JP6588892B2 - ヒメツリガネゴケにおけるプロリル−4−ヒドロキシラーゼの改変された発現 - Google Patents
ヒメツリガネゴケにおけるプロリル−4−ヒドロキシラーゼの改変された発現 Download PDFInfo
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Description
ヒメツリガネゴケのプロリル−4−ヒドロキシラーゼホモログを同定するために、アラビドプシス・タリアナのP4H1(AT2G43080.1)のアミノ酸配列を使用してヒメツリガネゴケのリソースの遺伝子モデル(www.cosmoss.org)に対してBLAST(基本的な局所アライメント検索ツール)検索を行った。P4H酵素と相同性を有するヒメツリガネゴケゲノムの6つの配列が同定された:Pp1s8_114V6.1(PpP4H1)、Pp1s192_51V6.1(PpP4H2)、Pp1s19_322V6.1(PpP4H3)、Pp1s172_91V6.1(PpP4H4)、Pp1s12_247V6.1(PpP4H5)およびPp1s328_29V6.1(PpP4H6)。Ppp4h2、3および6のmRNAについての配列情報が完全でなかったため、完全長配列を得るために製造業者のプロトコルに従って5’RACE(cDNA末端の迅速増幅)−PCR(GeneRacer(商標)、Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ)を利用した。Ppp4h6遺伝子に関して、mRNAの選択され得るスプライシング型に対応する2つの異なるcDNAを増幅した。このmRNAからは、異なるN末端を有する2つのタンパク質変異体が予測され得る(Ppp4h6aおよびPpp4h6b)。
P4H1cDNA(Pp1s8_114V6.1 受託番号:XM_001753185;配列番号1)
GCAAGATCGTCTGATTGCGCGCACGTCGGAGATCGCTTAAAGTGAAGGTTGCATTGCTCTGGCAAGAAGTATTTGCAGGTAGGACGGTAGAGTCTGGATGCGCCAGAGTTGTCGGTTTGGCCTTCTTCGCAAGGGAGAAGAAGTCATGATGCTTGGATTTAGCGAATTCGAAGAGCTGATCCTTGTTTTTCCGTCAGACTGGCAAGGGATGGAGTAATTCTACGAAGCGAGCGCGTCAGGGTTTGGTTTTAGGAAGCTGGGCTGCCACAGACACTTTTGACGATGGGTCCCTCTAGATATGTCATTGTGCTCCTCACATTTGTGACGATCGGCATGGCTGGGGGGGCGTTATTGCAGCTGGCTTTCTTGAAGAAGCTAGAACAAAGTAGTGGAGCTGGGATTTACAATTATAGAAGAGAGATAGGGGAATACGAAAACCAAACATTTGGATCGGGATTGTCCCTTTGGGCTAATGATGAAGATGCGAGAACACTACGTGTTGGACTGGTTAAGCAAGAAGTTATTAGCTGGCAACCCAGAATCATTCTCCTGCACAATTTCCTTAGTGCTGATGAATGTGATCACCTGATAAATCTTGCTCGCCCCAGGCTCGTGAAGTCAACAGTCGTGGATGCAACCACAGGCAAGGGAATCGAGAGTAAGGTTCGAACAAGCACAGGCATGTTCCTTAATGGAAATGACCGCAGACATCACACTATTCAGGCAATCGAAACCCGTATTGCTGCGTATTCTATGGTACCTGTTCAAAATGGGGAGCTCCTCCAAGTTTTACGATATGAATCTGATCAATATTACAAGGCACATCACGACTACTTTTCAGATGAGTTCAATTTAAAAAGGGGTGGGCAACGTGTGGCGACAATGCTTATGTACTTGACCGAGGGGGTCGAGGGAGGCGAAACAATATTTCCGCAGGCTGGAGATAAAGAGTGTAGCTGTGGCGGTGAAATGAAAATCGGCGTCTGTGTGAAACCTAAACGAGGGGATGCTGTCCTGTTTTGGAGCATTAAGCTGGATGGACAAGTTGATCCAACAAGCCTTCATGGTGGATGCAAAGTTTTGTCAGGAGAGAAATGGTCGTCTACCAAATGGATGAGGCAGCGAGCCTTTGATTAGGGTGAACTTTGGATGGTAGGAGCTGTAATCATAGTAGAAGACCAATAATAGCGATTATGCCTCATCATTCCGGAAGCTTTGCGGGCTTTTCCCGATGCATCTAAGAATGTATGTAATGAGCAACTTTGAATACTGTCAGTGATTCGTAACAAGAAAAAAATCGATTTAGTGGTATTGTGGACTTTGAAATGAAGGTTAAGATCACGAAGAGCTTT
P4H1cDNAに対応する翻訳(配列番号2)
MGPSRYVIVLLTFVTIGMAGGALLQLAFLKKLEQSSGAGIYNYRREIGEYENQTFGSGLSLWANDEDARTLRVGLVKQEVISWQPRIILLHNFLSADECDHLINLARPRLVKSTVVDATTGKGIESKVRTSTGMFLNGNDRRHHTIQAIETRIAAYSMVPVQNGELLQVLRYESDQYYKAHHDYFSDEFNLKRGGQRVATMLMYLTEGVEGGETIFPQAGDKECSCGGEMKIGVCVKPKRGDAVLFWSIKLDGQVDPTSLHGGCKVLSGEKWSSTKWMRQRAFD
P4H2cDNA(Pp1s192_51V6.1 受託番号:JX964780;配列番号3)
GTGATGCGTGATCCTGTGCTGCTGAGCGTGGGTTTTACCGACTTTAATCGGGCAAGGGCGTTGATGTTAACTTCTGCATCGTACTGGGAGGTTTGTCTACATCTCCGCGGGAATTTTCTGCGTCTTTTGGTGTGGATCCACAGCATGGCGTTGAGAGATAGAAGATGTAGTCTTATTCTAGCTCTCTTATTACTATCGGGATTACAAGCATTGGGAGCTCGTGTGGAAGACTTGCCTGGTTGGATGGAAGAAATCAATGAGGTGAAGGATGCTGAGGGTGGCGTGATTCAACAAGTTTCTAGGATTGATCCCACTCGTGTCAAGCAGCTTTCGTGGAAACCGCGTGCATTTCTATATTCAAACTTTTTGTCAGATGCAGAGTGTGATCATATGATATCGTTGGCAAAGGACAAGCTGGAGAAGTCAATGGTGGCCGATAATGAATCTGGGAAGAGTGTGAAGAGTGAAATTCGCACTAGCTCAGGTATGTTTTTGATGAAGGGTCAGGATGATATCATATCAAGGATTGAGGATAGGATTGCTGCATGGACCTTTCTACCGAAGGAGAATGGGGAGGCAATCCAGGTCTTGAGGTACCAAGATGGGGAGAAGTATGAGCCACATTTTGATTATTTCCACGATAAGAACAATCAGGCTCTTGGAGGTCACCGCATTGCCACTGTGTTAATGTACCTCTCCGACGTCGTCAAAGGTGGAGAGACAGTATTTCCTTCTTCTGAAGATCGAGGTGGTCCCAAGGATGATTCGTGGTCTGCTTGTGGGAAAACTGGGGTGGCCGTGAAACCAAGGAAAGGCGATGCCCTGCTCTTCTTCAGCCTACACCCCTCTGCAGTTCCAGATGAGTCAAGCTTACACACAGGATGCCCAGTTATCGAAGGGGAGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGATCCATGTTGCTGCATTTGAAAAGCCGCGTCCTAAGAATGGTGCATGTGTAAATGAGGTCGACAGTTGCGAAGAGTGGGCAGCTTATGGGGAATGTCAGAAAAATCCAGCCTACATGGTTGGGACAAAAGAGTGGCCAGGCTATTGCCGGAAAGCATGCCATGTGTGCTAGGTAGGGATATACCGTATTTCTTGGTTGCACTCTGTTGGGTTAGGGTAGGATATTTAATGTATTTGTGTCATCATCTAAGTATTAGGTCAGTTTCCAAACCAAGGAATCAGAGTTGTGGCTTTTGAAGAAGTATTATAGATCTTACGTACTAATTAAAAGGCTTGTGACCCTTGAGATGCACTTTATAAT
P4H2cDNAに対応する翻訳(配列番号4)
MRDPVLLSVGFTDFNRARALMLTSASYWEVCLHLRGNFLRLLVWIHSMALRDRRCSLILALLLLSGLQALGARVEDLPGWMEEINEVKDAEGGVIQQVSRIDPTRVKQLSWKPRAFLYSNFLSDAECDHMISLAKDKLEKSMVADNESGKSVKSEIRTSSGMFLMKGQDDIISRIEDRIAAWTFLPKENGEAIQVLRYQDGEKYEPHFDYFHDKNNQALGGHRIATVLMYLSDVVKGGETVFPSSEDRGGPKDDSWSACGKTGVAVKPRKGDALLFFSLHPSAVPDESSLHTGCPVIEGEKWSATKWIHVAAFEKPRPKNGACVNEVDSCEEWAAYGECQKNPAYMVGTKEWPGYCRKACHVC
P4H3cDNA(Pp1s19_322V6.1 受託番号:JX964781;配列番号5)
CGGCGCTTTGCAACTCCAATTTTGACCAGGCGAAGTGCACTTTGACATCTTGTTGAATGTCCTCTTCTAGAGCATTGAACGGCCCTTCTGTGAACATTTTAAACTATTCAACGGATGCCATTGACAGTCGTGGTTTTTGAAGTTCGAATCCAGAGCCCTCGCCATCAAATCGTTGCAGTAATCCTTGGTGATTTAGCAAGCTCGGGATCACTTCATGGATTTGGGGTCCTTCCTCTGCAGAGGCTGTTAGTACACACACACTGCATCAACTCCTACTGGTCTGGAAGCTTTTGAGGTTGGAAATAGTATGAAAGAGTCCCAGACAATTGGTGTATTGAGTGGAAGAGGGTTGTGAAGTTTGGGCGCTCGACTGAAATGACCTGCGTGGATGTTAGAAAATAAGCCAATTGGTGTTATGTAGAGATTCGTCACAACGCCCTCATTCCTCCAACCCTTAAATGCCTTGCCCTATTTGTGTACTCTCGTGTGCGGGAATGACGCTGTCCTTATACAATATGAAGTCATCGAAAAACAAAGGAAGAAAATGGAATCCTTTTACATACAAGCTCAGTTTGCCACAGGTGCTATTGTGGTGCACAATCTGCCTCTTAGCAGGCTATGCCGCCTCCAATTTCTTCCCCCAGAAAATAGAAGAGGAAGCAATATATCAGCCGTATCGGAAATCGGCTCAGCAAGAAGGGGAATTTCCATTTGGTGAATTCAGTGAAAAAGTGGTGTTAGATCATGGTAGCACTGGGGACAACTTCATCGCTGACATTCCTTTCCAGGTGTTGAGCTGGAAGCCTCGTGCGCTCTTGTATCCGAGATTTGCTAGCAAGGAGCAATGCGAGGCCATCATGAAGCTTGCAAGGACTCGTCTTGCTCCTTCTGCTCTGGCTTTGAGGAAAGGGGAGAGTGAAGACTCAACGAAAGACATCCGAACTAGTTCCGGGACTTTCTTGAGAGCCGACGAAGACACGACGCGGAGTTTGGAGCAAGTTGAAGAGAAGATGGCGAAAGCAACCATGATACCTCGCGAGAATGGAGAGGCTTTCAATGTGTTGAAGTACAATGTGGGACAAAAATACGACTGCCATTATGATGTTTTTGACCCAGCTGAGTATGGACCTCAACCAAGCCAACGGATGGCCTCCTTTCTCTTATATCTATCGGATGTGGAAGAGGGTGGAGAGACCATGTTTCCCTTCGAAAATTTTCAAAACATGAACATAGGCTTTGACTACAAGAAGTGCATTGGAATGAAAGTCAAGCCCCGCCAAGGTGATGCATTGCTTTTCTACTCAATGCATCCTAACGGCACATTTGATAAGAGCGCTCTGCATGGAAGCTGCCCTGTAATCAAAGGCGAGAAATGGGTTGCCACAAAGTGGATTCGCAACACTGACAAATTTTGATCACCACCATGCGAACGTTTTTACGTCCAAAATTAGGACATAGGAATCTGTCAATCAAATTAAAGGACATATCTTTTATATCATTTAAAAATTCTGAAACTGAGAACTCATATGAACACCAGTTGAAACATTCGGGTCAACCGGATTATCGACAT
P4H3cDNAに対応する翻訳(配列番号6)
MPCPICVLSCAGMTLSLYNMKSSKNKGRKWNPFTYKLSLPQVLLWCTICLLAGYAASNFFPQKIEEEAIYQPYRKSAQQEGEFPFGEFSEKVVLDHGSTGDNFIADIPFQVLSWKPRALLYPRFASKEQCEAIMKLARTRLAPSALALRKGESEDSTKDIRTSSGTFLRADEDTTRSLEQVEEKMAKATMIPRENGEAFNVLKYNVGQKYDCHYDVFDPAEYGPQPSQRMASFLLYLSDVEEGGETMFPFENFQNMNIGFDYKKCIGMKVKPRQGDALLFYSMHPNGTFDKSALHGSCPVIKGEKWVATKWIRNTDKF
P4H4cDNA(Pp1s172_91V6.1 受託番号:XM_001774115;配列番号7)
GTTACACAAATTCATCAACCTCGAGGCATTTGGTTCATCAGTGGATCCATTTGTTGGGGTTTCGTGTGGATTGAGCTTGTGGGTTTCCTTCTCCGACTCGGAAATCGCTCCTGACAGAGTTTTCACGGAAGCTTTTGAGGCTGGAAACGGAGAAGGATTATTCCAAAGAATCGGTTTTTTAAAGTGTCACTTATCTTGTTTTCAAGGACAGTCTCAATAACAATTTGGCGCAATTATCTGCAATGATTTACATGGATTGAATCGATTTTCAGTAGCTAAATGTAGGGTCTGCTAGGCCCTCTATATTCCGACCCTTGAGTGAAGACACTGCCTCCCAGGCAGTCCGTGCCTTATTTTAATCTCCTTGCGTGCAAAGAACAGGAAGGCTGACACCGATTATAAACGGTTGAGACATGAAAACGCCAAAGGTCCGGGCAAGGAGTGCAAACCCTTTAAGATACAAGCTTGGTTTTCCTCTGGTGCTCTTGTGTTGCACATTCTTCTTCTTGGTCGGCTTTTACGGTTCCAATTCCCTCTCCAAGGAAGAAAAACATGTGGTGATTGACCCCGTCACCAATGAGAAACTTGTGTTCGAACATGGCCGTACTGGAGACAGTTCTGTTACTGACATTCCTTTCCAGGTGTTAAGTTGGAAACCACGTGCCCTTTTGTATCCGAATTTTGCAAGCAAAGAGCAATGTGAAGCCATCATCAAGCTTGCGAGGACACGTCTTGCTCCTTCTGGTCTGGCTTTGAGGAAAGGGGAGAGTGAAGCCACAACGAAAGAAATCAGAACTAGTTCTGGAACTTTCTTGAGAGCCAGTGAAGATAAAACACAGAGTTTAGCGGAGGTTGAGGAGAAGATGGCCAGAGCAACCATGATACCTCGGCAGAATGGGGAGGCTTTTAATGTGTTGCGGTACAACCCAGGTCAAAAATACGATTGTCACTATGATGTTTTTGATCCAGCTGAGTATGGTCCTCAACCAAGCCAGCGGATGGCTTCCTTTCTCCTTTATTTATCAGACGTCGAAGAGGGCGGAGAAACGATGTTTCCCTTCGAAAACTTTCAAAATATGAACACAGGCTATAATTATAAGGACTGTATTGGGTTGAAAGTGAAACCCCGCCAAGGCGATGCTCTTCTTTTCTATTCAATGCATCCTAACGGTACATTTGACAAGACCGCATTGCATGGAAGCTGTCCAGTTATCAAAGGCGAAAAATGGGTCGCCACGAAGTGGATACGCAATACCGACAAATTTTAATCTGAAAGATCCCACTGGTGACTGTTATAACTTGCTGCCTTCTTAAAGTTCTTTCGGTAGTACTCTAGGAGCTTCAGGTTATCTTACAAAAGTATCGGGTCTGAGAAAGTGTAAAATCTGTGCGTACCTGAATCCATCAATTAAGTCATGGGTGTTATCTTTTAACATTCCTGGTCTCTGCCAACCAGAGTTCCAGAGAAACGGTTGTTCGCTGGATTATTGCCAGCTTAAAGTTCACTTAAGAAATTCTAAACTCTTCAACTAAGAAGACATTGTCCTTG
P4H4cDNAに対応する翻訳(配列番号8)
MKTPKVRARSANPLRYKLGFPLVLLCCTFFFLVGFYGSNSLSKEEKHVVIDPVTNEKLVFEHGRTGDSSVTDIPFQVLSWKPRALLYPNFASKEQCEAIIKLARTRLAPSGLALRKGESEATTKEIRTSSGTFLRASEDKTQSLAEVEEKMARATMIPRQNGEAFNVLRYNPGQKYDCHYDVFDPAEYGPQPSQRMASFLLYLSDVEEGGETMFPFENFQNMNTGYNYKDCIGLKVKPRQGDALLFYSMHPNGTFDKTALHGSCPVIKGEKWVATKWIRNTDKF
P4H5cDNA(Pp1s12_247V6.1 受託番号:JX964782;配列番号9)
GCTGCTTCAGGGTAGGACAAACCATCGTCGAAGGGGATGTGGGTCGACCTATTTTGGTCAACTTTATCTGTCTTTCTACTTCCGATGAATTGCCGTTTTTGTTGTAAGCGTTTGCACATGCAGGTTGGAGGCTGGTGAACTGCATACACAAATTTGATAGTCGGGGAGAAAGAGGAGTTTCTCACAGTGTCTTTGGTGATTGGATCATCCTCGAGGAGCTTTTAGCTCGAAGGGTTTCCTGATTTTAAGTTTGGAACCGAGGTATTTCAATCGTGAGAGTGGTTCTTAGCATGCATACATTTTGAGTGTGTAGGTATGGATCTCTATTCTAGAAGCCGTAGAGGCTGAGTAACTATTGCATTCTCTGAAATCCTGTTTACCTCGGCGCGGCCACATCTCGAAGTAGTCGGTAATTTTCTTCCTTGGGTTTCGTGGGAGCCGGGCGAAGTTCGTAACTATGGCGAAGCTGAGTCGAGGTCAAAGGAGAGGAGCTGGCACGATGGCTTTGTTGGTGCTGGTCCTGTTGTCTCTAGCGCTCATGCTCATGTTGGCACTTGGCTTTGTAGCCATGCCATCGGCGTCCCACGGGAGTTCGGCTGACGTTGTGGAAATCAAGCTGCCCTCACACAGGCATTTTGGTGCCAACCCCTTATCACGTTGGGTTGAAGTCCTCTCTTGGGAGCCCAGAGCCTTTCTATATCACCACTTTCTGACAGAAGAGGAATGCAATCATCTAATTGAAGTGGCCAGGCCAAGTCTGGTGAAGTCAACGGTTGTAGATAGTGATACAGGAAAGAGCAAAGACAGCAGAGTACGCACAAGTTCAGGTACATTTTTGATGCGAGGCCAAGATCCTGTGATCAAAAGAATCGAGAAGCGAATAGCTGACTTCACATTTATACCTGCTGAGCAAGGTGAAGGCTTACAAGTTCTGCAGTACAAAGAAAGTGAAAAATACGAGCCCCATTATGATTACTTCCACGATGCATACAATACCAAAAATGGCGGCCAAAGAATTGCTACCGTACTGATGTACCTGTCAAATGTCGAGGAAGGAGGAGAAACAGTTTTTCCAGCTGCTCAGGTGAACAAGACTGAAGTTCCCGATTGGGATAAATTATCTGAGTGTGCTCAGAAAGGTCTTTCTGTGCGACCACGCATGGGAGATGCCTTGCTTTTCTGGAGCATGAAACCAGATGCGACACTTGATTCCACTAGCTTGCATGGTGGCTGCCCCGTGATCAAGGGTACCAAATGGTCTGCTACTAAGTGGTTACATGTAGAAAACTATGCAGCCTGATGAGGATGGTACAAGATGTCTTCTGCAGGAAGTGAATTGTCACAAGCACCTGGTACAAGCAGATTCGAAATGCTTGGATGTAATGCATGGATGTTGGGAGAGGACAAACATACAAATTTATGATTCTGCATTACGTGAGATGTAATGATGAACCACCTCGTGCCTATCTGAATTCATATGAACAAACGAATAGATTTCCAATTCATACCAATAAAACAGAAAAGCCGCTTAACTTATTTGTTAACTTAGGCAGTTTTTTTGTTTTATTATTGGTGGTTTGCAATCGACCTTAACGACCATTTCTTGTAATCACCACAAACAAGCAAAATGCATATCTGATTTCATTCAAAATATACTTATAAAGACTGCTGAATCTATAACAAACAAAA
P4H5cDNAに対応する翻訳(配列番号10)
MAKLSRGQRRGAGTMALLVLVLLSLALMLMLALGFVAMPSASHGSSADVVEIKLPSHRHFGANPLSRWVEVLSWEPRAFLYHHFLTEEECNHLIEVARPSLVKSTVVDSDTGKSKDSRVRTSSGTFLMRGQDPVIKRIEKRIADFTFIPAEQGEGLQVLQYKESEKYEPHYDYFHDAYNTKNGGQRIATVLMYLSNVEEGGETVFPAAQVNKTEVPDWDKLSECAQKGLSVRPRMGDALLFWSMKPDATLDSTSLHGGCPVIKGTKWSATKWLHVENYAA
P4H6_a_cDNA(Pp1s328_29V6.1 受託番号:JX964783;配列番号11)
GAAAAAGAGCAGCAGTTGGAGTTGGAGTAGGCCAGATCGATGCTCCTCCTCCTCCCATGATGATAGATGACGAAGATTATGCTGTTGTTGTCGATGTTGTTGCTCGCTGATCATCAACACGAAGTTGCCGTTGCAGCTGCTCTTGCTCTTCACCGTCGACTCGGCAGAGGGGCACAGCTCAGCTGGTAATTTATTATTAGTGCCCATGGGTGGGATGGATGTGAGTGACATCGGCGCTTCTACCGACAGTGTGAAACCCCAGCGAGGCTGTGCCTTGCCTTGCCTTGGCTTGTGTGCATTGCCTCTCCCCTCCAGTTTTTTGGTGGGTTGGTGTTTGTGTGAGGGGGGAACAGAGGAGAGGGCGGGGGCAAGGGCTGTGGCAGCTATGGCGAGGTTGAGTAGGGGGCAAAGGACTGGAGTTGGCACGATGGCATTGCTGGTGTTCGCGTTTTTGTCTTTGATAGTCATGGTCATGTTGCTTCTGGACGTGGTAGCAATGCCATCGGGACGTCGAGGCTCGATTGACGAGGGAGCCGAAGTGGAATTGAAGCTGCCTACCCACAGGCATGTGGATGAAAATCCACTGGCACCTTGGGTTGAGGTCCTTTCCTGGGAGCCCAGAGCTTTTCTGTATCACCACTTTCTGACACAAGTGGAATGCAACCATCTTATTGAGGTGGCCAAGCCTAGCCTGGTGAAGTCAACAGTTATAGATAGTGCTACGGGAAAAAGCAAAGACAGCAGGGTTCGCACAAGTTCAGGGACATTTTTGGTGCGGGGCCAAGATCACATCATTAAGAGGATTGAGAAACGTATCGCTGACTTCACATTCATACCTGTTGAACAAGGTGAAGGCTTGCAAGTTTTGCAGTATAGAGAGAGTGAGAAATACGAGCCTCATTATGACTACTTTCACGATGCTTTCAATACTAAAAATGGTGGTCAGCGGATTGCTACCGTACTGATGTATCTGTCAGACGTTGAGAAAGGGGGAGAAACAGTTTTCCCGGCTTCTAAAGTGAACGCTAGTGAGGTTCCTGATTGGGATCAGCGATCCGAATGCGCTAAACGGGGCCTTTCTGTACGACCACGTATGGGAGATGCCTTACTTTTTTGGAGCATGAAACCAGATGCGAAGCTTGACCCTACCAGTTTGCATGGCGCTTGCCCTGTGATTCAAGGTACGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGTTACATGTTGAAAAATACGCAGCACGGTAAACATCCTTCTAGAAGTCTTCAACAGGATTACATGAATTATGCGAGCAGTCTTCTGGCATGAGCAGAGGTGAACTTGCCCAAACTTGCTCATGGAACAACAGAATCAGCTTGCGAGTTATTTACAAGGAGCGAGTGTCCATGCCTGAATGCTGGAACACCAGCGTGATGAGAACGCTTAGGAATACCAATTCTTCACTGATTTTACAAACCACACTAGCTACTACACATGACAAATTTCATGCTTTGACTTGGTTGATCTGCTTTTGTGTGAGGATCAGTATTTTATAAATAGGGGATGGAGCTCTTCAGCTCCTAATGTGCGATTTCG
P4H6_a_cDNAに対応する翻訳(配列番号12)
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組換えヒトエリスロポエチン(rhEPO)は、以下の例において、組換えヒトタンパク質の例と同様の役割を果たす。組織からコケバイオリアクター培養の培地に分泌されたコケ由来のrhEPOにおいて、非ヒトプロリルヒドロキシル化が生じた。したがって、翻訳後のrhEPO改変に関与するP4H酵素は、分泌に関する区画、すなわち小胞体(ER)またはゴルジ装置に存在することと結論づけられた。それに応じて、7つのヒメツリガネゴケP4Hホモログの細胞内局在を調べた。まず、それらの推定上の細胞内局在を、異なるアルゴリズムに基づく異なる4つプログラムを用いてコンピュータで分析した:Target P(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、MultiLoc(https://abi.inf.uni−tuebingen.de/Services/MultiLoc)、SherLoc(https://abi.inf.uni−tuebingen.de/Services/SherLoc2)およびWolf PSORT(http://wolfpsort.org/)。このアプローチによっては、整合性のある予測が得られなかった(表1)。
GFP融合タンパク質(緑蛍光タンパク質、P4H−GFP)としてP4Hをヒメツリガネゴケ細胞内で発現させることによって、7つのヒメツリガネゴケP4Hのそれぞれのインビボにおける細胞内局在を調査した(プラスミドの形成および植物材料ならびにトランスフォーメーション手順に関する詳細については、下記参照)。異なる7つのP4H−GFP融合タンパク質の細胞内局在を、トランスフェクションの3から14日後に共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)(510 META;Carl Zeiss MicroImaging、イェーナ、ドイツ)および対応するソフトウェア(バージョン3.5)によって分析した。アルゴンレーザーにより488nmにおける励起を達成し、発光はMETA検出器を用いて、GFPに関しては494〜558nmにおいて、クロロフィルに関しては601〜719nmにおいて測定した。細胞をC−Apochromat 63×/1.2 W corr液浸対物レンズ(Carl Zeiss MicroImaging)を用いて調べた。共焦点面をZEN2010ソフトウェア(Carl Zeiss MicroImaging)からエクスポートした。
コケ産生rhEPOの植物に典型的なプロリルヒドロキシル化に関与するこれらのホモログを最終的に同定するために、各ヒメツリガネゴケP4Hホモログの遺伝子の機能を破壊した。したがって、6つのp4h遺伝子に対する遺伝子標的化コンストラクトを設計した(図3)。
コケ産生rhEPOに見られるプロリルヒドロキシル化に対するp4h破壊のそれぞれの影響を確かめるために、各KO株(Δp4h)由来の組換えタンパク質をマススペクトロメトリーにより分析した。このために、全可溶性タンパク質を、親植物174.16および各p4hホモログの1つのノックアウト株の培養上清から沈殿させ、SDS−PAGEによって分離した。続いて、主要なrhEPOを含有するバンドをクマシーにより着色されたゲルから切りとり、トリプシンにより消化し、トリプシン処理ペプチドEAISPPDAASAAPLR(144〜158)の分析のためにマススペクトロメトリーに供した(タンパク質およびペプチド分析の詳細については、下記参照)。親植物174.16では、rhEPOのほぼ半分は、主にSPPモチーフの2番目のプロリンがヒドロキシル化されており(図5)、それは、MS/MSによって示されるとおりであった(図6)。驚くべきことに、それぞれ、p4h2、p4h3、p4h4、p4h5またはp4h6が破壊されたコケ株において産生されたrhEPOは、親植物に見られるのと同様のレベルでヒドロキシル化されていたが、p4h1遺伝子の破壊に限って、バイオ医薬品のプロリルヒドロキシル化を完全に止めるのに十分であった(図5)。これらのノックアウト植物の生育速度、rhEPO産生力および培養培地へのタンパク質の分泌は、親株174.16と比較して損なわれていなかった(データは示していない)。したがって、Δp4h1株によって産生されたrhEPOにはHypが完全にないことが示された。
プロリルヒドロキシル化のP4H1酵素活性を検証するために、この遺伝子をΔp4h1ノックアウト株192号において異所的に発現させた。半定量的RT−PCRにより、得られた株においてp4h1転写物の強い過剰発現が確認された(図4b)。5種類のp4h1過剰発現株(p4h1OE)をrhEPO−Pro−ヒドロキシル化について分析した。LC−ESI−MSの結果から、p4h1の過剰発現がコケ産生rhEPOのプロリルヒドロキシル化を元に戻したことが明らかになった(図7)。ヒドロキシル化されたrhEPOの割合ならびにヒドロキシル化パターンが、この遺伝子の高い発現レベルによって変更された。天然P4H1活性を有する親植物174.16では、rhEPOのおよそ半分がHypを示したが(図5)、p4h1過剰発現体のほぼすべてのrhEPOは酸化されていた(図7)。さらに、これらの過剰発現体では、親植物174.16において見られるように、モチーフSPPの1つのプロリンがヒドロキシル化されただけでなく、両隣のプロリンもHypに変換されていた(図7)。したがって、p4h1の発現が、コケ産生rhEPOのプロリルヒドロキシル化に必須で十分であること、およびその発現レベルがその酵素活性、ヒドロキシル化されたタンパク質分子の割合だけでなく、ヒドロキシル化のパターンにも影響を与えることが示された。
N.ベンタミアナでの発現時に、ヒト上皮のムチンMUC1の配列APPにおけるヒドロキシル化およびアラビノシル化が報告されたため(Pinkhasovら、Plant Biotechnol.J.、9:991〜1001ページ、2011年)、ヒメツリガネゴケのrhEPOのN末端ペプチドAPPRLICDSRVLをプロリルヒドロキシル化について分析した。親植物174.16、ノックアウト植物p4h1第192号および過剰発現体p4h1OE−451由来のrhEPOをキモトリプシン消化した後、LC−ESI−MS分析によりこのペプチドがいずれの場合にもヒドロキシル化されなかったことが明らかにされた(図8)。これは、アラニンが先行する連続したプロリン残基が存在するだけではコケのプロリルヒドロキシラーゼが認識するには十分でないことを明示している。
プログラムJalview(MAFFTバージョン5.0)を使用することによってさまざまな植物(例えば、Populus、Oryza、Arabidopsis、Physcomitrella)のプロリル−4−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列から複数の配列アライメントを生成した。QuickTree(Howeら、Bioinformatics、18:1546〜1547ページ、2002年)を用いて系統樹を予測した。その系統樹を図9に示す。
プラスミドコンストラクトの形成
ヒメツリガネゴケで同定された7つのP4Hホモログに対応するcDNAを、表3に挙げたプライマーを使用して増幅した(下記参照)。
ヒメツリガネゴケ[Physcomitrella patens(Hedw.)Bruch&Schimp]を過去に記載されたとおりに培養した(Frankら、Plant Biol.、7:220〜227ページ、2005年)。コケ産生rhEPOは、プロリルヒドロキシル化共通モチーフSPP(アミノ酸147〜149)でヒドロキシル化されることが示された。したがって、rhEPO産生ヒメツリガネゴケ株174.16(Weiseら、Plant Biotechnol.J.、5:389〜401ページ、2007年)をp4hノックアウトの形成のための親株として使用し、Δp4h1株192号をp4h1過剰発現株の形成のために使用した。これらのコケ株では、α1,3フコシルトランスフェラーゼおよびβ1,2キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されている(Koprivovaら、Plant Biotechnol.J.、2:517〜523ページ、2004年)。細胞内局在の実験のためにP4H−GFPとともに野生型のコケを使用した。
過去に記載されたとおりに抽出されたゲノムDNA(Parsonsら、Plant Biotechnol.J.、10:851〜861ページ、2012年)を用いたダイレクトPCRにより安定なトランスフォームされた植物のスクリーニングを行った(Schweenら、Plant Mol.Biol.Rep.、20:43〜47ページ、2002年)。これらの抽出物から2μlをPCRのための鋳型として使用した。それぞれ、ノックアウトコンストラクトの正しいゲノムの位置への5’および3’組込みを調べるため、および過剰発現コンストラクトのコケゲノムへの組込みを調べるために、表3に挙げたプライマーを使用した。予期されるPCRを示した植物の産物を、それぞれ推定上のノックアウトまたは過剰発現株と考え、続いて分析を行った。表3に挙げたプライマーを使用して過去に記載されたとおりのRT−PCR(Parsonsら、Plant Biotechnol.J.、10:851〜861ページ、2012年)により、KO株にはp4h転写物がないことが分析された。半定量的RT−PCRにより過剰発現株におけるp4h1の発現を分析した。このために、150ngのRNAに相当するcDNAを24、26および28サイクルで表3に挙げたp4h1プライマーを使用して増幅した。対照として、構成的に発現されるTATAボックス結合タンパク質に対するプライマー、TBP fwdおよびTBP rev(表3)を使用した。
記載されるとおりに(Buttner−Mainikら、Plant Biotechnol.J.、9:373〜383ページ、2011年)、10%(w/v)トリクロロ酢酸(TCA、Sigma−Aldrich、ダイゼンホーフェン、ドイツ)による沈殿によって全可溶性タンパク質を160mlの16日目の培養上清から回収した。ペレットをサンプルLaemmliローディングバッファー(Biorad、ミュンヘン、ドイツ)に再懸濁し、150Vで1時間、非還元条件下で12%のSDS−ポリアクリルアミドゲル(Ready Gel Tris−HCl、BioRad)においてタンパク質の電気泳動分離を行った。
図1は、ヒメツリガネゴケの推定上のプロリル−4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、アラビドプシス・タリアナのP4H1(AT2G43080.1)、ニコチアナ・タバクムのP4H(BAD07294)およびヒトコラーゲン−P4Hのα(I)サブユニット(NP_000908)のタンパク質配列の比較を示す。少なくとも5つの配列で一致するアミノ酸には、それぞれの位置の上に破線で印がつけられている。Fe2+および2−オキソグルタレートのC−5カルボキシル基との結合に関与する保存されている残基には、それぞれの位置の下にアスタリスクで印がつけられている。他のどの分析配列とも整列しなかったヒトα(I)サブユニットの最初の147個のアミノ酸は示していない。
Claims (8)
- 組換えタンパク質の製造のための方法であって、
− 配列番号1のプロリル−4−ヒドロキシラーゼ1遺伝子の破壊又は下方調節を含むヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)由来の植物細胞を含む植物ベースの系を準備するステップと、
− 組換えタンパク質をコードする遺伝子を植物ベースの系に送達するステップと、
− 組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現のために植物ベースの系を培養するステップと
を含む方法。 - プロリル−4−ヒドロキシラーゼ1遺伝子の破壊が、遺伝子のノックアウトを含む、請求項1に記載の方法。
- 組換えヒトエリスロポエチン(rhEPO)の製造のための、請求項1または2に記載の方法。
- プロリル−4−ヒドロキシラーゼ1遺伝子の破壊を使用して、少なくとも1つの植物特異的プロリルヒドロキシル化部位におけるプロリルヒドロキシル化を回避する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- プロリル−4−ヒドロキシラーゼ1遺伝子の破壊を使用して、ヒト特異的プロリルヒドロキシル化をもたらす、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号1のプロリル−4−ヒドロキシラーゼ1遺伝子の破壊又は下方調節を含むヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)由来の植物細胞を含む、植物ベースの系。
- 組換えタンパク質の産生のための、請求項6に記載の植物ベースの系の使用。
- 組換えタンパク質が、少なくとも1つの植物特異的プロリルヒドロキシル化部位においてプロリルヒドロキシル化されていない、請求項7に記載の使用。
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