ES2744993T3 - Expresión modificada de prolil-4-hidroxilasa en physcoitrella patens - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de fabricación de una proteína recombinante que comprende los pasos de - proporcionar células de Physcomitrella patens que comprende una ablación de la expresión del gen prolil- 4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o que comprende una regulación negativa de la expresión por amiARN u oligonucleótidos antisentido del gen prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, - administrar un gen que codifica para la proteína recombinante en dichas células, y - cultivar dichas células para la expresión del gen que codifica para la proteína recombinante.

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión modificada de prolil-4-hidroxilasa en physcoitrella patens

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una proteína recombinante en un sistema basado en plantas, una proteína recombinante, que se ha producido en un sistema basado en plantas, un sistema basado en plantas y el uso de la proteína recombinante.

Antecedentes de la invención

La producción recombinante de proteínas farmacéuticas es fundamental, no solamente para la medicina personalizada. Si bien la mayoría de los productos biofarmacéuticos se producen en cultivos de células de mamíferos, los productos farmacéuticos de origen vegetal (PFOV) están ganando impulso con el lanzamiento del primer producto al mercado (http://protalix.com/product-development/elelyso.asp). Aunque las modificaciones postraduccionales (MPTs) de las plantas son similares a las de los humanos, las pequeñas diferencias pueden afectar la calidad, la seguridad y la eficacia de las PFOV (Walsh and Jefferis, Nat. Biotechnol., 24:1241-1252, 2006). Una de las MPTs más comunes en los eucariontes superiores es la prolil-4-hidroxilasa (P4H)-hidroxilación catalizada por prolil. Los sitios de reconocimiento de secuencia P4H en las proteínas diana difieren entre humanos y plantas, ocasionando MPT no humanas. Además, en las plantas, las hidroxiprolinas resultantes son el ancla para la O-glicosilación que, nuevamente, difiere de la O-glicosilación en seres humanos.

Los sistemas basados en plantas están ganando aceptación como plataformas de producción alternativas para productos biofarmacéuticos recombinantes (Paul and Ma, Biotechnol. Appl. Biochem., 58:58-67, 2011). Con respecto a las ligeras diferencias en las modificaciones postraduccionales entre humanos y plantas, se ha logrado un progreso considerable en la humanización de la N-glicosilación ligada a la Asparagina de PFOV (Karnoup et al., Glycobiology, 15: 965-981, 2005; Pinkhasov et al., Plant Biotechnol. J., 9:991-1001, 2011; Weise et al., Plant Biotechnol. J., 5: 389-401, 2007, Cox et al., Nat. Biotechnol., 24: 1591-1597, 2006). La unión de los residuos inmunogénicos específicos de la planta de p1,2-xilosa y a1,3-fucosa al núcleo de N-glicano se abolió en diferentes sistemas vegetales (Cox et al., Nat. Biotechnol., 24:1591-1597, 2006; Koprivova et al., Plant Biotechnol. J., 2:517-523, 2004; Strasser et al., FEBS Lett., 561:132-136, 2004; Sourrouille et al., Plant Biotechnol. J., 6:702 -721,2008). Además, recientemente se reportó la eliminación de los epítopes de Lewis A en N-glicanos de rhEPO (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012). La humanización adicional de la N-glicosilación en PFOV se logró mediante la expresión de la (31,4 galactosiltransferasa humana (Bakker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:7577-7582, 2006; Huether et al., Plant Biol. (Stuttg.), 7:292-299, 2005) y enzimas heterólogas adicionales necesarias para la sialilación de ingeniería (Castilho et al., J. Biol. Chem., 285:15923-15930, 2010). A pesar de este progreso en la humanización de la N-glicosilación, las diferencias en la O-glicosilación pueden afectar la calidad del producto. La O-glicosilación de plantas difiere explícitamente de la O-glicosilación típica de tipo mucina humana (Gomord et al., Plant Biotechnol. J., 8:564-587, 2010) e induce la formación de anticuerpos en mamíferos (Leonard et al., J. Biol. Chem., 280:7932-7940, 2005; Yates et al., Glycobiology, 6:131-139, 1996). La inmunogenicidad de los productos biofarmacéuticos puede reducir la eficacia del producto y es un riesgo potencial para los pacientes (Schellekens, Nat. Rev. Drug Discov., 1:457-462, 2002). Tales efectos adversos obstaculizan el amplio uso de plantas como anfitriones de producción de productos biofarmacéuticos. En las plantas, el ancla principal para la O-glicosilación es la 4-trans-hidroxiprolina (Hyp) (Kieliszewski, Phytochemistry, 57:319-323, 2001), mientras que no se produce ninguna modificación adicional de Hyp en mamíferos (Gorres and Raines, Crit Rev. Biochem. Mol. Biol., 45: 106-124, 2010). Aunque Hyp siempre se sintetiza postraduccionalmente por prolil-4-hidroxilasas (P4Hs) a través de la hidroxilación del carbono y de la prolina, los sitios de reconocimiento difieren entre mamíferos y plantas (Gorres and Raines, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 45: 106 -124, 2010). Hyp es un componente estructural importante de las paredes celulares de las plantas y de la matriz extracelular de animales y de humanos. Aquí, Hyp juega un papel clave en la estabilización de la estructura del colágeno, una de las proteínas más abundantes en los mamíferos, donde la segunda prolina del tripéptido PPG generalmente es hidroxilada por las P4Hs del colágeno. En las plantas, los residuos Hyp son los sitios de unión para la O-glicosilación en las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (GRHPs), las proteínas más abundantes en la matriz extracelular de las plantas y de la pared celular. Las GRHP incluyen extensinas, glicoproteínas ricas en prolina y proteínas arabinogalactanos (AGP) (Kieliszewski, Phytochemistry, 57: 319-323, 2001; Kieliszewski and Lamport, Plant J., 5:157-172, 1994; Shpak et al., J. Biol. Chem., 276:11272-11278, 2001). La hidroxilación del prolil y la posterior glicosilación de las proteínas de la pared celular de la planta son de gran importancia para el crecimiento, la diferenciación, el desarrollo y la adaptación al estrés (Velasquez et al., Science, 332:1401-1403, 2011; Lamport et al., New Phytol., 169: 479-492, 2006).

Los motivos diana para la O-glicosilación anclada a Hyp en plantas, los denominados módulos de glicol fueron definidos y validados (Kieliszewski and Lamport, Plant J., 5:157-172, 1994; Shpak et al., J. Biol Chem., 276:11272-11278, 2001). De estos, el motivo consenso [A/S/T/V]-P(1,4)-X(0,10)-[A/S/T/V]-P(1,4) (donde X puede ser cualquier aminoácido) se obtuvo para predecir la prolil-hidroxilación en plantas (Gomord et al., Plant Biotechnol. J., 8:564-587, 2010). Según el análisis in silico del proteoma humano, aproximadamente el 30% de todas las proteínas contienen este motivo y, por lo tanto, son candidatos para la prolil-hidroxilación no humana y la posterior O-glicosilación cuando se expresan en plantas (Gomord et al., Plant Biotechnol. J., 8: 564-587, 2010). En consecuencia, se reportó la proliferación adversa de la prolil-hidroxilación típica de la planta e incluso la arabinosilación de PFOV (Karnoup et al., Glycobiology, 15:965-981, 2005; Pinkhasov et al., Plant Biotechnol. J., 9 991-1001, 2011; Weise et al., Plant Biotechnol. J., 5:389-401, 2007). Por otro lado, se sugirió la introducción artificial de la O-glicosilación de Hyp en PFOV como una alternativa a la PEGilación para aumentar la vida media en suero de los productos biofarmacéuticos (Xu et al., Biotechnol. Bioeng., 97:997-1008, 2007; Solicitud de patente EE.UU. 20060026719). Sin embargo, la prolil-hidroxilación no humana no solamente altera la secuencia nativa de la proteína, sino que también sirve como ancla para los O-glicanos, que en consecuencia podrían ser inmunogénicos. Por lo tanto, la eliminación del ancla Hyp es la única forma segura de evitar la O-glicosilación adversa en PFOV.

Los tres documentos EP 2 360 261 A1, Xu et al. (BMC Biotechnol, 11:69, 2011) y Stein et al. (Biomacromolecules, 10:2640-2645), cada uno trata con la producción de colágeno en diferentes sistemas vegetales (por ejemplo, maíz, tabaco). La hidroxilación de prolil específica para mamíferos o humanos se logra mediante la expresión exógena en mamífero/humano de prolil 4 hidroxilasa. Por lo tanto, los métodos descritos en los tres documentos requieren la expresión de prolil 4 hidroxilasa exógena de mamífero/humano.

Entre las plantas, el musgo Physcomitrella patens ofrece la posibilidad única de ingeniería genética precisa y dirigida mediante recombinación homóloga (por ejemplo, Strepp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4368-4373, 1998; Koprivova et al., Plant Biotechnol. J., 2: 517-523, 2004). Además, se han producido varios PFOV en el biorreactor de musgo, incluyendo rhEPO (Decker and Reski, Plant Cell Rep., 31:453-460, 2012), el líder biofarmacéutico a nivel mundial. Su rotación en el mercado supera los 10 mil millones de euros al año. EPO es una hormona peptídica altamente glicosilada estimulante de la eritropoyesis. El hEPO recombinante producida en las células OHC (ovario de hámster chino) se utiliza para la prevención o el tratamiento de anemia en pacientes de nefrología y de oncología, y puede ser objeto de abuso por actividades ilegales de dopaje. Una versión de EPO con glico-ingeniería (asialo-EPO) no tiene actividad hematopoyética, pero puede servir como un fármaco seguro con funciones de protección neurológica y tisular después de un derrame cerebral y de estrés adicional por hipoxia (Erbayraktar et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE. UU., 100:6741-6746, 2003). Recientemente se reportó la producción de asialo-EPO correctamente N-glicosilada en el biorreactor de musgo (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012). Sin embargo, la rhEPO derivada de la planta se hidroxila dentro del motivo SPP (147-149) (Weise et al., Plant Biotechnol. J., 5:389-401, 2007) y, por lo tanto, puede tener efectos adversos en los pacientes. El documento WO 2007/006570 A2 describe células de briófitas transformadas, tales como células de P. patens, que comprenden a un transgen implicado en la ruta de glicosilación.

Velasquez et al. (Science, 332:1401-1403, 2011) describe a las proteínas O-glicosiladas de la pared celular para el crecimiento del vello radicular en A. thaliana.

Weise et al. (Plant Biotechnol. J., 5:389-401, 2007) y Parsons et al. (Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012) se ocuparon de la producción de rhEPO en musgo y con la modulación del patrón de glicosilación de los N-glicanos dirigidos a las fucosil-/xilosil-/galactosiltransferasas específicas de la planta. De este modo, se eliminan las fucosas/xilosas/galactosas inmunogénicas en los N-glicanos. Ninguno de los documentos aborda la O-glicosilación porque la prolil hidroxilación (como un ancla para la O-glicosilación) no está sujeta a estas divulgaciones.

La hidroxilación de prolinas de una proteína humana recombinante producida en un sistema basado en plantas no puede obviarse hasta ahora. Solamente se hace evidente después de la producción de una proteína humana recombinante si sus prolinas están hidroxiladas y si está presente la O-glicosilación no humana o específica de plantas.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar un procedimiento para la producción de una proteína recombinante utilizando un sistema basado en plantas. También es un objeto de la presente divulgación proporcionar una proteína recombinante, que se ha producido en un sistema basado de plantas sin la necesidad de introducir genes exógenos de prolil-4-hidroxilasa en el sistema, en el que la proteína recombinante no comprende prolil hidroxilación no humana. Es un objeto adicional de la presente divulgación proporcionar un sistema basado en plantas utilizado para la producción de dicha proteína recombinante y proporcionar un uso de dicha proteína recombinante.

Descripción breve de la invención

La presente divulgación proporciona un procedimiento para la producción de una proteína recombinante que comprende a ninguna o solo hidroxilación de prolil específica de humano en un sistema basado en plantas. El procedimiento de la invención comprende los pasos de proporcionar células de P. patens que comprenden una ablación o regulación negativa de la expresión del gen endógeno de prolil-4-hidroxilasa 1 de acuerdo con la SEQ-ID No. 1, entregando a un gen que codifica para la proteína recombinante en las células y cultivando las células para la expresión del gen que codifica para la proteína recombinante Es obvio para una persona ordinaria experta en la técnica que la purificación de la proteína será un requisito previo para utilizar a la proteína recombinante para cualquier procesamiento adicional como la producción de un producto farmacéutico.

En este procedimiento, las células comprenden células vegetales derivadas de Physcomitrella patens. El gen prolil-4-hidroxilasa 1 es el gen de Physcomitrella patens prolil-4-hidroxilasa 1 de acuerdo con la SEQ-ID No. 1. Se divulga el Número de Acceso NCBI XM_001753185. La proteína recombinante puede ser eritropoyetina humana recombinante (rhEPO).

La presente divulgación también proporciona una proteína recombinante que se ha producido en un sistema basado en plantas que comprende una modulación para un gen de prolil-4-hidroxilasa endógeno de la planta. La proteína recombinante se produce mediante el procedimiento descrito anteriormente. Se pretende que la proteína recombinante no comprenda ninguna hidroxilación de prolil no humana. Se divulga una proteína que no comprende la hidroxilación de prolil específica de la planta, lo que significa que la hidroxilación de prolil específica de la planta puede no estar presente en al menos un sitio de hidroxilación de prolil específico de la planta para evitar cualquier efecto inmunológico o secundario en la especie de origen de la proteína recombinante.

La regulación de la expresión génica incluye una amplia gama de mecanismos que son utilizados por las células para regular positiva o negativamente la producción de productos génicos específicos (proteínas o ARN). La regulación de la transcripción afecta la producción de ARNm, mientras que la regulación de la traducción afecta a la producción de proteínas. Incluso las modificaciones postraduccionales pueden afectar la regulación de la expresión génica exitosa. Una persona experta en la técnica tiene conocimiento relevante sobre tecnologías adecuadas para la regulación positiva o negativa de la expresión de genes o de proteínas. Por lo tanto, el término "regulación negativa de la expresión génica" designa una disminución en la expresión génica o proteica en comparación con el estado no modificado.

La modulación o la modificación de un gen, actividad génica o expresión génica de acuerdo con la presente divulgación se refiere a la activación o a la regulación positiva, así como a la regulación negativa o la desactivación de un gen, actividad génica o expresión génica. La completa ablación de la expresión génica se puede lograr mediante la eliminación del gen, pero también mediante mutaciones con tecnologías de nucleasas (TALEN, CRISPR-Cas) o mediante la identificación de mutantes de plantas de colecciones que se han sometido a un tratamiento de rayos X, mutagénesis-EMS o inserción de ADN-T. La regulación negativa puede lograrse mediante amiARN u otras técnicas convencionales. Las técnicas para la regulación positiva, la regulación negativa o la desactivación de un gen son comparables en todas las plantas.

Las células comprenden células vegetales derivadas de Physcomitrella patens. El gen de prolil-4-hidroxilasa 1 ablado regulado negativamente es el gen de la prolil-4-hidroxilasa 1 de Physcomitrella patens de acuerdo con la SEQ-ID No. 1. Se divulga el Número de Acceso de NCBI XM_001753185.

En una realización adicional de la presente divulgación, la proteína recombinante es la eritropoyetina humana recombinante (rhEPO).

La presente divulgación también proporciona células que comprenden una modulación por ablación o regulación negativa de un gen endógeno de la planta prolil-4-hidroxilasa 1. El sistema basado en plantas puede comprender células vegetales derivadas de Physcomitrella patens y el gen de prolil-4-hidroxilasa 1 puede ser el gen de Physcomitrella patens, prolil-4-hidroxilasa 1 de acuerdo con la SEQ-ID No 1. Se divulga el Número de Acceso NCBI XM_001753185. Dichas células pueden utilizarse para la producción de una proteína recombinante, en la que la proteína recombinante solamente comprende la hidroxilación de prolil específica para humanos o carece de hidroxilación de prolil en al menos un sitio de hidroxilación de prolil específico de plantas.

Se divulga un sistema basado en plantas de una mutante de Physcomitrella patens depositada en el International Moss Stock Center bajo IMSC No. 40218.

El uso de un gen modulado de prolil-4-hidroxilasa de Physcomitrella patens para la fabricación de proteínas recombinantes es un objeto adicional de la presente divulgación.

Es un objeto adicional de la presente divulgación utilizar a la proteína recombinante como un producto farmacéutico o biofarmacéutico. La proteína recombinante puede ser parte de un producto farmacéutico en combinación con otros compuestos.

El alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones.

Descripción breve de las figuras

Figura 1. Comparación de la secuencia de proteínas de las prolil-4-hidroxilasas (P4Hs) putativas de P. patens, Arabidopsis thaliana P4H1 (AT2G43080.1), Nicotiana tabacum P4H (BAD07294) y la subunidad a (I) del colágeno humano-P4H (NP_000908).

Figura 2. Localización subcelular in vivo de homólogos de P4H de P. patens

Figura 3. Representación esquemática de las construcciones que eliminan a p4h

Figura 4. Análisis de expresión génica de p4h en líneas de musgo recombinantes

Figura 5. Análisis espectrométrico de masas de la hidroxilación de rhEPO producida por musgo

Figura 6. Análisis MS/MS del péptido EAISPPDAASAAPLR (144-158) a partir de rhEPO producida por musgo Figura 7. Efecto de la sobreexpresión del gen de prolil-hidroxilasa p4h1

Figura 8. Análisis del estado de hidroxilación del péptido N-terminal de rhEPO producida por musgo

Figura 9. Árbol filogenético de las secuencias de aminoácidos de diferentes prolil-4-hidroxilasas vegetales.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación proporciona un procedimiento para la producción de una proteína recombinante que comprende solamente la hidroxilación de prolil específica de humanos en células, comprende los pasos para proporcionar células, en el que las células comprenden una ablación o la regulación negativa para un gen endógeno de prolil-4-hidroxilasa 1 de planta gen de acuerdo con la SEQ-ID No. 1, que entrega un gen que codifica para la proteína recombinante en las células y cultivando las células para la expresión del gen que codifica para la proteína recombinante.

El término "planta endógena" se va a referir al propio gen de prolil hidroxilasa de la planta. En otras palabras, si el sistema basado en plantas comprende células vegetales derivadas de Physcomitrella patens, el gen de la prolil-4-hidroxilasa también se deriva de Physcomitrella patens. No está destinado a insertar un gen de mamífero adicional.

El suministro de ADN se entenderá como la introducción de ADN en células y en tejidos. Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, transformación, bombardeo de partículas, electroporación o transducción viral.

El cultivo significará cualquier tipo de técnica de cultivo conocida en la técnica que utiliza entre los equipos de laboratorio estándar los medios y los sustituyentes apropiados y las condiciones de cultivo para las células respectivas.

Se demostró inesperadamente que el procedimiento revela proteínas recombinantes, que pueden comprender solo la hidroxilación de prolil específica para humanos, lo que significa que se pueden eliminar todas las hidroxilaciones de prolil específicas de plantas.

En este procedimiento, las células comprenden células vegetales derivadas de Physcomitrella patens. El gen prolil-4-hidroxilasa 1 es el gen Physcomitrella patens prolil-4-hidroxilasa 1 de acuerdo con la SEQ-ID No. 1. La proteína recombinante puede ser la eritropoyetina humana recombinante (rhEPO).

La presente divulgación también proporciona una proteína recombinante, que se ha producido en un sistema basado en plantas de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se divulga un sistema basado en plantas que comprende la modulación de un gen de prolil-4-hidroxilasa endógeno de planta. La proteína recombinante solamente puede comprender la hidroxilación de prolil específica para humanos o no debe tener hidroxilación de prolil específica de plantas en al menos un sitio de hidroxilación de prolil específico de plantas. Un sistema divulgado basado en plantas se refiere a células vegetales o células derivadas de células vegetales. Un sistema basado en plantas que comprende un alelo eliminado significará que el sistema basado en plantas se modifica genéticamente de modo que un alelo de tipo silvestre del gen se reemplaza por una construcción de ingeniería. La expresión del gen respectivo puede, por lo tanto, regularse negativamente o eliminarse por completo. Cabe señalar que incluso la regulación negativa de un solo gen p4h ha demostrado ser suficiente. Las células antes de la ablación genética o la regulación negativa pueden ser de tipo silvestre o mutantes. Las secuencias de "tipo silvestre" dentro del significado de la presente divulgación se refieren a la versión no mutada de un gen común en la naturaleza o al alelo requerido para producir el fenotipo de tipo silvestre. El fenotipo de tipo silvestre es la forma o fenotipo más común en la naturaleza o en una población de crianza natural.

Las proteínas recombinantes se derivan de secuencias de ADN que a su vez resultan del uso de la clonación molecular para reunir material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otro modo no se encontrarían en organismos biológicos. Por ejemplo, una proteína humana recombinante se deriva de secuencias de ADN humano que han sido modificadas por material genético de múltiples fuentes.

La hidroxilación de prolil específica de humano va a significar que la proteína humana recombinante no comprende hidroxilaciones de prolil específicas de plantas. La hidroxilación de prolil específica de plantas es la hidroxilación de prolinas, que se realiza mediante las enzimas no moduladas de la planta. Por lo tanto, cuando una proteína humana recombinante se expresa en un sistema basado en plantas, las enzimas de la planta van a hidroxilar a las prolinas de una manera específica de la planta, dando lugar a la O-glicosilación no humana de la proteína humana recombinante. Por lo tanto, la eliminación de la hidroxilación de prolil específica de plantas tiene la ventaja de que se evita la O-glicosilación adversa. Las proteínas humanas recombinantes producidas en un sistema basado en plantas pueden, por lo tanto, humanizarse a través de la glico-ingeniería.

Dada la gran importancia de las proteínas O-glicosiladas para el cuerpo humano, incluso las ligeras diferencias entre las proteínas humanas recombinantes producidas en un sistema basado en plantas y sus contrapartes humanas nativas en esta modificación postraduccional van a dificultar la aprobación del fármaco por parte de las autoridades relevantes. Por lo tanto, la aproximación actual es eliminar con precisión a los sitios de unión para la O-glicosilación específica de plantas, residuos de prolina hidroxilados, en la proteína humana recombinante. Las células comprenden células vegetales derivadas de Physcomitrella patens. El gen de prolil-4-hidroxilasa 1 es el gen de Physcomitrella patens prolil-4-hidroxilasa 1 de acuerdo con la SEQ-ID No. 1.

Se demostró inesperadamente que la ablación del gen de acuerdo con la SEQ-ID No. 1 (NCBI No. De acceso XM_001753185) puede abolir la hidroxilación de prolil no deseada. Sorprendentemente, la tasa de crecimiento, la diferenciación, la productividad de rhEPO y la secreción de la proteína al medio de cultivo no se vieron afectadas en estas plantas mutantes por eliminación en comparación con la línea parental.

Physcomitrella patens se referirá al tipo silvestre o al musgo mutado.

En una realización adicional de la presente divulgación, la proteína recombinante es la eritropoyetina humana recombinante (rhEPO).

La presente invención también proporciona un sistema basado en plantas que comprende una ablación o la regulación negativa para un gen prolil-4-hidroxilasa endógeno de plantas, en el que el sistema basado en plantas comprende a células vegetales de Physcomitrella patens y en el que además el gen de prolil-4-hidroxilasa 1 es el gen de la prolil-4-hidroxilasa 1 de Physcomitrella patens según la SEQ-ID No. 1 para la producción de una proteína recombinante, en el que la proteína recombinante no comprende a ninguna hidroxilación de prolil no humana.

Un sistema basado en plantas divulgado puede ser la mutante Physcomitrella patens depositada en el International Moss Stock Center bajo IMSC No. 40218.

Se divulga el uso de la proteína recombinante como un producto farmacéutico, que incluye productos biofarmacéuticos, o para la fabricación de un producto farmacéutico.

Los productos biofarmacéuticos son productos farmacéuticos producidos utilizando medios biotecnológicos. Pueden ser, por ejemplo, proteínas (incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos (ADN, ARN u oligonucleótidos antisentido) y pueden utilizarse con fines de diagnóstico terapéutico o in vivo. Se producen por medios distintos a la extracción directa de una fuente biológica nativa (no modificada). Por ejemplo, los productos biofarmacéuticos se pueden producir en plantas genéticamente modificadas.

Se pretende que la proteína recombinante de la presente divulgación se pueda utilizar como un producto biofarmacéutico dado que no comprende la hidroxilación de prolil no humana y la hidroxilación de prolil no específica de plantas.

Experimentos

Experimento 1: Identificación de prolil-4-hidroxilasas (P4Hs) de Physcomitrella patens

Para la identificación de homólogos de prolil-4-hidroxilasa en P. patens, se utilizó la secuencia de aminoácidos de Arabidopsis thaliana P4H1 (AT2G43080.1) para realizar una búsqueda BLAST (herramienta basica local de búsqueda de alineación) contra los modelos genéticos en el recurso de Physcomitrella patens (www.cosmoss.org). Se identificaron seis secuencias del genoma de Physcomitrella patens que presentaban homología con las enzimas P4H: Pp1s8_114V6.1 (PpP4H1), Pp1s192_51V6.1 (PpP4H2), Pp1s19_322V6.1 (PpP4H3), Pp1s172_91V6.1 (PpP4H4), Pp1s12_247V6.1 (PpP4H5) y Pp1s328_29V6.1 (PpP4H6). Como la información de la secuencia no estaba completa para el ARNm de Ppp4h2, 3 y 6, se empleó 5'RACE-PCR (amplificación rápida de extremos de ADNc) (GeneRacerTM, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante para obtener secuencias completas. Se amplificaron dos ADNc diferentes para el gen de Ppp4h6, correspondientes a formas alternativas de empalme del ARNm, a partir de las cuales se podían predecir dos variantes de proteínas con diferentes N-terminales (Ppp4h6a y Ppp4h6b).

Se identificaron las siguientes secuencias:

P4H1 ADNc (Pp1s8_114V6.1 No. de acceso.: XM_001753185; SEQ ID NO. 1)

GCAAGATCGTCTGATTGCGCGCACGTCGGAGATCGCTTAAAGTGAAGGTTGCATT GCTCTGGCAAGAAGTATTTGCAGGTAGGACGGTAGAGTCTGGATGCGCCAGAGTT GTCGGTTTGGCCTTCTTCGCAAGGGAGAAGAAGTCATGATGCTTGGATTTAGCGA ATTCGAAGAGCTGATCCTTGTTTTTCCGTCAGACTGGCAAGGGATGGAGTAATTC TACGAAGCGAGCGCGTCAGGGTTTGGTTTTAGGAAGCTGGGCTGCCACAGACACT TTTGACGATGGGTCCCTCTAGATATGTCATTGTGCTCCTCACATTTGTGACGATCG GCATGGCTGGGGGGGCGTTATTGCAGCTGGCTTTCTTGAAGAAGCTAGAACAAAG T AGTGG AGCTGGG ATTT ACA ATT AT AGA AGAG AGAT AGGGGA AT ACG A A AACC A AACATTTGGATCGGGATTGTCCCTTTGGGCTAATGATGAAGATGCGAGAACACTA CGTGTTGGACTGGTTAAGCAAGAAGTTATTAGCTGGCAACCCAGAATCATTCTCC TGCACAATTTCCTTAGTGCTGATGAATGTGATCACCTGATAAATCTTGCTCGCCCC AGGCTCGTGAAGTCAACAGTCGTGGATGCAACCACAGGCAAGGGAATCGAGAGT AAGGTTCGAACAAGCACAGGCATGTTCCTTAATGGAAATGACCGCAGACATCAC ACTATTCAGGCAATCGAAACCCGTATTGCTGCGTATTCTATGGTACCTGTTCAAA ATGGGG AGCTCCTCC A AGTTTT ACG AT ATG A ATCTG ATC A AT ATT AC A AGGC AC A TCACGACT ACTTTTC AG ATG AGTTCA ATTT A A A A AGGGGTGGGC A ACGTGTGGCG ACAATGCTTATGTACTTGACCGAGGGGGTCGAGGGAGGCGAAACAATATTTCCGC AGGCTGGAGATAAAGAGTGTAGCTGTGGCGGTGAAATGAAAATCGGCGTCTGTG TGAAACCTAAACGAGGGGATGCTGTCCTGTTTTGGAGCATTAAGCTGGATGGACA AGTTGATCCAACAAGCCTTCATGGTGGATGCAAAGTTTTGTCAGGAGAGAAATGG TCGTCTACCAAATGGATGAGGCAGCGAGCCTTTGATTAGGGTGAACTTTGGATGG TAGGAGCTGTAATCATAGTAGAAGACCAATAATAGCGATTATGCCTCATCATTCC GGAAGCTTTGCGGGCTTTTCCCGATGCATCTAAGAATGTATGTAATGAGCAACTT TGAATACTGTCAGTGATTCGTAACAAGAAAAAAATCGATTTAGTGGTATTGTGGA CTTTGAAATGAAGGTTAAGATCACGAAGAGCTTT

Traducción correspondiente al ADNc de P4H1 (SEQ ID NO. 2)

MGPSRYVIVLLTFVTIGMAGGALLQLAFLKKLEQSSGAGIYNYRREIGEYENQTFGSG LSLWANDEDARTLRVGLVKQEVISWQPRIILLHNFLSADECDHLINLARPRLVKSTVV DATTGKGIESKVRTSTGMFLNGNDRRHHTIQAIETRIAAYSMVPVQNGELLQVLRYE SDQYYKAHHDYFSDEFNLKRGGQRVATMLMYLTEGVEGGETIFPQAGDKECSCGGE MKIGVCVKPKRGDAVLFWSIKLDGQVDPTSLHGGCKVLSGEKWSSTKWMRQRAFD

P4H2 ADNc (Pp1s192_51V6.1 No. de acceso.: JX964780; SEQ ID NO. 3)

GTGATGCGTGATCCTGTGCTGCTGAGCGTGGGTTTTACCGACTTTAATCGGGCAA GGGCGTTGATGTTAACTTCTGCATCGTACTGGGAGGTTTGTCTACATCTCCGCGGG AATTTTCTGCGTCTTTTGGTGTGGATCCACAGCATGGCGTTGAGAGATAGAAGAT GT AGTCTT ATTCT AGCTCTCTT ATT ACTATCGGG ATT ACA AGC ATTGGG AGCTCGT GTGGAAGACTTGCCTGGTTGGATGGAAGAAATCAATGAGGTGAAGGATGCTGAG GGTGGCGTGATTCAACAAGTTTCTAGGATTGATCCCACTCGTGTCAAGCAGCTTT CGTGGAAACCGCGTGCATTTCTATATTCAAACTTTTTGTCAGATGCAGAGTGTGAT CATATGATATCGTTGGCAAAGGACAAGCTGGAGAAGTCAATGGTGGCCGATAAT GA ATCTGGG A AGAGTGTG A AGAGTGAA ATTCGC ACT AGCTCAGGT ATGTTTTTGA TGAAGGGTCAGGATGATATCATATCAAGGATTGAGGATAGGATTGCTGCATGGA CCTTTCTACCGAAGGAGAATGGGGAGGCAATCCAGGTCTTGAGGTACCAAGATG

GGGAGAAGTATGAGCCACATTTTGATTATTTCCACGATAAGAACAATCAGGCTCT TGGAGGTCACCGCATTGCCACTGTGTTAATGTACCTCTCCGACGTCGTCAAAGGT GGAGAGACAGTATTTCCTTCTTCTGAAGATCGAGGTGGTCCCAAGGATGATTCGT GGTCTGCTTGTGGGAAAACTGGGGTGGCCGTGAAACCAAGGAAAGGCGATGCCC TGCTCTTCTTCAGCCTACACCCCTCTGCAGTTCCAGATGAGTCAAGCTTACACACA GGATGCCCAGTTATCGAAGGGGAGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGATCCATGTTG CTGCATTTGAAAAGCCGCGTCCTAAGAATGGTGCATGTGTAAATGAGGTCGACAG TTGCGA AG AGTGGGC AGCTT ATGGGG A ATGTC AG A A A A ATCCAGCCT ACATGGTT GGGACAAAAGAGTGGCCAGGCTATTGCCGGAAAGCATGCCATGTGTGCTAGGTA GGGATATACCGTATTTCTTGGTTGCACTCTGTTGGGTTAGGGTAGGATATTTAATG TATTTGTGTCATCATCTAAGTATTAGGTCAGTTTCCAAACCAAGGAATCAGAGTT GTGGCTTTTGAAGAAGTATTATAGATCTTACGTACTAATTAAAAGGCTTGTGACC CTTG AGATGCACTTT AT AAT

Traducción correspondiente al ADNc de P4H2 (SEQ ID NO. 4)

MRDPVLLSVGFTDFNRARALMLTSASYWEVCLHLRGNFLRLLVWIHSMALRDRRCS LILALLLLSGLQALGARVEDLPGWMEEINEVKDAEGGVIQQVSRIDPTRVKQLSWKP RAFLYSNFLSDAECDHMISLAKDKLEKSMVADNESGKSVKSEIRTSSGMFLMKGQDD

I1SRIEDRIAAWTFLPKENGEAIQVLRYQDGEKYEPHFDYFHDKNNQALGGHRIATVL MYLSDVVKGGETVFPSSEDRGGPKDDSWSACGKTGVAVKPRKGDALLFFSLHPSAV PDESSLHTGCPVIEGEKWSATKWIHVAAFEKPRPKNGACVNEVDSCEEWAAYGECQ KNPAYMVGTKEWPGYCRKACHVC

P4H3 ADNc (Pp1s19_322V6.1 No. de acceso.: JX964781; SEQ ID NO. 5)

CGGCGCTTTGCAACTCCAATTTTGACCAGGCGAAGTGCACTTTGACATC'ITC.TTGA ATGTCCTCTTCTAGAGCATTGAACGGCCCTTCTGTGAACATTTTAAACTATTCAAC GGATGCCATTGACAGTCGTGGTTTTTGAAGTTCGAATCCAGAGCCCTCGCCATCA A ATCGTTGC AGT A ATCCTTGGTG ATTT AGC A AGCTCGGG ATCACTTC ATGG ATTTG GGGTCCTTCCTCTGCAGAGGCTGTTAGTACACACACACTGCATCAACTCCTACTG GTCTGGAAGCTTTTGAGGTTGGAAATAGTATGAAAGAGTCCCAGACAATTGGTGT ATTGAGTGGAAGAGGGTTGTGAAGTTTGGGCGCTCGACTGAAATGACCTGCGTGG ATGTTAGAAAATAAGCCAATTGGTGTTATGTAGAGATTCGTCACAACGCCCTCAT TCCTCCAACCCTTAAATGCCTTGCCCTATTTGTGTACTCTCGTGTGCGGGAATGAC GCTGTCCTTATACAATATGAAGTCATCGAAAAACAAAGGAAGAAAATGGAATCC TTTTACATACAAGCTCAGTTTGCCACAGGTGCTATTGTGGTGCACAATCTGCCTCT TAGCAGGCTATGCCGCCTCCAATTTCTTCCCCCAGAAAATAGAAGAGGAAGCAAT ATATCAGCCGTATCGGAAATCGGCTCAGCAAGAAGGGGAATTTCCATTTGGTGAA TTC AGTG A A A A AGTGGTGTT AG ATC ATGGT AGC ACTGGGG ACA ACTTC ATCGCTG ACATTCCTTTCCAGGTGTTGAGCTGGAAGCCTCGTGCGCTCTTGTATCCGAGATTT GCTAGCAAGGAGCAATGCGAGGCCATCATGAAGCTTGCAAGGACTCGTCTTGCTC CTTCTGCTCTGGCTTTGAGGAAAGGGGAGAGTGAAGACTCAACGAAAGACATCC GAACTAGTTCCGGGACTTTCTTGAGAGCCGACGAAGACACGACGCGGAGTTTGG AGCAAGTTGAAGAGAAGATGGCGAAAGCAACCATGATACCTCGCGAGAATGGAG AGGCTTTCAATGTGTTGAAGTACAATGTGGGACAAAAATACGACTGCCATTATGA TGTTTTTGACCCAGCTGAGTATGGACCTCAACCAAGCCAACGGATGGCCTCCTTT CTCTTATATCTATCGGATGTGGAAGAGGGTGGAGAGACCATGTTTCCCTTCGAAA ATTTTC A AAAC ATGA AC AT AGGCTTTGACT AC AAG A AGTGCATTGG AATG A A AGT

CAAGCCCCGCCAAGGTGATGCATTGCTTTTCTACTCAATGCATCCTAACGGCACA TTTGATAAGAGCGCTCTGCATGGAAGCTGCCCTGTAATCAAAGGCGAGAAATGG GTTGCCACAAAGTGGATTCGCAACACTGACAAATTTTGATCACCACCATGCGAAC GTTTTTACGTCCAAAATTAGGACATAGGAATCTGTCAATCAAATTAAAGGACATA TCTTTTATATCATTTAAAAATTCTGAAACTGAGAACTCATATGAACACCAGTTGA AACATTCGGGTCAACCGGATTATCGACAT

Traducción correspondiente al ADNc de P4H3 (SEQ ID NO. 6)

MPCPICVLSCAGMTLSLYNMKSSKNKGRKWNPFTYKLSLPQVLLWCTICLLAGYAA SNFFPQKIEEEAIYQPYRKSAQQEGEFPFGEFSEKVVLDHGSTGDNFIADIPFQVLSWK PRALLYPRFASKEQCEAIMKLARTRLAPSALALRKGESEDSTKDIRTSSGTFLRADED TTRSLEQVEEKMAKATM IPRENGEAFNVLKYNVGQKYDCHYDVFDPAEYGPQPSQR MASFLLYLSDVEEGGETMFPFENFQNMNIGFDYKKCIGMKVKPRQGDALLFYSMHP NGTFDKSALHGSCPVIKGEKWVATKWIRNTDKF

P4H4 ADNc (Pp1s172_91V6.1 No. de acceso.: XM_001774115; SEQ ID NO. 7)

GTTACACA AATTCATCAACCTCGAGGCATTTGGTTCATCAGTGGATCCATTTGTTG GGGTTTCGTGTGGATTGAGCTTGTGGGTTTCCTTCTCCGACTCGGAAATCGCTCCT GACAGAGTTTTCACGGAAGCTTTTGAGGCTGGAAACGGAGAAGGATTATTCCAA AGAATCGGTTTTTTAAAGTGTCACTTATCTTGTTTTCAAGGACAGTCTCAATAACA ATTTGGCGCAATTATCTGCAATGATTTACATGGATTGAATCGATTTTCAGTAGCTA A ATGT AGGGTCTGCT AGGCCCTCT AT ATTCCGACCCTTG AGTGA AG AC ACTGCCT CCCAGGCAGTCCGTGCCTTATTTTAATCTCCTTGCGTGCAAAGAACAGGAAGGCT GACACCGATTATAAACGGTTGAGACATGAAAACGCCAAAGGTCCGGGCAAGGAG TGCAAACCCTTTAAGATACAAGCTTGGTTTTCCTCTGGTGCTCTTGTGTTGCACAT TCTTCTTCTTGGTCGGCTTTTACGGTTCCAATTCCCTCTCCAAGGAAGAAAAACAT GTGGTGATTGACCCCGTCACCAATGAGAAACTTGTGTTCGAACATGGCCGTACTG GAGACAGTTCTGTTACTGACATTCCTTTCCAGGTGTTAAGTTGGAAACCACGTGC CCTTTTGTATCCGAATTTTGCAAGCAAAGAGCAATGTGAAGCCATCATCAAGCTT GCGAGGACACGTCTTGCTCCTTCTGGTCTGGCTTTGAGGAAAGGGGAGAGTGAAG CCACAACGAAAGAAATCAGAACTAGTTCTGGAACTTTCTTGAGAGCCAGTGAAG ATAAAACACAGAGTTTAGCGGAGGTTGAGGAGAAGATGGCCAGAGCAACCATGA TACCTCGGCAGAATGGGGAGGCTTTTAATGTGTTGCGGTACAACCCAGGTCAAAA AT ACG ATTGTC ACT ATG ATGTTTTTG ATCCAGCTG AGT ATGGTCCTC AACC AAGCC AGCGGATGGCTTCCTTTCTCCTTTATTTATCAGACGTCGAAGAGGGCGGAGAAAC GATGTTTCCCTTCGA AAACTTTC A A AAT ATGA ACACAGGCT ATA ATT ATAAGGAC TGTATTGGGTTGAAAGTGAAACCCCGCCAAGGCGATGCTCTTCTTTTCTATTCAAT GC ATCCT A ACGGT AC ATTTG AC A AG ACCGC ATTGC ATGG A AGCTGTCC AGTT ATC A A AGGCGA A A A ATGGGTCGCCACGA AGTGG AT ACGCA AT ACCGAC A A ATTTT A A TCTG A A AG ATCCC ACTGGTGACTGTTATA ACTTGCTGCCTTCTT A A AGTTCTTTCG GT AGT ACTCT AGG AGCTTC AGGTT ATCTT ACA A A AGT ATCGGGTCTG AG A A AG TG TAAAATCTGTGCGTACCTGAATCCATCAATTAAGTCATGGGTGTTATCTTTTAACA TTCCTGGTCTCTGCCAACCAGAGTTCCAGAGAAACGGTTGTTCGCTGGATT ATTGC CAGCTTAAAGTTCACTTAAGAAATTCTAAACTCTTCAACTAAGAAGACATTGTCC TTG

Traducción correspondiente al ADNc de P4H4 (SEQ ID NO. 8)

MKTPKVRARSANPLRYKLGFPLVLLCCTFFFLVGFYCiSNSLSKEEKHVVIDPVTNEKL VFEHGRTGDSSVTDIPFQVLSWKPRALLYPNFASKEQCEAIIKLARTRLAPSGLALRK GESEATTKEIRTSSGTFLRASEDKTQSLAEVEEKMARATMIPRQNGEAFNVLRYNPGQ KYDCHYDVFDPAEYGPQPSQRMASFLLYLSDVEEGGETMFPFENFQNMNTGYNYKD CIGLKVKPRQGDALLFYSMHPNGTFDKTALHGSCPVIKGEKWVATKWIRNTDKF

P4H5 ADNc (Pp1s12247V6.1 No. de acceso: JX964782; SEQ ID NO. 9)

GCTGCTTCAGGGT AGG AC A A ACC ATCGTCG A AGGGG ATGTGGGTCG ACCT ATTTT GGTCAACTTTATCTGTCTTTCTACTTCCGATGAATTGCCGTTTTTGTTGTAAGCGTT TGCACATGCAGGTTGGAGGCTGGTGAACTGCATACACAAATTTGATAGTCGGGGA GAAAGAGGAGTTTCTCACAGTGTCTTTGGTGATTGGATCATCCTCGAGGAGCTTT TAGCTCGAAGGGTTTCCTGATTTTAACiTTTGGAACCGAGGTATTTCAATCGTGAG AGTGGTTCTTAGCATGCATACATTTTGAGTGTGTAGGTATGGATCTCTATTCTAGA AGCCGTAGAGGCTGAGTAACTATTGCATTCTCTGAAATCCTGTTTACCTCGGCGC GGCCACATCTCGAAGTAGTCGGTAATTTTCTTCCTTGGGTTTCGTGGGAGCCGGG CG A AGTTCGT A ACT ATGGCG A AGCTG AGTCG AGGTC A AAGG AG AGG AGCTGGC A CGATGGCTTTGTTGGTGCTGGTCCTGTTGTCTCTAGCGCTCATGCTCATGTTGGCA CTTGGCTTTGTAGCCATGCCATCGGCGTCCCACGGGAGTTCGGCTGACGTTGTGG A A ATC A AGCTGCCCTC AC AC AGGC ATTTTGGTGCCA ACCCCTT ATC ACGTTGGGT TGAAGTCCTCTCTTGGGAGCCCAGAGCCTTTCTATATCACCACTTTCTGACAGAAG AGGAATGCAATCATCTAATTGAAGTGGCCAGGCCAAGTCTGGTGAAGTCAACGG TTGTAGATAGTGATACAGGAAAGAGCAAAGACAGCAGAGTACGCACAAGTTCAG GTACATTTTTGATGCGAGGCCAAGATCCTGTGATCAAAAGAATCGAGAAGCGAAT AGCTG ACTTCACATTTATACCTGCTGAGCA AGG TGAAGGCTTACAAGTTCTGCAG TACAAAGAAAGTGAAAAATACGAGCCCCATTATGATTACTTCCACGATGCATACA ATACCAAAAATGGCGGCCAAAGAATTGCTACCGTACTGATGTACCTGTCAAATGT CGAGGAAGGAGGAGAAACAGTTTTTCCAGCTGCTCAGGTGAACAAGACTGAAGT TCCCGATTGGGATAAATTATCTGAGTGTGCTCAGAAAGGTCTTTCTGTGCGACCA CGCATGGGAGATGCCTTGCTTTTCTGGAGCATGAAACCAGATGCGACACTTGATT CCACTAGCTTGCATGGTGGCTGCCCCGTGATCAAGGGTACCAAATGGTCTGCTAC TAAGTGGTTACATGTAGAAAACTATGCAGCCTGATGAGGATGGTACAAGATGTCT TCTGCAGGAAGTGAATTGTCACAAGCACCTGGTACAAGCAGATTCGAAATGCTTG GATGTAATGCATGGATGTTGGGAGAGGACAAACATACAAATTTATGATTCTGCAT T ACGTG AGATGT A ATG ATGA ACC ACCTCGTGCCT ATCTG A ATTC AT ATG A AC A A A CG A AT AG ATTTCC A ATTC AT ACC A AT A A A AC AG A A A AGCCGCTT A ACTT ATTTGT T A A CTTAGGC AGTTTTTTTGTTTT ATT ATTGGTGGTTTGC A ATCG ACCTTA ACG AC CATTTCTTGTAATCACCACAAACAAGCAAAATGCATATCTGATTTCATTCAAAAT ATACTTATAAAGACTGCTCiAATCTATAACAAACAAAA

Traducción correspondiente al ADNc de P4H5 (SEQ ID NO. 10)

MAKLSRGQRRGAGTMALLVLVLLSLALMLMLALGFVAMPSASHGSSADVVEIKLPS HRHFGANPLSRWVEVLSWEPRAFLYHHFLTEEECNHLIEVARPSLVKSTVVDSDTGK SKDSRVRTSSGTFLMRGQDPVIKRIEKRIADFTFIPAEQGEGLQVLQYKESEKYEPHYD YFHDAYNTKNGGQRIATVLMYLSNVEEGGETVFPAAQVNKTEVPDWDKLSECAQK GLSVRPRMGDALLFWSMKPDATLDSTSLHGGCPVIKGTKWSATKWLHVENYAA

P4H5 a ADNc (Pp1s328_29V6.1 No. de acceso: JX964783; SEQ ID NO. 11)

GAAAAAGAGCAGCAGTTGGAGTTGGAGTAGGCCAGATCGATGCTCCTCCTCCTCC CATGATGATAGATGACGAAGATTATGCTGTTGTTGTCGATGTTGTTGCTCGCTGAT CATCAACACGAAGTTGCCGTTGCAGCTGCTCTTGCTCTTCACCGTCGACTCGGCA GAGGGGCACAGCTCAGCTGGTAATTTATTATTAGTGCCCATGGGTGGGATGGATG TGAGTGACATCGGCGCTTCTACCGACAGTGTGAAACCCCAGCGAGGCTGTGCCTT GCCTTGCCTTGGCTTGTGTGCATTGCCTCTCCCCTCCAGTTTTTTGGTGGGTTGGTG TTTGTGTGAGGGGGGAACAGAGGAGAGGGCGGGGGCAAGGGCTGTGGCAGCTAT GGCGAGGTTGAGTAGGGGGCAAAGGACTGGAGTTGGCACGATGGCATTGCTGGT GTTCGCGTTTTTGTCTTTGATAGTCATGGTCATGTTGCTTCTGGACGTGGTAGCAA TGCCATCGGGACGTCGAGGCTCGATTGACGAGGGAGCCGAAGTGGAATTGAAGC TGCCTACCCACAGGCATGTGGATGAAAATCCACTGGCACCTTGGGTTGAGGTCCT TTCCTGGGAGCCCAGAGCTTTTCTGTATCACCACTTTCTGACACAAGTGGAATGC A ACCATCTT ATTG AGGTGGCC A AGCCT AGCCTGGTG A AGTC A ACAGTT AT AGAT A GTGCTACGGGAAAAAGCAAAGACAGCAGGGTTCGCACAAGTTCAGGGACATTTT TGGTGCGGGGCCAAGATCACATCATTAAGAGGATTGAGAAACGTATCGCTGACTT CACATTCATACCTGTTGAACAAGGTGAAGGCTTGCAAGTTTTGCAGTATAGAGAG AGTGAGAAATACGAGCCTCATTATGACTACTTTCACGATGCTTTCAATACTAAAA ATGGTGGTCAGCGG ATTGCT ACCGT ACTG ATGT ATCTGTCAGACGTTG AG A A AGG GGGAGAAACAGTTTTCCCGGCTTCTAAAGTGAACGCTAGTGAGGTTCCTGATTGG GATCAGCGATCCGAATGCGCTAAACGGGGCCTTTCTGTACGACCACGTATGGGAG ATGCCTTACTTTTTTGGAGCATGAAACCAGATGCGAAGCTTGACCCTACCAGTTT GCATGGCGCTTGCCCTGTGATTCAAGGTACGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGTTA CATGTTGAAAAATACGCAGCACGGTAAACATCCTTCTAGAAGTCTTCAACAGGAT T ACATG A ATT ATGCG AGC AGTCTTCTGGC ATG AGCAG AGGTG A ACTTGCCC A A AC TTGCTCATGGAACAACAGAATCAGCTTGCGAGTTATTTACAAGGAGCGAGTGTCC ATGCCTG A ATGCTGG A AC ACC AGCGTG ATG AG A ACGCTT AGG A ATACCA ATTCTT C ACTG ATTTT AC A A ACC AC ACT AGCT ACT AC ACATGAC A A ATTTCATGCTTTGACT TGGTTG ATCTGCTTTTGTGTG AGG ATC AGT ATTTT ATA A AT AGGGG ATGG AGCTCT TC AGCTCCT AATGTGCCi ATTTCG

Traducción correspondiente al ADNc de P4H5_a_ (SEQ ID NO. 12)

MGGMDVSDIGASTDSVKPQRGCALPCLGLCALPLPSSFLVGWCLCEGGTEERAGAR AVAAMARLSRGQRTGVGTMALLVFAFLSLIVMVMLLLDVVAMPSGRRGSIDEGAEV ELKLPTHRHVDENPLAPWVEVLSWEPRAFLYHHFLTQVECNHLIEVAKPSLVKSTVI DSATGKSKDSRVRTSSGTFLVRGQDHIIKRIEKRIADFTFIPVEQGEGLQVLQYRESEK YEPHYDYFHDAFNTKNGGQRIATVLM YLSDVEKGGETVFPASKVNASEVPDW DQRS ECAKRGLSVRPRMGDALLFWSMKPDAKLDPTSLHGACPVIQGTKWSATKWLHVEK YAAR

P4H6_b_ADNc (Pp1s328_29V6.1 No. de acceso: JX964784; SEQ ID NO. 13)

GAAAAAGAGCAGCAGTTGGAGTTGGAGTAGGCCAGATCGATGCTCCTCCTCCTCC CATGATGATAGATGACGAAGATTATGCTGTTGTTGTCGATGTTGTTGCTCGCTGAT CATCAACACGAAGTTGCCGTTGCAGCTGCTCTTGCTCTTCACCGTCGACTCGGCA GAGGGGCACAGCTCAGCTGGTAATTTATTATTAGTGCCCATGGGTGGGATGGATG

TCACATCATTAAGAGGATTGAGAAACGTATCGCTGACTTCACATTCATACCTGTT GAACAAGGTGAAGGCTTGCAAGTTTTGCAGTATAGAGAGAGTGAGAAATACGAG CCTCATTATGACTACTTTCACGATGCTTTCAATACTAAAAATGGTGGTCAGCGGAT TGCTACCGTACTGATGTATCTGTCAGACGTTGAGAAAGGGGGAGAAACAGTTTTC CCGGCTTCTAAAGTGAACGCTAGTGAGGTTCCTGATTGGGATCAGCGATCCGAAT GCGCTAAACGGGGCCTTTCTGTACGACCACGTATGGGAGATGCCTTACTTTTTTG GAGCATGAAACCAGATGCGAAGCTTGACCCTACCAGTTTGCATGGCGCTTGCCCT GTGATTCAAGGTACGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGTTACATGTTGAAAAATACG CAGCACGGTAAACAT CCTT CTAGAAGT CTT CAACAGGATTACATG AATTATGCG A GCAGTCTTCTGGCATGAGCAGAGGTGAACTTGCCCAAACTTGCTCATGGAACAAC AGAATCAGCTTGCGAGTTATTTACAAGGAGCGAGTGTCCATGCCTGAATGCTGGA AC ACC AGCGTG AT GAGAAC GCTT AGG AAT ACC AATTCTT C ACT GATTTT AC AAAC CACACTAGCTACTACACATGACAAATTTCATGCTTTGACTTGGTTGATCTGCTTTT GTGTGAGGATCAGTATTTTATAAATAGGGGATGGAGCTCTTCAGCTCCTAATGTG CGATTTCG

Traducción correspondiente al ADNc de P4H6_b_ (SEQ ID NO. 14)

MARLSRGQRTGVGTMALLVFAFLSLTVMVMEELDVVAMPSGRRGSTDEGAEVELKL PTHRHVDENPLAPWVEVLSWEPRAFLYHHFLTQVECNHLIEVAKPSLVKSTVIDSAT GKSKDSRYRTSSGTFLVRGQDHIIKRIEKRIADFTFIPVEQGEGLQVLQYRESEKYEPH YDYFHDAFNTKNGGQRIATVLMYLSDVEKGGETVFPASKVNASEVPDWDQRSECAK RGLSVRPRMGDALLFWSMKPDAKLDPTSLHGACPVTQGTKWSATKWLHVEKYAAR

Todas las secuencias de proteínas deducidas tenían un dominio catalítico de la subunidad alfa de prolil-4-hidroxilasa (SMART 0702). Se predijeron dominios transmembranales N-terminales para todos los homólogos excepto para P4H2 (servidor TMHMM v.2.0, ht- tp: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).

Con la finalidad de obtener más información sobre las enzimas P4H predichas, las secuencias de aminoácidos deducidas se alinearon con secuencias de P4H ya caracterizadas de humanos, Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum. Los alineamientos de secuencias de proteínas se realizaron con el programa CLUSTAL W (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) y se visualizaron con Jalview (www.jalview.org/). El dominio catalítico en el extremo C-terminal de la proteína está altamente conservado en los siete homólogos de P. patens (Fig. 1). Los siete P4H putativos comparten una identidad del 16-24% con la subunidad a (I) catalítica humana y una identidad del 30-63% con AtP4H1. Entre las secuencias de musgo, el grado de identidad es de entre 30 y 81%. Todas las secuencias contienen el motivo HXD y una histidina distal, que son necesarias para unir a el cofactor Fe2+. Además, contienen a el residuo básico lisina que se une al grupo carboxilo C-5 del 2-oxoglutarato (Fig. 1). Estos residuos son indispensables para la actividad de colágeno P4Hs (Kivirikko and Myllyharju, Matrix Biol., 16:357-368, 1998) y de P4H1 de A.. thaliana (Hieta and Myllyharju, J. Biol. Chem., 277:23965- 23971, 2002), lo que indica que las siete secuencias de P. patens son prolil-4-hidroxilasas funcionales.

Experimento 2: Predicción in silico de la localización intracelular

La eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) sirve como ejemplo de una proteína humana recombinante en los siguientes ejemplos. La prolil-hidroxilación no humana se produjo en rhEPO derivado de musgo que se ha secretado del tejido al medio de cultivo del biorreactor de musgo. Por lo tanto, se concluyó que la enzima P4H responsable de la modificación de la rhEPO postraduccional se encuentra en los compartimientos secretores, es decir, el retículo endoplásmico (RE) o el aparato de Golgi. En consecuencia, se examinó la localización subcelular de los siete homólogos de P4H de P. patens. Primero, se analizó la localización putativa intracelular in silico con cuatro programas diferentes basados en diferentes algoritmos: Target P (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/), MultiLoc (https://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc), SherLoc (https://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/SherLoc2) y Wolf PSORT (http://wolfpsort.org/). Este enfoque no obtuvo predicciones consistentes (Tabla 1).

Tabla 1. Predicción de localización in silico de Physcomitrella patens P4Hs utilizando diferentes programas.

Experimento 3: Análisis in vivo de la localización intracelular

La localización intracelular in vivo de cada una de las siete P4H de P. patens se estudió expresándolas como proteínas de fusión GFP (proteína verde fluorescente, P4H-GFP) en células de P. patens (para detalles sobre la generación de plásmidos en el material vegetal y el procedimiento de transformación, véase más abajo). La localización subcelular de las siete proteínas diferentes de fusión P4H-GFP se analizó 3 a 14 días después de la transfección por microscopía de escaneo láser confocal (MELC) (510 META; Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemania) y el software correspondiente (versión 3.5). La excitación a 488 nm se logró con un láser de argón y la emisión se midió con un detector META a 494-558 nm para GFP y a 601-719 nm para la clorofila. Las células se examinaron con un objetivo de inmersión en agua C-Apochromat 63x/1.2 W corr (Carl Zeiss MicroImaging). Los planos confocales se exportaron desde el software ZEN2010 (Carl Zeiss MicroImaging).

En las secciones ópticas, las señales de GFP de las siete proteínas diferentes de fusión P4H se detectaron predominantemente como estructuras circulares definidas alrededor del núcleo, revelando el marcado de las membranas nucleares (Fig. 2). Dado que la membrana nuclear es parte del continuo endomembranoso de las células eucariontes, estas señales revelan que las siete P4H de musgo estaban dirigidas a los compartimentos secretores. Una versión de GFP dirigida a el RE (ASP-GFP-KDEL, Schaaf et al., Eur. J. Cell Biol., 83:145-152, 2004), así como GFP sin ningún péptido señal que muestre fluorescencia de GFP en el citoplasma, así como en el núcleo (Schaaf et al., Eur. J. Cell Biol., 83:145-152, 2004) sirvieron como controles. Por lo tanto, estos experimentos no proporcionaron una indicación clara de un P4H específico responsable de la generación de Hyp en rhEPO secretada en P. patens.

Experimento 4: Ablación de las funciones de genes de cada uno de los homólogos de P4H de P. patens Con la intención de identificar definitivamente a aquellos homólogos responsables por la hidroxilación de prolil típica de plantas de rhEPO producida por el musgo, se ablacionaron las funciones genéticas de cada uno de los homólogos de P4H de P. patens. Por consiguiente, se diseñaron construcciones de direccionamiento genético para los seis genes p4h (Fig. 3).

Las construcciones de direccionamiento de genes se transfirieron posteriormente a la línea de musgo productora de rhEPO 174.16 (Weise et al., Plant Biotechnol. J., 5:389-401, 2007) para generar líneas de eliminación específicas (KO) para cada uno de los genes de P4H. Después de la selección por antibióticos, las plantas supervivientes se cribaron para la integración homóloga de la construcción KO en el locus genómico correcto (para más detalles sobre el cribado de plantas transformadas, véase más abajo).

La pérdida del transcrito respectivo se probó por PCR-TR (Fig. 4a), confirmando la ablación exitosa del gen. Se seleccionó una línea para cada modificación genética para su posterior análisis, y se almacenó en el International Moss Stock Center (http://www.moss-stock-center.org; Tabla 2).

Tabla 2. Números de acceso de las plantas utilizadas. International Moss Stock Center (http://www.moss-stockcenter.org)

Experimento 5: Análisis de las proteínas recombinantes mediante espectrometría de masas

Para investigar el efecto de cada una de las ablaciones de p4h en la hidroxilación de prolil observada para rhEPO producida por musgo, la proteína recombinante de cada una de las líneas KO (Ap4h) se analizó mediante espectrometría de masas. Para este propósito, las proteínas solubles totales se precipitaron del sobrenadante del cultivo de la planta parental 174.16 y una línea de eliminación de cada homólogo de p4h, y se separaron por SDS-PAGE. Posteriormente, la banda principal que contiene a rhEPO se cortó del gel teñido con Coomassie, se digirió con tripsina y se sometió a espectrometría de masas para un análisis del péptido tríptico EAISPPDAASAAPLR (144-158) (para detalles sobre el análisis de proteínas y péptidos, véase más abajo). En la planta parental 174.16, casi la mitad de la rhEPO estaba hidroxilada (Figura 5), principalmente en la segunda prolina del motivo SPP, como se muestra por EM/EM (Figura 6). Sorprendentemente, mientras que la rhEPO producida en líneas de musgo con ablación p4h2, p4h3, p4h4, p4h5 o p4h6, respectivamente, se hidroxiló en niveles similares a los encontrados en la planta parental, la ablación exclusiva del gen p4h1 fue suficiente para abolir completamente la hidroxilación de prolil en el biofarmacéutico (Figura 5). La tasa de crecimiento, la productividad de rhEPO y la secreción de la proteína al medio de cultivo no se vieron afectadas en estas plantas mutantes de eliminación en comparación con la línea parental 174.16 (datos no mostrados). Por lo tanto, se mostró la falta total de Hyp en rhEPO producida por las líneas Ap4h1.

Debe observarse que ni el análisis de secuencia ni la localización intracelular de las siete proteínas revelaron qué genes fueron responsables por la O-glicosilación adversa de rhEPO. Sorprendentemente, solo la ablación de cada uno de los siete genes reveló a el gen responsable.

Experimento 6: Verificación de la actividad enzimática de P4H1

Para verificar la actividad enzimática de P4H1 en la prolil-hidroxilación, este gen se expresó de forma ectópica en la línea mutante de eliminación de Ap4h1 #192. La sobreexpresión fuerte de la transcripción de p4h1 se confirmó en las líneas resultantes mediante PCR-TR semicuantitativa (Figura 4b). Se analizaron cinco líneas de sobreexpresión de p4h1 (p4h1OE) para determinar la rhEPO-Pro-hidroxilación. Los resultados de LC-ESI-EM revelaron que la sobreexpresión de p4h1 restableció la hidroxilación de prolil de la rhEPO producida por el musgo (Figura 7). La proporción de rhEPO hidroxilada, así como el patrón de hidroxilación, se alteraron por los niveles elevados de expresión del gen. Mientras que en la planta parental 174.16, con la actividad de P4H1 nativa, aproximadamente la mitad de rhEPO mostró Hyp (Figura 5), casi toda la rhEPO se oxidó en los sobreexpresores de p4h1 (Figura 7). Además, en estos sobreexpresores no solo una prolina en el motivo SPP fue hidroxilada como se ve en la planta parental 174.16, sino que ambas prolinas contiguas se convirtieron en Hyp (Figura 7). Por lo tanto, se demostró que la expresión de p4h1 es esencial y suficiente para la prolil hidroxilación de la rhEPO producida por el musgo, y que su nivel de expresión influye en su actividad enzimática, no solamente en la proporción de moléculas de proteínas hidroxiladas sino también en el patrón de hidroxilación

Experimento 7: Análisis del péptido N-terminal de rhEPO APPRLICDSRVL para la prolil-hidroxilación en P. patens

Como la hidroxilación y la arabinosilación de la mucina epitelial humana MUC1 en la secuencia APP se reportó sobre la expresión en N. benthamiana (Pinkhasov et al., Plant Biotechnol. J., 9:991-1001, 2011), el péptido N-terminal de rhEPO APPRLICDSRVL se analizó para determinar la prolil-hidroxilación en P. patens. Después de la digestión quimotríptica de rhEPO derivada de la planta parental 174.16, la planta mutante de eliminación p4h1 #192 y el sobreexpresor p4h1OE-451, los análisis de LC-ESI-EM revelaron que este péptido no estaba hidroxilado en ninguno de los casos (Figura 8), lo que demuestra que la mera presencia de residuos de prolina contiguos precedidos por una alanina no es suficiente para ser reconocida por las prolil-hidroxilasas de musgo.

Experimento 8: Comparación filogenética de las secuencias de prolil-4-hidroxilasas de plantas.

Se generó un alineamiento de secuencia múltiple a partir de las secuencias de aminoácidos de las prolil-4-hidroxilasas de diferentes plantas (por ejemplo, Populus, Oryza, Arabidopsis, Physcomitrella) utilizando el programa Jalview (MAFFT Versión 5.0). Se calculó un árbol filogenético con QuickTree (Howe et al., Bioinformatics, 18: 1546-1547, 2002). El árbol filogenético se muestra en la Figura 9.

Métodos relacionados con los experimentos anteriores

Generación de las construcciones de plásmidos

Los ADNc correspondientes a los siete homólogos de P4H identificados en Physcomitrella patens se amplificaron utilizando a los cebadores enlistados en la Tabla 3 (véase más adelante).

Los ADNc se clonaron en pJET 1.2 (CloneJETTM PCR CloningKit, Fermentas, St Leon-Rot, Alemania). Posteriormente, las secuencias codificantes de p4h que incluyen una porción de la 5' UTR se clonaron en el plásmido mAV4mcs (Schaaf et al., Eur. J. Cell Biol., 83:145-152, 2004) usando los sitios XhoI y BglII que dan lugar a proteínas de fusión en el N-terminal P4H-GFP bajo el control del promotor 35S del virus de mosaico de la coliflor (CaMV). El mAV4mcs no modificado se utilizó como control para la localización citoplasmática y nuclear. Como control positivo para la localización al RE, se tomó pASP-GFP-KDEL (Schaaf et al., Eur. J. Cell Biol., 83:145-152, 2004).

Para generar las construcciones de eliminación de p4h, los fragmentos de ADN genómico de P. patens correspondientes a las prolil-4-hidroxilasas se amplificaron utilizando a los cebadores enlistados en la Tabla 3 y se clonaron en pCR®4-TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) o en pETBlue-1 AccepTor™ (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El fragmento genómico pTOPO_p4h1 se linearizó primero usando BstBI y SacI, eliminando así un fragmento de 273 pb, y se recircularizó ligando los sitios de restricción BamHI y HindIII que contienen oligonucleótidos de doble hebra. Estos sitios se utilizaron para la inserción de un casete de resistencia a la zeomicina (casete-zeo). El casete-zeo se obtuvo de pUC-zeo (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012) por digestión con HindIII y BamHI. Para la construcción p4h5 KO, se cortó un fragmento de 1487 pb del pTOPO_p4h5 utilizando sitios Sail y BglII y se reemplazó por sitios de restricción que contienen oligonucleótidos de doble hebra para BamHI y HindIII. Estos sitios de restricción se utilizaron para la inserción del casete-zeo obtenido del plásmido pUC-Zeo. La construcción p4h2 KO se clonó en el pETBlue-1 AccepTor™, y el casete-zeo reemplazó un fragmento genómico de 270 pb eliminado por digestión con KpnI y HindIII. El casete-zeo obtenido de pRT101-zeo (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012) por digestión con HindIII se insertó en el pET_p4h3 y las construcciones pTOPO_p4h4 KO digeridas con la misma enzima, reemplazando 990 pb y un fragmento genómico de 1183 pb, respectivamente. Para la construcción p4h6 KO, el casete-zeo se obtuvo del pUC-zeo por digestión con HindIII y SacI y se insertó en pTOPO_p4h6, reemplazando un fragmento genómico de 1326 pb. En todas las construcciones de KO, las regiones homólogas al gen diana tenían aproximadamente el mismo tamaño en ambos extremos del casete de selección, comprendiendo entre 500 y 1000 pb.

Para la construcción de sobreexpresión, la secuencia codificante para p4h1 y 79 pb del 5' UTR se amplificaron a partir de ADNc de musgo silvestre WT con los cebadores enlistados en la Tabla 3, y se clonaron bajo el control del promotor 35S y el terminador nos en el vector mAV4mcs (Schaaf et al., Eur. J. Cell Biol., 83:145-152, 2004). Para este propósito, el gen para GFP se eliminó del vector por digestión con Ecl136II y SmaI y la posterior religación del vector. El ADNc de p4h1 se insertó en el vector a través de los sitios de restricción XhoI y BglII. La construcción de sobreexpresión de p4h1 se linearizó mediante digestión con EcoRI y PstI y se transfirió a la línea Ap4h1 No.192 junto con pUC 18 sul (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012) para la selección de sulfadiazina.

Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados y sus correspondientes SEQ ID Nos.

(continuación)

(continuación)

Material vegetal y procedimiento de la transformación

Se cultivó a Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch & Schimp como se describió previamente (Frank et al., Plant Biol., 7:220-227, 2005). Se demostró que la rhEPO producida por musgo estaba hidroxilada en el motivo consenso de prolil-hidroxilación SPP (aminoácidos 147-149), por lo tanto, la línea de P. patens 174.16 productora de rhEPO (Weise et al., Plant Biotechnol. J., 5:389 -401, 2007) se utilizó como la línea parental para la generación de la eliminación de p4h y la línea Ap4h1 #192 se utilizó para la generación de líneas de sobreexpresión de p4h1. En estas líneas de musgo, los genes a1,3 fucosiltransferasa y (31,2 xilosiltransferasa están interrumpidos (Koprivova et al., Plant Biotechnol. J., 2:517-523, 2004). Se utilizó musgo de tipo silvestre para los experimentos de localización subcelular con P4H-GFP.

El aislamiento de protoplastos y la transfección mediada por PEG se realizó como se describió previamente (Frank et al., Plant Biol., 7:220-227, 2005; Rother et al., J. Plant Physiol., 143:72-77, 1994). La selección de mutantes se realizó con ZeocinTM (Invitrogen) o sulfadiazina (Sigma) como se describió anteriormente (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012).

Para la producción de rhEPO, se cultivó a P. patens como se describió anteriormente (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861,2012).

Cribado de plantas transformadas

El cribado de plantas transformadas estables se realizó mediante PCR directa (Schween et al., Plant Mol. Biol. Rep., 20: 43-47, 2002) con ADN genómico extraído como se describió anteriormente (Parsons et al., Plant Biotechnol J., 10 851-861, 2012). A partir de estos extractos, se utilizaron 2 pl como templado para PCR, utilizando los cebadores enlistados en la Tabla 3 para verificar la integración 5' y 3' de la construcción mutante de eliminación en el locus genómico correcto y para verificar la integración de la construcción de sobreexpresión en el genoma del musgo, respectivamente. Las plantas, que mostraron los productos de PCR esperados, se mutantes por eliminación putativas o líneas de sobreexpresión, respectivamente, y posteriormente se analizaron. La ausencia de los transcritos de p4h en las líneas KO se analizó mediante PCR-TR como se describió anteriormente (Parsons et al., Plant Biotechnol. J., 10:851-861, 2012) utilizando a los cebadores enlistados en la Tabla 3. La expresión de p4h1 en las líneas de sobreexpresión se analizó mediante PCR-TR semi-cuantitativa. Para este propósito, el ADNc equivalente a 150 ng de ARN se amplificó con 24, 26 y 28 ciclos utilizando a los cebadores p4h1 enlistados en la Tabla 3. Los cebadores para la proteína de unión a la caja TATA expresada constitutivamente, TBP fwd y TBP rev (Tabla 3) se utilizaron como controles.

Análisis de proteínas y péptidos

Las proteínas solubles totales se recuperaron de 160 ml del sobrenadante de cultivo de 16 días de edad por precipitación con ácido tricloroacético al 10% (p/v) (TCA, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania) como se describe (Büttner-Mainik et al., Plant Biotechnol. J., 9:373-383, 2011). El sedimento se resuspendió en una muestra de tampón de carga Laemmli (Biorad, Munich, Alemania) y la separación electroforética de proteínas se llevó a cabo en geles de SDS-poliacrilamida al 12% (Ready Gel Tris-HCl, BioRad) a 150 V durante 1 h en condiciones no-reductoras.

Para el análisis de los péptidos, las proteínas en los geles se tiñeron con solución de tinción de proteínas PageBlue® (Fermentas) y las bandas correspondientes a 25 kDa se cortaron, se S-alquilaron y se digirieron con tripsina o con quimotripsina (Grass et al., Anal. Bioanal. Chem. 400:2427-2438, 2011). El análisis por cromatografía líquida de fase inversa acoplada a la espectrometría de masas por ionización por electroaspersión en un instrumento Q-TOF (LC-ESI-EM y EM/EM) se realizó como se describió anteriormente (Grass et al., Anal. Bioanal. Chem. 400:2427-2438, 2011).

La cuantificación de la rhEPO producida por el musgo se realizó utilizando un kit de ELISA hEPO Quantikine IVD (cat. No. DEP00, R&D Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Descripción detallada de las figuras

La Figura 1 muestra la comparación de la secuencia de las proteínas putativas prolil-4-hidroxilasas (P4Hs) de P. patens, Arabidopsis thaliana P4H1 (AT2G43080.1), Nicotiana tabacum P4H (BAD07294) y la subunidad a (I) del colágeno humano-P4H (NP_000908). Los aminoácidos que son idénticos en al menos 5 secuencias están marcados con guiones por encima de las posiciones respectivas. Los residuos conservados responsables de la unión de Fe2+ y el grupo carboxilo C-5 del 2-oxoglutarato están marcados con un asterisco debajo de las posiciones respectivas. No se muestran los primeros 147 aminoácidos de la subunidad a (I) humana, que no se alinearon con ninguna otra secuencia analizada.

La Figura 2 muestra la localización subcelular in vivo de los homólogos de P4H de P. patens. La fluorescencia de las proteínas de fusión P4H-GFP en los protoplastos de P. patens se observó por microscopía confocal de 3 a 14 días después de la transfección. Las imágenes obtenidas para PpP4H1-GFP, PpP4H3-GFP y PpP4H4-GFP se toman como ejemplo del patrón de fluorescencia que se observó para todos los homólogos. (a-c) PpP4H1-GFP, (d-f) PpP4H3-GFP, (g-i) PpP4H4-GFP, (j-1) ASP-GFP-KDEL como control para la localización al RE, (m-o) GFP sin ningún péptido señal como control para la localización en el citosol. (a, d, g, j y m) secciones ópticas individuales que emiten fluorescencia GFP (494-558 nm), (b, e, h, k y n) fusión de autofluorescencia de la clorofila (601-719 nm) y fluorescencia GFP, (c, f, i, 1 y o) transmitieron imágenes de luz. Las flechas indican la membrana del núcleo celular.

La Figura 3 muestra la representación esquemática de las construcciones mutantes de eliminación de p4h. Los exones se presentan como rectángulos y los intrones como líneas. Los rectángulos blancos representan las regiones de los genes utilizados para las construcciones y los rectángulos rayados representan el casete de selección. Los sitios de restricción utilizados para insertar el casete de selección están marcados como SR. Las flechas representan los oligonucleótidos utilizados para la detección de la integración genómica.

Las Figuras 4a y 4b muestran el análisis de expresión del gen p4h en líneas de musgo recombinantes. La Figura 4a es el análisis de expresión de p4h1, p4h2, p4h3, p4h4, p4h5 y p4h6, respectivamente, en las plantas mutantes de eliminación putativas. Como control para el aislamiento eficiente del ARNm, la PCR-TR se realizó con cebadores correspondientes al gen expresado constitutivamente para la proteína ribosomal L21 (control). La Figura 4b es el análisis de expresión de p4h1 en el musgo silvestre (WT), la línea productora de rhEPO 174.16 y cinco líneas de musgo putativas que sobreexpresan a p4h1 (No. 12, 16, 32, 41 y 45). La PCR-TR semicuantitativa se realizó con un número de ciclos crecientes (24, 26 y 28) y cebadores específicos para p4h1, así como un control con cebadores correspondientes al gen expresado constitutivamente que codifica para la proteína de unión a la caja TATA TBP.

Las Figuras 5a y 5b muestran el análisis espectrométrico de masas de la hidroxilación de rhEPO producido por el musgo. La Figura 5a muestra la cromatografía líquida de fase inversa de péptidos trípticos mostrando picos de péptido oxidado y no oxidado EAISPPDAASAAPLR (144-158) derivado de rhEPO producido en las líneas de musgo 174.16 (planta parental de control), Ap4h1 No.192, Ap4h2 No. 6, Ap4h3 No.21, Ap4h4 No.95, Ap4h5 No.29 y Ap4h6 No.8. Se muestran cromatogramas iónicos seleccionados para los iones doblemente cargados de péptido no oxidado (m/z = 733.4) y oxidado (m/z 741.4). La Figura 5b muestra espectros de suma de banda ancha para el péptido 144-158 que muestra la ausencia de la prolil-hidroxilación (Pro) en la línea Ap4h1 No.192 y la presencia del péptido hidroxilado (Hyp) en la línea Ap4h4 No.95, como ejemplo. El pico entre "Pro" e "Hyp" es el péptido coeluyente incidentalmente YLLEAK. Las desviaciones del tiempo de retención son artefactos técnicos.

La Figura 6 muestra el análisis EM/EM del péptido EAISPPDAASAAPLR (144-158) de rhEPO producido por el musgo. El único espectro (Figura 6a) se deriva del péptido no oxidado (m/z 933.45) que muestra fielmente la secuencia parcial SPPDAAS. El otro espectro (Figura 6b) se derivó de uno de los dos péptidos oxidados (m/z 941.45). Dando la secuencia parcial aparente SPLDAAS, que significa SPODAAS como Hyp (O) y Leu isobárico. Un segundo pico ligeramente más pequeño de m/z 941.45 eluyó un poco más tarde y probablemente surgió de la hidroxilación de la otra prolina del motivo de hidroxilación SPP.

La Figura 7 muestra el efecto de la sobreexpresión del gen de prolil-hidroxilasa p4h1. La comparación de los cromatogramas de fase inversa que muestran el tiempo de retención para el péptido rhEPO producido por el musgo EAISPPDAASAAPLR (144-158) y sus versiones hidroxiladas en la línea de musgo mutante por eliminación Ap4h1 No.192 (Figura 7a) y en la línea de sobreexpresión p4hSE No. 32 (Figura 7b). Los espectros de cada pico se muestran debajo de los cromatogramas. En la línea de sobreexpresión, se encontraron el péptido doblemente hidroxilado y dos isómeros individualmente hidroxilados -uno que coeluye con el péptido parental-.

La Figura 8 muestra el análisis del estado de hidroxilación del péptido N-terminal de rhEPO producida por el musgo. La secuencia N-terminal APP también puede constituir una secuencia diana para la prolil-hidroxilasa de el musgo. Por lo tanto, el extremo N-terminal de rhEPO producida por el musgo se analizó por cromatografía líquida de fase inversa acoplada a espectrometría de masas por ionización por electropulverización (LC-ESI-EM) de péptidos quimiotrípticos. El cribado de las masas del péptido no oxidado y el péptido oxidado APPRLICDSRVL (1-12) de rhEPO producida en la línea de control del musgo 174.16, la mutante por eliminación Ap4h1 No.192 y la línea de sobreexpresión p4h1 SE No. 45 no revelaron ninguna indicación de hidroxilación de Pro en este péptido.

Por lo tanto, los experimentos muestran la identificación y la caracterización funcional de un gen vegetal responsable de la prolil hidroxilación no humana de la eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) producida en biorreactores de musgo. La ablación dirigida de este gen abolió la prolil hidroxilación no deseada de rhEPO y, por lo tanto, allana el camino para las proteínas humanas recombinantes producidas en un sistema basado en plantas humanizado mediante la glico-ingeniería.

La figura 9 muestra el árbol filogenético de las secuencias de aminoácidos de diferentes prolil-4-hidroxilasas de plantas. Se muestra que los diferentes genes de prolil-4-hidroxilasa de Physcomitrella no están separados filogenéticamente de otras plantas. Más bien, el análisis de secuencia muestra que las diferentes prolil-4-hidroxilasas de algas verdes, musgos y plantas de semillas son muy similares entre sí y también más similares entre sí que dentro de una y la misma especie. Por lo tanto, es obvio para un experto en la técnica que el procedimiento descrito no solo funciona en Physcomitrella sino que también en otras plantas.

La proteína humana recombinante puede ser cualquier proteína que se pretenda producir en un sistema basado en plantas sin prolil hidroxilación adversa. La invención divulgada no está restringida incluso a proteínas humanas recombinantes y también puede utilizarse en la fabricación de proteínas de otras especies, como de animales o plantas.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de fabricación de una proteína recombinante que comprende los pasos de

- proporcionar células de Physcomitrella patens que comprende una ablación de la expresión del gen prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o que comprende una regulación negativa de la expresión por amiARN u oligonucleótidos antisentido del gen prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta de acuerdo con la SEQ ID NO: 1,

- administrar un gen que codifica para la proteína recombinante en dichas células, y

- cultivar dichas células para la expresión del gen que codifica para la proteína recombinante.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de eritropoyetina humana recombinante (rhEPO).

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la ablación de la expresión del gen de prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta comprende la eliminación del gen de prolil-4-hidroxilasa, introduciendo mutaciones con técnicas tales como tecnologías de nucleasa, tratamiento con rayos X, mutagénesis-EMS o inserción de ADN-T o regulación negativa que comprende técnicas tales como interferencia de ARN y en donde la proteína recombinante tiene una falta de prolil hidroxilación en al menos un sitio de prolil hidroxilación específico de plantaS, causada por la ablación de la expresión de gen prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína recombinante tiene prolil hidroxilación específica para humanos, causada por la ablación de la expresión del gen de prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Células de Physcomitrella patens que comprenden una ablación de la expresión del gen prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o que comprenden una regulación negativa de la expresión por amiARN u oligonucleótidos antisentido del gen prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

6. Células de Physcomitrella patens de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la ablación de la expresión del gen de prolil-4-hidroxilasa 1 endógeno de la planta comprende la eliminación del gen de prolil-4-hidroxilasa, introduciendo mutaciones con técnicas tales como tecnologías de nucleasa, tratamiento con rayos X, mutagénesis-EMS o inserción de ADN-T o regulación negativa que comprende técnicas tales como interferencia de ARN

7. El uso de células de Physcomitrella patens según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 para la producción de una proteína recombinante.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la proteína recombinante carece de prolil hidroxilación en al menos un sitio de prolil hidroxilación específico de plantas.