JP6603721B2 - 血液凝固因子ｖｉｉｉ遺伝子をターゲットとするエンドヌクレアーゼ及びそれを含む血友病治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、血液凝固因子ＶＩＩＩ遺伝子をターゲットとするエンドヌクレアーゼを用いたＡ型血友病治療用組成物に関する。

Ａ型血友病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ）は、全世界的に男性５０００人当たり１人の有病率を有する平凡な遺伝的出血性疾患（Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の１つである。この疾患は、血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）での多様な遺伝子変異によって誘発される。遺伝子型によって、臨床的症状は、軽症（５〜３０％活性）、普通（１〜５％活性）及び重症（＜１％活性）に分けられる（Ｇｒａｗ ｅｔ ａｌ．，２００５）。重症Ａ型血友病の約半分が点突然変異よりは、Ｆ８ １番イントロン相同体（ｉｎｔ１ｈ、重症Ａ型血友病の約５％）及び２２番イントロン相同体（ｉｎｔ２２ｈ、重症Ａ型血友病の約４０％）を含む染色体逆位によって発生する。これら２つの逆位は、非対立性相同組替え（ｎｏｎａｌｌｅｌｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ＮＡＨＲ）を通じて相同体から誘導されるＤＳＢ（ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）の誤った修復から由来する。先日に、本発明者らは、１４０ｋｂｐ離れており、それぞれ０．１％及び１．９％の頻度を有する２つの同じｉｎｔ１ｈ配列（以下、ｉｎｔ１ｈ−１及びｉｎｔ１ｈ−２）の間の染色体分節を逆位させるために、不滅化された野生型ヒト細胞株で注文製作したＺＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を、野生型誘導万能細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）でＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用した（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。前記方法は、誤ったＤＳＢ修復を模倣して人為的に逆位遺伝子型を誘導する。３つのｉｎｔ２２ｈ配列（ｉｎｔ２２ｈ−１、−２及び−３）を含む他の６００−ｋｂｐ逆位は、１４０−ｋｂｐ逆位よりも８倍さらに頻繁であったが、逆位部位が大きく、Ｘ染色体上に２個ではない３個の相同体が存在して修復がさらに難しかった。それだけではなく、ｉｎｔ２２ｈ（１０ｋｂｐ）は、ｉｎｔ１ｈ（１ｋｂｐ）よりも遥かに大きいために、通常のＰＣＲを用いてｉｎｔ２２ｈ逆位または修復の遺伝子型を分析することは非常に難しいが、これは、全体１０−ｋｂｐ ｉｎｔ２２ｈが増幅されなければならないためである。実は、遺伝子ハサミ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて、患者由来のｉＰＳＣはもとより、ヒト細胞でｉｎｔ２２ｈを含む６００−ｋｂｐ染色体分節が修復されうるということは知られていない。

本発明者らは、ＩＩ型の束の規則的な間隔を有した短い回帰性繰り返しＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）として、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）と知られたシステムを使用してＡ型血友病患者由来のｉＰＳＣで、これら２つの逆位を正常な配列に修復させようとした。

また、本発明者らは、ＴＡＬＥＮがヒトｉＰＳＣの１４０−ｋｂｐ染色体分節に逆位を起こして、Ａ型血友病の最も平凡な遺伝子型を模倣するＡ型血友病モデル細胞株を製作し、前記逆位部位をｆｌｉｐ−ｆｌｏｐして野生型に戻すのに用いられうるということを見つけた。なによりも、Ｆ８ ｍＲＮＡが血友病モデルｉＰＳＣから分化された細胞ではない帰先遺伝された（ｒｅｖｅｒｔｅｄ）、すなわち、遺伝子矯正されたｉＰＳＣから分化された細胞で発現された。これは、遺伝子ハサミがｉＰＳＣの大きな遺伝子分節を再配列し、このような遺伝子再配列を含有するクローンの分離に使われうるということを報告する最初の研究結果であり、これは、ｉＰＳＣの遺伝子再配列で引き起こされた遺伝的欠陥を矯正する原理証明を提供する。

本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

本発明者らは、血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）での多様な遺伝子変異によって誘発されるＡ型血友病に対する効率的であり、根源的な治療方法を開発するために鋭意研究した。その結果、Ｆ８遺伝子の逆位が逆位発生部位をターゲッティングするガイドＲＮＡ、及びこれによってターゲッティングされた部位を切断するＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼを用いて成功的に修復（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）されるということを見つけ、本発明を完成した。また、Ｆ８遺伝子の逆位が逆位発生部位をターゲッティングするＴＡＬエフェクタードメイン及び前記ドメインとそれぞれ結合して、前記ドメインによってターゲッティングされた遺伝子部位を切断する一対のエンドヌクレアーゼを用いて成功的に修復されるということを見つけ、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位矯正用組成物及びそれを用いた逆位矯正方法を提供することである。

本発明の他の目的は、血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位が矯正された誘導万能幹細胞の製造方法、それを用いて製造された誘導万能幹細胞及びそれを有効成分として含むＡ型血友病治療用組成物を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位矯正用組成物を提供する：
（ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド；及び
（ｂ）次のヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇｕｉｄｉｎｇ ＲＮＡ）または前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド：
（ｉ）配列表の配列番号１で表されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列；及び
（ｉｉｉ）Ｆ８遺伝子の２２番イントロン上の前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内に存在する１５〜２５ｂｐヌクレオチド配列
で構成された群から選択される一対のヌクレオチド配列であって、
前記（ｉｉｉ）は、前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内で前記（ｉ）または前記（ｉｉ）とそれぞれ８０％以上の配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有するヌクレオチド配列が存在せず、同時にダウンストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが連結されたことを特徴とする組成物。

本発明の他の態様によれば、本発明は、Ａ型血友病患者の体細胞を前記組成物と接触させるか、前記組成物が挿入された遺伝子伝達体に形質転換させる段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位を矯正する方法を提供する。

本発明によれば、本発明は、Ｆ８遺伝子の２２番イントロン相同体（ｉｎｔ２２ｈ）の逆位発生部位を特異的に認識する誘導ＲＮＡを用いてターゲット部位がガイディングされ、前記部位をＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼが正確に切断することによって、逆位によって覆された遺伝子部位が切断される。切断された遺伝子部位は、一定頻度で再逆位を起こすことによって、結果的に逆位の矯正が達成される。

本発明によれば、本発明の配列表の配列番号１で表される配列は、Ｆ８遺伝子のｉｎｔ２２ｈ−１のアップストリームに存在する２０ｂｐの連続したヌクレオチド配列のうち、８０％以上の配列類似性を有する他のヌクレオチド配列が存在せずとも、アップストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが直接に連結された配列のうち、最も先に表われる配列であり、配列表の配列番号２で表される配列は、Ｆ８遺伝子のｉｎｔ２２ｈ−３のダウンストリームに存在する２０ｂｐの連続したヌクレオチド配列のうち、８０％以上の配列類似性を有する他のヌクレオチド配列が存在せずとも、ダウンストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが直接に連結された配列のうち、最も先に表われる配列である。したがって、これら２つの配列またはこれら２つの配列の間に存在しながら、前述した（ｉｉｉ）の条件を満足するヌクレオチド配列をターゲットとして用いる場合、Ｆ８遺伝子の２２番イントロンで発生する逆位、より具体的には、ｉｎｔ２２ｈ−１とｉｎｔ２２ｈ−３との間で発生する逆位を矯正することができる。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、正常血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘発方法、逆位が発生した血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位矯正方法及びそれを用いて製作された逆位が矯正されたＡ型血友病患者由来の誘導万能幹細胞を提供する。
（ｂ）本発明の方法は、重症Ａ型血友病の原因のうち、多数を占めるＦ８遺伝子のイントロン１及びイントロン２２の逆位を効率的に再現することによって、Ａ型血友病の発病機作研究及び治療剤スクリーニングのためのリサーチツールとして有用に用いられうる。
（ｃ）本発明の方法で製作された逆位−矯正誘導万能幹細胞は、正常遺伝子またはタンパク質伝達を通じる制限的な方法によらず、突然変異が発生した遺伝子型を野生型のような状態に修復させることによって、Ａ型血友病に対する効率的であり、根源的な治療を可能にする。

Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣで部分−逆位されたＦ８遺伝子の矯正結果を示す図である。図１ａは、ヒト皮膚線維芽細胞（ＷＴ）及びＡ型血友病患者由来の尿細胞（Ｐａ１、Ｐａ２及びＰａ３）でゲノムＤＮＡを分離し、適切なプライマー（Ｂａｇｎａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）でＰＣＲ分析を行うことによって、イントロン１（左側）または２２（右側）の逆位を検出した結果である。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣで部分−逆位されたＦ８遺伝子の矯正結果を示す図である。図１ｂは、イントロン２２の逆位及び修復を示す模式図である。３つの相同部位をｉｎｔ２２ｈ−１、ｉｎｔ２２ｈ−２及びｉｎｔ２２ｈ−３でそれぞれ示した。青色矢印の頭は、ＰＣＲプライマーを示す。ｉｎｔ２２ｈ−１またはｉｎｔ２２ｈ−３付近のヌクレアーゼターゲット部位は、黒色（ＲＧＥＮ ０２）または赤色（ＲＧＥＮ ０３）の稲妻状にそれぞれ表示した。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣで部分−逆位されたＦ８遺伝子の矯正結果を示す図である。図１ｃは、ＨｅＬａ細胞でヌクレアーゼターゲット部位の突然変異をＴ７Ｅ１分析で確認した結果である。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣで部分−逆位されたＦ８遺伝子の矯正結果を示す図である。図１ｄは、ＨｅＬａ細胞で５６３−ｋｂｐ染色体分節の逆位に該当するＰＣＲ産物を示す。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣで部分−逆位されたＦ８遺伝子の矯正結果を示す図である。図１ｅは、ｉＰＳＣクローンで逆位矯正を確認するＰＣＲ分析結果である。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣで部分−逆位されたＦ８遺伝子の矯正結果を示す図である。図１ｆは、逆位−矯正されたｉＰＳＣクローンでの変曲点連結部のＤＮＡ配列を示す。各ＲＧＥＮターゲット配列を下線で表示し、ＰＡＭ配列は、緑色で表示し、点線は、削除された塩基を示す。小文字は、挿入された配列を示し、青色矢印は、切断部位を示す。 逆位−矯正されたｉＰＳＣクローンの特性を分析した結果を示す図である。図２ａは、親及び矯正された細胞株で内生的なＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ ｍＲＮＡを検出するための定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）結果を示す。各遺伝子の発現レベルは、ＧＡＰＤＨを通じて標準化した。 逆位−矯正されたｉＰＳＣクローンの特性を分析した結果を示す図である。図２ｂは、逆位−矯正された細胞株のインビトロ分化を示す。各マーカータンパク質の発現は、外胚葉（Ｎｅｓｔｉｎ）、中胚葉［α−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）］及び内胚葉［ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）］に分化したことを示す（スケールバー、５０ｍｍ）。 逆位−矯正されたｉＰＳＣクローンの特性を分析した結果を示す図である。図２ｃは、ヒトＥＳＣ特異的マーカーであるＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４発現を免疫細胞化学を通じて検出した結果である（スケールバー、１００ｍｍ）。各ｉＰＳＣ細胞株の核型も共に表示した。 逆位−矯正されたｉＰＳＣクローンの特性を分析した結果を示す図である。図２ｄは、イントロン１及び２２の逆位−矯正されたｉＰＳＣ細胞株で分化した細胞でのＦ８遺伝子発現を示す図である。野生型ｉＰＳＣｓ（ＷＴ）、患者ｉＰＳＣｓ（Ｐａ１、Ｐａ２及びＰａ３）及び逆位−矯正されたＰａ１−（Ｃｏ−１及びＣｏ−２）またはＰａ２−ｉＰＳＣｓ（Ｃｏ−１、Ｃｏ−２及びＣｏ−３）から由来した細胞でのＦ８及び中胚葉マーカー（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ（上端）及びｑＰＣＲ（下端）で測定した。ＧＡＰＤＨ発現がローディング対照群として使われた。 逆位−矯正されたｉＰＳＣクローンの特性を分析した結果を示す図である。図２ｅは、逆位−矯正されたｉＰＳＣ細胞株でエキソン１及び２またはエキソン２２及び２３の間の正しいスプライシングを示すクロマトグラムである。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣでイントロン１の逆位の矯正を示す図である。図３ａは、重症Ａ型血友病患者で発見されるイントロン１の逆位が矯正される過程の模式図を示す。青色矢印の頭は、ＰＣＲプライマーを示す。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣでイントロン１の逆位の矯正を示す図である。図３ｂは、ＨｅＬａ細胞でＦ８遺伝子のイントロン１内のＲＧＥＮ ０１ターゲット部位の突然変異頻度をＴ７Ｅ１分析を通じて測定した結果を示す。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣでイントロン１の逆位の矯正を示す図である。図３ｃは、ＨｅＬａ細胞の逆位遺伝子型に相応するＰＣＲ産物を示す図である。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣでイントロン１の逆位の矯正を示す図である。図３ｄは、２つのイントロン１相同体（ｉｎｔ１ ｈｏｍｏｌｏｇ １及び２と命名）及び変曲点連結部のＤＮＡ配列を示す図である。ゲノムＤＮＡをＲＧＥＮをコードするプラスミドに形質転換したＨｅＬａ細胞から分離し、逆位特異的なＰＣＲバンドを分離した後、２つの変曲点連結部の配列を分析した。ＲＧＥＮターゲット配列は、下線で表示し、ＰＡＭ配列は、緑色で表示し、点線は、削除された塩基を示す。小文字は、挿入された塩基を示す。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣでイントロン１の逆位の矯正を示す図である。図３ｅは、４個の矯正されたクローン（Ｃｏ−１〜Ｃｏ−４）のゲノムＤＮＡ ＰＣＲ分析結果を示す。ゲノムＤＮＡをイントロン１の逆位患者（Ｐａ１−Ｕ）の尿由来の細胞及び逆位または正常遺伝子型の陽性対照群である野生型ｉＰＳＣ（ＷＴ）からそれぞれ分離した。 Ａ型血友病患者由来のｉＰＳＣでイントロン１の逆位の矯正を示す図である。図３ｆは、２つの相同体（ｉｎｔ１ ｈｏｍｏｌｏｇ １及び２と命名）及び変曲点連結部のＤＮＡ配列を示す。ゲノムＤＮＡをＲＧＥＮをコードするプラスミドに形質転換したｉＰＳＣから分離した。修復特異的ＰＣＲバンドを分離し、２つの変曲点連結部の配列を分析した。ＲＧＥＮターゲット配列を下線で表示し、ＰＡＭ配列は、緑色で示し、点線は、削除された塩基を意味する。 ＨｅＬａ細胞または患者ｉＰＳＣでのターゲッティングされた逆位及び修復を示す図である。図４ａは、ＨｅＬａ細胞で逆位に対する２つの変曲点連結部のＤＮＡ配列を示す。各ＲＧＥＮターゲット配列を下線で表示し、ＰＡＭ配列は、緑色で示し、点線は、削除された塩基を意味する。小文字は、挿入された塩基を示し、青色矢印は、切断部位を示す。 ＨｅＬａ細胞または患者ｉＰＳＣでのターゲッティングされた逆位及び修復を示す図である。図４ｂは、イントロン１の部位での変曲点連結部のＤＮＡ配列を示す。ＲＧＥＮ ＲＮＰは、電気穿孔を通じてイントロン１（Ｐａ１−ｉＰＳＣｓ）の逆位細胞に直接に伝達された。全体ＤＮＡをｉＰＳＣから分離後、シーケンシングした。各ＲＧＥＮターゲット配列を下線で表示し、ＰＡＭ配列は、緑色で示し、点線は、削除された塩基を意味する。小文字は、挿入された塩基を示し、２つの青色矢印は、切断部位を示す。配列が一回以上検出された場合、検出された回数を括弧内の番号で表示した。 ＨｅＬａ細胞または患者ｉＰＳＣでのターゲッティングされた逆位及び修復を示す図である。図４ｃは、イントロン２２の部位での変曲点連結部のＤＮＡ配列を示す。ＲＧＥＮ ＲＮＰは、電気穿孔を通じてイントロン２２（Ｐａ３−ｉＰＳＣｓ）の逆位細胞に直接に伝達された。全体ＤＮＡをｉＰＳＣから分離後、シーケンシングした。各ＲＧＥＮターゲット配列を下線で表示し、ＰＡＭ配列は、緑色で示し、点線は、削除された塩基を意味する。小文字は、挿入された塩基を示し、２つの青色矢印は、切断部位を示す。配列が一回以上検出された場合、検出された回数を括弧内の番号で表示した。 エピソームリプログラミングベクターを用いてＨＤＦからｉＰＳＣクローンを製作した結果を示す図である。図５ａは、拡張されたヒトｉＰＳＣ（Ｅｐｉ３クローン）の形態を示す図である（スケールバー、２００μｍ）。 エピソームリプログラミングベクターを用いてＨＤＦからｉＰＳＣクローンを製作した結果を示す図である。図５ｂは、ｉＰＳＣ（Ｅｐｉ３クローン）に対するアルカリホスファターゼ染色結果である（スケールバー、５００μｍ）。 エピソームリプログラミングベクターを用いてＨＤＦからｉＰＳＣクローンを製作した結果を示す図である。図５ｃは、確立されたｉＰＳＣ細胞株（Ｅｐｉ１ｔＥｐｉ８）に残っているエピソームベクター（ＥＢＮＡ−１）配列を検出した結果を示す。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、分離された全体ＤＮＡに対する対照群として使われた。電気穿孔前（ｎａ）と後（６日）に細胞から分離された全体ＤＮＡが、それぞれエピソームベクターＤＮＡに対する陰性及び陽性対照群としてそれぞれ使われた。レトロウイルス由来の野生型ｉＰＳＣ細胞株（ｉＰＳＣ１）も、陰性対照群として分析された。 エピソームリプログラミングベクターを用いてＨＤＦからｉＰＳＣクローンを製作した結果を示す図である。図５ｄは、免疫細胞化学を通じてヒトＥＳＣ−特異的マーカーであるＯＣＴ４及びＳＳＥＡ−４の発現を検出した結果を示す。ＤＡＰＩ信号は、イメージ内の全体細胞を示す（スケールバー、１００μｍ）。 エピソームリプログラミングベクターを用いてＨＤＦからｉＰＳＣクローンを製作した結果を示す図である。図５ｅは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＧＡＰＤＨの転写レベルを測定するために、遺伝子−特異的プライマー（表３）を用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行った結果を示す。ｍＲＮＡレベルは、ＨＤＦｓ、ヒトＥＳ細胞株（Ｈ９）、野生型ｉＰＳＣ細胞株（ＷＴ−ｉＰＳＣＥｐｉ３）及びＷＴ−ｉＰＳＣＥｐｉ３細胞株（１、ＨＤＦｓ；２、Ｈ９；３、ＷＴ−ｉＰＳＣ；４、Ｉｎｖ １；５、Ｉｎｖ ２）から由来した逆位クローン（Ｉｎｖ １及びＩｎｖ ２）ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＷＴ−ｉＰＳＣＥｐｉ３細胞株（１、ＨＤＦｓ；２、Ｈ９；３、ＷＴ−ｉＰＳＣ；４、Ｉｎｖ １；５、Ｉｎｖ ２）で測定した。 エピソームリプログラミングベクターを用いてＨＤＦからｉＰＳＣクローンを製作した結果を示す図である。図５ｆは、ｑＰＣＲを通じて各細胞でのＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８ ｍＲＮＡを定量化した結果であって、ＧＡＰＤＨ発現を基準に標準化した。 エピソームリプログラミングベクターを用いてＨＤＦからｉＰＳＣクローンを製作した結果を示す図である。図５ｇは、外胚葉（Ｎｅｓｔｉｎ）、中胚葉［α−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）、及び内胚葉［ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）］マーカータンパク質の発現を示す（スケールバー、５０μｍ）。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＦ８遺伝子のＴＡＬＥＮ−媒介逆位を示す図である。図６ａは、Ａ型血友病患者で表われる染色体逆位の予想メカニズムである。Ｆ８遺伝子に該当する１４０−ｋｂｐ染色体分節の逆位は、逆方向から由来した２つの相同部位（Ｆ８遺伝子の１番イントロンに位置したｈｏｍｏｌｏｇ １及び１４０−ｋｂｐアップストリーム部位に位置するｈｏｍｏｌｏｇ ２）と関連している。赤色三角形は、ＴＡＬＥＮターゲット部位を、矢印は、１４０−ｋｂｐ逆位を検出するために設計されたプライマーをそれぞれ示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＦ８遺伝子のＴＡＬＥＮ−媒介逆位を示す図である。図６ｂは、１１個のＴＡＬＥＮ対のＴ７Ｅ１分析結果を示す。Ｔ７Ｅ１によって切断されたＤＮＡバンドの予想位置は、別表で表示した。 ｉＰＳＣのＦ８座位のＴＡＬＥＮ−媒介逆位を示す図である。図７ａは、４個の逆位クローンのゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ分析結果を示す。Ａ型血友病患者細胞（Ｐａ）及び野生型ｉＰＳＣ（ＷＴ）から分離したゲノムＤＮＡ試料をそれぞれ逆位または正常遺伝子型に対する陽性対照群として用いた。 ｉＰＳＣのＦ８座位のＴＡＬＥＮ−媒介逆位を示す図である。図７ｂは、逆位クローンの変曲点連結部（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のＤＮＡ配列を示す図である。ＴＡＬＥＮ結合部位は、赤色（ｈｏｍｏｌｏｇ １）または青色（ｈｏｍｏｌｏｇ ２）で表示した。 Ｆ８遺伝子逆位の修復（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）を示す図である。３つの繰り返しクローンから収得したゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行った（図８ａ）。Ａ型血友病患者細胞（Ｐａ）または野生型ｉＰＳＣ（ＷＴ）から分離したゲノムＤＮＡを逆位または正常遺伝子型のための陽性対照群としてそれぞれ使用した。 Ｆ８遺伝子逆位の修復（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）を示す図である。図８ｂは、繰り返しクローンでの変曲点連結部のＤＮＡ配列を示す図である。ＴＡＬＥＮ結合部位は、赤色（ｊｕｎｃｔｉｏｎ １）または青色（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ２）で示した。ダッシュは、削除された塩基を示す。 Ｆ８遺伝子逆位の修復（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）を示す図である。図８ｃは、繰り返しクローン（クローン１及び３）で２つのＴＡＬＥＮ結合部位の間の配列（それぞれ相同体１及び２）に対するクロマトグラムをそれぞれ示す。 逆位及び繰り返しクローンの特性を分析した結果を示す図である。図９ａは、逆位及び繰り返しクローンから由来した細胞でのＦ８遺伝子発現を示す。ＰＣＲを通じて野生型ｉＰＳＣｓ（ＷＴ）、逆位クローン（Ｉｎｖ １及び２）及び繰り返しクローン（Ｒｅｖ １、２、及び３）から由来した細胞でのＦ８及び外胚葉マーカー遺伝子（ＦＯＸＡ２及びＳｏｘ１７）の発現を検出した。ＧＡＰＤＨをローディング対照群として使用した。 逆位及び繰り返しクローンの特性を分析した結果を示す図である。図９ｂは、逆位及び繰り返しクローンから分化された上皮細胞のＦ８タンパク質発現を示す図である。分化された細胞を固定し、指示された抗体で染色した。ＤＡＰＩ信号は、イメージ内の全体細胞を示す（ＦＶＩＩＩ、Ｆ８タンパク質；ｖＷＦ、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（成熟上皮マーカータンパク質）；スケールバー、１００μｍ）。 エピソームリプログラミングベクターを用いて製作されたヒトｉＰＳＣｓの特性を分析した結果を示す図である。核型分析は、１０継代（Ｅｐｉ３）及び１２継代（Ｅｐｉ８）のＷＴ−ｉＰＳＣ細胞株の染色体に対して行った（図１０ａ）。 エピソームリプログラミングベクターを用いて製作されたヒトｉＰＳＣｓの特性を分析した結果を示す図である。ヒトＥＳＣ−特異的表面マーカーであるＮａｎｏｇ及びＴＲＡ−１−６０の発現を免疫細胞化学分析を通じて測定した（図１０ｂ）。ＤＡＰＩ信号は、イメージ内の全体細胞を示す（スケールバー、１００μｍ）。 エピソームリプログラミングベクターを用いて製作されたヒトｉＰＳＣｓの特性を分析した結果を示す図である。図１０ｃは、外胚葉（Ｐａｘ６）、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及び内胚葉（ＨＮＦ３β）標識タンパク質の発現を示す（スケールバー、５０μｍ）。 ターゲッティングされた逆位の頻度を示す図である。ターゲッティングされた逆位の頻度をデジタルＰＣＲを用いて測定した（図１１ａ）。 ターゲッティングされた逆位の頻度を示す図である。ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドに形質転換された細胞から分離したゲノムＤＮＡ試料を順次に希釈してデジタルＰＣＲ分析を行った。ＺＦＮｓ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）またはＴＡＬＥＮで誘発された染色体逆位の頻度を測定した（図１１ｂ）。Ｚ１０は、Ｆ８遺伝子の１番イントロン相同体をターゲッティングするＺＦＮ対である。１４０−ｋｂｐ逆位の頻度は、デジタルＰＣＲで測定した。上限と下限は、信頼区間９５％を示す。 ＴＡＬＥＮオフターゲット効果を分析した結果を示す図である。本発明で設計されたＴＡＬＥＮの潜在的なオフターゲット部位は、インシリコで探索した。ＴＡＬＥＮターゲット部位と最も類似した３個の潜在的なオフターゲット部位を選定してＴ７Ｅ１分析を行うことによって、これら部位でのオフターゲット切断有無を確認した。 逆位及び繰り返しクローンでのヒトＥＳマーカーの発現を示す図である。野生型ｉＰＳＣ細胞株（ＷＴ−ｉＰＳＣＥｐｉ３）、逆位クローン（Ｉｎｖ １）及び繰り返しクローン（Ｒｅｖ １、２及び３）のＯＣＴ４、Ｓｏｘ２及びＬｉｎ２８ ｍＲＮＡレベルを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定した。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを標準化に使用した。 逆位及び繰り返しクローンのインビトロ分化を示す図である。マーカータンパク質の発現は、それぞれ逆位クローン（上端）及び繰り返しクローン（下端）での外胚葉（βＩＩＩ−チューブリン）、中胚葉［α−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）］及び内胚葉［ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏタンパク質）及びＨＮＦ３β］を示す（スケールバー、５０μｍ）。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明で用いられるＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）である。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明で用いられる誘導ＲＮＡは、前記配列表の配列番号１で表されるヌクレオチド配列及び前記配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡである。

本発明によれば、本発明のＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼ及び誘導ＲＮＡは、それぞれタンパク質及び転写されたＲＮＡの形態で用いられてもよく、これらをそれぞれコーディングするＤＮＡが搭載されたベクターに形質転換することによって、目的細胞に伝達されても良い。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位矯正用組成物を提供する：
（ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド；及び
（ｂ）配列表の配列番号４で表されるヌクレオチド配列内に含まれる１５〜２５ｂｐの長さのヌクレオチド配列であって、前記配列表の配列番号４で表されるヌクレオチド配列内に８０％以上の配列類似性を有するヌクレオチド配列が存在せず、同時にダウンストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが連結されたヌクレオチド配列またはその相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡまたは前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド。

本発明によれば、本発明は、前述した発明の態様によって、Ｆ８遺伝子の２２番イントロンで発生する逆位の矯正が可能であるが、配列表の配列番号４で表される配列のＦ８遺伝子の１番イントロン内の配列をターゲットとする誘導ＲＮＡを使用することによって、Ｆ８遺伝子の１番イントロンで発生する逆位の矯正も可能である。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明で用いられる誘導ＲＮＡは、配列表の配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその相補的な配列を特異的に認識する。配列表の配列番号３で表される配列は、１番イントロン相同体１（ｉｎｔ１ｈ−１）及びｉｎｔ１ｈ−２にいずれも存在する連続したヌクレオチド配列であって、それをターゲットとする誘導ＲＮＡを用いてｉｎｔ１ｈ−１及びｉｎｔ１ｈ−２の間で発生する逆位の矯正が可能である。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明で用いられるＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次の段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位が矯正された誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の製造方法を提供する：
（ａ）Ａ型血友病患者から分離された体細胞を逆分化させて誘導万能幹細胞を収得する段階；及び
（ｂ）前記誘導万能幹細胞を前述した本発明の組成物と接触させるか、前記組成物が挿入された遺伝子伝達体に形質転換させる段階。

Ａ型血友病患者から分離された体細胞を逆分化させて収得した誘導万能幹細胞は、患者固有の逆位された遺伝子を収めており、これは、前述した本発明の方法を通じてインビトロで矯正されうる。すなわち、逆位が発生した部分を調査した後、前記逆位発生部位を特異的に認識する誘導ＲＮＡを用いるならば、一定頻度で逆位が矯正されて野生型と同じ遺伝子型を有する患者カスタマイズド型誘導万能幹細胞を収得することができる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の方法によって製造された誘導万能幹細胞を提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の誘導万能幹細胞を有効成分として含むＡ型血友病治療用組成物を提供する。

本発明の誘導万能幹細胞は、血友病患者の遺伝子逆位が矯正された細胞であって、以後、適切な体細胞に分化されて患者に移植された後、矯正された遺伝子を発現することによって、難病であるＡ型血友病に対する有用な細胞治療用組成物になりうる。したがって、本発明の組成物は、直接体内移植されたままインビボで目的細胞に分化を誘導することもでき、あるいはインビトロで目的細胞に分化を完了した後、体内に移植することもできる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導用組成物を提供する：
（ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド；及び
（ｂ）次のヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡまたは前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド：
（ｉ）配列表の配列番号１で表されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列；及び
（ｉｉｉ）Ｆ８遺伝子の２２番イントロン上の前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内に存在する１５〜２５ｂｐヌクレオチド配列
で構成された群から選択される一対のヌクレオチド配列であって、
前記（ｉｉｉ）は、前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内で前記（ｉ）または前記（ｉｉ）とそれぞれ８０％以上の配列類似性を有するヌクレオチド配列が存在せず、同時にダウンストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが連結されたことを特徴とする組成物。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導用組成物を提供する：
（ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド；及び
（ｂ）配列表の配列番号４で表されるヌクレオチド配列内に含まれる１５〜２５ｂｐの長さのヌクレオチド配列であって、前記配列表の配列番号４で表されるヌクレオチド配列内に８０％以上の配列類似性を有するヌクレオチド配列が存在せず、同時にダウンストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが連結されたヌクレオチド配列またはその相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡまたは前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド。

本発明で用いられる各構成については、既に前述したので、過度な重複を避けるために、その記載を省略する。

本発明によれば、本発明の方法を逆位が発生した患者細胞を出発物質として使用する場合、発生した逆位の再逆位、すなわち、矯正を誘導することができるが、逆に、正常人の細胞を出発物質として用いる場合、逆位を誘導することができる。したがって、正常遺伝子型を有する細胞を出発細胞として用いることによって、本発明は、人為的血友病細胞を効率的に収得する有用なリサーチツール（ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）になりうる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導用組成物を正常人の体細胞に導入する段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導方法を提供する。

本発明で用いられる各組成物及び段階については、既に前述したので、過度な重複を避けるために、その記載を省略する。

本発明の一態様によれば、本発明は、次を含むポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位矯正用組成物を提供する：
（ａ）一対のエンドヌクレアーゼ；及び
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼのうち１つにそれぞれ連結され、Ｆ８遺伝子の逆位発生部位を特異的に認識するアミノ酸配列を含む一対のＴＡＬ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ）エフェクタードメイン。

本発明の他の態様によれば、本発明は、Ａ型血友病患者の体細胞を前記組成物と接触させるか、前記組成物が挿入された遺伝子伝達体に形質転換させる段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位を矯正する方法を提供する。

本発明によれば、本発明は、Ｆ８遺伝子の逆位発生部位を特異的に認識するＴＡＬエフェクタードメインを用いてターゲット部位がガイディングされ、前記部位を前記ドメインと結合したエンドヌクレアーゼが正確に切断することによって、逆位によって覆された遺伝子部分の両端部位が切断される。切断された遺伝子部位は、一定頻度で再逆位を起こすことによって、結果的に逆位の矯正が達成される。

本発明で、用語“特異的に認識”は、本発明のターゲット配列との相互作用によって、それを選択的に認識することを意味し、これにより、“特異的に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）”と同じ意味として使われる。本発明で用いられるＴＡＬエフェクターは、３４個のアミノ酸からなる中央繰り返しドメイン（ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ）を有しながら、１２及び１３番目のアミノ酸残基は、多様なアミノ酸からなっており、ＲＶＤ（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）と呼ばれる。それぞれのＲＶＤは、特定のＤＮＡの塩基を識別する役割を果たし、ＮＩ＝Ａ、ＮＮ＝Ｇ、ＮＧ＝Ｔ、及びＨＤ＝Ｃを認識して、これと特異的に結合する（Ｂｏｃｈ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９−１５１２（２００９））。したがって、ターゲットＤＮＡ配列についての情報がある場合、このようなコードに基づいて、ターゲットＤＮＡ配列と特異的に結合するＴＡＬエフェクターアミノ酸配列を決定することができる。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明によって矯正されるＦ８遺伝子の逆位は、Ｆ８遺伝子の１番イントロンでの逆位であり、前記一対のＴＡＬエフェクタードメインは、それぞれ配列表の配列番号３４で表されるヌクレオチド配列内に含まれる第１位置及び第２位置のヌクレオチド配列に特異的に結合し、前記第１位置及び第２位置のヌクレオチド配列は、それぞれ１５〜２５ｂｐの長さを有しながら、互いに１０〜２０ｂｐ離れている。本発明によれば、配列表の配列番号３４で表されるヌクレオチド配列は、Ｆ８遺伝子の１番イントロンの相同体１のヌクレオチド配列（約１ｋｂ）である。したがって、第１位置及び第２位置は、それぞれ左側ＴＡＬエフェクター及び右側ＴＡＬエフェクターが結合し、これにそれぞれ連結された一対のエンドヌクレアーゼは、第１位置及び第２位置の間の１０〜２０ｂｐ（スぺーサ）部分を正確に切断する。

本発明の具体的な具現例によれば、前記第１位置及び第２位置のヌクレオチド配列は、それぞれ配列表の配列番号３０及び配列番号３１で表されるヌクレオチド配列である。

より具体的には、本発明の配列表の配列番号３０で表されるヌクレオチド配列に特異的に結合するアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む。

より具体的には、本発明の配列表の配列番号３１で表されるヌクレオチド配列に特異的に結合するアミノ酸配列は、配列表の配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明で用いられるエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。

本発明によれば、本発明のエンドヌクレアーゼ及びＴＡＬエフェクターは、それぞれタンパク質の形態で用いられてもよく、これらをそれぞれコーディングするＤＮＡが搭載されたベクターに形質転換することによって、目的細胞に伝達されても良い。

本発明の他の態様によれば、本発明は、次の段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位が矯正された誘導万能幹細胞の製造方法を提供する：
（ａ）Ａ型血友病患者から分離された体細胞を逆分化させて誘導万能幹細胞を収得する段階；及び
（ｂ）前記誘導万能幹細胞を本発明の前述した組成物と接触させるか、前記組成物が挿入された遺伝子伝達体に形質転換させる段階。

Ａ型血友病患者から分離された体細胞を逆分化させて収得した誘導万能幹細胞は、患者固有の逆位された遺伝子を収めており、これは、前述した本発明の方法を通じてインビトロで矯正されうる。すなわち、逆位が発生した部分を調査した後、前記逆位発生部位を特異的に認識するＴＡＬエフェクタードメインを用いるならば、一定頻度で逆位が矯正されて野生型と同じ遺伝子型を有する患者カスタマイズド型誘導万能幹細胞を収得することができる。

本発明の具体的な具現例によれば、本発明の一対のＴＡＬエフェクタードメインは、それぞれＦ８遺伝子上で切断しようとする部位を挟んで１０〜２０ｂｐ離れており、より具体的には、１２〜１６ｂｐ離れており、最も具体的には、１２〜１４ｂｐ離れている。

本発明の具体的な具現例によれば、前記Ａ型血友病は、Ｆ８遺伝子の１番イントロンで逆位が発行したＡ型血友病であり、前記一対のＴＡＬエフェクタードメインは、それぞれ配列表の配列番号３０及び配列番号３１で表されるヌクレオチド配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む。

本具現例は、Ａ型血友病のうち、Ｆ８遺伝子の１番イントロンで逆位が発生したＡ型血友病の逆位が矯正された誘導万能幹細胞を製作するための具現例であり、その各構成及び段階は、既に前述したので、過度な重複を避けるために、その記載を省略する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の方法によって製造された誘導万能幹細胞を提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の誘導万能幹細胞を有効成分として含むＡ型血友病治療用組成物を提供する。

本発明の誘導万能幹細胞は、血友病患者の遺伝子逆位が矯正された細胞であって、以後、適切な体細胞に分化されて患者に移植された後、矯正された遺伝子を発現することによって、難病であるＡ型血友病に対する有用な細胞治療用組成物になりうる。したがって、本発明の組成物は、直接体内移植されたままインビボで目的細胞に分化を誘導することもでき、あるいはインビトロで目的細胞に分化を完了した後、体内に移植することもできる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次を含むポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導用組成物を提供する：
（ａ）一対のエンドヌクレアーゼ；及び
（ｂ）前記（ａ）のうちの１つに連結され、Ｆ８遺伝子上の第１位置のヌクレオチド配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含むＴＡＬエフェクタードメイン：
（ｃ）前記（ａ）のうちの１つに連結され、Ｆ８遺伝子上の第２位置のヌクレオチド配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含むＴＡＬエフェクタードメインまたは前記エフェクタードメインをコードするヌクレオチドであって、前記第１位置及び第２位置は、それぞれ１５〜２５ｂｐの長さを有し、互いに１０〜２０ｂｐ離れていることを特徴とする組成物。

本発明で用いられる各構成については、既に前述したので、過度な重複を避けるために、その記載を省略する。

本発明によれば、本発明の方法を逆位が発生した患者細胞を出発物質として使用する場合、発生した逆位の再逆位、すなわち、矯正を誘導することができるが、逆に、正常人の細胞を出発物質として用いる場合、逆位を誘導することができる。したがって、正常遺伝子型を有する細胞を出発細胞として用いることによって、本発明は、人為的血友病細胞を効率的に収得する有用なリサーチツールになりうる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の組成物を正常人の体細胞に導入する段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導方法を提供する。

本発明で用いられる各組成物及び段階については、既に前述したので、過度な重複を避けるために、その記載を省略する。

以下、前述した本発明に共通して適用される事項について説明する。

本明細書において、用語“ヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、異ならせて特別に言及されていない限り、天然のヌクレオチドの類似体を含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０））。

本発明で、用語“特異的に認識”は、本発明のターゲット配列との相補性に基づいて、それを選択的に認識することを意味し、これにより、“特異的に結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）”と同じ意味として使われる。用語“相補的”は、所定のアニーリングまたはハイブリダイジング条件下で本発明の誘導ＲＮＡがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズする程度に十分に相補的であることを意味し、実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）及び完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）であることをいずれも包括する意味を有し、具体的には、完全に相補的であることを意味する。本明細書において、用語、“実質的に相補的”は、完全に一致される配列だけではなく、特定の配列にアニーリングすることができる範囲内で、比較対象の配列と部分的に不一致される配列も含まれる意味である。

本明細書において、用語“誘導万能幹細胞”は、分化された細胞から人為的な逆分化過程を通じて多能性分化能を有するように誘導された細胞を称し、逆分化誘導万能幹細胞とも称される。誘導万能幹細胞は、胚芽幹細胞とほぼ同じ特性を有し、具体的に、細胞外形、遺伝子、タンパク質発現パターンが類似し、インビトロ及びインビボで全分化能を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、遺伝子の生殖腺転移（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。本発明の誘導万能幹細胞としては、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、兎などのあらゆる哺乳類由来の逆分化誘導万能幹細胞を含むが、具体的には、ヒト由来の誘導万能幹細胞であり、最も具体的には、Ａ型血友病患者から由来した誘導万能幹細胞である。

本明細書において、用語“逆分化”は、存在する分化細胞を未分化状態に戻して新たな分化組織形成を可能にする後成学的な逆行過程を意味するものであって、リプログラミング過程とも言い、細胞誘電体の後成学的な変形（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ）の可逆性に基づいたものである。本発明での目的によって、前記“逆分化”とは、０％以上ないし１００％未満の分化能を有する分化された細胞を未分化状態に戻す過程であれば、いずれもこれに含まれ、例えば、０％の分化能を有する分化された細胞を１％の分化能を有する分化された細胞に微分化させる過程も、これに含まれうる。

本発明の逆分化は、既に分化された細胞の分化能を回復させることができる当業者に知られた多様な方法を通じて行われ、例えば、前記Ａ型血友病患者から分離された体細胞にＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣで構成された群から選択される１つ以上の遺伝子を形質転換することでなされる。

誘導万能幹細胞を得るために、ヒト体細胞の培養に用いられる培地は、通常の如何なる培地も含む。例えば、Ｅａｇｌｅｓ’ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｅａｇｌｅ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２（１９５９））、α−ＭＥＭ（Ｓｔａｎｎｅｒ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３０：５２（１９７１））、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２（Ｈａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物（Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０））、Ｗａｙ−ｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２２：１００３（１９５９））、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（ＭｃＣｏｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１００：１１５（１９５９））、及びＭＣＤＢシリーズ（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １４：１１（１９７８））などが用いられうるが、これらに限定されるものではない。

本明細書において、用語“遺伝子伝達体”は、所望のターゲット遺伝子を対象細胞に導入して発現させるための媒介体を意味する。理想的な遺伝子伝達体は、人体または細胞に無害であり、量産が容易であり、効率的に遺伝子を伝達しなければならない。

本明細書において、用語“遺伝子伝達”は、遺伝子が細胞内に運ばれることを意味し、遺伝子の細胞内浸透（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と同じ意味を有する。組織レベルで、前記用語“遺伝子伝達”は、遺伝子の拡散（ｓｐｒｅａｄ）と同じ意味を有する。したがって、本発明の遺伝子伝達体は、遺伝子浸透システム及び遺伝子拡散システムと記載されうる。

本発明の遺伝子伝達体を製造するために、本発明のヌクレオチド配列は、適した発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）内に存在することが望ましい。前記発現コンストラクトで、本発明のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に連結されることが望ましい。本明細書において、用語“作動的に結合された”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／または解毒を調節する。本発明において、本発明のヌクレオチド配列に結合されたプロモーターは、望ましくは、動物細胞、より望ましくは、哺乳動物細胞で作動してリラキシン遺伝子の転写を調節することができるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（哺乳動物サイトメガロウイルス）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｕ６プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。最も望ましくは、本発明で使われるプロモーターは、ＣＭＶプロモーター及び／またはＵ６プロモーターである。

本発明の遺伝子伝達体は、多様な形態で製作することができるが、これは、（ｉ）裸（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクター、そして、（ｉｖ）前記裸組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはニオソームの形態で製作することができる。

本発明のヌクレオチド配列は、通常の動物形質転換に用いられるあらゆる遺伝子伝達システムに適用可能であり、望ましくは、プラスミド、アデノウイルス（Ｌｏｃｋｅｔｔ ＬＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：２０７５−２０８０（１９９７））、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ、Ｌａｓｈｆｏｒｄ ＬＳ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レトロウイルス（Ｇｕｎｚｂｕｒｇ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レンチウイルス（Ｗａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５−６２（１９９９））、単純ヘルペスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｔ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１４１１−１４１５（１９９５））、ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：６４９−６５７（１９９９））、リポソーム（Ｍｅｔｈｏ ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １９９，Ｓ．Ｃ．Ｂａｓｕ ａｎｄ Ｍ．Ｂａｓｕ（Ｅｄｓ．）、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ ２００２）またはニオソームに適用可能である。最も具体的には、本発明の遺伝子伝達体は、プラスミドである。

本発明で、遺伝子伝達体がウイルスベクターに基づいて製作された場合には、前記接触させる段階は、当業者に公知のウイルス感染方法によって実施される。ウイルスベクターを用いた宿主細胞の感染は、前述した引用文献に記載されている。

本発明で、遺伝子伝達体が裸組換えＤＮＡ分子またはプラスミドである場合には、微小注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０）；及びＨａｒｌａｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０１：１０９４−１０９９（１９８５））、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）；及びＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１：８４１（１９８２）；及びＴｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８（１９８６））、リポソーム媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０）；Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０（１９８２）；及びＮｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））方法によって遺伝子を細胞内に導入させ、最も具体的には、電気穿孔法を利用できる。

本発明で、治療しようとするＡ型血友病は、重症Ａ型血友病である。本明細書において、用語“重症Ａ型血友病（ｓｅｖｅｒｅ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ）”は、血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）の活性が正常人の１％未満である場合を意味する。

本明細書において、用語“治療”は、（ａ）疾患、疾病または症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、Ａ型血友病にかかった個体で矯正されて野生型と同じ遺伝子を発現することによって、遺伝子逆位で誘発された症状の発展を抑制するか、それを除去するか、または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体でもＡ型血友病の治療組成物になり、あるいは他の薬理成分と共に投与されて、前記疾患に対する治療補助剤としても適用される。これにより、本明細書において、用語“治療”または“治療剤”は、“治療補助”または“治療補助剤”の意味を含む。

本明細書において、用語“投与”または“投与する”は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接に投与することによって、対象体の体内で同量を形成させることを言う。したがって、用語“投与する”は、本発明の有効成分である誘導万能幹細胞またはそれを再分化させた成体細胞を注入または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）することを含むので、用語“投与する”は、“注入する”または“移植する”のような意味として使われる。

組成物の“治療的有効量”は、組成物を投与しようとする対象体に治療的または予防的効果を提供するのに十分な抽出物の含量を意味し、これにより、“予防的有効量”を含む意味である。本明細書において、用語“対象体”は、制限なしにヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、犬、猫、馬、牛、豚、猿、チンパンジー、ヒヒまたは赤毛猿を含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。

本発明の組成物が薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）または培地などを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与し、具体的には、血管内（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ）投与することができる。

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。本発明の薬剤学的組成物の一般的な投与量は、成人基準に１日当たり１０^２〜１０^１０細胞である。

本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

実施例１．ＲＧＥＮ （ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）
実験方法
本発明によるＡ型血友病患者の尿由来のｉＰＳＣの分析は、大韓民国の延世大学校研究倫理審議委員会の承認（ＩＲＢ ＃ ４−２０１２−００２８）下になされた。あらゆる自願者は、ヒトｉＰＳＣ生成のための尿試料の寄贈に先立って、書面同意書に署名した。

細胞培養及び形質転換
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２）を１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び１％抗生剤が補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。ＤＳＢを誘発するために、１×１０^５ＨｅＬａ細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００形質感染試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造社の説明書によって、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（それぞれ０．５ｍｇ）に共形質転換した。ＷｉＣｅｌｌ Ｉｎｃで購入したヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）細胞株（Ｈ９）、ヒト皮膚線維芽細胞由来の野生型ｉＰＳＣｓ（ＷＴ−ｉＰＳＣ Ｅｐｉ３ ｌｉｎｅ）（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）及び尿由来のｉＰＳＣは、ｈＥＳＣ培地［２０％ノックアウト血清代替物（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）］で４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と共に保持させた。尿由来のｉＰＳＣで修復を誘発させるために、電気穿孔システム（Ｎｅｏｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１×１０^６細胞に５μｇ Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び５μｇ ｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（イントロン２２の逆位に対して、各５μｇのｓｇＲＮＡプラスミド）を電気穿孔した。

Ｃａｓ９タンパク質を尿由来のｉＰＳＣに直接伝達するために、従来に報告された方法を少し変形して形質転換を行った（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｃａｓ９タンパク質（１５μｇ）を２０μｇの転写されたｓｇＲＮＡ（イントロン２２の逆位に対する各ｓｇＲＮＡプラスミド２０μｇ）と混合し、常温で１０分間インキュベーションしてＲＮＰ（ＲＧＥＮ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を形成させた。ＲＮＰは、微細穿孔システムを通じて２Ｘ１０^５ｉＰＳＣに形質転換された。

重症Ａ型血友病患者から尿由来の細胞の分離及び拡張
重症Ａ型血友病と診断された１１人の患者から尿試料を収集し、前記診断は、韓国血友財団から臨床的に確認されたものである。尿由来の細胞は、従来に報告された方法で分離した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。要約すれば、細胞を約１００ｍｌの中間尿（ｍｉｄｓｔｒｅａｍ ｕｒｉｎｅ）から１０分間４００ｇでの遠心分離を通じて収集した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ、ＲＥＧＭ（ｒｅｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔ ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）から収得）及び１％抗生剤が補充されたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。このような条件で４日間培養後、細胞を拡張させるために、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）で培養した。これら細胞をゼラチン−コーティングされた培養皿に８０〜９０％のコンフルエンシに分けた。Ｆ８遺伝子型を確認するために、尿由来の患者細胞から分離したゲノムＤＮＡ視標をＦ８座位のイントロン１及び２２の逆位付近の適切な部位を認識するプライマーセットを用いてＰＣＲ分析を行った（Ｂａｇｎａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

ＲＧＥＮ組成物
従来報告された方法でＣａｓ９をコードするプラスミドを構築した（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＨＡエピトープ及びＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）に融合されたＣａｓ９タンパク質をＣＭＶプロモーター下で発現させた。ｓｇＲＮＡ発現には、Ｕ６プロモーターを使用した（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。精製された組換えＣａｓ９タンパク質は、ＴｏｏｌＧｅｎ，Ｉｎｃで購入した。ガイドＲＮＡは、ＭＥＧＡ ｓｈｏｒｔ ｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて従来に報告された方法でインビトロで転写した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。転写されたＲＮＡは、フェノール：クロロホルム抽出を通じて精製し、分光計で定量化した。

Ｔ７Ｅ１分析及びターゲッティングされた逆位の頻度測定
従来に報告された方法によってＴ７Ｅ１分析を行った（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００９）。要約すれば、ＲＧＥＮターゲット部位を含むＰＣＲアンプリコンを加熱して変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させ、アニーリングして異型接合（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）ＤＮＡ切片を形成させた。以後、前記切片にＴ７エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を３７℃で２０分間処理して、ミスマッチ部位が切断されるようにした後、生成物をアガロースゲル電気泳動で分析した。Ｆ８座位でのターゲッティングされた矯正の頻度を従来に報告された方法でデジタルＰＣＲ分析を通じて測定した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。リポフェクタミン２０００形質転換試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＧＥＮ及びｓｇＲＮＡプラスミドに共形質転換された細胞から分離したゲノムＤＮＡを順次に希釈し、該希釈された試料に対してＰＣＲ分析を行った。各希釈ポイントでの陽性バンド切片を決定し、結果をＥｘｔｒｅｍｅ Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを用いて分析した（ＨｕａｎｄＳｍｙｔｈ，２００９）。

ＨｅＬａ細胞でＦ８座位のＲＧＥＮ−媒介逆位の確認
本発明で設計されたＲＧＥＮの誘電体矯正活性を確認するために、各ＲＧＥＮをｓｇＲＮＡ発現プラスミドと共にＨｅＬａ細胞に共形質転換した。ＲＧＥＮ活性は、Ｔ７Ｅ１分析を通じて測定した。

患者由来のｉＰＳＣのＦ８座位でのターゲッティングされたＲＧＥＮ−媒介矯正
ｉＰＳＣをＳＴＯ細胞支持層で培養し、ＩＶ型コラゲナーゼで処理して採集した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を従来に報告された方法で単一細胞に分離した（Ｄｅｓｂｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これら単一細胞をＲＧＥＮ及びｓｇＲＮＡプラスミドと混合し、８５０ボルトの電圧で３０分間パルスを加えた。以後、細胞を支持細胞上にシーディングし、１０日間培養した。Ｆ８座位で発生した遺伝子逆位を検出するために、それぞれのコロニーから抽出した細胞を破砕し、ＰＣＲ分析を行い、使われたプライマーは、次の通りである：
１−Ｆ１：５’−ＡＡＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡ−３’、
１−Ｒ１：５’−ＴＧＧＣＡＴＴＡＡＣＧＴＡＴＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡ−３’；
１−Ｆ２：５’−ＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＡＡＴＧ−３’、
１−Ｒ２：５’−ＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＡＡＴＧ−３’；
２２−Ｆ１：５’−ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴ−３’、
２２−Ｒ２：５’−ＣＡＡＡＣＧＴＡＧＣＡＴＴＡＣＣＴＧＡＴＴＧＴ−３’；
２２−Ｆ２：５’−ＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡ−３’、
２２−Ｒ２：５’−ＴＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣＡＡ−３’。

クローン細胞群の確立及び特性分析
矯正された細胞のクローンを分離するために、所望の遺伝子変形（逆位遺伝子型の矯正）がなされたものであって、ＰＣＲを通じて確認された各コロニーを単一細胞に分離し、新たな細胞支持層にシーディングした。４回継代培養後、いくつかのクローン（イントロン１矯正された４個のクローン及びイントロン２２矯正された３個のクローン）を選定してシーケンシングを行い、追加実験を進行した。変曲点の配列分析のために、増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動してアガロースゲルから溶出した。

ＲＮＡ分離、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造社の説明書によって、総ＲＮＡを精製した。ＤｉａＳｔａｒ^ＴＭ ｃＤＮＡ合成キット（ＳｏｌＧｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）を用いて総ＲＮＡ（１μｇ）からｃＤＮＡを合成した。Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＧＡＰＤＨの発現を確認するために、合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＥｘ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＰＣＲを行った。ｑＰＣＲのために、ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を製造社の説明書によって使用した。イントロン１またはイントロン２２矯正細胞株からＦ８ ｍＲＮＡをそれぞれ増幅するために、エキソン１（または、イントロン２２矯正細胞株でエキソン２１）に位置した正方向プライマーをエキソン３（または、イントロン２２矯正細胞株でエキソン２３）に位置した逆方向プライマーと共に使用した。ＲＴ−ＰＣＲまたはｑＰＣＲには、次のプライマーセットを用いた：
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：５’−ＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＡ−３’、
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：５’−ＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’；
ＯＣＴ４−Ｆ：５’−ＣＣＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡ−３’、
ＯＣＴ４−Ｒ：５’−ＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＣＴ−３’；
ＬＩＮ２８−Ｆ：５’−ＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＡＧＣＣＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣ−３’、
ＬＩＮ２８−Ｒ：５’−ＴＣＡＡＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＴＡＧＧ−３’；
ＳＯＸ２−Ｆ：５’−ＴＴＣＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡ−３’、
ＳＯＸ２−Ｒ：５’−ＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣ−３’；
ＮＡＮＯＧ−Ｆ：５’−ＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧ−３’、
ＮＡＮＯＧ−Ｒ：５’−ＴＧＧＴＧＧＴＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＡＡＧ−３’；
Ｆ８−エキソン１−Ｆ：５’−ＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡ−３’、
Ｆ８−エキソン３−Ｒ：５’−ＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣ−３’；
Ｆ８−エキソン２１−Ｆ：５’−ＣＣＧＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧ−３’、
Ｆ８−エキソン２３−Ｒ：５’−ＡＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＡＡＣＧＧＡＴＧ−３’；
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−Ｆ：５’−ＡＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡ−３’、
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−Ｒ：５’−ＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＡＧＧＴＴＧＧ−３’）。

尿由来のｉＰＳＣの生成及びインビトロ分化
３継代以下に培養後、尿由来の細胞からｉＰＳＣを生成した。エピソームリプログラムベクターまたはセンダイウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて従来に報告された方法によって尿由来の細胞からｉＰＳＣを製作した（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ヒトＥＳ細胞と類似した形態を示す７個のｉＰＳＣコロニーを機械装置で取り上げて特性分析のためにさらに培養した。ｉＰＳＣは、インビトロで公知の方法を用いて３つの胚葉に分化させた（Ｓｕｇｉｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通じて部分的にｉＰＳＣを分離させることによって、胚芽体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ、ＥＢ）形成を誘導した。ＥＢをペトリディッシュ（ＳＰＬ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｏｒｅａ）に移し、ｂＦＧＦがなく、５％ＦＢＳが補充されたｈＥＳＣ培地で１０日間分化した。ＥＢが３つの胚葉を代表する細胞に自発的に分化されるかの有無は、適切な抗体を用いた免疫染色を通じて調査した。ｉＰＳＣを中胚葉系列に分化させるために、従来に報告された方法を少し変形して使用した（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。要約すれば、ＥＢをペトリディッシュに移し、ｂＦＧＦがなく、２０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補充されたｈＥＳＣ培地で培養した。３日目に、ＥＢをマトリゲル−コーティングされたディッシュにプレーティングし、前述した培地で３日間さらに培養した。分化６日目に、中胚葉系列に分化した細胞を採集してＦ８遺伝子発現を調査した。

ｉＰＳＣの特性分析
白血球アルカリホスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて製造社の説明書によって、アルカリホスファターゼ活性を測定した。ｉＰＳＣ細胞株が尿由来の細胞で生成されたということを確認するために、ＳＴＲ（ｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）を分析した。ＡｍｐＦＩＳＴＲ ＰＣＲ反応システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｉＰＳＣ細胞株及び親細胞から分離したゲノムＤＮＡ試料からＳＴＲ座位を増幅した。ＰＣＲ−基盤ＳＴＲ分析は、Ｈｕｍａｎ Ｐａｓｓ Ｉｎｃ（Ｋｏｒｅａ）で行った。核型分析のために、各ｉＰＳＣ細胞株由来染色体に対するＧ−バンディング分析をＧｅｎＤｉｘ Ｉｎｃ（Ｋｏｒｅａ）で行った。ＥＳ細胞マーカーに対する免疫染色は、従来に報告された方法通りに行った（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。核の視覚化のために、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、イメージは、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡またはＦＳＸシステムを用いてキャプチャー後、分析した。

ターゲッティングされた深層シーケンシング
ヌクレアーゼターゲット部位を含むゲノムＤＮＡ分節は、Ｐｈｕｓｉｏｎ重合酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて増幅した。同量のＰＣＲアンプリコンに対してＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑを用いてペアードエンドリード（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｒｅａｄ）シーケンシングを行った。ＲＧＥＮ切断部位付近（ＰＡＭｅｎ３ｂｐアップストリーム）にｌはＲＧＥＮによって誘発された突然変異と見なした。

全体遺伝子シーケンシング
ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造社の説明書によって、ゲノムＤＮＡを精製した。Ｃｏｖａｒｉｓシステムを用いてゲノムＤＮＡ（１μｇ）を切片化し、Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘを通じて鈍い末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）を形成させた。切片化されたＤＮＡをアダプタで結合させてライブラリーを製作した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いてＭａｃｒｏｇｅｎ（Ｋｏｒｅａ）でライブラリーをシーケンシングした。

全体遺伝子シーケンシング分析及び変異情報の抽出
ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで収得したＦＡＳＴＱファイルをＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ）のＩｓａａｃワークフローを通じてＭａｃｒｏｇｅｎで分析した。要約すれば、ペアードエンドによってリーディングされたＦＡＳＴＱファイルを基準遺伝子（ｈｇ１９）によってＩｓａａｃ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｓａａｃ Ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてアラインした。以後、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及びｉｎｄｅｌｓをＩｓａａｃ Ｖａｒｉａｎｔ Ｃａｌｌｅｒで同定した。多様な変異のうちから、本発明者らは、ＲＧＥＮが置換をほとんど誘導しないために、インデル（ｉｎｄｅｌ）に焦点を合わせた。バイオインフォマティクスフィルターを適用して公共データベースに登載されたｉｎｄｅｌ及び他の遺伝子から抽出されたｉｎｄｅｌを除外させた。次いで、ＲＧＥＮターゲット部位をｉｎｄｅｌ位置に相応する野生型座位と比較した。３１〜１０６個のｉｎｄｅｌ部位が５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ＰＡＭ配列を含み、それぞれのオンターゲット配列と少なくとも１２ヌクレオチドマッチを示した。最後に、繰り返し配列を有する部位を除外させた後、１０個のｉｎｄｅｌ部位に対してターゲッティングされた深層シーケンシングを行った。

潜在的なオフターゲット部位の検査
各遺伝子配列で多様な潜在的なオフターゲット部位にヌクレアーゼ−誘導ｉｎｄｅｌが存在するか否かを調査するために、Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒを使用してオンターゲット部位と８個までのヌクレオチドが差が出るか、５塩基のＤＮＡまたはＲＮＡバルジ（ｂｕｌｇｅ）と２個までのヌクレオチドが差が出る、あらゆる潜在的なオフターゲット部位を同定した（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。各潜在的なオフターゲット部位で全体ＣＩＧＡＲストリングの２０％からなる保存的ＣＩＧＡＲストリングを作るために、内部コンピュータプログラムを使用した。次いで、多様な潜在的なオフターゲット部位の保全的ＣＩＧＡＲストリングと基準配列のＣＩＧＡＲストリングとを比較した。その結果、８３〜３４８個の潜在的なオフターゲット部位を収得した。最後に、独立クローンのみで観察され、ターゲット部位周辺で繰り返し配列を有さない４個のｉｎｄｅｌ部位に対してターゲッティングされた深層シーケンシングを行った。

実験結果
まず、本発明者らは、互いに姻戚関係のない１１人の重症Ａ型血友病患者の遺伝子型を分析し、ｉｎｔ１逆位を有した１人の患者とｉｎｔ２２逆位を有した２人の患者とを同定した。これにより、ｉｎｔ１逆位を有した１人の患者（“Ｐａ１”と命名）及びｉｎｔ２２逆位を有した２人の患者（“Ｐａ２”及び“Ｐａ３”と命名）を選定して実験を進行した（図１ａ）。エピソームベクターまたはセンダイウイルスを通じて４個のＹａｍａｎａｋａ因子を尿内の上皮細胞に導入することによって、それぞれのｉＰＳＣを確立して、出血性疾患を有するこれら患者の線維芽細胞を収得して浸湿型生検を通すことを避けようとした。同時に、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）で構成されたＲＧＥＮが野生型ＨｅＬａ細胞及び患者ｉＰＳＣで、これら逆位を誘導または修復する活性を有するか否かを調査した。ＲＧＥＮ ０１は、ｉｎｔ１ｈ内の部位をターゲッティングするように設計された（図３ａ）。ＲＧＥＮ ０１は、活性が非常に高く、ｉｎｔ１ｈ内のターゲット部位で３４％の頻度で小規模挿入及び削除（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ、ｉｎｄｅｌｓ）を誘導した（図３ｂ）。さらに、ＲＧＥＮ ０１は、逆位−特異的ＰＣＲから見るように、ＨｅＬａ細胞の１４０−ｋｂｐ染色体分節逆位を誘導する（図３ｃ）。デジタルＰＣＲ分析結果、前記逆位の頻度は、２．２％〜３．１％に測定された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

本発明者らは、逆位−特異的ＰＣＲアンプリコンのＤＮＡ配列を分析した結果、２つの逆位変曲点連結部でｉｎｄｅｌが誘導されたということを確認した（図３ｄ）。このような高い頻度に基づいて、本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをＰａ１由来ｉＰＳＣ（Ｐａ１−ｉＰＳＣｓ）に共形質転換し、ＰＣＲを用いてｉＰＳＣコロニーを分析した。１２０個のコロニーのうち、８個のコロニー（必ずしも１つの細胞でから由来しない）（６．７％）が、アガロースゲル上で陽性ＰＣＲバンドを生成した。

４個のコロニーを追加的に培養して単一細胞由来クローンを収得した。これらクローンは、ｉｎｔ１ｈ−１及びｉｎｔ１ｈ−２部位に該当するＰＣＲアンプリコンを生成したが、それを通じてＰａ１細胞の１４０−ｋｂｐ染色体分節での逆位が修復されたということが分かる（図３ｅ）。

一方、このようなＰＣＲアンプリコンは、Ｐａ１ ｉＰＳＣｓまたは泌尿器細胞から生成されていない。本発明者らは、ＰＣＲアンプリコンをシーケンシングすることによって、３つのクローンのターゲット部位でｉｎｄｅｌが誘導されないということを観察した。他のクローンでは、ターゲット部位で３−ｂｐ削除が検出された（図３ｆ）。

引き続き本発明者らは、他のｉｎｔ２２ｈ逆位にも焦点を合わせた。目的する６００−ｋｂｐ分節逆位の修復以外に、２つまたは３つのｉｎｔ２２相同体を含む所望しない削除または逆位の可能性を排除するために、相同体の外側部分をターゲッティングする２つのＲＧＥＮを使用した（図１ｂ）。このような戦略は、また適切なプライマーを使用して修復有無をよく検出可能にする。本発明者らは、ｉｎｔ２２ｈ−１及びｉｎｔ２２ｈ−３付近の部位をターゲッティングするために、２つのＲＧＥＮ（ＲＧＥＮ ０２及びＲＧＥＮ ０３）を設計し、Ｔ７Ｅ１（Ｔ７ ｅｎｄｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ）分析を通じてＨｅＬａ細胞でのヌクレアーゼ活性を試験した。これらＲＧＥＮは、活性が非常に高く、４４％または３２％の頻度でターゲット部位のｉｎｄｅｌを誘導した（図１ｃ）。次いで、２つのターゲット部位の間の５６３−ｋｂｐ染色体分節の逆位をＰＣＲで検出した。ＲＧＥＮ ０２またはＲＧＥＮ ０３のみをＨｅＬａ細胞に形質転換する場合、逆位−特異的ＰＣＲアンプリコンが生成されていない。一方、これらＲＧＥＮプラスミドを共形質転換すると２つの逆位−特異的ＰＣＲアンプリコンが生成された（図１ｄ）。逆位頻度は、１．５％〜２．２％である（表１）。

^＊上限及び下限は、９５％信頼区間を示す。

ＰＣＲアンプリコンのＤＮＡ配列を調査した結果、ｉｎｄｅｌがほとんど２つの逆位変曲点連結部を伴うことを観察することによって、２つのＲＧＥＮで誘発された２つのＤＳＢがエラー頻発ＮＨＥＪ（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）によって修復されたということが分かった（図４ａ）。ＨｅＬａ細胞は、Ｆ８エキソンの方向において野生型である。Ｐａ２及びＰａ３細胞で、Ｆ８エキソン１〜２２は逆位された。しかし、依然としてこれら２つのＲＧＥＮターゲット部位は、保存されており、大量の染色体分節を修復することができる。

次いで、ＲＧＥＮ ０２及び０３を電気穿孔を通じてＰａ２ ｉＰＳＣに形質転換し、１３５個のコロニーを分離した後、そのゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ分析を行った。５個のコロニー（３．７％）が逆位−矯正（すなわち、修復）に該当するＰＣＲアンプリコンを生成した。Ｐａ２ ｉＰＳＣｓまたは野生型ｉＰＳＣでは、このようなＰＣＲ産物が収得されていない（図１ｅ）。これらコロニーを確張して３個の独立した単一細胞由来のクローンを分離した。２つのＲＧＥＮ部位の間の５６３−ｋｂｐ染色体分節が修復されたか否かを確認するために、２つの逆位変曲点連結部でのＤＮＡ配列を調査した（図１ｆ）。その結果、ＨｅＬａ細胞でのようにエラー頻発ＮＨＥＪの特徴であるｉｎｄｅｌが、これら逆位−矯正されたｉＰＳＣの２つの変曲点連結部で観察された。

本発明者らは、逆位−矯正されたｉＰＳＣが多能性を保持するか否かを調査した。まず、逆位−矯正されたＰａ１（ｉｎｔ１ｈ逆位）及びＰａ２（ｉｎｔ２２ｈ逆位）ｉＰＳＣでの幹細胞マーカー発現を調査した結果、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧが活発に転写されることを確認した（図２ａ）。また、これら逆位−矯正されたｉＰＳＣは、３つの１次胚葉に成功的に分化し（図２ｂ）、さらに、これらは正常な核型を示した（図２ｃ）。それを総合すれば、ＲＧＥＮによる全体的な染色体修復は、患者由来のｉＰＳＣの多能性に否定的な影響を及ぼさないということが分かる。

中胚葉から由来した上皮細胞は、Ｆ８遺伝子発現の主な根源である（Ｓｈａｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。本発明者らは、患者ｉＰＳＣ及び逆位−矯正された患者ｉＰＳＣを中胚葉に分化させた後、ＲＴ−ＰＣＲを通じてＦ８ ｍＲＮＡのレベルを測定した。予想通りに、Ｐａ１−ｉＰＳＣから分化された細胞でＦ８エキソン１及び２に相応するＰＣＲバンドが検出されることによって、患者由来の細胞では、Ｆ８が発現されないということが分かった（図２ｄ）。一方、これらエキソンに該当するＰＣＲバンドは、野生型ｉＰＳＣまたは２つの逆位−矯正されたＰａ１−ｉＰＳＣｓ（Ｃｏ−１及びＣｏ−２）から分化された細胞から検出された。同様に、Ｆ８エキソン２２及び２３に相応するＰＣＲアンプリコンは、Ｐａ２−及びＰａ３−ｉＰＳＣから分化された細胞で検出されていないが、３個の逆位−矯正されたｉＰＳＣから分化された細胞では検出された（図２ｄ）。

逆位−矯正されたｉＰＳＣから分化された細胞でエキソン１及び２またはエキソン２２及び２３が、正しくスプライシングされたということをサンガーシーケンシングを通じて確認した（図２ｅ）。このような結果は、イントロン１及び２２の逆位を有する患者ｉＰＳＣでＦ８遺伝子が矯正されたということを示す。

ＲＧＥＮオンターゲット及びオフターゲット部位でプラスミド切片の所望しない挿入を防ぐために、イントロン１または２２の逆位を有する２つの患者ｉＰＳＣ（Ｐａ１及びＰａ３）にＥ．ｃｏｌｉから発現された後、精製された組換えＣａｓ９タンパク質及びインビトロから転写されたｓｇＲＮＡ（ＲＧＥＮ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）を形質導入した。

ＰＣＲ及びサンガーシーケンシングを用いてＦ８遺伝子の遺伝的機能を回復する１４０−ｋｂｐまたは５６３−ｋｂｐ染色体分節の修復を確認した（図４ｂ及び図４ｃ）。プラスミドとは異なって、ＲＮＰは、形質導入直後、染色体のターゲットＤＮＡを即時切断し、細胞内で迅速に分解されるために（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＲＧＥＮ ＲＮＰの形質導入を通じてオンターゲットサイトの誘電体矯正活性を犠牲させずとも、オフターゲット効果を減少させることができる。

ＲＧＥＮは、オンターゲット部位と配列が同じオフターゲット突然変異を誘導することができる（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｒａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。本発明者らは、ターゲッティングされた深層シーケンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）及び全体ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＧＳ）を用いて、本発明で用いられたＲＧＥＮが患者ｉＰＳＣで逆位の矯正以外に、他の二次的被害を残すか否かを調査した。まず、ウェブ基盤プログラムであるＣａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ，Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．２０１４）を用いてヒト遺伝子で３個のＲＧＥＮオンターゲット部位と３個に至るヌクレオチドが、異なる潜在的なオフターゲット部位を探索した。ＲＧＥＮ ０１、ＲＧＥＮ ０２及びＲＧＥＮ ０３で総１２、６及び１４個の部位がそれぞれ発見された。逆位−矯正されたｉＰＳＣでｉｎｄｅｌが、これら部位で誘発されていないということを確認するために、ターゲッティングされた深層シーケンシングを用いた（表２）。

次いで、患者（Ｐａ１及びＰａ２）ｉＰＳＣから分離したゲノムＤＮＡ及びそれぞれの逆位−矯正されたｉＰＳＣに対してＷＧＳを行った。まず、ｈｇ１９標準遺伝子を基準にｉｎｄｅｌを同定するために、変異情報抽出プログラムであるＩｓａａｃを使用した。バイオインフォマティクスフィルターを適用して公共データベースに登載されたｉｎｄｅｌ、ｉｎｔ１ｈまたはｉｎｔ２２ｈ逆位及び他の逆位−矯正された遺伝子を有する患者遺伝子から抽出されたｉｎｄｅｌ、そして、シーケンシングエラーに起因したｈｏｍｏ−ｐｏｌｙｍｅｒまたは繰り返し配列で表われるｉｎｄｅｌを除外させた。その結果、それぞれの逆位−矯正された遺伝子配列で固有の９，８４８〜１３，７０７個のｉｎｄｅｌが収得された。次いで、ＲＧＥＮターゲット部位をｉｎｄｅｌ位置に相応する野生型座位と比較した。３１〜１０６個のｉｎｄｅｌ部位のみが５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ＰＡＭ配列を有し、それぞれのオンターゲット配列と少なくとも１２個のヌクレオチドマッチを示した（表２）。以後、２つの逆位−矯正された遺伝子で、これらｉｎｄｅｌに相応するＤＮＡ配列を調査した。如何なるｉｎｄｅｌも、ターゲッティングされた深層シーケンシングで確認されていない。次いで、オンターゲット部位と８個までのヌクレオチドが差が出るか、５塩基のＤＮＡまたはＲＮＡバルジと２個までのヌクレオチドが差が出る、あらゆる潜在的なオフターゲット部位をＣａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒを通じてコンピュータで同定した。以後、数千個の潜在的なオフターゲット部位のうち、導出された１０個の付近に配列されたシーケンスリードを標準配列と比較した結果（表２）、オフターゲットｉｎｄｅｌは、同定されていない。このような結果は、本発明で用いられた３つのＲＧＥＮが逆位−矯正された患者ｉＰＳＣでオフターゲット突然変異を誘発しないということを示す。要約すれば、本発明者らは、重症Ａ型血友病の半分に至る原因を提供する２つの大規模染色体逆位を修復するために、患者由来のｉＰＳＣでＲＧＥＮを使用し、それを通じて逆位−矯正されたｉＰＳＣから分化された細胞がＦ８遺伝子を発現することを観察した。ターゲッティングされた深層シーケンシング及びＷＧＳ分析を通じて逆位−矯正されたｉＰＳＣでオフターゲット突然変異が誘発されないということを確認した。これは、ＲＧＥＮまたは他の遺伝子ハサミを用いて患者ｉＰＳＣで染色体逆位などの大規模遺伝子再配列が矯正されうるということを示す最初の事例である。染色体逆位は、ハンター症候群（Ｂｏｎｄｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）及び癌（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０００）のような他の遺伝的疾患とも関連がある。ＲＧＥＮを用いたｉＰＳＣでのターゲッティングされた遺伝子再配列は、遺伝子の構造的変形を可能にして、これらの機能を研究する手段及びＡ型血友病を含めた幅広い染色体再配列で誘発される多様な遺伝疾患の遺伝子及び細胞治療方法で有用に用いられうる。

実施例２．ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）
実験方法
ＴＡＬＥＮをコードするプラスミド
本発明で用いられるＴＡＬＥＮプラスミドは、ワンストップＧｏｌｄｅｎ−Ｇａｔｅアセンブリーのために構築されたＴＡＬエフェクターアレイプラスミドを用いて従来に報告された方法で合成した（Ｋｉｍ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１（３）：２５１−２５８）。それぞれのＴＡＬＥＮプラスミドは、ＲＶＤモジュールのアレイであるＡｖｒＢｓ３のＮ末端１３５アミノ酸、４個のＲＶＤ ｈａｌｆｒｅｐｅａｔｓのうちの１つ、そして、Ｓｈａｒｋｅｙ ＦｏｋＩドメインをコードする（Ｇｕｏ Ｊ，Ｇａｊ Ｔ，Ｂａｒｂａｓ ＣＦ，３ｒｄ（２０１０）Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＦｏｋＩ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４００（１）：９６−１０７）。ＴＡＬＥＮサイトは、Ｆ８遺伝子の１番イントロン相同体をターゲッティングするように設計された；潜在的なオフターゲットサイトは、従来報告された方法によって同定した（Ｋｉｍ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１（３）：２５１−２５８）。

Ａ型血友病患者からゲノムＤＮＡの分離
大韓民国のソウル大学校研究倫理審議委員会の承認下にＡ型血友病患者の血液細胞を分析した。血液試料は、韓国血友財団から提供され、ゲノムＤＮＡは、従来に報告された方法で分離した（Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｗｅｏｎ Ｊ，Ｋｉｍ Ｅ，Ｋｉｍ Ｓ，Ｋｉｍ ＪＳ（２０１２）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ ＲＥＳ ２２（３）：５３９−５４８）。

ターゲッティングされた逆位の頻度測定
ターゲッティングされた逆位の頻度をデジタルＰＣＲ分析を通じて従来に報告された方法で測定した（Ｋｉｍ Ｓ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｉｍ Ｅ，Ｋｉｍ ＪＳ（２０１０）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ １０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４７７）。ＴＡＬＥＮプラスミドに形質転換された細胞から分離したゲノムＤＮＡ試料を順次に希釈し、該希釈した試料に対して適切なプライマーを使用してｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った（表３）。各希釈時点での陽性バンドの分節をカウンティングし、結果をＥｘｔｒｅｍｅ Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを用いて分析した（Ｈｕ Ｙ，Ｓｍｙｔｈ ＧＫ（２００９）ＥＬＤＡ：Ｅｘｔｒｅｍｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｓｓａｙｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４７（１−２）：７０−７８）。

細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１１２６８）及び成人ＨＤＦｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃ−００４−５Ｃ）をＦＢＳ（１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び抗生剤（１％）が補充されたＤＭＥＭで培養した。ＷｉＣｅｌｌで購入したヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）細胞株（Ｈ９）、レトロウイルス由来の野生型ｉＰＳＣｓ（ｉＰＳＣ１）、及び本発明で製作したｉＰＳＣは、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で構成されたｈＥＳＣ培養液で従来に報告された方法通りに保持した（Ｋｉｍ ＤＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｒｏｂｕｓｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＥＳ ａｎｄ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｉｎｎａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ６（２）：２７０−２８１）。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＦ８座位をターゲッティングするＴＡＬＥＮの確認
本発明で設計されたＴＡＬＥＮの遺伝子−操作活性を確認するために、それぞれのＴＡＬＥＮ対をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換し、これらの活性をＴ７Ｅ１分析を通じて測定した（Ｋｉｍ ＨＪ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｉｍ Ｈ，Ｃｈｏ ＳＷ，Ｋｉｍ ＪＳ（２００９）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｖｉａ ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９（７）：１２７９−１２８８）。Ｆ８座位をターゲッティングするＴＡＬＥＮによって誘導された逆位の頻度を測定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を８０％のコンフルエンシでシーディングし、以後、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴＡＬＥＮをコードするプラスミドに形質転換した。ゲノムＤＮＡ試料を分離し、従来報告された方法でＰＣＲ分析を行って染色体逆位を確認した（Ｋｉｍ Ｓ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｉｍ Ｅ，Ｋｉｍ ＪＳ（２０１０）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ １０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４７７）。

ｉＰＳＣの製作及び３つの胚葉へのインビトロ分化
特定のリプログラミング因子をコードするエピソームベクターを報告された方法によって使用した（Ｏｋｉｔａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（５）：４０９−４１２）。要約すれば、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭで育ったＨＤＦを微細穿孔システム（Ｎｅｏｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通じて製造社の説明書によって、エピソームベクター（総３μｇ）を電気穿孔した。１，６５０ボルトの電圧で１０分間３回パルスを加えた後、細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含む）でさらに培養した。形質転換７日後、細胞をフィーダー層に移した。ｈＥＳＣと類似した形態を示すｉＰＳＣコロニーを機械装置で取り上げて特性分析のためにさらに培養した。

ｉＰＳＣは、インビトロで公知の方法を用いて３つの胚葉に分化させた（Ｓｕｇｉｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｅｅｄｅｒｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７（８）：３５５８−３５６３）。ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通じて部分的にｉＰＳＣを分離させることによって、形成された胚芽体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｉｅｓ、ＥＢｓ）を超低吸着プレート（（Ｕｌｔｒａｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｌａｔｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ノックアウト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び５％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地で培養した。前記条件で１週間培養後、ＥＢをマトリゲル−コーティングディッシュに付着させ、１０日間さらに培養した。ＥＢが３つの胚葉を代表する細胞で自発的に分化されるかの有無は、適切な抗体を用いた免疫染色を通じて調査した。

ｉＰＳＣの分化
従来報告された方法によってｉＰＳＣを内胚葉系列に分化させた（Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１（１）：２９７−３０５）。要約すれば、ｉＰＳＣコロニーをｍＴｅＳＲ−１ ｈＥＳＣ成長培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で無支持細胞環境（ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ）で培養した。確かな内胚葉細胞を収得するために、未分化ｉＰＣＳを１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び５μＭホスファチジルイノシトール３−キナーゼ抑制剤（ＬＹ−２９４００２；Ｓｉｇｍａ）が補充されたＲＰＭＩ／Ｂ２７（ＲＰＭＩ−１６４０はＳｉｇｍａ、Ｂ２７はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎで購入）培地で５日間培養した。内胚葉に分化された細胞を採集して総ＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。

従来報告された方法を少し変形してｉＰＳＣを内胚葉上皮細胞に分化させた（Ｙｏｏ ＣＨ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４（３３）：８１４９−８１６０）。要約すれば、ＥＢを２０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が補充されたｈＥＳＣ培地で培養し、ＥＢ形成３日目にＥＢをマトリゲル−コーティングされたディッシュに付着させた後、１０日間１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び５０ｎｇ／ｍＬ ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充された培地で上皮細胞への分化を誘導した。

ｉＰＳＣの逆位及び修復誘導のためのＴＡＬＥＮ形質転換
ＩＶ型コラーゲンを処理することによって、培養されたｉＰＳＣを収集した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で追加的に処理して単一細胞浮遊物を生成した（Ｄｅｓｂｏｒｄｅｓ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２（６）：６０２−６１２）。これら単一細胞は、ＴＡＬＥＮをコードするプラスミド（５μｇのそれぞれのプラスミド）と混合して８５０ボルトの電圧で３０分間パルスを加えた。以後、細胞をフィーダー細胞に細胞をシーディングし、１０日間培養した。ゲノム逆位または修復を検出するために、それぞれのコロニーで得た細胞をリシス緩衝液［プロテイナーゼＫを含有する１×Ｅｘ−ｔａｑ緩衝液（ｐＨ８．０）］で３時間５６℃で破砕した。プロテイナーゼＫを不活性化した後、２μＬ ゲノムＤＮＡ溶液をＥｘ−ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）及び特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動で分析し、使われたプライマーは、表５に表示した。

細胞のクローナルポピュレーションの分離、ＰＣＲ分析及び変曲点のＤＮＡシーケンシング
逆位（または、繰り返し）細胞のクローナルポピュレーションを分離するために、ＰＣＲを通じて所望の遺伝子変形がなされたものであって、同定された各コロニーを公知の方法を通じてコラゲナーゼ及びＡｃｃｕｔａｓｅを用いて単一細胞に分離し、リプレーティングした。３回の継代培養後、いくつかのクローン（逆位６クローン及び修復４クローン）を選定してシーケンシング及び追加実験を進行した。配列決定のために、増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＳｏｌＧｅｎｔ）を用いてアガロースゲルで溶出し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。クローニングされたＰＣＲ産物は、Ｔ７プライマーを用いてシーケンシングした。

ＲＮＡ分離、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造社の説明書によって、細胞から全体ＲＮＡを精製した。ＤｉａＳｔａｒ ｃＤＮＡ合成キット（ＳｏｌＧｅｎｔ）を用いて総ＲＮＡ（１μｇ）からｃＤＮＡを合成した。Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、ＦＯＸＡ２、Ｓｏｘ１７及びＧＡＰＤＨの発現を確認するために、合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＥｘ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＰＣＲを行った。ｑＰＣＲのために、製造社の説明書によって、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲまたはｑＰＣＲのための特異的プライマーは、表５に羅列した。

アルカリホスファターゼ染色及び免疫染色
白血球アルカリホスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて製造社の説明書によって、アルカリホスファターゼ活性を測定した。多能性幹細胞マーカー染色のために、細胞を４％ホルムアルデヒド溶液に固定させ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過化させた。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５％正常ゴート血清及び２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で培養した。以後、細胞を１次抗体と共に２時間常温で培養し、ＰＢＳで洗浄した後、常温で１時間蛍光−接合２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｏｒ ５９４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に培養した。核を視覚化するために、細胞をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むアンチフェード・マウンティング培地にマウンティングした。イメージをキャプチャーしてＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡またはＦＳＸシステムを通じて分析した。

ＤＮＡ指紋分析及び核型分析
ｉＰＳＣ細胞株の皮膚線維芽細胞の起源を確認するために、Ｇｅｎｅ−Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｓｓ Ｉｎｃ．でＰＣＲ−基盤ＳＴＲ（ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）分析を行った。要約すれば、ｉＰＳＣ細胞株及びこれらの親細胞から分離されたゲノムでＰＣＲからＡｍｐＦＩＳＴＲ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＳＴＲ座位を増幅した。増幅産物は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ＸＬＳＴＲ Ｐ分析器及びＧｅｎｅｍａｐｐｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。核型の調査のために、染色体をＧｉｅｍｓａで染色してＧ−バンディング分析を行い、分析には、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用した。

統計的分析
データは、平均±標準誤差で示した。統計的分析にスチューデントｔ検定を適用し、Ｐ＜０．０５である場合、統計的有意性を有すると見なした。

実験結果
ヒトｉＰＳＣｓの製作及び特性分析
４つのＹａｍａｎａｋａ因子をコードするエピソームベクターを電気穿孔してヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＨＤＦｓ）から野生型ｉＰＳＣｓを収得した。胚芽幹細胞（ＥＳＣ）−類似コロニーは、形質転換された細胞をフィーダー細胞層にリプレーティングした後、１０日後に表われた。アルカリホスファターゼ活性を有する総８個のコロニー（Ｅｐｉ１−Ｅｐｉ８と命名）を選定した（図５ａ及び図５ｂ）。７または８継代後、これらクローンにエピソームベクターが存在しないということを確認するために、ベクター内のＥＢＮＡ−１配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行った。１つのクローン（Ｅｐｉ１）のみがＥＢＮＡ−１配列を含有し、これにより、以後、分析から除外された（図５ｃ）。次いで、２つのｉＰＳＣ細胞株（Ｅｐｉ３及びＥｐｉ８）の核型を確認し、図１０ａから見るように、これらは、正常な核型を有した。これらｉＰＳＣが、親ＨＤＦから由来したものであるか否かを確認するために、ＤＮＡ指紋分析を行った（表４）。このような初期特性分析後、本発明者らは、Ｅｐｉ３細胞株を追加実験の対象として選定した。

このｉＰＳＣ細胞株は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０のような典型的なＥＳＣマーカータンパク質を発現した（図５ｄ及び図１０ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の分析結果、ヒトＥＳＣ細胞株であるＨ９よりもＥｐｉ３細胞株で多能性マーカー遺伝子が高発現されることが分かった（図５ｅ及び図５ｆ）。次いで、Ｅｐｉ３細胞株の分化能を調査した。胚芽体を収得してゼラチン−コーティング培養皿に付着させてインビトロで３個の胚葉に自発的に分化されるようにした。予想通りに、外胚葉（Ｎｅｓｔｉｎ及びＰａｘ６）、中胚葉［α−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ］及び内胚葉［ＡＦＰ（α−ｆｅｔｏタンパク質）及びＨＮＦ３β（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ３−β）］系列のマーカータンパク質が分化された細胞で発現された（図５ｇ及び図１０ｃ）。これらデータは、成人ＨＤＦ由来のＥｐｉ３細胞株が多能性を有するということを示す。

ＴＡＬＥＮ対を用いたｉＰＳＣｓのＦ８座位のターゲティングされた逆位
逆位のような構造変異（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ、ＳＶｓ）は、Ａ型血友病を含む遺伝的疾患と関連がある（Ｆｅｕｋ Ｌ，Ｃａｒｓｏｎ ＡＲ，Ｓｃｈｅｒｅｒ ＳＷ（２００６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ７（２）：８５−９７）。ほぼ半分に達する重症Ａ型血友病は、Ｘ−関連Ｆ８遺伝子を損傷させる２つの互いに異なる逆位によって誘発される。これら逆位は、１番イントロン（重症Ａ型血友病の１〜４％）または２２番イントロン（重症Ａ型血友病の約５０％）内の配列を含む非対立性ＨＲ（ｎｏｎａｌｌｅｌｉｃ ＨＲ、ＮＡＨＲ）及びこれらの相応する相同配列（それぞれ１番または２番イントロン逆位と命名）から発生する（Ｌａｋｉｃｈ Ｄ，Ｋａｚａｚｉａｎ ＨＨ，Ｊｒ．，Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ＳＥ，Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ Ｊ（１９９３）Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ａｒｅ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ５（３）：２３６−２４１）。本発明者らは、１番イントロン逆位に焦点を合わせて１番イントロン相同体をターゲットとする１１対のＴＡＬＥＮを構築した（図６ａ）。これらＴＡＬＥＮの遺伝子操作活性をＴ７Ｅ１（Ｔ７ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ）分析を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を通じて試験した（Ｋｉｍ ＨＪ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｉｍ Ｈ，Ｃｈｏ ＳＷ，Ｋｉｍ ＪＳ（２００９）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｖｉａ ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９（７）：１２７９−１２８８）（図６ｂ）。ターゲット部位で３３％の頻度で突然変異を誘導して、最も活性が高いＴＡＬＥＮ対（ＴＡＬＥＮ ０１と命名）を選定した。前記ＴＡＬＥＮは、１．９％の頻度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞で１番イントロン相同体を含む１４０−ｋｂ逆位を誘導した（図１１）。次いで、本発明者らは、前記ＴＡＬＥＮが相同性が高い部位でオフターゲット効果を示すか否かを調査した結果、Ｔ７Ｅ１分析を通じて、これら部位でオフターゲット突然変異が検出されないということを確認した（図１２及び表５）。

以後、本発明者らは、血友病モデル細胞株を製作するために、同じＴＡＬＥＮ対を用いてｉＰＳＣで１４０−ｋｂ逆位を誘導した。野生型ｉＰＳＣにＴＡＬＥＮプラスミドを電気穿孔して１０日間培養することによって、コロニーを形成させた。逆位を検出することができる特異的プライマーを用いて、各コロニーから分離されたゲノムＤＮＡ試料に対するＰＣＲを行った。４３２個のうち、６個のコロニー（１．４％、ＨＥＫ２９３細胞に匹敵）が、２つの逆位変曲点連結部で陽性ＰＣＲバンドを表わした。４個のコロニーを追加的に培養して単一細胞クローンを作った。これらクローンは、１４０−ｋｂ逆位の診断基準となるＰＣＲバンドを形成したが、野生型の遺伝子型に該当するＰＣＲバンドを生成しなかった（図７ａ）。次いで、本発明者らは、これらＰＣＲ産物をクローニングしてＤＮＡ配列を調査することによって、逆位遺伝子型を確認した。ＴＡＬＥＮのターゲット部位でｉｎｄｅｌ（挿入あるいは削除）は発見されず（図７ｂ）、これは、１番または２番イントロン類似体でＴＡＬＥＮによって誘導された単一ＤＳＢが無エラー（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ）ＮＡＨＲを通じてＤＮＡ逆位を触発したということを示唆する。しかし、ＴＡＬＥＮがイントロン相同体１で１つ、相同体２でさらに１つに総２個のＤＳＢを生成し、これらＤＳＢが、２次突然変異を残さないままＮＨＥＪによって切れた間に結合した可能性を排除することができない。

ｉＰＳＣシステムでの逆位分節のターゲッティングされた逆位
以前研究で、本発明者らは、ＺＦＮ対を用いてＨＥＫ２９３細胞の１番イントロン相同体を含むターゲッティングされた染色体逆位を誘導して逆位を有する異型接合クローンを分離した（Ｌｅｅ ＨＪ，Ｋｗｅｏｎ Ｊ，Ｋｉｍ Ｅ，Ｋｉｍ Ｓ，Ｋｉｍ ＪＳ（２０１２）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２２（３）：５３９−５４８）。しかし、ＨＥＫ２９３細胞は、Ｆ８遺伝子を発現せず、細胞治療に使われない。さらに、ＨＥＫ２９３細胞は、３つのコピーのＸ染色体を有する。このような限界は、逆位部位を修復してＦ８遺伝子の発現を回復させることによって、治療的適用をしようとする試みに障害になる。

本発明者らは、血友病モデルｉＰＳＣ細胞株の逆位１４０−ｋｂｐ分節がＴＡＬＥＮ対を用いた修復によって矯正されうるか否かを調査した（ＴＡＬＥＮ部位は、疾患モデル細胞株で完全に保存される）。ＴＡＬＥＮプラスミドを逆位を含む２つのｉＰＳＣクローン（以下、“逆位クローン”）に形質転換し、いくつかのコロニーから分離したゲノムＤＮＡ試料に対してＰＣＲ分析を行うことによって、繰り返し細胞を同定しようとした。本発明者らは、総３００個のコロニーをスクリーニングした後、それぞれのｉＰＳＣクローンから２つの繰り返しクローンを収得した。したがって、修復頻度は、１．３％（３００のうち４）であり、これは、逆位頻度と同一である。ＰＣＲ分析を通じて、これら繰り返しクローンの遺伝子型が野生型に修復された遺伝子型と一致するということが分かった：これらクローンの試料では、逆位特異的ＰＣＲバンドは検出されていない（図８ａ）。以後、相同体１及び２を含むこれらＰＣＲ産物をクローニングし、シーケンシングした。２つのクローンには、追加的な突然変異がなかったが、残りの２つのクローンには、相同体１及び２いずれもで２つのＴＡＬＥＮ部位に２−ｂｐ削除が起こった（図８ｂ）。このような結果は、重症Ａ型血友病で表われる逆位遺伝子型が疾患モデルの生成に使われたものと同じＴＡＬＥＮ対を用いて矯正されうるということを示す。

それだけではなく、本発明者らは、ヒトＥＳマーカーを発現するか、及びこれらが、３つの１次胚葉に分化する能力を有するか否かを確認することによって、逆位クローン及び繰り返しクローンが依然として多能性細胞に残っているか否かを調査した。これらクローンは、幹細胞マーカーを野生型ｉＰＳＣに匹敵するレベルに発現し（図５ｆ）、インビトロで３個の胚葉に分化した（図１４）。このような結果は、ＴＡＬＥＮ−媒介誘電体工学がｉＰＳＣの多能性に否定的な影響を及ぼさないということを示す。

繰り返しｉＰＳＣから分化された細胞でのＦ８遺伝子発現
Ｆ８遺伝子は、それぞれ内胚葉及び中胚葉から由来する肝細胞及び上皮細胞で発現される（Ｚｅｌｅｃｈｏｗｓｋａ ＭＧ，ｖａｎ Ｍｏｕｒｉｋ ＪＡ，Ｂｒｏｄｎｉｅｗｉｃｚ−Ｐｒｏｂａ Ｔ（１９８５）Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０３９）：７２９−７３０；Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ；Ｓｈａｈａｎｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｅｄｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ＦＶＩＩＩ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｏｏｌ．Ｂｌｏｏｄ １１５（２３）：４９０２−４９０９）。まず、本発明者らは、Ｆ８遺伝子が野生型及び繰り返しｉＰＳＣクローンから由来する内胚葉細胞で発現されうるか否かを調査した。ｉＰＳＣを内胚葉に分化させた後、ＲＴ−ＰＣＲ分析してＦ８ ｍＲＮＡを測定した結果、予想通りに、Ｆ８ ｍＲＮＡが野生型及び繰り返しｉＰＳＣクローンから分化された細胞から検出された（図９ａ）。一方、逆位を有するｉＰＳＣから分化した細胞では、野生型及び繰り返しｉＰＳＣほど効率的に内胚葉に分化されたにもかかわらず、Ｆ８ ｍＲＮＡは検出されていない。次いで、Ｆ８タンパク質の主生産源である上皮細胞でのＦ８タンパク質発現を調査した（Ｓｈａｈａｎｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｅｄｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａ ＦＶＩＩＩ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｏｏｌ．Ｂｌｏｏｄ １１５（２３）：４９０２−４９０９）。ｉＰＳＣを上皮細胞に分化させた後、Ｆ８タンパク質検出のための免疫染色を行った。予想通りに、野生型及び繰り返しｉＰＳＣクローンから分化された細胞は、Ｆ８タンパク質を発現した（図９ｂ）。しかし、逆位クローンから分化された細胞は、これらｉＰＳＣが成功的に上皮細胞に分化したことが成熟上皮細胞標識タンパク質であるｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の発現を通じて確認されたということにも、Ｆ８タンパク質は発現されていない。このような結果は、Ｆ８遺伝子の保全性が繰り返しｉＰＳＣで保持されることを立証するものである。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。

Claims (13)

1. 次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位矯正用組成物：
   （ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド；及び
   （ｂ）次のヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡまたは前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド：
   （ｉ）配列表の配列番号１で表されるヌクレオチド配列；
   （ｉｉ）配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列；及び
   （ｉｉｉ）Ｆ８遺伝子の２２番イントロン上の前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内に存在する１５〜２５ｂｐヌクレオチド配列
   で構成された群から選択される一対のヌクレオチド配列であって、
   前記（ｉｉｉ）は、前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内で前記（ｉ）または前記（ｉｉ）とそれぞれ８０％以上の配列類似性を有するヌクレオチド配列が存在せず、同時にダウンストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが連結されたことを特徴とする組成物。
2. 前記ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記誘導ＲＮＡは、前記配列表の配列番号１で表されるヌクレオチド配列及び前記配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
4. 前記組成物は、血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の２２番イントロンで発生する逆位を矯正することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
5. 次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位矯正用組成物：
   （ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド：前記ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）である；及び
   （ｂ）配列表の配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡまたは前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド。
6. 前記組成物は、血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の１番イントロンで発生する逆位を矯正する請求項５に記載の組成物。
7. Ａ型血友病患者の体細胞を請求項１から６のいずれかに記載の組成物と接触させるか、前記組成物が挿入された遺伝子伝達体で形質転換させる段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位を矯正するインビトロにおける方法。
8. 次の段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位が矯正された誘導万能幹細胞の製造方法：
   （ａ）Ａ型血友病患者から分離された体細胞を逆分化させて誘導万能幹細胞を収得する段階；及び
   （ｂ）前記誘導万能幹細胞を請求項１から６のいずれかに記載の組成物と接触させるか、前記組成物が挿入された遺伝子伝達体で形質転換させる段階。
9. 前記段階（ａ）は、前記Ａ型血友病患者から分離された体細胞をＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣで構成された群から選択される１つ以上の遺伝子で形質転換することでなされることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 請求項８に記載の方法によって製造された誘導万能幹細胞を有効成分として含むＡ型血友病治療用組成物。
11. 次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導用組成物：
    （ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド；及び
    （ｂ）次のヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡまたは前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド：
    （ｉ）配列表の配列番号１で表されるヌクレオチド配列；
    （ｉｉ）配列表の配列番号２で表されるヌクレオチド配列；及び
    （ｉｉｉ）Ｆ８遺伝子の２２番イントロン上の前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内に存在する１５〜２５ｂｐヌクレオチド配列
    で構成された群から選択される一対のヌクレオチド配列であって、
    前記（ｉｉｉ）は、前記（ｉ）及び前記（ｉｉ）の間の５６２，９７５ｂｐの長さのヌクレオチド内で前記（ｉ）または前記（ｉｉ）とそれぞれ８０％以上の配列類似性を有するヌクレオチド配列が存在せず、同時にダウンストリームに５’−Ｎ（Ｇ／Ａ）Ｇ−３’ヌクレオチドが連結されたことを特徴とする組成物。
12. 次を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位誘導用組成物：
    （ａ）ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド：前記ＲＮＡ−誘導エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）である；及び
    （ｂ）配列表の配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその相補的な配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡまたは前記誘導ＲＮＡをコードするヌクレオチド。
13. 請求項１１から１２のいずれかに記載の組成物を正常人の体細胞に導入する段階を含む血液凝固因子ＶＩＩＩ（Ｆ８）遺伝子の逆位を誘導するインビトロにおける方法。