléico com comprimentos de 100,250, 300, 400, 500, 750, 900, 1.000, 1.250 e 1.500nucleotídeos que ficam a montante (por exemplo, imediatamentea montante) do sítio de início da tradução.

Por "recrutar" entenda-se atrair para aincorporação em um tecido.

Por "reduzir" ou "aumentar" entenda-se umaalteração negativa ou positiva, respectivamente, de pelomenos 10%, 25%, 50%, 75% ou 100%.

Por "regeneração da retina" entenda-se o aumento donúmero, da sobrevivência ou da proliferação das células naretina ou no epitélio pigmentado da retina.

Por "reparação de danos do epitélio pigmentar daretina" entenda-se a melhoria da lesão ao epitélio pigmentar,danos ou a morte celular.

Por "célula-tronco" entenda-se uma célulaprogenitora capaz de gerar um ou mais tipos de célulasdiferenciadas.

Por "indivíduo" entenda-se um mamífero, incluindo,mas sem ficar a eles limitado, um ser humano ou um mamíferonão-humano, tal como um bovino, eqüino, canino, ovino oufelino.

Por "laser sublimiar" entenda-se uma terapia alaser que induz uma lesão que é indetectável ou mal-detectável na retina durante ou depois do tratamento. Umalesão é "indetectável" onde pouca ou nenhuma reação visívelintra-operativa do tecido está presente ou onde pouca ounenhuma morte celular (por exemplo, menos de 10%, 5%, 2,5%,1% das células no tecido tratado morrem ou sofrem apoptose)devido ao tratamento a laser.

Tal como utilizado na presente invenção, os termos"tratar" "que trata", "tratamento" e outros do gêneroreferem-se à redução ou à melhora de um distúrbio e/ou dossintomas associados com o mesmo. Deve ser apreciado, emboranão impossibilitado, que o tratamento de um distúrbio ou deuma condição não requer que o distúrbio, a condição ou ossintomas associados com o mesmo sejam completamenteeliminados.

Tal como utilizado na presente invenção, os termos"previne" "que previne" "prevenção", "tratamento profilático"e outros do gênero referem-se à redução da probabilidade dedesenvolver um distúrbio ou uma condição em um indivíduo, quenão tenha, mas esteja em risco ou suscetível de desenvolverum distúrbio ou uma condição.

Por "referência" entenda-se uma condição padrão oude controle.

Por "transdiferenciação" entenda-se a alteração dacélula, de modo que expresse pelo menos um polipeptídeoexpresso caracteristicamente por uma célula de um tipo diferente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra uma série de montagens de tecidoocular. As regiões escuras na Figura 1 representam as célulasde proteína verde fluorescente (GFP+, sigla em inglês) queforam incorporadas na camada do RPE nas áreas que receberam aradiação laser. A fluorescência de fundo, tal comodeterminada pelo olho contralateral (não-afetado), foiremovida. Do lado direito da Figura 1 corresponde a um ciclode operação de 5%, e o lado esquerdo corresponde a um ciclode operação de 10%.

A Figura 2 é um gráfico de incorporação de células-tronco hematopoiéticas (HSC, sigla em inglês) quantitativo noepitélio pigmentar da retina (RPE).

A Figura 3 é uma série de painéis que mostram asmontagens de tecido ocular extraídas de camundongos quereceberam injeção sub-orbital de GFP+HSC em combinação comchoque térmico farmacologicamente induzido utilizandoderivados de geldanamicina D28 ou H71 que receberam a injeçãodo polipeptídeo Hsp70.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção apresenta de maneira geral composições emétodos que são úteis para o tratamento ou a prevenção de umadoença ocular. A invenção é baseada, pelo menos em parte, naconstatação de que o laser ou a indução farmacológica dechoque térmico na camada e coróide do epitélio pigmentar daretina (RPE) faz com que as células-tronco hematopoiéticassejam recrutadas para o RPE, onde se transdif erenciam emcélulas que expressam marcadores específicos às células doepitélio pigmentar da retina. Sem desejar se limitar pelateoria, esta resposta residente se deve pelo menos em parte àativação da resposta ao choque térmico.

Conforme relatado mais detalhadamente a seguir, aestimulação do laser sublimiar visível do epitélio pigmentarda retina e coróide foi utilizada para recrutar as HSC para acamada do RPE. A transferência adotiva de HSC etiquetadas porGFP e de animais quiméricos de GFP foi utilizada parademonstrar que as células-tronco hematopoiéticas podem migrarà camada do RPE. 0 SVL induz a expressão de proteínas dechoque térmico e a subseqüente expressão do fator-1 derivadodo estroma celular (SDF-1, sigla em inglês) dosquimioatrativos de HSC e de fator de crescimento endotelialvascular (VEGF, sigla em inglês). O efeito induzido pelolaser poderia ser retomado por meio da administraçãointravitral dos compostos que induzem quimicamente a respostaao choque térmico. As HSC recrutadas adquiriram ascaracterísticas morfológicas de células do RPE maduras etambém expressaram as proteínas específicas do RPE. Dessemodo, a presente invenção apresenta métodos para o tratamentode indivíduos que têm uma doença ocular, tais comoretinopatia diabética, neovascularização coroidal, glaucomaretinite pigmentosa, degeneração macular relacionada à idade,glaucoma, distrofias corneais, retinosquise, mal deStargardt, drusas autossômicas dominantes e distrofia macularde Best, edema macular cistóide, descolamento da retina,danos fóticos, retinopatias isquêmicas, doença degenerativada retina induzida por inflamação, retinosquise juvenilligada ao X, glaucoma, Malattia Leventinese (ML) e distrofiaretiniana em favo de mel de Doyne.

Células-tronco hematopoiéticas

As células-tronco hematopoiéticas são as célulasderivadas da medula óssea que representam uma fonte endógenaconhecida por seu potencial reparador bem como pela suaplasticidade. As células-tronco hematopoiéticas derivadas damedula óssea (HSC) podem reparar tecidos danificados,incluindo o coração, o fígado, o cérebro, os músculos e osrins. Conforme relatado na presente invenção, as células-tronco hematopoiéticas também podem ser utilizadas parareparar a retina. A estimulação do laser sublimiar (STL,sigla em inglês) da retina induz o recrutamento de HSC que setransdiferenciam subseqüentemente em células similares aoRPE. Sem desejar se limitar pela teoria, esse processo émediado, pelo menos em parte, pelas interações molecularesque envolvem quimiocinas, tais como o fator de crescimentoderivado estromal 1 (SDF-I) e receptores de quimiocina, talcomo o receptor SDF-I (CXCR-4) que é ativado pelo lasersublimiar.

As células-tronco são recrutadas para as áreas delesão para efetuar o reparo do tecido lesado. Caso desejado,o número das células-tronco hematopoiéticas presentes nacirculação de um indivíduo pode ser aumentado antes, duranteou após a indução de choque térmico. Em uma realização, esseaumento no número das células-tronco hematopoiéticas érealizado pelas células-tronco hematopoiéticas mobilizadoraspresentes na medula óssea do indivíduo ao administrar um oumais fatores estimulantes de colônias de macrófagosgranulócitos (MG-CSF), fator de células-tronco (SCF), IL-8,SDF-I (fator derivado estromal), interleucina-1 (IL-I),interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6) , interleucina-7(IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-11 (IL-Il),interleucina-12 (IL-12) e NIP-Ia , fator de células-tronco(SCF)7 tirosina-quinase-3 FMS-similar (flt-3, sigla eminglês), fator-β de crescimento transformador (TGF-β,τη siglaem inglês), um fator hematopoiético ativo anterior, descrito,por exemplo, no pedido de patente WO 91/05795, etrombopoietina (TPO), ligante de FLK-2, ligante de FLT-2,EPO, Oncostatina M e MCSF. SDF-I é uma citocina potente queinduz o recrutamento de células-tronco. 0 SDF-I é expressopor células do RPE durante o esforço. A administração de G-CSF e/ou SDF-I irá aumentar o número de HSC no sangueperiférico e intensificará provavelmente o recrutamentosubseqüente de HSC à retina e à camada do RPE.

Preferencialmente, as células-tronco hematopoiéticas dainvenção não expressam ou então expressam níveis reduzidos dequalquer um ou mais de um dos seguintes marcadores: Lin",CD2", CD3", CD7", CD8", CD10", CD14", CD15", CD16", CD19", CD20"CD33", CD38", CD71", HLA-DR" e glicoforina A".

Lasers oftálmicos

Os lasers oftálmicos constituem uma ferramentaimportante para o tratamento de vários distúrbios da retinaonde têm sido utilizados tipicamente para gerar queimadurasfotoquímicas induzidas por laser. Por outro lado, acredita-seque o laser de diodo de 810 nanômetros cause menos danos àretina neuro-sensora porque a energia é absorvida pelo RPE. Apresente invenção apresenta métodos que utilizam umaaplicação de laser sub-visível para mobilizar as células-tronco hematopoiéticas e recrutar as mesmas para a camada doepitélio pigmentar da retina. No presente método, um laserinfravermelho (810 nm) é utilizado no modo de micropulso parao tratamento de distúrbios da retina. 0 uso de pulsos delaser breves e repetitivos durante uma única exposição limitaa quantidade de condução de calor e os danos subseqüentes aoRPE. Em uma abordagem, a administração do laser é controladapara reduzir ou eliminar os danos fototérmicos. Por exemplo,o tratamento a laser é controlado para reduzir ou eliminar areação intraoperativa do tecido visível (por exemplo, necrosepor fotocoagulação) e/ou a morte celular posterior(apoptose). Em outros exemplos, o limiar da lesão térmicanão-letal é controlado de modo que a reação intraoperativa dotecido visível seja reduzida ou ausente, a morte celularposterior seja reduzida ou ausente e o recrutamentoconsistente positivo de HSC esteja presente.Preferencialmente, os danos fototérmicos são reduzidos empelo menos 10%, 25% ou 30% em relação a um paciente tratadocom a terapia a laser convencional; mais preferencialmente,os danos fototérmicos são reduzidos em pelo menos 50%, 75%,85%, 95% ou 100%. Mais preferencialmente, a acuidade visualdo paciente é substancialmente preservada (por exemplo, épreservada ou mantida próxima ao nível atual de acuidadevisual do paciente).

Os métodos para induzir choque térmico utilizandoum laser sublimiar incluem, por exemplo, a administração deum padrão de grade de 40-50 cavidades espaçadas com laser de810 nm com um diâmetro de 5 μιη, 10 μπι, 25 μιτι, 35 μιτι ou 50 μπι.As modalidades de intensidade e de aplicação podem servariadas para reduzir ou eliminar os danos fototérmicos. Porexemplo, um modo de aplicação de onda contínua (cw); um modode aplicação de micropulso (mP) (por exemplo, utilizandociclo de operação de 20%, 15%, 10% e 5%) ; ou um modo deaplicação de pulso longo, podem ser utilizados.

Em realizações particulares, os presentes métodoscaracterizam o uso de um laser sublimiar que tem umcomprimento de onda de pelo menos aproximadamente 100 nm até2.000 nm, em que a potência do laser sublimiar é pelo menosde aproximadamente 10 mW a 100 mW (por exemplo, 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100) . O laser é aplicado por umperíodo de pelo menos 0,001, 0,005, 0,1, 0,2 ou 1,0milissegundo. Em outras realizações, 10 mW são administradosem um pulso de 0,1 milissegundo ou 100 mW são administradosem um pulso de 0,1 milissegundo.

Os tecidos oculares tratáveis pelo tratamento alaser incluem a coróide, o epitélio pigmentar da retina ouqualquer outro tecido ocular onde o reparo aos danos detecido às células-tronco seja desejável.

Embora os exemplos específicos descritos napresente invenção estejam relacionados ao uso dos lasers parainduzir choque térmico, o elemento versado na técnica iráapreciar que a invenção não fica limitada aos mesmos.Virtualmente qualquer método de aplicação de energia comcapacidade de induzir a resposta ao choque térmico em pelomenos uma célula de um tecido ocular pode ser utilizado. Taismétodos incluem, por exemplo, a estimulação utilizandoradiação, termografia transpupilar ou qualquer outra forma deenergia, tal como a energia de luz, em uma quantidadesuficiente para estimular o recrutamento de células-tronco,podem ser utilizados. Em várias realizações, a estimulação dolaser suficiente para recrutar células-tronco refere-se a umfeixe luminoso ou fótons que têm um comprimento de onda deaproximadamente 100 nm até 2.000 nm. Geralmente, ocomprimento de onda fica compreendido entre aproximadamente500 nm e aproximadamente 900 nm.

Ativadores de resposta ao choque térmicoOs ativadores de resposta ao choque térmico incluemagentes (por exemplo, composto pequeno, polipeptídeo emoléculas de ácido nucléico) que induzem uma resposta aochoque térmico em uma célula. Tais agentes aumentam, porexemplo, a expressão da atividade biológica de uma proteínade choque térmico, tal como Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60,Hsp40 e membros pequenos da família Hsp. Maispreferencialmente, o agente aumenta a expressão ou aatividade biológica de Hsp90 ou Hsp70. A proteína de choquetérmico 90 (Hsp90) é um protetor envolvido na sinalização,proliferação e sobrevivência de células e é essencial para aestabilidade conformacional e a função de uma série deproteínas. Os moduladores Hsp90 são úteis nos métodos dainvenção, e tais moduladores aumentam a expressão ou aatividade biológica de Hsp90. Os moduladores Hsp90 incluemantibióticos de ansamicina de benzoquinona, tais como ageldanamicina e 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-AAG), que se ligam especificamente a Hsp90 e alteram a suafunção. Outros moduladores Hsp90 incluem, mas sem ficar aeles limitados, radicicol, novobiocina e qualquer inibidorHsp90 que se liga à cavidade de ATP/ADP de Hsp90.

Outros agentes que induzem choque térmico incluem,mas sem ficar a eles limitados, geldanamicina, (InvivoGen,San Diego, Califórnia; Chang et al. , J Cell Biochem 2006 Iode janeiro; 97 (1) :156-65) , celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, InvivoGen, San Diego, Califórnia),EC102, radicicol (Chang et al. , J Cell Biochem 2006 Io dejaneiro; 97 (1) : 156-65), geranilageranilacetona (Eisai,Tóquio, Japão), paeoniflorina (Axxora, San Diego, CA), PU-DZ8e H- 71 (H-71 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz,CA) , bem como análogos ou miméticos de qualquer um destescompostos. O celastrol, um triterpeno quinona-metideo, ativaa resposta humana ao choque térmico. O celastrol e outrosativadores da resposta ao choque térmico são úteis para otratamento da doença ocular. Os ativadores da resposta aochoque térmico incluem, mas sem ficar a eles limitados,celastrol, metil éster celastrol, diacetato dediidrocelastrol, butil éster celastrol, diidrocelastrol, esais ou análogos dos mesmos.

Doença Ocular

A invenção pode ser utilizada para o tratamento dasdoenças oculares que incluem a retinopatia pré-proliferativa,retinopatia diabética, neovascularização coroidal, glaucoma,retinite pigmentosa, degeneração macular relacionada à idade,distrofias corneais, retinosquise, mal de Stargardt, drusasautossômicas dominantes e distrofia macular de Best.

Particularmente, a invenção apresenta o tratamentoda neovascularização relacionada à retinopatia diabéticaproliferativa e à neovascularização coroidal. A diabetes tipoI é associada com um risco elevado para retinopatia diabéticaproliferativa (Jacobsen, N. et al. 2003 Ugeskr Laeger165:2953-6). A exposição crônica ao meio diabético conduz tipicamente à retinopatia pré-proliferativa. A retinopatiapré-proliferativa é associada com as áreas de isquemia focai.Aceita-se extensamente que a neovascularização estejaassociada com a expressão aumentada de fatores pró-angiogênicos tais como o fator de crescimento endotelial25 vascular (VEGF), juntamente com a expressão reduzida defatores antiangiogênicos, tais como a endostatina e o fatorde pigmento derivado do epitélio, PEDF (Funatsu, H., et al.2003 Invest Ophthalmol Vis Sci 44:1042-7; Noma, H., et al.2002 Arch Ophthalmol 120:1075-80; Dawson, D. W. et al 199930 Science 285:245-8; Spranger, J., et al. 2001 Diabetes50:2641-5; Holekamp, N.M. et al 2002 Am J Ophthalmol 134:220-7; Boehm, B.O., et al. 2003 Horm Metab Res 35:382-6). Amudança no equilíbrio entre os fatores pró-angiogênicos e22/80antiangiogênicos evoca a neovascularização e induz ovazamento capilar (Funatsu, H., et al. 2002 Am J Ophthalmol133:70-7; Caldwell, R. B., et al. 2003 Diabetes Metab Res Rev19:442-55; Antcliff, R. J. et al. 1999 Semin Ophthalmol14:223-32). Após vários anos, os pacientes que têmretinopatia pré-proliferativa experimentam a patologia daretina caracterizada pela perda extensiva de capilares daretina e de exsudatos algodonosos múltiplos, seguida pelodesenvolvimento de vasos novos que crescem a partir da retinapara o vítreo normalmente avascular. Os vasos novos e frágeissão propensos ao vazamento, causando edema macular e visãoborrada. Suscetíveis a rompimento, a ruptura desses vasosanormais pode resultar em perda imediata da visão.

Se permitido o crescimento, a neovascularizaçãopode formar membranas fibrovasculares cegantes, causando odescolamento da retina. Sob os protocolos de tratamentopresentemente disponíveis, a retinopatia diabéticaproliferativa é tratada no estágio proliferativo da condiçãoao colocar uma malha de queimaduras a laser sobre a retina. 0tratamento destrutivo resulta na perda substancial da visão.Após um período de vinte anos de diabetes, 33% dos adultosmais jovens receberam tais tratamentos a laser, com umadiminuição associada na acuidade visual e no ângulo visual(Kokkonen, J. et al. 1994 Acta Paediatr 83:273-8; EarlyTreatment Diabetic Retinopathy Study Research Group 1991Ophthalmology 98:766-85; Davies, N. 1999 Eye 13 (Pt4):531-6;Dosso, A.A. et al. 2000 Diabetes Care 23:1855).

Uma outra condição que pode ser tratada com osmétodos da invenção é a neovascularização coroidal. Aneovascularização coroidal é responsável pela perdasignificativa da visão associada com a degeneração macularrelacionada à idade (DMRI), por exemplo. Na neovascularizaçãocoroidal anormal, os vasos novos crescem a partir da coróidepara o espaço sub-retiniano. As retinas com risco elevadopara a neovascularização coroidal são identificadas pelapresença de drusas múltiplas ou grandes e moles, drusasreticulares e/ou mudanças pigmentares (MacularPhotocoagulation Study Group 1997, Arch Ophthalmol 115:741-7;Arnold, J.J. et al. 1995 Retina 15:183-91). VEGF, umaproteína regulada pela hipoxia, é associada com aneovascularização coroidal (Frank, R.N., et al. 1996 Am JOphthalmol 122:393-403; Ishibashi, T. et al. 1997 Arch ClinExp Ophthalmol 235:159-67; Kwak, N. et al. 2000 InvestOphthalmol Vis Sci 41:3158-64).

A degeneração da retina é uma outra condiçãotratável pelo tratamento ao utilizar os métodos da invenção.

As doenças degenerativas da retina incluem aquelas doençascaracterizadas por lesão do neurônio da retina ou pela mortede células neuronais da retina. Os neurônios retinianosincluem, mas sem ficar a eles limitados, fotorreceptores ecélulas ganglionares retinianas. As doenças degenerativas daretina incluem doenças degenerativas da retina herdadas,adquiridas e induzidas por inflamação. As doençasdegenerativas da retinaherdadas incluem, por exemplo, todasas formas de degeneração macular (por exemplo, degeneraçãomacular relacionada à idade seca e exsudativa), mal deStargardt, mal de Best, glaucoma, retinite pigmentosa, edegeneração do nervo óptico. As doenças degenerativas daretinaadquiridas incluem aquelas associadas com o edemamacular cistóide, o descolamento da retina, danos fóticos,retinopatias isquêmicas devido à oclusão venosa ou arterialou outros distúrbios vasculares, retinopatias devido atrauma, cirurgia ou lesões penetrantes do olho, evitreorretinopatia periférica. As doenças degenerativas daretina induzidas por inflamação incluem aquelas associadascom a degeneração da retina viral, bacteriana e induzida portoxina e/ou uveíte, bem como aquelas que resultam em neuriteóptica.

Outros doenças e distúrbios suscetíveis aotratamento utilizando os métodos da invenção incluemretinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma, MalattiaLeventinese (ML) e distrofia da retina e colméia de Doyne(DHRD, sigla em inglês), e distrofias corneais.

A presente invenção também apresenta métodos para aprevenção de danos celulares nos neurônios retinianos,incluindo os danos associados com o trauma e as complicaçõespós-cirúrgicas por exposição subseqüente à luz brilhanteprejudicial em uma modalidade protetora.

Ensaios de Seleção

Tal como discutido na presente invenção, os compostos que induzem o choque térmico ou o recrutamento decélulas-tronco ao epitélio pigmentar da retina são úteis nosmétodos da invenção. Qualquer número de métodos estádisponível para a realização dos ensaios de seleção paraidentificar tais compostos. Em uma abordagem, a expressão deum polipeptídeo Hsp ou de uma molécula de ácido nucléico émonitorada em uma célula (por exemplo, uma célula ocular, talcomo uma célula da coróide ou do epitélio pigmentar da retinain vitro ou in vivo) ; a célula entra em contato com umcomposto candidato; e o efeito do composto na expressão de umpolipeptídeo Hsp ou da molécula de ácido nucléico é testadoutilizando qualquer método conhecido no estado da técnica oudescrito na presente invenção. Um composto que aumenta aexpressão de polipeptídeo Hsp ou de uma molécula de ácidonucléico na célula que entrou em contato em relação a umacélula do controle que não entrou em contato com o composto éconsiderado útil nos métodos da invenção. Alternativamente,os compostos são selecionados para identificar aqueles queaumentam o recrutamento de células-tronco para a retina. Emuma realização, o recrutamento de células-tronco é testado emum camundongo quimérico injetado local ou sistemicamente comcélulas-tronco que expressam GFP+. A presença de células GFP+é testada, por exemplo, ao examinar montagens lisas da retinautilizando microscopia de fluorescência. Os compostos que onúmero de células-tronco recrutou para a retina são úteis nosmétodos da invenção. Em outras realizações, a sobrevivênciaou a diferenciação de tais células é testada utilizandomarcadores específicos de célula. Em uma abordagemrelacionada, a seleção é realizada na presença de 11-cis-retinal, 9-cis-retinal ou de um análogo ou derivado dosmesmos. Os compostos úteis aumentam o número das células-tronco recrutadas para a retina em pelo menos 10%, 15% ou 20%ou preferencialmente em 25%, 50% ou 75%; ou maispreferencialmente em pelo menos 100%.

Caso desejado, a eficácia do composto identificadoé testada em um modelo animal que tem uma doença ocular (porexemplo, um modelo animal de retinite pigmentosa) ou que temdiabetes.

Compostos de Teste e Extratos

De maneira geral, os compostos com capacidade deinduzir uma resposta ao choque térmico em uma célula ou deaumentar o recrutamento de células-tronco para um tecidoocular são identificados a partir de grandes bibliotecas deprodutos naturais ou de extratos sintéticos (ou semi-sintéticos) ou a partir de bibliotecas químicas de acordo comos métodos conhecidos no estado da técnica. Os técnicos noassunto da descoberta e do desenvolvimento de drogas irãocompreender que a fonte precisa dos extratos ou compostos deteste não é essencial ao(s) procedimento(s) de seleção dainvenção. Conseqüentemente, virtualmente qualquer número deextratos ou compostos químicos pode ser selecionadoutilizando os métodos descritos na presente invenção. Osexemplos de tais extratos ou compostos incluem, mas sem ficara eles limitados, extratos a base de plantas, fungos,procarióticos ou animais, caldos de fermentados e compostossintéticos, bem como a modificação de compostos existentes.

Numerosos métodos também estão disponíveis para gerar asíntese aleatória ou dirigida (por exemplo, semi-síntese ousíntese total) de qualquer número de compostos químicos,incluindo, mas sem ficar a eles limitado, compostos a base desacarídeos, lipxdeos, peptídeos e ácidos nucléico. Asbibliotecas de compostos sintéticos estão comercialmentedisponíveis junto a Brandon Associates (Merrimack, Ν. H.) eAldrich Chemical (Milwaukee, Wis.). Alternativamente, asbibliotecas de compostos naturais na forma de extratosbacterianos, fúngicos, de plantas e de animais estãocomercialmente disponíveis junto a uma série de fontes,incluindo Biotics (Sussex, Reino Unido), Xenova (Slough,Reino Unido), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft.Pierce, Fia.) e PharmaMar, EUA (Cambridge, Mass.). Alémdisso, as bibliotecas produzidas natural ou sinteticamentesão produzidas, caso desejado, de acordo com os métodosconhecidos no estado da técnica, por exemplo, por meio dosmétodos padrão de extração e de fracionamento. Além disso,caso desejado, qualquer biblioteca ou composto é facilmentemodificado utilizando métodos químicos, físicos oubioquímicos padrão.

Além disso, técnicos no assunto de descoberta edesenvolvimento de drogas compreendem facilmente que osmétodos para a desreplicação (por exemplo, desreplicaçãotaxonômica, desreplicação biológica e desreplicação químicaou qualquer combinação das mesmas) ou a eliminação dasréplicas ou repetições dos materiais já conhecidos por suaatividade no recrutamento de células-tronco ou na indução dechoque térmico devem ser empregados sempre que possível.Quando se verifica que um extrato bruto recrutacélulas-tronco ou induz um choque térmico, um fracionamentoadicional do extrato de ligação positivo é necessário paraisolar os constituintes químicos responsáveis pelo efeitoobservado. Desse modo, o objetivo da extração, dofracionamento e do processo de purificação é a caracterizaçãocuidadosa e identificação de uma entidade química dentro doextrato bruto que induz o choque térmico ou o recrutamento decélulas-tronco. Os métodos de fracionamento e de purificaçãode tais extratos heterogênicos são conhecidos no estado datécnica. Caso desejado, os compostos mostrados como sendoagentes úteis para o tratamento de qualquer patologiarelacionada a uma doença ocular que requeira o reparo ou aregeneração de um tecido ocular são modificados quimicamentede acordo com os métodos conhecidos no estado da técnica.

Composições Farmacêuticas

A presente invenção caracteriza preparaçõesfarmacêuticas que compreendem agentes com capacidade deinduzir ou de replicar o choque térmico (por exemplo, ao aumentar a expressão ou a atividade de Hsp70 ou de Hsp90) emum tecido ocular juntamente com veículos farmaceuticamenteaceitáveis. Tais preparações que compreendem polipeptídeos,polinucleotídeos ou compostos pequenos têm aplicaçõesterapêuticas e profiláticas. Os agentes úteis nos métodosdescritos na presente invenção incluem aqueles que aumentam aexpressão ou a atividade biológica de um polipeptídeo Hsp90ou Hsp70 ou que induzem de alguma outra maneira uma respostaao choque térmico em um tecido ocular que recruta desse modouma célula-tronco para o tecido. Caso desejado, ascomposições da invenção são formuladas juntamente com osagentes que aumentam o número das células-troncohematopoiéticas presentes na circulação de um indivíduo, porexemplo, ao mobilizar as células-tronco hematopoiéticaspresentes na medula óssea do indivíduo.

Os agentes que aumentam a mobilização ou orecrutamento de células-tronco incluem, mas sem ficar a eleslimitados, drogas antiblásticas e G-CSF ou GM-CSF,interleucina-1 (IL-I), interleucina-3 (IL-3), interleucina-6(IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8),interleucina-11 (IL-Il), interleucina-12 (IL-12) e NIP-Ia ,fator de células-tronco (SCF), tirosina-quinase-3 FMS-similar(flt-3), fator-β de crescimento transformador (TGF-β), umfator hematopoiético ativo anterior, descrito, por exemplo nopedido de patente WO 91/05795 e trombopoietina (TPO), ligantede FLK-2, ligante de FLT-2, Epo, Oncostatina M e MCSF.

Caso desejado, as composições da invenção podem serformuladas juntamente com compostos que intensificam atransdiferenciação de uma célula-tronco hematopoiética em umacélula epitelial pigmentar da retina. Tais compostos incluemo ácido trans-retinóico, a 11-cis-daretinal ou a 9-cis-retinal.

Os compostos da invenção podem ser administradoscomo parte de uma composição farmacêutica. As composiçõesdevem ser estéreis e conter uma quantidade terapeuticamenteeficaz dos agentes da invenção em uma unidade de peso ou devolume apropriada para a administração a um indivíduo. Ascomposições e as combinações da invenção podem fazer parte deum pacote farmacêutico, onde cada um dos compostos estápresente em quantidades de dosagem individuais.

As composições farmacêuticas da invenção a seremutilizadas para a administração profilática ou terapêuticadevem ser estéreis. A esterilidade é facilmente obtida pormeio de filtração através das membranas de filtração estéreis(por exemplo, membranas com 0,2 μιη), por irradiação gama oupor quaisquer outros meios apropriados conhecidos por umtécnico no assunto. As composições terapêuticas depolipeptídeo são colocadas geralmente em um recipiente quetem uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco oufrasco de solução intravenosa que tem um bloqueadorperfurável por uma agulha de injeção hipodérmica. Essascomposições serão armazenadas comumente em recipientes dedoses unitários ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolasou frascos vedados, como uma solução aquosa ou como umaformulação liofilizada para reconstituição.

Os compostos podem ser combinados, opcionalmente,com um excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 termo"excipiente farmaceuticamente aceitável" tal como utilizadona presente invenção significa uma ou mais cargas sólidas oulíquidas compatíveis, diluentes ou substâncias deencapsulação que são apropriadas para a administração a umser humano. 0 excipiente contém preferencialmente quantidadesmenores de aditivos tais como as substâncias que intensificama isotonicidade e a estabilidade química. Tais materiais sãoatóxicos aos receptores nas dosagens e concentraçõesempregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato,succinato, acetato, lactato, tartarato e outros ácidosorgânicos ou seus sais; tris-hidróximetilamino metano (TRIS),bicarbonato, carbonato e outras bases orgânicas e seus sais;antioxidantes, tal como o ácido ascórbico; polipeptídeos combaixo peso molecular (por exemplo, menos de aproximadamentedez resíduos), por exemplo, poliarginina, polilisina,poliglutamato e poliaspartato; proteínas, tais como albuminado soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos,tais como a polivinil pirrolidona (PVP), polipropilenoglicóis (PPGs) e polietileno glicóis (PEGs); aminoácidos,tais como a glicina, o ácido glutâmico, o ácido aspártico, ahistidina, a lisina ou a arginina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos que incluem a celulose ouseus derivados, glicose, manose, sacarose, dextrinas ouderivados sulfatados de carboidrato, tais como a heparina, osulfato de condroitina ou o sulfato de dextrano; íons demetais polivalentes, tais como íons de metais divalentes queincluem íons de cálcio, íons de magnésio e íons de manganês;agentes quelantes, tal como o ácido etilenodiaminotetracético(EDTA); álcoois de açúcar, tais como o manitol ou o sorbitol;contra-íons, tais como o sódio ou o amônio; e/ou tensoativosnão-iônicos, tais como os polissorbatos ou poloxâmeros.

Outros aditivos também podem ser incluídos, tais comoestabilizantes, antimicrobianos, gases inertes,reabastecedores de fluidos e de nutrientes (isto é, dextrosede Ringer), reabastecedores de eletrólitos, e outros dogênero, que podem estar presentes em quantidadesconvencionais.

As composições, tal como descritas acima, podem seradministradas em quantidades eficazes. Uma quantidade eficazirá depender do modo de administração, da condição particularque está sendo tratada e do resultado desejado. Também podedepender do estágio da condição, da idade e da condiçãofísica do indivíduo, da natureza da terapia simultânea, setal existir, e de fatores similares conhecidos peloprofissional médico. Para aplicações terapêuticas, essa é aquantidade suficiente para atingir um resultado medicamentedesejável.

Com respeito a um indivíduo que tem uma doença ouum distúrbio ocular, uma quantidade eficaz é suficiente parainduzir choque térmico em pelo menos uma célula de um tecidoocular; suficiente para atrair pelo menos uma célula-troncoao tecido; ou suficiente para estabilizar, retardar oureduzir um sintoma associado a uma patologia ocular.

Geralmente, as doses dos compostos da presente invenção devemser de aproximadamente 0,01 mg/kg por dia a aproximadamente1.000 mg/kg por dia. Espera-se que doses que variam deaproximadamente 50 a aproximadamente 2 000 mg/kg sejamapropriadas. Doses mais baixas irão resultar de determinadasformas de administração, tal como a administraçãointravenosa. Caso uma resposta em um indivíduo sejainsuficiente nas doses iniciais aplicadas, doses maiselevadas (ou doses eficazmente mais elevadas por uma via deaplicação mais localizada e diferente) podem ser empregadasaté o ponto em que a tolerância do paciente permitir.Contempla-se que doses múltiplas por dia atingem os níveissistêmicos apropriados de uma composição da presenteinvenção.

Uma variedade de vias de administração édisponível. Os métodos da invenção, falando de maneira geral,podem ser praticados utilizando qualquer modo deadministração que seja medicamente aceitável, significandoqualquer modo que produza níveis eficazes dos compostosativos sem causar efeitos clinicamente adversos inaceitáveis.Em uma realização preferida, uma composição da invenção éadministrada intra-ocularmente. Outros modos de administraçãoincluem as vias oral, retal, tópica, intraocular, bucal,intravaginal, intracisternal, intracerebroventricular,intratraqueal, nasal, transdermal, implantes dentro/sobre, ouvia parenteral. O termo "parenteral" inclui subcutanêo,intratecal, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal ouinfusão. As composições que compreendem uma composição dainvenção podem ser adicionadas a um fluido fisiológico, talcomo o humor intravitral. A administração oral pode serpreferida para o tratamento profilático por causa daconveniência ao paciente bem como pela programação dedosagem.

As composições farmacêuticas da invenção podemopcionalmente conter adicionalmente uma ou mais proteínasadicionais tal como desejado. As proteínas ou o materialbiológico apropriado podem ser obtidos a partir do plasmahumano ou de mamífero por meio de qualquer um dos métodos depurificação conhecidos e disponíveis a um técnico no assunto;

a partir de sobrenadantes, extratos ou lisatos de cultura detecido recombinante, vírus, levedura, bactérias ou similaresque contêm um gene que expressa uma proteína humana ou demamífero que é introduzida de acordo com técnicas padrão deDNA recombinante; ou a partir de líquidos biológicos humanos(por exemplo, sangue, leite, Iinfa, urina ou similares) ou apartir de animais transgênicos que contêm um gene queexpresse uma proteína humana que é introduzida de acordo comas técnicas transgênicas padrão.

As composições farmacêuticas da invenção podemcompreender um ou mais compostos de tamponamento do pH paramanter o pH da formulação em um nível predeterminado quereflita o pH fisiológico, tal como na faixa deaproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0. O composto detamponamento do pH utilizado na formulação líquida aquosapode ser um aminoácido ou uma mistura de aminoácidos, talcomo a histidina ou uma mistura de aminoácidos tais como ahistidina e a glicina. Alternativamente, o composto detamponamento do pH é preferencialmente um agente que mantém opH da formulação em um nível predeterminado, tal como nafaixa de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 e que nãoquelata íons de cálcio. Os exemplos ilustrativos de taiscompostos de tamponamento do pH incluem, mas sem ficar a eleslimitados, íons de imidazol e de acetato. O composto detamponamento do pH pode estar presente em qualquer quantidadeapropriada para manter o pH da formulação em um nívelpredeterminado.

As composições farmacêuticas da invenção tambémpodem conter um ou mais agentes de modulação osmótica, istoé, um composto que modula as propriedades osmóticas (porexemplo, tonicidade, osmolalidade e/ou pressão osmótica) daformulação a um nível que seja aceitável à corrente sangüíneae às células sangüíneas de indivíduos receptores. O agente demodulação osmótica pode ser um agente que não quelata íons decálcio. O agente de modulação osmótica pode ser qualquercomposto conhecido ou disponível a um técnico no assunto paramodular as propriedades osmóticas da formulação. O técnico noassunto pode determinar empiricamente a adequabilidade de umdeterminado agente de modulação osmótica para o uso naformulação da invenção. Os exemplos ilustrativos de tiposapropriados de agentes de modulação osmótica incluem, mas semficar a eles limitados: sais, tais como o cloreto de sódio eo acetato de sódio; açúcares, tais como a sacarose, adextrose e o manitol; aminoácidos, tal como a glicina; e asmisturas de um ou de mais desses agentes e/ou tipos deagentes. 0(s) agente(s) de modulação osmótica pode(m) estarpresente(s) em qualquer concentração suficiente para modularas propriedades osmóticas da formulação.

As composições que compreendem um composto dapresente invenção podem conter íons de metais multivalentes,tais como íons de cálcio, íons magnésio de e/ou íons demanganês. Qualquer íon de metal multivalente que ajuda aestabilizar a composição e que não afeta adversamente doisindivíduos receptores pode ser utilizado. 0 elemento versadona técnica, com base nestes dois critérios, pode determinaros íons de metal apropriados empiricamente, e as fontesapropriadas de tais íons de metal são conhecidas, e incluemos sais inorgânicos e orgânicos.

As composições farmacêuticas da invenção tambémpodem ser uma formulação líquida não-aquosa. Qualquer líquidonão-aquoso apropriado pode ser empregado, contanto quepropicie estabilidade aos agentes ativos contidos no mesmo.Preferencialmente, o líquido não-aquoso é um líquidohidrofílico. Os exemplos ilustrativos de líquidos não-aquososapropriados incluem: glicerol; sulfóxido de dimetila (DMSO);polidimetil siloxano (PMS); etileno glicóis, tais comoetileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol,polietileno glicol ("PEG") 200, PEG 300 e PEG 400; epropileno glicóis, tais como o dipropileno glicol, otripropileno glicol, polipropileno glicol ("PPG") 425, PPG725, PPG 1000, PPG 2000, PPG 3000 e PPG 4000.

As composições farmacêuticas da invenção tambémpodem ser uma formulação líquida misturada aquosa/não-aquosa.Qualquer formulação líquida não-aquosa apropriada, tais comoaquelas descritas acima, pode ser empregada juntamente comqualquer formulação líquida aquosa, tais como aquelasdescritas acima, contanto que a formulação líquida misturadaaquosa/não-aquosa propicie estabilidade ao composto contidona mesma. Preferencialmente, o líquido não-aquoso em talformulação é um líquido hidrofílico. Os exemplos ilustrativosde líquidos não-aquosos apropriados incluem: glicerol; DMSO;PMS; etileno glicóis, tais como PEG 200, PEG 300 e PEG 400; epropileno glicóis, tais como PPG 425, PPG 725, PPG 1000, PPG2000, PPG 3000 e PPG 4000.

As formulações estáveis apropriadas podem permitira armazenagem dos agentes ativos em um estado líquidocongelado ou descongelado. As formulações líquidas estáveispodem ser armazenadas a uma temperatura de pelo menos -70°C,mas também podem ser armazenadas a temperaturas mais elevadasde pelo menos 0°C ou entre aproximadamente 0°C eaproximadamente 42°C, dependendo das propriedades dacomposição. Um técnico no assunto geralmente sabe que asproteínas e os polipeptídeos são sensíveis às mudanças de pH,temperatura e uma multiplicidade de outros fatores que podemafetar a eficácia terapêutica.Outros sistemas de aplicação podem incluir sistemasde aplicação de liberação controlada, de liberação retardadaou de liberação prolongada. Tais sistemas podem evitaradministrações repetidas das composições da invenção,aumentando a conveniência ao indivíduo e ao médico. Muitostipos de sistemas de aplicação de liberação são disponíveis econhecidos por um técnico no assunto. Eles incluem sistemas abase de polímero tais como polilactídeos (Patente U.S. N°.3.773.919; Patente Européia N°. 58.481), poli(lactídeo-glicolídeo), copolioxalatos, policaprolactonas,poliesteramidas, poliortoésteres, ácidos poliidróxibutíricos, tais como o ácido poli-D-(-)-3-hidróxi butírico(Patente Européia N°. 133.988), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman, K. R. et al. ,Biopolymers 22:547-556), poli (metacrilato de 2-hidroxietila)ou etileno vinil acetato (Langer, R. et al. , J. Biomed.Mater. Res. 15: 267-277; Langer, R. Chem. Tech. 12: 98-105) epolianidridos.

Outros exemplos de composições de liberaçãoprolongada incluem matrizes de polímero semi-permeáveis naforma de artigos moldados, por exemplo, películas oumicrocápsulas. Os sistemas de aplicação também incluemsistemas de não-polímeros que incluem: lipídeos que incluemesteróis tais como o colesterol, ésteres de colesterol eácidos graxos ou gorduras neutras tais como di- mono- etriglicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel tais como ohidrogel bio-reabsorvível derivado biologicamente (isto é,hidrogéis de quitina ou hidrogéis de quitosana); sistemassilásticos; sistemas a base de peptídeo; revestimentos decera; tabletes comprimidos que utilizam aglutinantes eexcipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos; eoutros do gênero. Os exemplos específicos incluem, mas semficar a eles limitados: (a) sistemas erosionais em que oagente é contido em uma forma dentro de uma matriz tal comoaquelas descritas nas Patentes U.S. N°. 4.452.775, 4.667.014,4.748.034 e 5.239.660 e (b) sistemas difusionais em que umcomponente ativo permeia a uma taxa controlada a partir de umpolímero tal como descrito nas Patentes U.S. N°. 3.832.253 e3.854.480.

Um outro tipo de sistema de aplicação que pode serutilizado com os métodos e as composições da invenção é umsistema de dispersão coloidal. Os sistemas de dispersãocoloidal incluem sistemas a base de lipideo que incluememulsões de óleo-em-água, micelas, micelas misturadas elipossomos. Os lipossomos são vasos artificiais da membrana,que são úteis como um vetor de aplicação in vivo ou in vitro.

Os vasos unilamelares grandes (LUV, sigla em inglês), quevariam no tamanho de 0,2 - 4,0 μτη, podem encapsularmacromoléculas grandes dentro do interior aquoso e podem seraplicados às células em uma forma biologicamente ativa(Fraley, R. e Papahadjopoulos, D., Trends Biochem. Sci 6: 77-80).

Os lipossomos podem ser alvejados a um tecidoparticular ao acoplar o lipossomo a um ligante específico talcomo um anticorpo, um açúcar, um glicolipídeo ou uma proteínamonoclonal. Os lipossomos estão comercialmente disponíveisjunto à Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN™ eLIPOFECTACE™, que são formados de lipídeos catiônicos taiscomo cloreto de N-[1-(2,3-dioleilóxi)-propil]-Ν,N,N-trimetilamônio (DOTMA) e brometo de dimetildioctadecilamônio(DDAB). Os métodos para a elaboração de lipossomos são bemconhecidos no estado da técnica e foram descritos em muitaspublicações, por exemplo, na patente DE 3.218.121; Epstein etal., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 82:3688-3692 (1985); Hwanget al., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 77:4030-4034 (1980); EP52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedidode Patente Japonês 83-118008; Patente U.S. N°. 4.485,045 e4.544.545; e EP 102.324. Os lipossomos também foram revistospor Gregoriadis, G., Trends Biotechnol., 3:235-241).

Um outro tipo de veículo é uma micropartícula ou umimplante biocompatível que é apropriado para o implantação noreceptor mamífero. Os implantes bioerodíveis exemplificadoresque são úteis de acordo com este método são descritos noPedido Internacional PCT N°. PCT/US/03307 (Publicação WO N°.95/24929, intitulada "Polymeric Gene Delivery System"). 0documento PCT/US/0307 descreve matrizes poliméricasbiocompatíveis, preferencialmente biodegradáveis para conterum gene exógeno sob o controle de um promotor apropriado. Asmatrizes poliméricas podem ser utilizadas para obter aliberação prolongada do gene ou do produto exógeno do gene noindivíduo.

A matriz polimérica está preferencialmente na formade uma micropartícula, tal como uma microesfera (em que umagente é disperso em toda uma matriz polimérica sólida) ouuma microcápsula (em que um agente é armazenado no núcleo deum escudo polimérico). As microcápsulas dos polímerosantecedentes que contêm drogas são descritas, por exemplo, naPatente U.S. N°. 5.075.109. Outras formas de matrizpolimérica para conter um agente incluem películas,revestimentos, géis, implantes e stents. 0 tamanho e acomposição do dispositivo da matriz polimérica sãoselecionados para resultar em cinética de liberação favorávelno tecido em que a matriz é introduzida. 0 tamanho da matrizpolimérica adicional é selecionado de acordo com o método deaplicação que deve ser utilizado. Preferencialmente, quandouma via em aerossol é utilizada, a matriz polimérica e acomposição são englobadas em um veículo tensoativo. Acomposição da matriz polimérica pode ser selecionada para quetenha ambas as taxas de degradação favoráveis e também queseja formada de um material que seja bioaderente, paraaumentar adicionalmente a eficácia de transferência. Acomposição da matriz também pode ser selecionada para não sedegradar, mas em vez disso, para ser liberada por meio dedifusão durante um período de tempo prolongado. 0 sistema deaplicação também pode ser uma microesfera biocompatível queseja apropriada para aplicação local específica de sítio.Tais microesferas são descritas em Chickering, D. E., et al. ,Biotechnol. Bioeng., 52:96-101; Mathiowitz, E., et al. ,Nature 386: 410-414.

Ambas as matrizes poliméricas biodegradáveis e não-biodegradáveis podem ser utilizadas para aplicar ascomposições da invenção ao indivíduo. Tais polímeros podemser polímeros naturais ou sintéticos. 0 polímero éselecionado com base no período de tempo em que a liberação édesejada, geralmente da ordem de algumas horas a um ano oumais. Tipicamente, a liberação durante um período que variaentre algumas horas e três a doze meses é a mais desejável. 0polímero está opcionalmente na forma de um hidrogel que podeabsorver até aproximadamente 90% de seu peso em água e,adicionalmente, é opcionalmente reticulado com íonsmultivalentes ou outros polímeros.

Exemplos de polímeros sintéticos que podem serutilizados para formar o sistema de aplicação biodegradávelincluem: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos,polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatosde polialquileno, álcoois polivinílicos, éterespolivinílicos, ésteres polivinílicos, haletos polivinílicos,polivinil pirrolidona, poliglicolídeos, polissiloxanos,poliuretanos e co-polímeros dos mesmos, alquil celulose,hidróxialquil celulose, éteres de celulose, ésteres decelulose, nitrocelulose, polímeros de ésteres acrílicos emetacrílicos, metil celulose, etil celulose, hidróxipropilcelulose, hidróxipropilmetil celulose, hidróxibutilmetilcelulose, acetato de celulose, propionato de celulose,acetato de butirato de celulose, acetato de ftalato decelulose, carbóxietil celulose, triacetato de celulose, salde sulfato de sódio de celulose, poli(metacrilato de metila),poli(metacrilato de etila), poli(metacrilato de hexila) ,poli(metacrilato de isobutila), poli(metacrilato de hexila) ,poli(metacrilato de isodecila), poli(metacrilato de laurila),poli(metacrilatode fenila), poli(acrilato de metila), poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila),poli(acrilato de octadecila), polietileno, polipropileno,poli(etileno glicol), óxido de poli(etileno), tereftalato depoli(etileno), álcoois poli(vinilicos), acetato depolivininila, cloreto de polivinila, poliestireno, polivinilpirrolidona e polímeros de ácido láctico e de ácidoglicólico, polianidridos, poli(orto)éster, ácidopoli(bútico), ácido poli(valérico) e poli(lactídeo-cocaprolactona) e polímeros naturais tais como o alginato eoutros polissacarídeos que incluem o dextrano e a celulose,colágeno, derivados químicos dos mesmos (substituições,adições de grupos químicos, por exemplo, alquila, alquileno,hidroxilações, oxidações e outras modificações feitasrotineiramente por um técnico no assunto), albumina e outrasproteínas hidrofílicas, zeína e outras prolaminas e proteínashidrofóbicas, copolímeros e misturas dos mesmos. Em geral,estes materiais se degradam pela hidrólise enzimática ou pelaexposição à água in vivo, pela erosão da superfície ou emmassa.

Métodos de Aplicação Ocular

As composições da invenção são aplicadastipicamente ao olho para o tratamento de uma doença ocular(por exemplo, a retinopatia diabética, neovascularizaçãocoroidal, glaucoma retinite pigmentosa, degeneração macularrelacionada à idade, glaucoma, distrofias corneais,retinosquise, mal de Stargardt, drusas autossômicasdominantes e distrofia macular de Best, edema macularcistóide, descolamento da retina, danos fóticos, retinopatiasisquêmicas, doença degenerativa da retina induzida porinflamação, retinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma,Malattia Leventinese (ML) e distrofia retiniana em favo demel de Doyne). Em uma realização, uma composição da invençãoé administrada através de um dispositivo ocular apropriadopara o implante direto no vítreo do olho. As composições dainvenção podem ser fornecidas em composições de liberaçãoprolongada, tais como aquelas descritas, por exemplo, nasPatentes U.S. N°. 5.672.659 e 5.595.760. Foi verificado quetais dispositivos propiciam uma liberação controlada eprolongada de várias composições para tratar o olho sem riscode efeitos colaterais locais e sistêmicos prejudiciais. Umobjeto do presente método ocular de aplicação é a maximizaçãoda quantidade de droga contida em um dispositivo ou em umimplante intraocular ao minimizar seu tamanho a fim deprolongar a duração do implante. Vide, por exemplo, asPatentes U.S. N°. 5.378.475; 6.375.972 e 6.756.058 e asPublicações U.S. 20050096290 e 200501269448.· Tais implantespodem ser implantes biocompativeis e/ou biodegradáveis oupodem ser implantes não-biodegradáveis. Os implantes ocularesbiodegradáveis são descritos, por exemplo, na Publicação dePatente U.S. N°. 20050048099. Os implantes podem serpermeáveis ou impermeáveis ao agente ativo e podem serintroduzidos em uma câmara do olho, tal como as câmarasanterior ou posterior ou podem ser implantados na esclera, noespaço transcoroidal ou na região avascularizada externa aovitreo. Alternativamente, uma lente de contato que aja comoum depósito para composições da invenção também pode serutilizada para a aplicação da droga.Em uma realização preferida, o implante pode serposicionado sobre uma região avascular, tal como na esclera,para permitir a difusão transcleral da droga ao sitio detratamento desejado, por exemplo, o espaço e a máculaintraocular do olho. A aplicação transcleral minimamenteinvasiva pode ser utilizada para aplicar uma quantidadeeficaz dos compostos ativos à retina com absorção sistêmicainsignificante. A aplicação transcleral utiliza a área desuperfície grande e acessível da esclera, o grau elevado dehidratação que a torna condutora às substâncias solúveis emágua, hipocelularidade com uma escassez correspondente deenzimas proteolíticas e do sítio de ligação de proteína e apermeabilidade que não declina apreciavelmente com a idade.

Uma bomba osmótica carregada com os compostos ativos pode serimplantada em um indivíduo de modo que os compostos ativossejam aplicados transcleralmente à retina em um modo deliberação retardada. (Ambati, et al., Invest. Ophthalmol.Vis. Sci., 41: 1186-91 (2000)). Além disso, o sítio dedifusão transcleral fica preferencialmente nas proximidadesda mácula. Os exemplos de implantes para a aplicação de umacomposição incluem, mas sem ficar a eles limitados, osdispositivos descritos nas Patentes U.S N° 3 . 416.530;3 . 828 . 777; 4 . 014 .335; 4.300.557; 4 327 . 725 4 . 853.224;4 . 946 . 450; 4 . 997 . 652; 5 .147.647; 5 164 . 188 5 . 178 . 635;5 .300, 114 ; 5 . 322 . 691; 5 .403.901; 5 443 . 505 5 . 466 .466;5 .476 . 511; 5 . 516 .522; 5.632.984; 5 679 . 666 5 . 710.165;5 . 725 . 4 93 ; 5 . 743 . 274 ; 5 . 766 . 242; 5 766 . 619 5 . 770.592;5 . 773 . 019; 5 . 824 . 072; 5.824.073; 5 830 . 173 5 . 836.935;5 . 869 . 079, 5 . 902 . 598; 5.904.144; 5 916 . 584 6 . 001.386;6 . 074 . 661; 6 . 110 . 485; 6 .126.687; 6 .14 6.3 66; 6 . 251 .090; e6 .299. 895 e no pedido de patente WO 01/30323 e no pedido de patente WO 01/28474, os quais são incorporados na presenteinvenção a título de referência.Os exemplos incluem, mas sem ficar a eleslimitados, os seguintes: um sistema de aplicação de droga deliberação prolongada que compreende um reservatório internoque compreende uma quantidade eficaz de um agente eficaz naobtenção de um efeito fisiológico ou farmacológico local ousistêmico desejado, um tubo interno impermeável à passagem doagente, sendo que o tubo interno tem uma primeira e umasegunda extremidades e cobre pelo menos uma porção doreservatório interno, sendo que o tubo interno é feito sob medida e é formado de um material de modo que o tubo internopossa suportar o seu próprio peso, um elemento impermeávelposicionado na primeira extremidade do tubo interno, sendoque o elemento impermeável previne a passagem do agente forado reservatório através da primeira extremidade do tubointerno e um elemento permeável posicionado na segundaextremidade externa do tubo interno, sendo que o elementopermeável permite a difusão do agente fora do reservatórioatravés da segunda extremidade do tubo interno; um métodopara a administração de um composto da invenção a um segmento de um olho, sendo que o método compreende a etapa deimplantar um dispositivo de liberação prolongada paraaplicação do composto da invenção no vitreo do olho ou umdispositivo implantável de liberação prolongada para aadministração de um composto da invenção a um segmento de umolho; um dispositivo de liberação prolongada de droga quecompreende: a) um núcleo da droga que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um primeiroagente eficaz na obtenção de um efeito diagnóstico ou eficazna obtenção de um efeito desejado fisiológico oufarmacológico local ou sistêmico; b) pelo menos um "copo"unitário essencialmente impermeável à passagem do agente quecircunda e define um compartimento interno para aceitar onúcleo da droga, sendo que o "copo" unitário compreende umaextremidade superior aberta com pelo menos um sulco embutidoem torno de pelo menos uma porção da extremidade superioraberta do "copo" unitário; c) um plugue permeável que épermeável à passagem do agente, sendo que o plugue permeávelé posicionado na extremidade superior aberta do "copo"unitário, sendo que o sulco interage com o plugue permeávelmantendo o mesmo na posição e fechando a extremidade superioraberta, o plugue permeável permite a passagem do agente forado núcleo da droga, através do plugue permeável e para forada extremidade superior aberta do "copo" unitário; e d) pelomenos um segundo agente eficaz na obtenção de um efeitodiagnóstico ou eficaz na obtenção de um efeito fisiológico oufarmacológico local ou sistêmico desejado; ou um dispositivode liberação prolongada de droga que compreende: um núcleointerno que compreende uma quantidade eficaz de um agente quetem uma solubilidade desejada e uma camada de revestimento depolímero, sendo que a camada do polímero é permeável aoagente, em que a camada de revestimento de polímero cobrecompletamente o núcleo interno.

Outras abordagens para a aplicação ocular incluem ouso de lipossomos para alvejar um composto da presenteinvenção ao olho e preferencialmente às células epiteliaispigmentares da retina, células coroidais e/ou membrana deBruch. Por exemplo, o composto pode ser complexado com oslipossomos na maneira descrita acima e esse complexo decomposto/lipossomo é injetado em pacientes com uma doençaocular, utilizando a injeção intravenosa para dirigir ocomposto ao tecido ou à célula ocular desejada. A injeçãodireta do complexo do lipossomo em proximidade às célulasepiteliais pigmentares da retina ou à membrana de Bruchtambém pode propiciar o alvejamento do complexo. Em umarealização específica, o composto é administrado através deaplicação intraocular prolongada (tal como VITRASERT ouENVISION). Em uma realização específica, o composto éaplicado por meio de injeção subcutânea posterior. Em umaoutra realização específica, as partículas de microemulsãoque contêm as composições da invenção são aplicadas ao tecidoocular para a extração de lipídeos da membrana de Bruch, dascélulas epiteliais do pigmento da retina, ou de ambas.

As nanopartículas consistem em um sistema deveículo coloidal que demonstraram melhorar a eficácia dadroga encapsulada ao prolongar a vida média do soro. Asnanopartículas de polialquilcianoacrilatos (PACA) são umsistema polimérico coloidal de aplicação de droga que está emdesenvolvimento clínico, tal como descrito por Stella et al.,J. Pharm. Sci., 2000. 89: páginas 1452-1464; Brigger et al.,Int. J. Pharm., 2001. 214: páginas 37-42; Calvo et al. ,Pharm. Res., 2001. 18: páginas 1157-1166; e Li et al., Biol.Pharm. Bull., 2001. 24: páginas 662-665. Os poli-hidróxiácidos biodegradáveis, tais como os copolímeros de ácidopoliláctico (PLA) e de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA)estão sendo utilizados extensivamente em aplicaçõesbiomédicas e receberam a aprovação do FDA para determinadasaplicações clínicas. Além disso, as nanopartículas de PEG-PLGA têm muitas características de veículo desejáveisincluindo (i) que o agente a ser encapsulado compreende umafração razoavelmente elevada de peso (carregamento) dosistema de veículo total; (ii) que a quantidade de agenteutilizada na primeira etapa do processo de encapsulação éincorporada no veículo final (a eficiência de captura) em umnível razoavelmente elevado; (iii) que o veículo pode sercongelado a seco e ser reconstituído na solução semagregação; (iv) que o veículo é biodegradável; (v) que osistema de veículo é de tamanho pequeno; e (vi) que o veículointensifica a persistência das partículas.

As nanopartículas são sintetizadas utilizandovirtualmente qualquer escudo biodegradável conhecido noestado da técnica. Em uma realização, um polímero, tal comoácido poliláctico (PLA) ou ácido poliláctico-co-glicólico(PLGA) é utilizado. Tais polímeros são biocompatíveis ebiodegradáveis e estão sujeitos às modificações que aumentamdesejavelmente a eficácia fotoquímica e o período decirculação da nanopartícula. Em uma realização, o polímero émodificado com um grupo terminal de ácido carboxílico (COOH)que aumenta a carga negativa da partícula e limita desse modoa interação com aptâmeros de ácido nucléico carregadosnegativamente. As nanopartículas também são modificadas compolietileno glicol (PEG), que também aumenta a vida média e aestabilidade das partículas em circulação. Alternativamente,o grupo COOH é convertido em um éster de N-hidróxisuccinimida (NHS) para a conjugação covalente aos aptâmerosmodificados por amina.

Os polímeros biocompatíveis úteis na composição enos métodos da invenção incluem, mas sem ficar a eleslimitados, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos,polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatosde polialquileno, álcoois polivinílicos, éterespolivinílicos, ésteres polivinílicos, haletos polivinílicos,polivinil pirrolidona, poliglicolídeos, polissiloxanos,poliuretanos e copolímeros dos mesmos, alquil celulose,hidróxialquil celulose, éteres de celulose, ésteres decelulose, nitrocelulose, polímeros de ésteres acrílicos emetacrílicos, metil celulose, etil celulose, hidróxipropilcelulose, hidróxipropilmetil celulose, hidróxibutilmetilcelulose, acetato de celulose, propionato de celulose,butirato de acetato de celulose, ftalato de acetato decelulose, carbóxi etil celulose, triacetato de celulose, salde sulfato de sódio de celulose, poli(metacrilato de metila),poli(metacrilato de etila), poli(metacrilato de butila),poli(metacrilato de isobutila), poli(metacrilato de hexila) ,poli(metacrilato de isodecila), poli(metacrilato de laurila),poli(metacrilato de fenila), poli(acrilato de metila),poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila),poli(acrilato de octadecila), polietileno, polipropileno,poli(etileno glicol), óxido de poli(etileno), tereftalato depoli(etileno), álcoois poli(vinílicos), acetatopoli(vinílico), cloreto polivinilico, poliestireno, polivinilpirrolidona, ácidos poliialurônicos, caseína, gelatina,glutina, polianidridos, ácido poliacrilico, alginato,quitosana, poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato deetila), poli(metacrilato de butila), poli(metacrilato deisobutila), poli(metacrilato de hexila), poli(metacrilato deisodecila), poli(metacrilato de laurila), poli(metacrilato defenila), poli(acrilato de metila), poli(acrilato deisopropila), poli(acrilato de isobutila), poli(acrilato deoctadecila), e as combinações de qualquer um destes. Em umarealização, as nanoparticulas da invenção incluem polímerosde PEG-PLGA.

As composições da invenção também podem seraplicadas topicamente. Para a aplicação tópica, ascomposições são fornecidas em qualquer excipientefarmaceuticamente aceitável que seja aprovado para aaplicação ocular. Preferencialmente, a composição é aplicadana forma de gotas à superfície do olho. Para algumasaplicações, a aplicação da composição é baseada na difusãodos compostos através da córnea ao interior do olho.

Técnicos no assunto irão reconhecer que os melhoresregimes de tratamento para o uso dos compostos da presenteinvenção para o tratamento de uma doença ocular podem serdiretamente determinados. Esta não é uma questão deexperimentação, mas sim de otimização, que é conduzidarotineiramente nas artes médicas. Estudos in vivo emcamundongos nús freqüentemente fornecem um ponto de partida apartir do qual se começa a otimizar os regimes de dosagem ede aplicação. A freqüência das injeções será inicialmente umavez por semana, tal como foi feito em alguns estudos comcamundongos. No entanto, essa freqüência pode serfavoravelmente ajustada de um dia ou quinzenalmente ou até ummês, dependendo dos resultados obtidos a partir dasexperimentações clinicas iniciais e das necessidades de umpaciente particular.

As quantidades de dosagem humana podem serinicialmente determinadas ao extrapolar a quantidade decomposto utilizada nos camundongos, tal como um técnico noassunto reconhece que é rotina no estado da técnica amodificação da dosagem para os seres humanos em comparaçãoaos modelos animais. Em determinadas realizações previstas adosagem pode variar entre aproximadamente 1 mg de composto/kgde peso corpóreo a aproximadamente 5.000 mg/kg de pesocorpóreo; ou de aproximadamente 5 mg/Kg de peso corpóreo aaproximadamente 4.000 mg/Kg de peso corpóreo ou deaproximadamente 10 mg/Kg de peso corpóreo a aproximadamente3.000 mg/Kg de peso corpóreo; ou de aproximadamente 50 mg/Kgde peso corpóreo a aproximadamente 2.000 mg/Kg de pesocorpóreo; ou de aproximadamente 100 mg/Kg de peso corpóreo aaproximadamente 1.000 mg/Kg de peso corpóreo; ou deaproximadamente 150 mg/Kg de peso corpóreo a aproximadamente500 mg/Kg de peso corpóreo. Em outras realizações, essa dosepode ser de aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150,200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100, 1.150, 1.200, 1.250,1.300, 1.350, 1.400, 1.450, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800,1.900, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500 e 5.000 mg/kgde peso corpóreo. Em outras realizações, comtempla-se quedoses mais elevadas podem ser utilizadas, sendo que taisdoses podem estar na faixa de aproximadamente 5 mg decomposto/kg corpo a aproximadamente 2 0 mg de composto/kgcorpo. Em outras realizações, as doses podem ser deaproximadamente 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 mg/Kg de pesocorpóreo. Naturalmente que essa quantidade de dosagem podeser ajustada para cima ou para baixo, tal como é feitorotineiramente em tais protocolos de tratamento, dependendodos resultados das experimentações clínicas iniciais e dasnecessidades de um paciente particular.

Terapias de Combinação

As composições e os métodos da invenção podem seradministrados em combinação com qualquer terapia padrãoconhecida no estado da técnica. Caso desejado, um agente queinduz choque térmico em um tecido ocular ou um regime delaser sublimiar (descrito na presente invenção) éadministrado juntamente com um agente que promove orecrutamento, a sobrevivência, a proliferação ou atransdiferenciação de uma célula-tronco (por exemplo, umacélula-tronco hematopoiética). Tais agentes incluemcolágenos, fibronectinas, lamininas, integrinas, fatoresangiogênicos, fatores antiinflamatórios, glicosaminoglicanos,vitrogênio, anticorpos e fragmentos dos mesmos, equivalentesfuncionais destes agentes, e as combinações dos mesmos.

Em outras realizações, um agente que induz o choquetérmico em um tecido ocular ou um regime de laser sublimiar(descrito na presente invenção) da invenção é administrado emcombinação com um composto antiinflamatório que éadministrado convencionalmente para o tratamento de umadoença ocular. Tais compostos antiinflamatórios incluem, massem ficar a eles limitados, qualquer um ou mais de compostosesteroidais e não esteroidais e os exemplos incluem:

Alclofenaco; Dipropionato de Alclometasona; Algestonaacetonida; Alfa Amilase; Ancinafal; Ancinafida; Anfenacosódico ; hidrocloridrato de Amiprilose; Anakinra; Anirolaco;Anitrazafeno; Apazona; Balsalazida Dissódica; Bendazaco;Benoxaprofeno; hidrocloridratro de Benzidamina; Bromelaínas;Broperamol; Budesonida; Carprofeno; Cicloprofeno; Cintazona;Cliprofeno; Propionato de Clobetasol; Butirato deClobetasona; Clopiraeo; Propionato de Cloticasona; Acetato deCormetasona; Cortodoxona; Deflazaeorte; Desonida;Desoximetasona; Dipropionato de Dexametasona; Diclofenaeopotássico; Diclofenaeo sódico; Diacetato de Diflorasona;Diflumidona sódica; Diflunisal; Difluprednato; Diftalona;Dimetilsulfóxido; Drocinonida; Endrisona; Enlimomab; Enolicansódico; Epirizol; Etodolaco; Etofenamato; Felbinaco; Fenamol;Fenbufeno; Fenclofenaco; Fencloraco; Fendosal; Fenpipalona;Fentiazaco; Flazalona; Fluazacorte; Ácido Flufenâmico;Flumizol; Acetato de Flunisolida; Flunixina; MegluminaFlunixina; Fluocortina de Butila; Acetato de Fluorometolona;Fluquazona; Flurbiprofeno; Fluretofeno; Propionato deFluticasona; Furaprofeno; Furobufeno; Halcinonida; Propionatode Halobetasol; Acetato de Halopredona; Ibufenaco;Ibuprofeno; Ibuprofeno de Alumínio; Ibuprofeno de Piconol;Ilonidape; Indometacina; Indometacina sódica; Indoprofeno;Indoxol; Intrazol; Acetato de Isoflupredona; Isoxepaco;Isoxicam; Cetoprofeno; hidrocloridrato de Lofemizol;Lornoxicam; Etabonato de Loteprednol; Meclofenamato de Sódio;Ácido Meclofenâmico; Dibutirato de Meclorisona; ÁcidoMefenâmico; Mesalamina; Meseclazona; Suleptanato deMetilprednisolona; Morniflumato; Nabumetona; Naproxeno;Naproxeno Sódico; Naproxol; Nimazona; Olsalazina Sódica;Orgoteína; Orpanoxina; Oxaprozina; Oxifenbutazona;hidrocloridrato de Paranilina; Polissulfato de Pentosanasódico; Glicerato sódico de Fenbutazona; Pirfenidona;Piroxicam; Cinamato de Piroxicam; Piroxicam Olamina;Pirprofeno; Prednazato; Prifelona; Ácido Prodólico;Proquazona; Proxazol; Citrato de Proxazol; Rimexolona,·Romazarite; Salcolex; Salnacedina; Salsalato; Cloreto deSanguinarina; Seelazona; Sermetaeina; Sudoxicam; Sulindaco;Suprofeno; Talmetacina; Talniflumato; Talosalato; Tebufelona;

Tenidape; Tenidape sódieo; Tenoxieam; Tesieam; Tesimida;Tetridamina; Tiopinaeo; Pivalato de Tixocortol; Tolmetina;Tolmetina sódiea; Trielonida; Triflumidato; Zidometaeina; ouZomepiraeo sódieo.

Além disso, em outras realizações, um agente queinduz o choque térmico em um tecido ocular ou em um regime delaser sublimiar da invenção é administrado em combinação comum agente que aumenta ou diminui a angiogênese em um tecidoocular. Tais agentes têm a capacidade de modular a expressãoou a atividade de um fator angiogênico, tal como o fator decrescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimentode fibroblastos básico (bFGF), bFGF-2, leptinas, ativadoresde plasminogênio (tPA, uPA), angiopoietinas, lipoproteina A,fator de crescimento transformador β, bradiquinina,oligossacarídeos angiogênicos (por exemplo, hialuronana,sulfato de heparana), trombospondina, fator de crescimento dehepatócitos (também conhecido como fator de dispersão) emembros da família do receptor de quimiocina CXC.

Em outras realizações, os agentes e os métodos sãoadministrados conjuntamente com os agentes quimioterápicosque intensificam a mobilização de células-tronco derivadas damedula óssea, incluindo citoxano, ciclofosfamida, VP-16 ecitocinas tais como GM-CSF, G-CSF ou combinações dos mesmos.

As combinações da invenção podem ser administradassimultaneamente ou dentro de algumas horas, dias ou semanasumas das outras. Em uma abordagem, um agente que induz ochoque térmico em um tecido ocular ou um regime de lasersublimiar (descrito na presente invenção) é administradoantes, simultaneamente com ou depois da administração de umaterapêutica convencional descrita na presente invenção. Emalgumas realizações, pode ser desejável a mobilização de umacélula derivada da medula óssea antes da indução de choquetérmico, onde tal mobilização aumenta o número das células-tronco recrutadas para o tecido ocular. Em outrasrealizações, pode ser preferível a administração do agenteque mobiliza uma célula derivada da medula ósseasimultaneamente com ou após (por exemplo, dentro de uma,duas, três, cinco ou dez horas) a indução do choque térmico.

Métodos para Aumentar o Recrutamento de Células-tronco em um Tecido Ocular

Conforme relatado na presente invenção, a induçãode choque térmico em um tecido ocular recruta eficazmentecélulas-tronco (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas)para esse tecido, onde melhoram uma doença ou um distúrbioocular. Caso desejado, as células-tronco substancialmentepurificadas (ou seu precursor ou outras células progenitoras)são administradas ao paciente conjuntamente com um agente ouregime de tratamento (por exemplo, tratamento com lasersublimiar) que induz o choque térmico em um tecido ocularpara facilitar o reparo de um tecido ocular. Tais métodospodem ser utilizados para intensificar o reparo de um tecidoocular ao aumentar o recrutamento de células-tronco nessetecido.

Os métodos de isolamento de células-troncohematopoiéticas são conhecidos no estado da técnica. Em umarealização, as células-tronco hematopoiéticas são isoladas dosangue utilizando a aferese. A aferese para leucócitos totaiscomeça quando a contagem de leucócitos totais é deaproximadamente 500-2.000 células/μΐ e a contagem deplaquetas é de aproximadamente 50.000/μ1. As amostras podemser monitoradas para a presença de células CD34+ e/ou Thy-I+para determinar o pico de mobilização de células-tronco e,desse modo, o momento mais favorável para colher as células-tronco sangüíneas periféricas. Várias técnicas podem serempregadas para separar as células ao inicialmente remover ascélulas de linhagem dedicada (células "empenhadas nalinhagem")., caso desejado. Os anticorpos monoclonais sãoparticularmente úteis para identificar os marcadoresassociados com as linhagens de células particulares e/ouestágios de diferenciação. Os anticorpos podem ser unidos aum suporte sólido para permitir a separação bruta. Astécnicas de separação empregadas devem maximizar aviabilidade da fração a ser coletada.

O uso de técnicas de separação inclui aquelasbaseadas nas diferenças nas propriedades físicas (porexemplo, densidade do gradiente de centrifugação epurificação centrífuga de contrafluxo), nas propriedades desuperfície das células (afinidade da lectina e do anticorpo)e nas propriedades de tingimento vitais (tingimento deligação de mitocôndrias Rodamina 123 e tingimento de ligaçãode DNA Hoechst 33342) . Outros procedimentos para a separaçãoque pode ser utilizada incluem a separação magnética,utilizando grânulos magnéticos revestidos por anticorpos, acromatografia de afinidade, agentes citotóxicos unidos a umanticorpo monoclonal ou utilizados conjuntamente com umanticorpo monoclonal, incluindo complemento e citotoxinas, e"fritar" com o anticorpo unido a uma matriz sólida, ouqualquer outra técnica conveniente. As técnicas que propiciama separação exata incluem a citometria de fluxo (por exemplo,a citometria de fluxo que utiliza uma pluralidade de canaisde cores, canais de detecção de ângulo baixo e de difusão deluz obtusa, canais de impedância).

Uma grande proporção de células diferenciadas podeser removida de uma amostra utilizando uma separaçãorelativamente bruta, onde as linhagens principais dapopulação de células do sistema hematopoiético, tais como aslinfociticas e mielomonocíticas, são removidas, bem como aspopulações linfociticas, tais como as célulasmegacariociticas, mastócitos, eosinófilos e basófilos.Geralmente, pelo menos aproximadamente 70 a 90 por cento dascélulas hematopoiéticas são removidos.

Concomitante ou subseqüentemente a uma separaçãobruta que resulta em uma seleção positiva, por exemplo,utilizando o marcador CD34, uma seleção negativa pode serexecutada, na qual os anticorpos para os marcadoresespecíficos de linhagem presentes nas células dedicadas sãoempregados. Em sua maior parte, esses marcadores incluem CD2"CD3", CDl', CD8", CD10", CD14", CD15", CD16", CD19", CD20",CD33", CD38", CD71", HLA-DR" e glicoforina A; incluindopreferencialmente pelo menos CD2", CD14", CD15", CD16", CD19" eglicoforina A; e normalmente incluindo pelo menos CD14" eCD15". Tal como utilizado na presente invenção, Lin" refere-sea uma população de células que não tem pelo menos um marcadorespecífico de linhagem.

As células-tronco purificadas têm perfis dedispersão lateral baixo e perfis de baixo a médio dedispersão frontal pela análise de FACS. As preparações deCitospina mostram que as células-tronco enriquecidas têm umtamanho entre as células linfóides maduras e os granulócitosmaduros. As células podem ser selecionadas com base naspropriedades de dispersão da luz bem como a sua expressão devários antígenos de superfície da célula.

Preferencialmente, as células são separadasinicialmente por uma separação grosseira, seguida por umaseparação fina, com a seleção positiva de um marcadorassociado com as células-tronco e a seleção negativa para osmarcadores associados com as células empenhadas na linhagem.As composições altamente enriquecidas em células-tronco podemser obtidas dessa maneira.

As células-tronco purificadas ou parcialmentepurificadas são então administradas ao paciente. Aadministração pode ser local (por exemplo, por meio daadministração direta ao humor vítreo ou a um vaso fornecedorde um tecido ocular de interesse), ou pode ser sistêmica.

Terapia de Polinucleotideos para Induzir o Choquetérmico

A terapia de polinucleotídeos que caracteriza umpolinucleotideo que codifica uma proteína, variante de Hsp oufragmento do mesmo ou uma proteína com capacidade de ativar ochoque térmico é uma outra abordagem terapêutica para otratamento de uma doença ocular. Alternativamente, ospolinucleotídeos codificam os polipeptídeos terapêuticos queintensificam o recrutamento, a sobrevivência, a proliferaçãoou a diferenciação de células-tronco ou então melhoram umsintoma associado com a doença ocular (por exemplo, reduzem ainflamação, a angiogênese ou a morte de células) . Casodesejado, uma célula-tronco da invenção é modificadageneticamente para expressar uma molécula bioativa ou aproteína heteróloga ou para superexpressar uma proteínaendógena. A célula pode carregar as informações genéticasrequeridas para a sobrevivência da célula, do tecido ou doórgão a longo prazo ou para detectar ou monitorar as células.Em um exemplo, a célula é modificada geneticamente paraexpressar uma molécula bioativa que promove a angiogênese. Emum outro exemplo, as células são modificadas geneticamentepara expressar um marcador de proteína fluorescente. Exemplosde marcadores incluem GFP, EGFP, BFP, CFP, YFP e RFP. Taispolinucleotídeos podem ser aplicados às células de umindivíduo que tem uma doença ocular onde a expressão dasproteínas recombinantes tem um efeito terapêutico. Porexemplo, as moléculas de ácido nucléico que codificam ospolipeptídeos terapêuticos são aplicadas às células-tronco,tais como as células-tronco derivadas da medula óssea,células-tronco hematopoiéticas, seus precursores ouprogenitores. Em outras abordagens, as moléculas de ácidonucléico são aplicadas às células de um tecido ocular, taiscomo a retina, o epitélio pigmentar ou a coróide da retina.As moléculas de ácido nucléico devem ser aplicadas às célulasde um indivíduo de maneira possam ser extraídas para queníveis terapeuticamente eficazes de polipeptídeosterapêuticos (por exemplo, proteína Hsp, tal como Hsp 70, Hsp90) ou fragmentos das mesmas possam ser produzidos.

Existe uma variedade de sistemas de expressão paraa produção dos polipeptídeos da invenção. Os vetores deexpressão úteis para a produção de tais polipeptídeosincluem, sem limitação, vetores cromossomais, epissomais ederivados de vírus, por exemplo, vetores derivados deplasmídeos bacterianos, bacteriófagos, transposons, epissomosde levedura, elementos de inserção, elementos cromossomais delevedura, vírus tais como os baculovírus, Papova vírus, taiscomo SV4 0, vírus da varíola bovina, adenovírus, vírus davaríola aviária, vírus e retrovírus da pseudoraiva, e vetoresderivados das combinações dos mesmos.

Um sistema de expressão bacteriano particular paraa produção do polipeptídeo é o sistema de expressão de pET deE. coli (por exemplo, pET-28) (Novagen, Inc., Madison, Wis).De acordo com este sistema de expressão, o DNA que codificaum polipeptídeo é introduzido em um vetor de pET em umaorientação projetada para permitir a expressão. Uma vez que ogene que codifica tal polipeptídeo está sob o controle dossinais T7 reguladores, a expressão do polipeptídeo é atingidapela indução da expressão de T7RNA polimerase na célulahospedeira. Isto é conseguido tipicamente ao utilizar ascepas do hospedeiro que expressam a T7RNA polimerase emresposta à indução de IPTG. Uma vez produzido, o polipeptídeorecombinante é então isolado de acordo com os métodos padrãoconhecidos no estado da técnica, por exemplo, aquelesdescritos na presente invenção.

Um outro sistema de expressão bacteriana para aprodução de polipeptídeo é o sistema de expressão de pGEX(Pharmacia). Esse sistema emprega um sistema de fusão do genede GST que é projetado para a expressão de alto nível dosgenes ou dos fragmentos de genes como proteínas de fusão comrápida purificação e recuperação rápida de produtos de genesfuncionais. A proteína de interesse é fundida ao terminalcarboxila da proteína de glutationa S-transferase a partir deSchistosoma japonicum e é purificada facilmente a partir doslisatos bacterianos por meio de cromatografia de afinidadeutilizando Glutationa Sefarose 4B. As proteínas de fusãopodem ser recuperadas sob condições amenas pela eluição com aglutationa. A clivagem do domínio de glutationa S-transferaseda proteína de fusão é facilitada pela presença de sítios dereconhecimento para as proteases de sítio específico amontante deste domínio. Por exemplo, as proteínas expressasnos plasmídeos de pGEX-2T podem ser clivadas com trombina; eaquelas expressas em pGEX-3X podem ser clivadas com o fatorXa.

Alternativamente, os polipeptídeos recombinantes dainvenção são expressos em Pichia pastoris, uma levedurametilotrófica. A Pichia tem a capacidade de metabolizar ometanol como fonte única de carbono. A primeira etapa nometabolismo do metanol é a oxidação do metanol em formaldeídopela enzima, álcool oxidase. A expressão dessa enzima, que écodificada pelo gene AOXl, é induzida pelo metanol. 0promotor AOXl pode ser utilizado para a expressão depolipeptídeo induzível ou o promotor de GAP para a expressãoconstitutiva de um gene de interesse.

Uma vez que o polipeptídeo recombinante da invençãoé expresso, ele é isolado, por exemplo, utilizando acromatografia de afinidade. Em um exemplo, um anticorpo (porexemplo, produzido tal como descrito na presente invenção)criado versus um polipeptídeo da invenção pode ser unido auma coluna e ser utilizado para isolar o polipeptídeorecombinante. A Iise e o fracionamento do polipeptídeo queabriga as células antes da cromatografia de afinidade podemser executados por meio de métodos padrão (vide, por exemplo,Ausubel et al., supra). Alternativamente, o polipeptídeo éisolado utilizando uma seqüência de Tag, tal como um Tag dehexahistidina, que se liga à coluna de níquel.

Uma vez isolada, a proteína recombinante pode, casodesejado, ser adicionalmente purificada, por exemplo, pormeio de cromatografia líquida de alto desempenho (vide, porexemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry andMolecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980). Ospolipeptídeos da invenção, particularmente os fragmentos depeptídeo curtos, também podem ser produzidos por meio desíntese química (por exemplo, pelos métodos descritos emSolid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., 1984 The PierceChemical Co., Rockford, 111). Essas técnicas gerais deexpressão e de purificação de polipeptídeo também podem serutilizadas para produzir e isolar fragmentos ou análogos depeptídeo úteis (descritos na presente invenção).

Caso desejado, um vetor que expressa os fatores derecrutamento de células-tronco é administrado a um tecidoocular, tal como a camada epitelial pigmentar da retina. SDF-1 (também chamado de PBSF) (Campbell et al. (1998) Science279(5349): 381-4), 6-C-cina(também chamada de Exodus-2) eMIP-3β (também chamado de ELC ou Exodus-3) induzem aaderência da maioria dos linfócitos circulantes, incluindo amaioria das células CD4+T; e MIP-3a (também chamado de LARCou Exodus-1) provocaram a aderência das células CD4+T dememória, mas inexperientes. Tangemann et al. (1998) J.Immunol. 161:6330-7 descrevem o papel da quimiocina de tecidolinfóide secundário (SLC), uma quimiocina associada ao vênuloendotelial elevado (HEV), com a localização dos linfócitosnos órgãos linfóides secundários. Campbell et al. (1998) J.Cell Biol 141(4) : 1053-9 descrevem o receptor para SLC comoCCR7 e que seu ligante, SLC, pode provocar a interrupçãorápida de integrina dependente dos linfócitos que rolam sob ocisalhamento fisiológico.

Em outras abordagens, os vetores que expressampolipeptídeos antiangiogênicos são administrados para reduzira neovascularização em um tecido ocular. Tais polipeptídeosantiangiogênicos incluem, mas sem ficar a eles limitados,interferon-α e interferon-β.

Além disso, em outras abordagens, um vetor quecodifica um polipeptídeo caracteristicamente expresso em umacélula ocular é introduzido em uma célula-tronco da invenção.Os polipeptídeos expressos em células endoteliais da retinaincluem o marcador do epitélio dependente pigmentar daretina, RPE 65 e os marcadores de tecido endotelial, taiscomo RPCA-I. Caso desejado, as células-tronco expressamconstitutivamente os marcadores específicos para o endotéliodo SNC (tal como P-glicoproteína, GLUT-I e o receptor detransferrina). As células-tronco transformadas com estesvetores exibem preferencialmente as característicasmorfológicas e características de expressão de antígeno dascélulas epiteliais pigmentares da retina (por exemplo, amorfologia de pavimento e expressão de RET-PE2 e decitoqueratinas). Exemplos de proteínas da retina específicas,que incluem SAGE Tags conhecidos, são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

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Os vetores virais transducentes (por exemplo,retrovirais, adenovirais e virais adeno-associados) podem serutilizados para a terapia de genes de células somáticas,especialmente por causa de sua eficiência elevada deinfecção, e de integração e de expressão estáveis (vide, porexemplo, Cayouette et al. , Human Gene Therapy 8: 423-430,1997; Kido et al. , Current Eye Research 15: 833-844, 1996;Bloomer et al. , Journal of Virology 71: 6641-6649, 1997;Naldini et al., Science 272: 263-267, 1996; e Miyoshi et al. ,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94: 10319, 1997). Por exemplo,um polinucleotídeo que codifica uma proteína Hsp, variante ouum fragmento da mesma, pode ser clonado em um vetorretroviral e a expressão pode ser dirigida de seu promotorendógeno, da repetição terminal longa retroviral ou de umpromotor específico para um tecido ou uma célula de interesse(por exemplo, um tecido ocular, tal como o coróide ou acamada epitelial pigmentar da retina). Outros vetores viraisque podem ser utilizados incluem, por exemplo, um vírus devaríola, um papiloma vírus bovino ou um vírus de herpes, talcomo o vírus Epstein-Barr (vide também, por exemplo, osvetores de Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman,Science 244: 1275-1281, 1989; Eglitis et al. , BioTechniques6: 608-614, 1988; Tolstoshev et al. , Current Opinion inBiotechnology 1: 55-61, 1990; Sharp, The Lancet 33 7: 1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research andMolecular Biology 36: 311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17: 407-416, 1991; Miller etal., Biotechnology 7: 980-990, 1989; Le Gal La Salle et al. ,Science 259: 988-990, 1993; e Johnson, Chest 107: 77S-83S,1995). Os vetores retrovirais são particularmente bemdesenvolvidos e têm sido utilizados em ambientes clínicos(Rosenberg et al. , N. Engl. J. Med 323: 370, 1990; Andersonet al., Patente U.S. N°. 5.399.346). Com a máximapreferência, um vetor viral é utilizado para a administraçãode um polinucleotídeo de Hsp ao olho.

As abordagens não-virais também podem serempregadas para a introdução de uma terapêutica á uma célulade um paciente (por exemplo, uma célula ou um tecido ocular).Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico pode serintroduzida em uma célula ao administrar o ácido nucléico napresença de lipofecção (Feigner et al., Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sei. 298:278, 1989;Staubinger et al. , Methods in Enzymology 101:512, 1983),conjugação de asialoorosomucóide-polilisina (Wu et al. ,Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al. ,Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989) ou por meiode microinjeção sob condições cirúrgicas (Wolff et al. ,Science 247:1465, 1990). Os ácidos nucléicos sãoadministrados preferencialmente em combinação com umlipossomo e uma protamina.

A transferência de genes também pode ser conseguidaao empregar meios não-virais que envolvem a transfecção invitro. Tais métodos incluem o uso de fosfato de cálcio,dextrano de DEAE, eletroporação e fusão de protoplasto. Oslipossomos também podem ser potencialmente benéficos para aaplicação de DNA em uma célula. 0 transplante de genesnormais nos tecidos afetados de um paciente também pode serrealizado ao transferir um ácido nucléico normal em um tipode célula cultivável ex vivo (por exemplo, uma célulaprimária autóloga ou heteróloga ou progênie da mesma), depoisde a célula (ou seus descendentes) ser injetada em um tecidoalvejado.

A expressão do cDNA para o uso nos métodos deterapia de polinucleotídeo pode ser dirigida a partir dequalquer promotor apropriado (por exemplo, o citomegalovírushumano (CMV), vírus símio 4 0 (SV4 0) ou promotores demetalotioneína) e ser regulada por qualquer elementoregulatório apropriado de mamífero. Exemplos de promotoresconstitutivos incluem os promotores para os seguintes genesque codificam determinadas funções constitutivas ou "detarefas domésticas": hipoxantina fosforibosila transferase(HPRT), diidrofolato reductase (DHFR) (Scharfmann et al. ,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 88:4626-4630 (1991)), adenosinadeaminase, fosfoglicerol cinase (PGK), piruvato cinase,fosfoglicerol mutase fosfoglicerol, promotor de actina (Laiet al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 86:10006-10010 (1989)) eoutros promotores constitutivos conhecidos por um técnico noassunto. Além disso, muitos promotores virais funcionamconstitutivamente nas células eucarióticas. Estes incluem: ospromotores iniciais e finais de SV4 0; as repetições determinal longo (LTR) do Vírus da Leucemia Moloney e outrosretrovírus; e o promotor de cinase de timidina do Vírus doHerpes Simplex, entre muitos outros. Conseqüentemente,qualquer um dos promotores constitutivos referidos acima podeser utilizado para controlar a transcrição de uma inserção degene heterólogo.

Os genes que estão sob o controle de promotoresindutíveis são expressos somente ou a um grau maior, napresença de um agente de indução, (por exemplo, a transcriçãosob o controle do promotor de metalotioneína é aumentadaintensamente na presença de determinados íons de metal). Ospromotores induzíveis incluem os elementos responsivos (REs)que estimulam a transcrição quando seus fatores de induçãosão limitados. Por exemplo, há REs para fatores de soro,hormônios esteróides, ácido retinóico e AMP cíclico. Ospromotores que contêm um RE particular podem ser escolhidos afim de obter uma resposta induzível e, em alguns casos, opróprio RE pode ser unido a um promotor diferente, conferindodesse modo induzimento ao gene recombinante. Desse modo, aoselecionar o promotor apropriado (constitutivo versusinduzível; forte versus fraco), é possível controlar aexistência e o nível da expressão de um agente terapêuticonas células-tronco e/ou nas células da retina geneticamentemodificadas. A seleção e a otimização destes fatores para aaplicação de uma dose terapeuticamente eficaz de um agenteterapêutico particular são consideradas como enquadradasdentro do escopo de um técnico no assunto sem experimentaçãoindevida, levando em consideração os fatores descritos acimae o perfil clinico do paciente.

Adicionalmente a pelo menos um promotor e pelomenos um ácido nucléico heterólogo que codifica o agenteterapêutico, o vetor de expressão inclui preferencialmente umgene de seleção, por exemplo, um gene de resistência àneomicina, para facilitar a seleção das células-tronco queforam transfectadas ou transduzidas com o vetor de expressão.

Caso desejado, os intensificadores conhecidos paradirecionar preferencialmente a expressão de genes em tiposespecíficos de células podem ser utilizados para dirigir aexpressão de um ácido nucléico. Os intensificadoresutilizados podem incluir, sem limitação, aqueles que sãocaracterizados como intensificadores de tecido ou específicosde células. Alternativamente, se um clone genômico forutilizado como um construto terapêutico, a regulação pode sermediada pelas seqüências regulatórias cognatas ou, casodesejado, pelas seqüências regulatórias derivadas de umafonte heteróloga, que inclui qualquer um dos promotores oudos elementos regulatórios descritos acima.

Uma outra abordagem terapêutica incluída nainvenção envolve a administração de uma terapêuticarecombinante, tal como uma proteína Hsp recombinante,variante ou fragmento da mesma, diretamente ao sítio de umtecido afetado por uma doença real ou potencial, ousistemicamente (por exemplo, por meio de qualquer técnicarecombinante convencional de administração de proteínas). Adosagem da proteína administrada depende de uma série defatores, incluindo o tamanho e a saúde de cada paciente. Paraqualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicosdevem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidadeindividual e o julgamento profissional da pessoa queadministra ou que supervisiona a administração das composições.

A via ocular é a via de inoculação preferida dedrogas de residência induzida de células-tronco e/ou devetores aos tecidos oculares. No entanto, esta designaçãocomo a via de inoculação preferida não se presta aimpossibilitar nenhuma outra via de administração. As vias deinoculação de vetor preferidas são feitas através das viasintravitral ou sub-retinal. A via ocular inclui, mas semficar a elas limitada, a injeção subconjuntival, gotas desuperfície, um dispositivo de liberação retardada tal como umescudo de colágeno, uma lente de contato de hidrogel ou umALZA "Ocusert". A vacinação subconjuntival é feita utilizandoproparacaína como anestesia antes da injeção de 0,2-0,5 ml dovetor, em uma dose de 10-1.000 μg/inoculação, aplicada em umaseringa de insulina e em uma agulha de pequeno calibre. Ainjeção é aplicada no cul-de-sac inferior ao assegurar que omaterial vacinai permaneça de modo subconjuntival e não vazepara fora.

A inoculação com gotas de superfície envolve acolocação do vetor com ou sem adjuvante e/ou droga de traficode células-tronco no cul-de-sac conjuntival e então a fricçãodo olho delicadamente por trinta segundos enquanto fechado. Oprocedimento pode ser repetido duas ou três vezes por diadurante cinco dias para prolongar a exposição, o que tudocompreende uma vacinação única. Para uma retenção melhor, osdutos de drenagem de lágrima podem ser temporariamentebloqueados utilizando colágeno ou outros dispositivos.Alternativamente, o vetor e/ou o DNA puro podem serencapsulados em uma microcápsula e então ser implantados noolho para facilitar a liberação continua.

Kits

A invenção apresenta kits para o tratamento ou aprevenção de uma doença, de um distúrbio ou de sintomasoculares dos mesmos. Em uma realização, o kit inclui umpacote farmacêutico que compreende uma quantidade eficaz deum modulador protetor de Hsp90 (por exemplo, Geldanamicina)ou um ativador de resposta ao choque térmico (por exemplo,Celastrol). Preferencialmente, as composições estão presentesna forma de dosagem unitária. Em algumas realizações, o kitcompreende um recipiente estéril que contém uma composiçãoterapêutica ou profilática; tais recipientes podem sercaixas, ampolas, garrafas, frascos, tubos, saquinhos, bolsas,blisteres ou outras formas apropriadas de recipientesconhecidas no estado da técnica. Tais recipientes podem serfeitos de plástico, vidro, papel laminado, folha de metal oude outros materiais apropriados para conter medicamentos.

Caso desejado, as composições da invenção ou ascombinações das mesmas são fornecidas juntamente cominstruções para administração a um indivíduo que tem ou estáem risco de desenvolver uma doença ou um distúrbio ocuíar,tal como a retinopatia diabética, neovascularização coroidal,glaucoma retinite pigmentosa, degeneração macular relacionadaà idade, glaucoma, distrofias corneais, retinosquise, mal deStargardt, drusas autossômicas dominantes e distrofia macularde Best. As instruções irão incluir geralmente as informaçõessobre o uso dos compostos para o tratamento ou a prevenção deuma doença ou de um distúrbio ocular. Em outras realizações,as instruções incluem pelo menos um dos seguintes: descriçãodo composto ou da combinação de compostos; programação eadministração de dosagem para o tratamento de um distúrbioocular ou dos sintomas do mesmo, precauções; avisos;indicações; contra-indicações; informações sobresupêrdosagem; reações adversas; farmacologia animal; estudosclínicos; e/ou referências. As instruções podem ser impressasdiretamente no recipiente (quando presente) ou como umaetiqueta aplicada ao recipiente ou como uma folha, umpanfleto, um cartão ou uma pasta separada fornecida dentro oucom o recipiente.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Recrutamento de Células-tronco por Laser

Camundongos quiméricos foram construídos comcélulas-tronco GFP+ que foram transplantadas em cincocamundongos que haviam sido submetidos à irradiação quaseletal. Os camundongos quiméricos foram feitos com as células-tronco hematopoiéticas GFP expressoras de doadores GFPhomozigotos transgênicos. Essas células foram transplantadasnos receptores que haviam sido submetidos à irradiação quaseletal. Esses camundongos GFP quiméricos (C57B16.gfp) foramutilizados em todos os estudos subseqüentes com laser.Utilizando o laser de diodo de 810 nm com um diâmetro deponto de 75 μπι, vários níveis de energia foram aplicados àretina incluindo a energia de 5 mJ (50 mW, 0,1 milissegundo)que não produziu reação visível do laser no tecido na retina(irradiância do laser de 113 0 W/cm2) . Este foi considerado olimiar sub-visível. Três semanas após o laser, os animaisforam submetidos à eutanásia e os olhos foram colhidos. Os"copos" do olho foram preparados e a retina neuro-sensora foiremovida.

Os olhos que receberam a energia de laser sublimiardemonstraram um recrutamento resistente de células-troncohematopoiéticas (HSC) para a camada epitelial pigmentar daretina em um teste padrão difuso. Essas mudanças ocorreramdentro de um período de duas semanas. 0 laser sublimiar induzas células-tronco de adulto a migrarem e a repararem oepitélio pigmentar da retina tal como mostrado nas Figuras 1e 2. A Figura 1 demonstra a localização dependente de ciclode operação das células GFP+ no nível do RPE. As regiõesescuras na Figura 1 representam as células GFP+ que foramincorporadas na camada do RPE nas áreas que receberam olaser. A fluorescência de fundo, tal como determinado pelosolhos contralaterais (não-afetados) foi removida destaimagem. A Figura 2 é um gráfico que quantifica a incorporaçãode células-tronco (HSC) humanas no RPE.

Exemplo 2: As HSC Recrutadas Para a Retina Expressam umMarcador de Retina Específico

Pela microscopia de imunofluorescência confocal,também foi mostrado que as células GFP positivas foram co-localizadas com RPE65, uma proteína específica para o RPE,sugerindo que as células-tronco hematopoiéticas recrutadasadquiriram características do RPE. Esses olhos tambémdemonstraram o recrutamento de células endoteliais difusas.

Os olhos que receberam o laser com energia elevada comnotável opacificação da retina (150 mW, 0,1 segundo)mostraram o recrutamento focai das GFP+HSC para a região dacicatriz juntamente com as células endoteliais. O lasersublimiar induziu as HSC a migrarem e serem incorporadas noRPE. O grau de incorporação é correlacionado com o ciclo deoperação do laser. O ciclo de operação de 15% resultou nomaior grau de incorporação de HSC.

Exemplo 3: Laser limiar sub-visível hsp70, hsp90 e Indução daResposta ao Choque térmico Resultou na Liberação de SDF-I eVEGF

Os lasers oftálmicos constituem uma ferramentaimportante para o tratamento de vários distúrbios da retina.Na maioria dos exemplos, o efeito foi atribuído às mudançasvisíveis na retina (isto é, queimaduras fotoquímicasinduzidas por laser). Acredita-se que o laser de diodo de 810nm cause menos danos à retina neuro-sensora porque a energiado laser é absorvida pelo RPE. A Figura 2 demonstrou alocalização dependente do ciclo de operação das células GFP+no nível do RPE. Há uma resposta máxima de 10% ciclo deoperação. Isto foi confirmado separadamente utilizando osmétodos de transferência adotiva, uma técnica que seassemelha intimamente à terapia celular. A transferênciaadotiva envolve a administração sistêmica de HSC e resulta naresidência rápida destas células às áreas que produzem osquimioatrativos.

O laser de micropulso foi desenvolvido clinicamentepara minimizar os danos fotodestrutivos à retina. O laserinfravermelho (810 nm) utilizado no modo de micropulso é umamodalidade relativamente nova para o tratamento potencial dedistúrbios da retina. 0 uso de pulsos de laser repetitivos ebreves durante uma única exposição limita a quantidade decondução de calor e os danos subseqüentes ao RPE. Ele vemganhando recentemente aceitação clínica por esta razão. Aresposta ao choque térmico é considerada uma respostacitoprotetora com base na capacidade de união das proteínasde choque térmico para limitar o desdobramento incorreto daproteína.

Para determinar se o uso de laser de micropulsoagiu através dos efeitos térmicos que induzem a resposta aochoque térmico e/ou a indução de citocina e dos fatores decrescimento que atraem as HSC ao olho, um laser infravermelhocom ciclo de operação variável foi utilizado para examinar otempo de curso de expressão do mRNA de hsp70, de hsp90 e decristalinas na retina neuro-sensora e no "copo" posterior quecontém o RPE e o complexo coróide. Um aumento de pico emhsp70 foi observado duas horas após o laser na retina neurale quatro horas após o laser no "copo" posterior do olho. OmRNA para hsp90 atingiu o seu pico drasticamente na retinaneural e no "copo" posterior do olho em duas horas. Aexpressão induzida por laser de SDF-I e de seu receptor CXCR-4 no "copo" posterior do olho também foi observada. O exame aduas horas após o laser sugeriu que um tratamento breve comlaser afetou a maquinaria transcricional da célula do RPE ereprogramou a célula do RPE a produzir uma série de fatoresque são capazes de recrutar HSC à retina. Quatro horas após olaser, foi observado um aumento na expressão de SDF-I e CXCR-4. Uma vez que SDF-I e VEGF são conhecidos por seremresponsivos a hipoxia, o efeito do laser na retina nos níveisdo HIF-Ia mRNA de foram examinados. A mRNA para HIF-Ia foireduzido em duas horas e aumentado em quatro horas no "copo"posterior do olho.

Esses estudos suportam a regulação autócrina eparácrina do RPE por SDF-I e VEGF. Sem desejar se limitarpela teoria, é provável que o laser sub-visível ative oambiente extracelular do RPE - as camadas fotorreceptoras - ecrie um ambiente receptivo para recrutamento de HSC.Evidências crescentes indicam que hsp70 extracelular é umagente neuroprotetor. Sem desejar se limitar pela teoria,hsp7 0 pode agir como um fator neuroprotetor na retina,facilitando o recrutamento de HSC para a retina parapropiciar o reparo do RPE. As proteínas de choque térmicoprovavelmente funcionam no recrutamento de HSC à retina. Istopode ser realizado in vivo pelo recrutamento de HSC seguindoa produção local de proteínas quimioatrativas.

Exemplo 4: Aumento dos níveis de Hsp70 mRNA depois do choquetérmico de culturas de RPE primáriasPara determinar se o RPE poderia ser uma fonte deresposta à citocina in vivo observada, as culturas de RPE eARPE19 (célula de RPE imortalizada) humanas primárias foramsubmetidas a choque térmico. Duas horas após o choquetérmico, a supressão dos mRNA das proteínas de choquetérmico, HIF-Ια bem como SDF-I e VEGF, foi observada. Emculturas de RPE, um aumento drástico de quarenta vezes nosníveis do hsp90 mRNA foi observado. Os resultados de hsp90 invitro paralelizaram os resultados in vivo. De um modoimpressionante, um aumento de cinqüenta vezes nos níveis dohsp7 0 mRNA de foi observado nas culturas de RPE primárias,que indicaram que as células de RPE residentes liberaram esteagente neuroprotetor putativo. Com base nestes dados in vivoe sem desejar ser limitado pela teoria, é provável que ascélulas de RPE sejam a fonte dos fatores quimiotáticos quefacilitaram o recrutamento de HSC à retina. Isto não eliminaa possibilidade de que outros tipos de células participem naresposta de recrutamento.

Resumidamente, esses resultados indicaram pelaprimeira vez que as HSC podem ser localmente recrutadas paraa retina, incluindo a camada do RPE por meio de indução alaser ou farmacológica. Isto foi obtido com a indução de SVLde resposta ao choque térmico. A resposta ao choque térmicoinduzida por laser foi associada temporalmente com aliberação de HIF-Ia e então dos quimioatrativos SDF-I e VEGFde HSC. Os presentes resultados não produziram nenhumaqueimadura ou cicatriz com laser clinicamente visível. Estafalta de danos distingue os presentes métodos dos métodos queinduzem o laser retinodestrutivo visível.

Exemplo 5: 0 Choque térmico Quimicamente Induzido Recruta HSC

Para o RPE

Essas observações foram estendidas quimicamente aoinduzir a resposta ao choque térmico em células do RPEhumanas primárias. Quatro horas após a exposição ao laser,havia um aumento exuberante nos níveis de hsp7 0 e um aumentomoderado nos níveis do mRNA de hsp90, de hsp32 e docristalina. A expressão de SDF-I também foi observada. 0curso de tempo para esta expressão espelhou aquele observadodurante a indução de choque térmico clássica.

Além disso, o choque térmico quimicamente induzidorecrutou as HSC para o RPE tal como mostrado na Figura 3. Aindução farmacológica com indutores de molécula pequena deresposta ao choque térmico foi induzida por meio de injeçãointravitral de geldanamicina ou separadamente ao expor ascélulas do RPE resultantes da indução idêntica de SDF-I eVEGF. Essas experiências fornecem evidências conclusivas deque a indução de choque térmico por indução a laser ouindução farmacológica resulta diretamente na produção de HIF-la e de HSC quimiocinas essenciais, SDF-I e VEGF. Além disso,elas sugerem que a manipulação farmacológica conduzeficazmente ao recrutamento de HSC para a camada e àdiferenciação do RPE.

Os estudos clínicos mostraram que pacientes idososreduziram os níveis de HSC em sua circulação. Essas célulaspodem ser mobilizadas da medula óssea para incorporar acirculação sistêmica para o recrutamento para a retina.

Atualmente, a forma seca comum de DMRI não tem nenhumtratamento eficaz. A presente invenção apresenta o laser emétodos farmacológicos para o tratamento da DMRI. Ospresentes métodos apresentam adicionalmente a terapia decélulas-tronco hematopoiéticas para a DMRI. Os presentesestudos sugerem que os defeitos de reparos relacionados com aidade podem contribuir com o desenvolvimento da DMRI eadicionalmente indicar que a DMRI pode ser tratada aointensificar a função de reparo utilizando uma combinação delaser e de abordagens farmacológicas. Em particular, ainvenção apresenta métodos para o tratamento de pacientes comDMRI com um agente que mobiliza HSC, tal como GM-CSF, seguidopelo laser sub-visível ou pela injeção intravitral doscompostos que podem induzir a resposta ao choque térmico quedeve iniciar o reparo celular da camada do RPE.

Os resultados descritos acima foram obtidosutilizando os seguintes métodos e materiais.

Eletrorretinografia (ERG)

A função retinal dos olhos tratados e não-tratadosé avaliada por ERG (uma técnica não-invasiva utilizada paradeterminar a função fotorreceptora) em uma base periódica(por exemplo, mensalmente) para determinar o efeito do laserou da terapia do agente farmacológico. A eletrorretinografiaé uma técnica não-invasiva em que a resposta elétrica cornealà luz é medida em animais anestesiados. Os camundongos sãoanestesiados com injeções intraperitoneais de uma mistura de80-100 mg/kg de cetamina e 5-10 mg/kg de xilazina paraanestesia (Phoenix Pharmaceuticals, St. Joseph, MO). Ascórneas dos camundongos são anestesiadas com uma gota com0,5% de HCl proparacaína (Akorn, Buffalo Grove, IL) edilatadas com uma gota com 2,5% de HCl de fenilefrina(Akorn). Os eletrodos de medição dotados de pontas de fios deouro são colocados em cima de ambas as córneas com uma gotacom 2,5% de hipromelose (Akorn) para manter o contato doeletrodo e a hidratação corneal. Um eletrodo de referência écolocado subcutaneamente no centro do couro cabeludo inferiordo camundongo e um eletrodo de ligação à terra é colocadosubcutaneamente na pata traseira. 0 camundongo foi apoiado emuma plataforma deslizante caseira que manteve o animal a umatemperatura constante de 37°C. 0 animal é posicionado de modoque sua cabeça inteira descanse dentro da abóbada deiluminação de Ganzfeld (campo cheio) de um UTAS-E 2000 VisualElectrodiagnostic System (LKC Technologies, Inc.,Gaithersburg, MD) . As ERGs escotópicas de campo cheio sãomedidas por flashes de 10 milissegundos em uma intensidade de0,9 e 1,9 Iog cd m-2 a intervalos de um minuto.

As respostas são amplificadas a um ganho de 4.000,filtradas entre 0,3 e 500 Hz e digitalizadas a uma taxa de2.000 hertz em dois canais. A média de cinco respostas emcada intensidade é calculada. Os traços de ondas sãoanalisados utilizando o pacote de software UTAS-E 2000 (LKCTechnologies, Inc.). Ondas-A são medidas a partir da linha debase ao pico na direção negativa da córnea; ondas-B sãomedidas a partir do pico negativo da córnea ao pico positivoda córnea principal.

Os animais recebem uma pomada antibiótica tripla(Vetropolycin) em seus olhos para manter a umidade após oprocedimento e são levados a voltar à consciência em umabandeja aquecida a 37 graus antes de serem retornados aoviveiro. Os animais que recebem a anestesia deCetamina/Xilazina também irão receber 0,01-0,02 ml/g de pesocorpóreo de LRS SQ morno.

Fundoscopia

O exame da retina dos olhos tratados e não-tratadosé avaliada pela examinação fundoscópica. A fundoscopia é umatécnica não-invasiva em que fotografias da retina são tiradasde animais anestesiados. Os camundongos são anestesiados e assuas córneas são anestesiadas e dilatadas tal como descritoacima para a análise de ERG. A fotografia de fundo éexecutada com uma câmera e lente especializada, uma câmera defundo portátil Kowa Genesis (Kowa Company, Ltd., Tóquio,Japão) focalizadas através de uma Volk Super 66 Stereo FundusLens (Keeler, Berkshire, Inglaterra). Duas fotografias decada olho são geralmente tiradas para assegurar uma imagemcorretamente focalizada. Os animais recebem uma pomadaantibiótica tripla (Vetropolycin) em seus olhos para manter aumidade após o procedimento e são levados a recuperar aconsciência em uma bandeja aquecida a 37°C antes de seremretornados ao viveiro. Os animais que recebem a anestesia deCetamina/Xilazina também irão receber 0,01-0,02 ml/g de pesocorpóreo de LRS SQ morno.

Tratamento a Laser

A preparação pré-cirúrgica dos animais envolve acertificação que eles são fisicamente ativos e podem sersubmetidos à anestesia. Os camundongos precisam estar semnenhuma evidência de descarga ocular ou evidência de cataratapara tornar possível a visualização da retina para executar otratamento de queimadura a laser. Antes do tratamento alaser, os animais são anestesiados com injeçãointraperitoneal com uma mistura de 80-100 mg/kg de cetamina ede 5-10 mg/kg de xilazina. Nenhuma formação de edema cornealou de catarata é atribuída ao uso desses anestésicos. 0 nívelde anestesia é monitorado por uma espetada na pata e a taxade respiração. A falta de resposta reflexa à espetada na pataindica que o animal foi anestesiado corretamente. Nenhumapomada ocular é aplicada antes ou durante o tratamento alaser porque isto deve impedir o tratamento a laser eficaz.Uma pomada antibiótica é aplicada para proteger o olho não-tratado. Se nenhuma resposta for demonstrada após a espetadana pata, então o tratamento a laser será prosseguido.

Dor, aflição ou desconforto são sugeridos pelamovimentação do animal durante o tempo requerido para otratamento a laser. Se o animal mostrar movimentaçãoaumentada pouco antes ou durante a cirurgia a laser, então aanestesia é suplementada ao expor o animal ao isoflurano pordez segundos. Aproximadamente 1 ml de isoflurano é embebidoem um Kimwipe enrolado em espiral colocado no fundo de umtubo centrifugador plástico de 50 ml e o tubo é tampado. Casonecessário, a extremidade aberta deste tubo pode ser mantidamomentaneamente perto do nariz do animal. Esse procedimento éexecutado em uma coifa a vapor. Depois disso, a taxa derespiração do animal continuará a ser monitorada e a respostaà dor do animal será monitorada pela espetada na pata. Senenhuma movimentação for demonstrada após a espetada na pata,então a cirurgia a laser será prosseguida. O tratamento alaser dura aproximadamente 3 0 segundos por camundongo. Umainjeção intraperitoneal de yohimbine (2 mg/kg de pesocorpóreo) é utilizada para inverter o efeito dacetamina/xilazina. Isto irá reduzir a quantidade de tempo queos olhos estão em risco devido à perda de reflexo depiscamento sob anestesia. Nenhum comportamento anormal éesperado após a cirurgia.

Dor, aflição e desconforto podem ocorrer após otratamento a laser. A literatura indica que a recuperaçãohumana após o tratamento a laser é auxiliada pela aplicaçãode . cetorolaco à córnea ao final do procedimento(Kosrirukvongs et al, Topical ketorolac tromethamine in thereduction of adverse effects of laser in situkeratomileusist, J. Med Assoc Thai, 2001; 84: 804-810, ePrice, et al, Pain reduction after laser in situkeratomileusis with ketorolac tromethamine ophthalmicsolution 0.5%: a randomized, double-masked, placebo-controlled trail, J. Refeact Surg, 2002; 18: 140-144).Portanto, após o tratamento a laser, gotas de uma solução decetorolaco (0,5% de OP) serão aplicadas aos olhos doscamundongos por 48 horas após o tratamento, e por mais tempocaso necessário. 0 nome comercial dessa solução é Acular PF Solution. Essa duração de tratamento com Acular PF não temnenhum efeito adverso nos camundongos e não tem nenhum efeitona neovascularização tal como evidenciado pela análise dosanimais injetados com veiculo. Os animais serão mantidos emsuas gaiolas e mantidos à temperatura ambiente (18-26°C) ou em uma bandeja aquecida a 37 °C e serão monitoradosvisualmente continuamente até que mostrem sinais derecuperação da anestesia. A recuperação completa da anestesiaocorre somente quando o animal está inteiramente alerta eperambula pela gaiola.

Cultura de Medula Óssea:

Os camundongos doadores foram submetidos àeutanásia "humana" antes da cultura de medula óssea, uma vezque esse procedimento não é uma cirurgia com sobrevida. Osanimais foram submetidos à eutanásia por meio de injeção comuma dose excessiva de cetamina (60 mg de Xilazina/Kg, 30 mgde Cetamina/Kg) administrada IP. Depois que a perda da dorprofunda foi atingida, tal como determinado pela falha emresponder à espetada no dedo/pata, um deslocamento cervicalfoi executado para confirmar a morte.

Para cultivar as células-tronco derivadas de medulaóssea do camundongo, os fêmures foram assepticamentedissecados de camundongos transgênicos com quatro a oitosemanas de vida que expressam a proteína de fluorescênciaverde intensificada (GFP). Ambas as extremidades dos fêmuresforam cortadas e o tutano foi extraído com 5 ml do meio EagleModificado da Dulbecco (DMEM; Nissui Co., Tóquio, Japão)contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) , 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina G e 10% de heparina,utilizando uma seringa de 2,5 ml com agulha de calibre 21. Aanálise de FACS foi utilizada para confirmar o fenótipoapropriado das BMSCs.

Injeções Intraperitoneais

O procedimento para a injeção intraperitoneal é talcomo segue: O indivíduo é escolhido pela nuca bem perto dasorelhas. A cauda do camundongo será presa pelos dedospequenos da mesma mão. Utilizando uma agulha hipodérmicaestéril de calibre 26, a pele e o músculo abdominal serãoperfurados e o conteúdo da agulha será injetado na cavidadeperitoneal com cuidado para evitar o diafragma e outrosórgãos internos.

Injeções IntravitreaisOs camundongos são anestesiados tal como descritoacima. 0,5% de cloridreto de proparacaína (AlconLaboratories, Inc., Fort Worth, TX) é utilizado paraanestesia tópica adicional. HCl de fenilefrina e/ou sulfatode atropina é aplicado à superfície ocular antes da injeção afim de obter a dilatação da íris para minimizar os danosrelacionados ao procedimento e uma pomada oftálmicaantibiótica tripla (Vetropolycin) é aplicada após a injeção,para impedir a infecção. Uma agulha de calibre 3 0 é utilizadapara fazer uma incisão perfuradora 0,5 mm posterior ao limbustemporal, e a agulha microinjetora é introduzida através daincisão, até aproximadamente 1,5 mm de profundidade,angularmente em direção ao nervo óptico até que a ponta daagulha seja visualizada no centro do vítreo. Todas asinjeções são visualizadas com o auxílio de um microscópio dedissecação, Nikon SM2800 (Nikon, Melville, NY) com ailuminação fornecida por uma fonte e luz de fibra óptica de150 watts da Southern Micro Instruments com braços de fibraóptica da Schott Fostec (Southern Micron Instruments,Marietta, GA) . Até 2 microlitros da suspensão da droga sãoentão introduzidos lentamente no vítreo e a agulha é retiradacom cuidado.

Após este procedimento, os camundongos sãocolocados para se recuperar em gaiolas limpas em uma bandejaaquecida. Os animais são observados até que estejaminteiramente recuperados do procedimento, depois do que sãoretornados ao viveiro.

Injeções Retro-orbitais

Para a aplicação local de células-tronco, asinjeções retro-orbitais funcionam muito bem nos transplantesde células-tronco como uma alternativa às injeçõesintravenosas na veia da cauda. Os camundongos sãoanestesiados com cetamina/xilazina tal como descrito acima ouatravés do uso de isoflurano administrado através de umvaporizador de precisão. A pele acima do olho é delicadamenteretraída, de um modo similar a um procedimento desangramento. As injeções são executadas utilizando umaseringa de 1 cc e uma agulha de calibre 27 ou 30, com ochanfrado virado para fora e são introduzidas em um ângulo de45° no centro da área do sinus retro-orbital. A ponta daagulha é avançada com cuidado para penetrar o sinus retro-orbital; isto é feito cuidadosamente para se ter certeza deque a agulha esteja aproximadamente na metade do sinus. Até200 μl da suspensão de células são injetados lentamente. Asuspensão de células é filtrada antes da injeção de modo quenão contenha nenhuma pelota. Após a injeção, a agulha éremovida com cuidado, mantendo o chanfro virado para forapara proteger o olho do camundongo contra riscos.

Para injeções múltiplas, há intervalos de pelomenos dois dias entre as injeções. Os olhos são alternadospara injeções subseqüentes, com um máximo de duas injeçõespor olho por camundongo. O anestésico tópico de proparacaínaé administrado um minuto antes da injeção.

A injeção retro-orbital é significativamente menostraumática do que o sangramento do olho no mesmo sítio. Osítio é inspecionado ou observado após o procedimento para seassegurar que não haja nenhum trauma ao olho. Após cadainjeção e assim que qualquer sangramento tenha paradototalmente, a pomada oftálmica antibiótica será aplicada eespalhada uniformemente no olho para impedir infecção. Após oprocedimento, o animal é monitorado quanto a sinais de dor(blefaroespasmo, entortar os olhos) dentro das 24-48 horasseguintes e dados analgésicos conforme necessário.

Depois da anestesia, o(s) animal(is) é(são)observado(s) até que estejam conscientes e caminhando, depoisdo que será/serão retornado(s) a sua(s) gaiola(s) para asprateleiras de gaiolas.

Outras Realizações

A partir da descrição antecedente, ficará evidenteque variações e modificações podem ser feitas na invençãodescrita na presente invenção para que sejam adotadas nosvários usos e condições. Tais realizações também estão dentrodo âmbito das reivindicações seguintes.

A relação de uma lista de elementos em qualquerdefinição de uma variável na presente invenção incluidefinições dessa variável como qualquer elemento oucombinação única (ou sub-combinação) dos elementosrelacionados. A relação de uma realização na presenteinvenção inclui essa realização como qualquer realizaçãoúnica ou em combinação com quaisquer outras realizações oupartes da mesma.

Todas as patentes e publicações mencionadas nesterelatório descritivo são incorporadas na presente invenção atitulo de referência até a mesma extensão tal como se cadapatente e publicação independente fosse indicada específica eindividualmente para ser incorporada a título de referência.

Claims (66)

1. USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA TRATAR UMA DOENÇAOCULAR EM UM INDIVÍDUO, caracterizado pelo fato decompreender:(a) a indução de choque térmico em pelo menos umacélula de um tecido ocular; e(b) o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular, melhorando desse modo o distúrbio ocular.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o choque térmico é induzido notecido ocular utilizando laser limiar sub-visível (SVL).

3. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o choque térmico é induzidoutilizando um composto pequeno selecionado do grupo queconsiste em geldanamicina, celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, EC102, radicicol,geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8, e H-71.

4. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o choque térmico é induzidoutilizando um polipeptideo selecionado do grupo que consisteem HSPlOO, HSP90, HSP70, HSP60, e HSP4 0.

5. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o choque térmico é induzidoutilizando um vetor de expressão que compreende umpolinucleotideo que codifica um polipeptideo de choquetérmico.

6. USO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que o dito usoaumenta a expressão ou a atividade de uma proteína de choquetérmico selecionada do grupo que consiste em HSP100, HSP90,HSP70, HSP60, e HSP4 0.

7. USO, de acordo com a reivindicação 4 ou 5,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de choquetérmico é HSP70 ou HSP90.

8. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a célula-tronco é uma célula-tronco hematopoiética.

9. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito uso reduz pelo menos umsintoma da doença ou distúrbio ocular.

10. USO, de acordo com a reivindicação 1, em que adoença ou distúrbio ocular é selecionado do grupo queconsiste em retinopatia diabética, neovascularizaçãocoroidal, glaucoma retinite pigmentosa, degeneração macularrelacionada a idade, glaucoma, distrofias corneais,retinosquise, mal de Stargardt, drusas autossômicasdominantes, e distrofia macular de Best, edema macularcistóide, descolamento da retina, danos fóticos, retinopatiasisquêmicas, doença degenerativa retinal induzida porinflamação, retinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma,Malattia Leventinese (ML) e distrofia retiniana em favos demel de Doyne.

11. MÉTODO PARA RECRUTAR UMA CÉLULA-TRONCO PARA UMTECIDO OCULAR DE UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DA MESMA, sendoque o método é caracterizado pelo fato de compreender aestimulação do tecido ocular com um laser sublimiar , em queo nível de estimulação é suficiente para recrutar pelo menosuma célula-tronco para o tecido.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que é utilizado um ciclo deoperação de 10% ou 15%.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o laser sublimiar tem umcomprimento de onda de pelo menos aproximadamente 100 nm a- 2.000 nm.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a energia do laser sublimiaré de aproximadamente 5 mW a 2 00 mW.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a energia do laser sublimiaré de 10 mW a 100 mW.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o laser é administrado em ummicropulso.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a duração do micropulso é deaproximadamente 0,001 milissegundo a 1,0 milissegundo.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a duração do micropulso é de- 0,1 milissegundo.

19. MÉTODO, de acordo qualquer uma dasreivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que aenergia do laser sublimiar fica compreendida entre 10 mW e- 100 mW e é administrada em um pulso de 0,1 milissegundo.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a estimulação aumenta aexpressão ou a atividade biológica de uma proteína de choquetérmico selecionada do grupo que consiste em HSP100, HSP90,HSP70, HSP60, e HSP4 0.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a estimulação altera aexpressão ou a atividade de uma proteína selecionada do grupoque consiste em SDF-1, VEGF, HIF-Ia , cristalina, fator detranscrição induzível por hipóxia 1-alfa (HIF-Ia), e CXCR-4.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o método aumenta a expressãode um polipeptídeo HSP70 ou HSP90 em pelo menos dez vezes.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o método aumenta a expressãoou a atividade de um polipeptídeo HSP70 ou HSP90 em pelomenos quarenta vezes.

24. MÉTODO PARA RECRUTAR UMA CÉLULA-TRONCO PARA UMTECIDO OCULAR DE UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DA MESMA, sendoque o método é caracterizado pelo fato de compreender:(a) a administração de um agente a um indivíduo emuma quantidade suficiente para induzir choque térmico em umtecido ocular; e(b) o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular.

25. USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA TRATAR UMA DOENÇAOU UM DISTÚRBIO OCULAR EM UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DOMESMO, sendo que o dito uso é caracterizado pelo fato decompreender:(a) administração de um agente a um indivíduo emuma quantidade suficiente para induzir choque térmico em umtecido ocular; e(b) o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular, desse modo melhorando a doença ou o distúrbioocular.

26. USO, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio ocularé selecionado do grupo que consiste em retinopatia diabética,neovascularização coroidal, glaucoma retinite pigmentosa,degeneração macular relacionada a idade, glaucoma, distrofiascorneais, retinosquise, mal de Stargardt, drusas autossômicasdominantes, e distrofia macular de Best, edema macularcistóide, descolamento da retina, danos fóticos, retinopatiasisquêmicas, doença degenerativa retinal induzida porinflamação, retinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma,Malattia Leventinese (ML) e distrofia retiniana em favos demel de Doyne.

27. USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA REGENERAR A RETINAEM UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DO MESMO, sendo que o ditouso é caracterizado pelo fato de compreender:(a) a administração de um agente a um indivíduo emuma quantidade suficiente para induzir choque térmico em umtecido ocular; e(b) o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular, regenerando desse modo a retina.

28. USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA REPARAR OS DANOS AOEPITÉLIO PIGMENTAR DA RETINA EM UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADEDO MESMO, sendo que o método é caracterizado pelo fato decompreender:(a) a administração de um agente a um indivíduo emuma quantidade suficiente para induzir choque térmico em umtecido ocular; e(b) o recrutamento de uma célula-tronco para otecido ocular, reparando desse modo o epitélio do pigmentoretinal.

29. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que ochoque térmico é induzido utilizando um composto pequeno.

30. USO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de o composto pequeno é selecionadodo grupo que consiste em geldanamicina, celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, EC102, radicicol,geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8, e H-71.

31. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que ochoque térmico é induzido utilizando um polipeptídeo.

32. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que ochoque térmico é induzido utilizando um vetor de expressãoque compreende um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo de choque térmico.

33. USO, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de choquetérmico é selecionado do grupo que consiste em HSPlOO, HSP90,HSP70, HSP60, e HSP40.

34. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que oagente aumenta a expressão ou a atividade biológica de umaproteína de choque térmico selecionada do grupo que consisteem HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, e HSP40.

35. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que oagente altera a expressão ou a atividade de uma proteínaselecionada do grupo que consiste em SDF-I, VEGF, HIF-Ia ,cristalina, fator induzível por hipóxia 1-alfa (HIF-Ia), eCXCR-4.

36. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de queaumenta a expressão de um polipeptídeo HSP70 ou HSP90 em pelomenos dez vezes.

37. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de queaumenta a expressão ou a atividade de um polipeptídeo HSP70ou HSP90 em pelo menos quarenta vezes.

38. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que umagente que aumenta a mobilização da célula-troncohematopoiética é administrado ao indivíduo antes da induçãoda resposta ao choque térmico.

39. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de quecompreende adicionalmente a administração de um agente anti-inflamatório ou um agente anti-angiogênico.

40. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que ométodo compreende adicionalmente a administração de um agenteque suporta a sobrevivência, a proliferação, ou atransdiferenciação de uma célula-tronco hematopoiética.

41. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que oindivíduo tem uma doença ou um distúrbio ocular selecionadodo grupo que consiste em retinopatia diabética,neovascularização coroidal, glaucoma retinite pigmentosa,degeneração macular relacionada a idade, glaucoma, distrofiascorneais, retinosquise, mal de Stargardt, drusas autossômicasdominantes, e distrofia macular de Best, edema macularcistóide, descolamento da retina, danos fóticos, retinopatiasisquêmicas, doença degenerativa retinal induzida porinflamação, retinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma,Malattia Leventinese (ML) e distrofia retiniana em favos demel de Doyne.

42. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que ométodo compreende adicionalmente a administração de todoácido trans-retinóico para intensificar a transdiferenciaçãoda célula-tronco a uma célula epitelial pigmentar da retina.

43. USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA TRATAR UMA DOENÇAOU UM DISTÚRBIO OCULAR EM UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DOMESMO, sendo que o dito uso é caracterizado pelo fato decompreender:(a) a administração ao indivíduo de um agente quemobiliza uma célula-tronco derivada da medula óssea noindivíduo;(b) a indução de choque térmico em um tecidoocular; e(c) o recrutamento da célula-tronco para o tecidoocular, desse modo melhorando a doença ou o distúrbio ocular.

44. USO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o agente é um fatorestimulante de colônia de macrófagos de granulócitos ou umfator de células-tronco.

45. USO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o choque térmico é induzidoutilizando um tratamento de laser sublimiar.

46. USO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o choque térmico é induzidoutilizando um agente que é um composto pequeno, umpolipeptídeo, ou uma molécula de ácido nucléico.

47. USO, de acordo com a reivindicação 46,caracterizado pelo fato de que o composto pequeno éselecionado do grupo que consiste em geldanamicina,celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, EC102,radicicol, geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8, e H-71.

48. USO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio ocularé selecionado do grupo que consiste em retinopatia diabética,neovascularização coroidal, glaucoma retinite pigmentosa,degeneração macular relacionada a idade, glaucoma, distrofiascorneais, retinosquise, mal de Stargardt, drusas autossômicasdominantes, e distrofia macular de Best, edema macularcistóide, descolamento da retina, danos fóticos, retinopatiasisquêmicas, doença degenerativa retinal induzida porinflamação, retinosquise juvenil ligada ao X, glaucoma,Malattia Leventinese (ML) e distrofia retiniana em favos demel de Doyne.

49. USO DE CHOQUE TÉRMICO PARA TRATAR ADEGENERAÇÃO MACULAR EM UM INDIVÍDUO COM NECESSIDADE DO MESMO,sendo que o dito uso é caracterizado pelo fato decompreender:(a) a administração ao indivíduo de GM-CSF e/ouFator de Célula-tronco, em que a administração mobiliza umacélula-tronco derivada da medula óssea no indivíduo;(b) a indução de choque térmico em um tecido ocularmediante a administração de um tratamento ou agente de lasersublimiar ; e(c) o recrutamento da célula-tronco derivada damedula óssea para o tecido ocular, melhorando desse modo adegeneração macular.

50. USO, de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado dogrupo que consiste em geldanamicina, celastrol, 17-alilamino--17-demetoxigeldanamicina, EC102, radicicol,geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8, e H-71.

51. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que o agente é administrado por meio de injeção intravitreal ouretro-orbital.

52. USO, de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de que a administração induz o reparocelular da camada de RPE.

53. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de quecompreende adicionalmente a administração de um vetor quecodifica um polipeptídeo terapêutico.

54. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de quecompreende adicionalmente a administração de uma célula-tronco substancialmente purificada ao indivíduo.

55. USO OU MÉTODO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que acélula-tronco é administrada localmente por meio de infecçãointravitral ou retro-orbital.

56. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA 0 RECRUTAMENTO DECÉLULAS-TRONCO, sendo que a composição é caracterizada pelofato de compreender uma quantidade eficaz de um compostopequeno selecionado do grupo que consiste em geldanamicina,celastrol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, EC102,radicicol, geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8, e H--71 em um excipiente farmaceuticamente aceitável, e acomposição é formulada para aplicação ocular.

57. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA 0 RECRUTAMENTO DECÉLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR, sendo que a composição écaracterizada pelo fato de compreender um vetor de expressãoque compreende um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo de choque térmico em um excipientefarmaceuticamente aceitável, e a composição é formulada paraa aplicação ocular.

58. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 57, caracterizada pelo fato de que opolipeptídeo de choque térmico é selecionado do grupo queconsiste em HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, e HSP4 0.

59. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA 0 RECRUTAMENTO DECÉLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR, sendo que a composição écaracterizada pelo fato de compreender um polipeptídeoselecionado do grupo que consiste em HSPlOO, HSP90, HSP70,HSP60, e HsSPO em um excipiente farmaceuticamente aceitável.

60. KIT, caracterizado pelo fato de compreenderuma quantidade eficaz de um agente que induz uma resposta dechoque térmico em um tecido ocular, e instruções parautilizar o kit para aumentar o recrutamento de células-tronco.

61. KIT, de acordo com a reivindicação 60,caracterizado pelo fato de que o agente é um polipeptídeo, umpolinucleotídeo, ou um composto pequeno.

62. KIT, de acordo com a reivindicação 61,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é HSP100,HSP90, HSP70, HSP60, e HSP40.

63. KIT, de acordo com a reivindicação 61,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codificaHSPlOO, HSP90, HSP70, HSP60, e HSP40.

64. KIT, de acordo com a reivindicação 61,caracterizado pelo fato de que o composto pequeno éselecionado do grupo que consiste em geldanamicina,celastrol, 17-alilamino-l7-demetoxigeldanamicina, EC102,radicicol, geranilgeranilacetona, paeoniflorina, PU-DZ8, e H--71.

65. MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM AGENTE QUE AUMENTAo RECRUTAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR, sendoque o método é caracterizado pelo fato de compreender:(a) a colocação de uma célula ocular em contato comum composto de teste;(b) a identificação de um aumento na expressão ouna atividade de um polipeptídeo de choque térmico em relaçãoa uma célula ocular não-tratada, identificando desse modo umcomposto que aumenta o recrutamento de células-tronco.

66. MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM AGENTE QUE AUMENTAO RECRUTAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO EM UM TECIDO OCULAR, sendoque o método é caracterizado pelo fato de compreender:(a) a colocação de uma célula ocular em contatoum composto de teste;(b) a identificação de um aumento no númerocélulas-tronco no tecido.