JP2016519136A - ヒメツリガネゴケにおけるプロリル−４−ヒドロキシラーゼの改変された発現 - Google Patents

Abstract

本発明の分野は、植物ベースの系における組換えタンパク質の産生のための方法であって、植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む植物ベースの系を準備するステップと、組換えタンパク質をコードする遺伝子を植物ベースの系に送達するステップと、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現のために植物ベースの系を培養するステップとを含む、方法に関する。本発明の分野はさらに、植物ベースの系で産生された組換えタンパク質に関する。植物ベースの系および組換えタンパク質の使用も提供される。

Description

本発明は、植物ベースの系（ｐｌａｎｔ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）における組換えタンパク質の産生のための方法、植物ベースの系で産生された組換えタンパク質、植物ベースの系、および組換えタンパク質の使用に関する。

医薬用タンパク質の組換え産生は、個別化医療のためにだけでなく重要なものである。大半のバイオ医薬品は、哺乳動物細胞培養で産生されているが、市場に出された最初の製品とともに植物産生医薬品（ＰＭＰ：ｐｌａｎｔ−ｍａｄｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の勢いが増している（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔａｌｉｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｅｌｅｌｙｓｏ．ａｓｐ）。植物の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、ヒトのものと類似しているが、わずかな差がＰＭＰの品質、安全性および効果に影響を及ぼす可能性がある（ＷａｌｓｈおよびＪｅｆｆｅｒｉｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２４：１２４１〜１２５２ページ、２００６年）。高等真核生物の最も一般的なＰＴＭの１つは、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）によって触媒されるプロリルヒドロキシル化である。標的タンパク質上のＰ４Ｈ配列認識部位がヒトと植物とでは異なっていることから、非ヒトＰＴＭが起こる。さらに、植物で結果として生じるヒドロキシプロリンは、Ｏ−グリコシル化のためのアンカーであり、このＯ−グリコシル化もヒトのＯ−グリコシル化とは異なる。

植物ベースの系は、組換えバイオ医薬品用の代替的な産生プラットフォームとして受け入れられつつある（ＰａｕｌおよびＭａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８：５８〜６７ページ、２０１１年）。ヒトと植物の間の翻訳後修飾におけるわずかな差に関しては、ＰＭＰのアスパラギン（Ｎ）−結合型グリコシル化のヒト化においてかなりの進歩を遂げた（Ｋａｒｎｏｕｐら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５：９６５〜９８１ページ、２００５年；Ｐｉｎｋｈａｓｏｖら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、９：９９１〜１００１ページ、２０１１年；Ｗｅｉｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、５：３８９〜４０１ページ、２００７年、Ｃｏｘら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２４：１５９１〜１５９７ページ、２００６年）。さまざまな植物系において、植物特異的な免疫原性β１，２−キシロースおよびα１，３−フコース残基のコアＮ−グリカンへの付着が無効になっていた（Ｃｏｘら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２４：１５９１〜１５９７、２００６年；Ｋｏｐｒｉｖｏｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、２：５１７〜５２３ページ、２００４年；Ｓｔｒａｓｓｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、５６１：１３２〜１３６ページ、２００４年；Ｓｏｕｒｒｏｕｉｌｌｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、６：７０２〜７２１ページ、２００８年）。さらに、最近、ｒｈＥＰＯのＮ−グリカンにあるルイスＡエピトープの排除が報告された（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１、２０１２年）。ＰＭＰにおけるＮ−グリコシル化のさらなるヒト化が、ヒトβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂａｋｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０３：７５７７〜７５８２ページ、２００６年；Ｈｕｅｔｈｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．（Ｓｔｕｔｔｇ．）、７：２９２〜２９９ページ、２００５年）および工学的シアリル化に必須の付加的な異種酵素の発現によって実現された（Ｃａｓｔｉｌｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８５：１５９２３〜１５９３０ページ、２０１０年）。Ｎ−グリコシル化のヒト化にこうした進歩があるにもかかわらず、Ｏ−グリコシル化の差が製品品質に影響を及ぼす可能性がある。植物Ｏ−グリコシル化は、典型的なヒトのムチン型Ｏ−グリコシル化（Ｇｏｍｏｒｄら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、８：５６４〜５８７ページ、２０１０年）とは明らかに異なり、哺乳動物において抗体形成を誘導する（Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：７９３２〜７９４０ページ、２００５年；Ｙａｔｅｓら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、６：１３１〜１３９ページ、１９９６年）。バイオ医薬品の免疫原性は、製品の効力を低下させる場合もあり、患者にとって潜在的なリスクである（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、１：４５７〜４６２ページ、２００２年）。そのような有害な影響により、バイオ医薬品のための産生宿主として植物を広く使用することが妨げられている。植物のＯ−グリコシル化のための主要なアンカーは、４−トランス−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）であるが（Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７：３１９〜３２３ページ、２００１年）、哺乳動物ではＨｙｐにさらなる改変は起こらない（ＧｏｒｒｅｓおよびＲａｉｎｅｓ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４５：１０６〜１２４ページ、２０１０年）。Ｈｙｐは、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）によってプロリンのγ炭素のヒドロキシル化により常に翻訳後に合成されるが、認識部位が哺乳動物と植物では異なる（ＧｏｒｒｅｓおよびＲａｉｎｅｓ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４５：１０６〜１２４ページ、２０１０年）。Ｈｙｐは、植物細胞壁ならびに動物およびヒトの細胞外基質の重要な構成成分である。現時点において、Ｈｙｐは、哺乳動物において最も豊富なタンパク質の１つであるコラーゲンの構造の安定化に重要な役割を果たしており、トリペプチドＰＰＧの第２のプロリンは、コラーゲンＰ４Ｈによって通常ヒドロキシル化される。植物において、Ｈｙｐ残基は、植物の細胞外基質および細胞壁に最も豊富なタンパク質であるヒドロキシプロリンが豊富な糖タンパク質（ＨＲＧＰ）のＯ−グリコシル化の付着部位である。ＨＲＧＰは、エクステンシン、プロリンが豊富な糖タンパク質およびアラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）を含む（Ｋｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７：３１９〜３２３ページ、２００１年；ＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＬａｍｐｏｒｔ、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５：１５７〜１７２ページ、１９９４年；Ｓｈｐａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：１１２７２〜１１２７８ページ、２００１年）。植物細胞壁タンパク質のプロリルヒドロキシル化およびそれに続くグリコシル化が、生長、分化、発生およびストレス適応に非常に重要である（Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３２：１４０１〜１４０３ページ、２０１１年；Ｌａｍｐｏｒｔら、Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌ．、１６９：４７９〜４９２ページ、２００６年）。

植物におけるＨｙｐ−結合Ｏ−グリコシル化に関する標的モチーフ、いわゆる、糖モジュール（ｇｌｙｃｏｍｏｄｕｌｅ）が定義され、実証された（ＫｉｅｌｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＬａｍｐｏｒｔ、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５：１５７〜１７２ページ、１９９４年；Ｓｈｐａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：１１２７２〜１１２７８ページ、２００１年）。これらから、植物におけるプロリルヒドロキシル化を予測するための共通モチーフ［Ａ／Ｓ／Ｔ／Ｖ］−Ｐ_{（１，４）}−Ｘ_{（０，１０）}−［Ａ／Ｓ／Ｔ／Ｖ］−Ｐ_{（１，４）}（式中、Ｘはあらゆるアミノ酸であり得る）が導き出された（Ｇｏｍｏｒｄら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、８：５６４〜５８７ページ、２０１０年）。ヒトプロテオームのコンピュータによる分析によると、すべてのタンパク質のうちのおよそ３０％がこのモチーフを含有することから、植物で発現される場合、これは、非ヒトプロリルヒドロキシル化およびそれに続くＯ−グリコシル化の候補である（Ｇｏｍｏｒｄら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、８：５６４〜５８７ページ、２０１０年）。このため、ＰＭＰの植物に典型的な有害なプロリルヒドロキシル化およびアラビノシル化も報告された（Ｋａｒｎｏｕｐら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５：９６５〜９８１ページ、２００５年；Ｐｉｎｋｈａｓｏｖら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、９：９９１〜１００１ページ、２０１１年；Ｗｅｉｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、５：３８９〜４０１ページ、２００７年）。一方、ＰＭＰのＨｙｐ−Ｏ−グリコシル化の人為的な導入が、バイオ医薬品の血清半減期を延ばすためのペグ化の代替手段として提案された（Ｘｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９７：９９７〜１００８ページ、２００７年；米国特許出願第２００６００２６７１９号）。しかしながら、非ヒトプロリルヒドロキシル化はタンパク質の天然配列を変えるだけでなく、Ｏ−グリカンのためのアンカーとしても働き、ひいては、免疫原性をもつ可能性もある。したがって、アンカーＨｙｐの排除がＰＭＰの有害なＯ−グリコシル化を回避するための安全な唯一の方法である。

３つの文献ＥＰ２３６０２６１Ａ１、Ｘｕら（ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１１：６９ページ、２０１１年）およびＳｔｅｉｎら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１０：２６４０〜２６４５ページ）は、それぞれさまざまな植物系（例えば、トウモロコシ、タバコ）におけるコラーゲン産生について論じている。哺乳動物またはヒト特異的プロリルヒドロキシル化は、外因性の哺乳動物／ヒトプロリル４ヒドロキシラーゼの発現によって達成される。したがって、３つの文献すべてにおいて開示されている方法には、外因性の哺乳動物／ヒトプロリル４ヒドロキシラーゼの発現が必要とされる。

植物のうち、コケであるヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）は、相同組換えによる高精度な標的遺伝子操作に対して他にない可能性がある（例えば、Ｓｔｒｅｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５：４３６８〜４３７３ページ、１９９８年；Ｋｏｐｒｉｖｏｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、２：５１７〜５２３ページ、２００４年）。さらに、世界中の主要なバイオ医薬品であるｒｈＥＰＯを含むいくつかのＰＭＰは、コケバイオリアクター（ｍｏｓｓ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）で産生されている（ＤｅｃｋｅｒおよびＲｅｓｋｉ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、３１：４５３〜４６０ページ、２０１２年）。その市場取引高は、年間１００億ユーロを超える。ＥＰＯは赤血球形成を刺激する高度にグリコシル化されたペプチドホルモンである。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で産生された組換えｈＥＰＯは、腎臓病患者やがん患者の貧血の予防または治療のために使用されるが、不正なドーピング行為に悪用される可能性がある。糖改変型（ｇｌｙｃｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）のＥＰＯ（アシアロ−ＥＰＯ）は、造血活性はないが、脳卒中および付加的な低酸素ストレス後の神経および組織保護機能を有する安全な薬物として働くことができる（Ｅｒｂａｙｒａｋｔａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１００：６７４１〜６７４６ページ、２００３年）。コケバイオリアクターにおけるＮ−グリコシル化アシアロ−ＥＰＯの適切な産生について最近報告がなされた（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）。しかしながら、植物由来のｒｈＥＰＯはモチーフＳＰＰ内（１４７〜１４９）でヒドロキシル化されており（Ｗｅｉｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、５：３８９〜４０１ページ、２００７年）、したがって、患者に有害な影響がある可能性もある。

Ｗｅｉｓｅら（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、５：３８９〜４０１ページ、２００７年）およびＰａｒｓｏｎｓら（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）はともに、コケにおけるｒｈＥＰＯの産生および植物特異的フコシル−／キシロシル−／ガラクトシルトランスフェラーゼを標的化することによるＮ−グリカンのグリコシル化パターンのモジュレーションについて論じている。それにより、Ｎ−グリカンにある免疫原性のフコース／キシロース／ガラクトースが除去される。（Ｏ−グリコシル化のアンカーとしての）プロリルヒドロキシル化はこれらの開示の対象ではないため、両文献はＯ−グリコシル化には対処していない。

植物ベースの系で産生された組換えヒトタンパク質のプロリンのヒドロキシル化は、今までのところ未然に防ぐことができない。組換えヒトタンパク質のプロリンがヒドロキシル化されているかどうか、非ヒトまたは植物特異的Ｏ−グリコシル化が存在しているかどうかは、組換えヒトタンパク質の産生後にのみ明らかになる。

本発明の開示の目的は、植物ベースの系を使用した組換えタンパク質の産生のための方法を提供することである。本発明の開示の目的はまた、外因性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を植物ベースの系に導入する必要なく植物ベースの系で産生された組換えタンパク質を提供することであり、この組換えタンパク質は、いかなる非ヒトプロリルヒドロキシル化も含まない。本発明の開示のさらなる目的は、そのような組換えタンパク質の産生に使用される植物ベースの系を提供すること、およびそのような組換えタンパク質の使用を提供することである。

本発明の開示は、植物ベースの系における、プロリルヒドロキシル化を含まないか、またはヒト特異的プロリルヒドロキシル化のみを含む組換えタンパク質の産生のための方法を提供する。本方法は、植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む植物ベースの系を準備するステップと、組換えタンパク質をコードする遺伝子を植物ベースの系に送達するステップと、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現のために植物ベースの系を培養するステップとを含む。医薬品の製造のようなさらなる任意の処理に組換えタンパク質を使用するために、タンパク質の精製が必要条件になることは当業者には自明である。

この方法では、植物ベースの系は、ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含んでもよい。プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ_＿００１７５３１８５のヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子であってもよい。組換えタンパク質は、組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）であってもよい。

本発明の開示はまた、植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む植物ベースの系で産生された組換えタンパク質を提供する。本組換えタンパク質は、上記の方法によって産生される。組換えタンパク質は、非ヒトプロリルヒドロキシル化をまったく含まないことが意図される。またそのようなタンパク質が植物特異的プロリルヒドロキシル化を含まない場合も本発明の開示の範囲内であり、これは、組換えタンパク質の元の種におけるいかなる免疫作用または副作用も回避するために、植物特異的プロリルヒドロキシル化部位の少なくとも１つにおいても、植物特異的プロリルヒドロキシル化が存在しない場合もあることを意味する。

遺伝子発現の調節は、特定の遺伝子産物（タンパク質もしくはＲＮＡ）の産生を上方調節また下方調節するために細胞によって使用される広い範囲のメカニズムを含む。転写の調節は、ｍＲＮＡ産生に影響を及ぼす一方で、翻訳の調節は、タンパク質産生に影響を及ぼす。翻訳後修飾であっても、遺伝子発現調節の成功に影響を及ぼす可能性がある。当業者であれば、遺伝子またはタンパク質発現の上方調節または下方調節に適した技術についての関連する知識を有する。したがって、「遺伝子発現の下方調節」という用語は、未改変状態と比較した遺伝子またはタンパク質発現の低下を指す。

本発明の開示による遺伝子のモジュレーションもしくは改変、遺伝子活性または遺伝子発現とは、遺伝子、遺伝子活性もしくは遺伝子発現の活性化または上方調節ならびに下方調節またはノックアウトを指す。遺伝子発現の完全な無効化は、遺伝子のノックアウトによってだけでなく、ヌクレアーゼ技術（ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）による変異またはＸ線処理、ＥＭＳ−突然変異誘発もしくはＴ−ＤＮＡ挿入を受けた集団からの植物変異体の同定によっても達成することができる。下方調節は、ａｍｉＲＮＡまたはその他の従来の技術によって達成することができる。遺伝子の上方調節、下方調節またはノックアウトのための技術は、すべての植物において類似している。

植物ベースの系は、ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含んでもよい。モジュレートされたプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子であってもよい。

本発明の開示の別の実施形態では、本組換えタンパク質は組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）である。

本発明の開示はまた、植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む植物ベースの系を提供する。植物ベースの系は、ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含んでもよく、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子であってもよい。そのような系が組換えタンパク質の産生に使用されてもよく、本組換えタンパク質は、ヒト特異的プロリルヒドロキシル化のみを含むか、または少なくとも１つの植物特異的プロリルヒドロキシル化部位にプロリルヒドロキシル化がない。

この植物ベースの系は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｓｓ Ｓｔｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒにＩＭＳＣ番号４０２１８として寄託されているヒメツリガネゴケ変異体であってもよい。

本発明の開示のさらなる目的は、ヒメツリガネゴケのモジュレートされたプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子の、組換えタンパク質の製造への使用である。

本発明の開示のさらなる目的は、本組換えタンパク質を医薬品またはバイオ医薬品として使用することである。本組換えタンパク質がその他の化合物と組み合わせた医薬品の一部であってもよいことも本発明の開示の範囲内であることが、当業者には自明である。

ヒメツリガネゴケの推定上のプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＰ４Ｈ１（ＡＴ２Ｇ４３０８０．１）、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）Ｐ４Ｈ（ＢＡＤ０７２９４）およびヒトコラーゲン−Ｐ４Ｈのα（Ｉ）サブユニット（ＮＰ＿０００９０８）のタンパク質配列の比較を示す図である。

ヒメツリガネゴケＰ４Ｈホモログのインビボにおける細胞内局在を示す図である。

ｐ４ｈノックアウトコンストラクトの略図である。

組換えコケ株のｐ４ｈ遺伝子の発現分析を示す図である。 図４ａと同じである。

コケ産生ｒｈＥＰＯのヒドロキシル化のマススペクトロメトリー分析を示す図である。 図５ａと同じである。

コケ産生ｒｈＥＰＯからのペプチドＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲ（１４４〜１５８）のＭＳ／ＭＳ分析を示す図である。 図６ａと同じである。

プロリルヒドロキシラーゼ遺伝子ｐ４ｈ１の過剰発現の影響を示す図である。 図７ａと同じである。

コケ産生ｒｈＥＰＯのＮ末端ペプチドのヒドロキシル化状態の分析を示す図である。

異なる植物のプロリル−４−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列の系統樹を示す図である。

本発明の開示は、ヒト特異的プロリルヒドロキシル化のみを含む組換えタンパク質の植物ベースの系における産生のための方法を提供する。本方法は、植物ベースの系を準備するステップであって、植物ベースの系が植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む、系を準備するステップと、組換えタンパク質をコードする遺伝子を植物ベースの系に送達するステップと、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現のために植物ベースの系を培養するステップとを含む。

「植物内在性」という用語は、植物自体のプロリルヒドロキシラーゼ遺伝子を指すものとする。言い換えると、植物ベースの系がヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含む場合、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子もヒメツリガネゴケに由来するものである。これは、付加的な哺乳動物の遺伝子の挿入は意図しない。

ＤＮＡの送達は、細胞および組織へのＤＮＡの導入と解釈されるものとする。任意の既知の最先端の方法、例えば、トランスフォーメーション、微粒子銃、エレクトロポレーションまたはウイルスによる形質導入が使用されてもよい。

培養とは、標準的な研究室設備の中でそれぞれの細胞に対して適切な培地および基質（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）ならびに培養条件を使用した、当該技術分野において既知の培養技術の任意のタイプを意味するものとする。

予想外にも、本方法が、ヒト特異的プロリルヒドロキシル化のみを含む可能性のある組換えタンパク質を明らかにしたことが示され、これは、あらゆる植物特異的プロリルヒドロキシル化を排除することができることを意味する。

この方法では、植物ベースの系は、ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含んでもよい。プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子であってもよい。組換えタンパク質は、組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）であってもよい。

本発明の開示はまた、上記の方法に係る植物ベースの系で産生された組換えタンパク質を提供する。したがって、植物ベースの系は、植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む。この組換えタンパク質は、ヒト特異的プロリルヒドロキシル化のみを含んでもよく、または少なくとも１つの植物特異的プロリルヒドロキシル化部位において植物特異的プロリルヒドロキシル化を有さないものとする。

植物ベースの系とは、植物細胞または植物細胞由来の細胞を指す。ノックアウト対立遺伝子を含む植物ベースの系とは、植物ベースの系が遺伝子操作されることにより、遺伝子の野生型対立遺伝子が人工コンストラクトによって置換されることを意味するものとする。それにより、それぞれの遺伝子の発現を、下方調節するか、または完全に無効にすることができる。１つのｐ４ｈ遺伝子の下方調節でも十分であることが示されたことに留意されたい。

遺伝子改変前の植物ベースの系は、野生型または変異体であってもよい。本発明の開示の趣旨の範囲内の「野生型」配列とは、自然界において一般的な非変異型の遺伝子または野生型の表現型をもたらすために必要とされる対立遺伝子を指す。野生型の表現型は、自然界または天然生育集団において最も一般的な形態または表現型である。

組換えタンパク質は、分子クローニングを使用して複数のソースからの遺伝物質を合わせて、そうでなければ生物中で見出されない配列を作り出すことにより生じたＤＮＡ配列に由来する。例えば、組換えヒトタンパク質は、複数のソースからの遺伝物質によって改変されたヒトＤＮＡ配列由来のものである。

ヒト特異的プロリルヒドロキシル化とは、組換えヒトタンパク質が植物特異的プロリルヒドロキシル化を含まないことを意味するものとする。植物特異的プロリルヒドロキシル化は、植物のモジュレートされていない酵素によって行われるプロリンのヒドロキシル化である。したがって、組換えヒトタンパク質が植物ベースの系で発現される場合、植物の酵素がプロリンを植物特異的な様式でヒドロキシル化することになり、これが、組換えヒトタンパク質の非ヒトＯ−グリコシル化を引き起こす。このように、植物特異的プロリルヒドロキシル化の排除には、有害なＯ−グリコシル化が回避されるという利点がある。それゆえに、植物ベースの系で産生される組換えヒトタンパク質は、糖鎖工学によりヒト化されてもよい。

人体にとってＯ−グリコシル化タンパク質が非常に重要であることを考慮すると、この翻訳後修飾が植物ベースの系で産生された組換えヒトタンパク質とそれらの天然ヒト対応物との間にわずかな差しかなくても、関係当局による薬物の認可を妨げることになる。したがって、本発明のアプローチは、組換えヒトタンパク質上の植物特異的Ｏ−グリコシル化の付着部位、ヒドロキシル化プロリン残基を正確に排除することである。

植物ベースの系は、ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含んでもよい。プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子であってもよい。

予想外にも、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５の遺伝子の破壊により、望ましくないプロリルヒドロキシル化を無効にできることが示された。驚くべきことに、これらのノックアウト植物の生長速度、分化、ｒｈＥＰＯ産生力および培養培地へのタンパク質の分泌は、親株と比較して損なわれていなかった。

ヒメツリガネゴケは、野生型または変異型のコケを指すものとする。

本発明の開示の別の実施形態では、本組換えタンパク質は組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）である。

本発明の開示はまた、植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む植物ベースの系を提供し、この場合、植物ベースの系がヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含み、さらに組換えタンパク質の産生ためのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子であり、組換えタンパク質にはいかなる非ヒトプロリルヒドロキシル化も含まれない。

この植物ベースの系は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｓｓ Ｓｔｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒにＩＭＳＣ番号４０２１８として寄託されているヒメツリガネゴケ変異体であってもよい。

本発明の開示のさらなる目的は、本組換えタンパク質を、バイオ医薬品を含む医薬品として、または医薬品の製造のために使用することである。

バイオ医薬品とは、バイオ工学的手段を使用して生産された医薬品である。バイオ医薬品は、例えば、タンパク質（抗体を含む）または核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド）であってもよく、治療目的またはインビボ診断の目的で使用されてもよい。バイオ医薬品は、（遺伝子操作されていない）天然の生物学的ソースからの直接抽出以外の手段によって生産される。例えば、バイオ医薬品は、遺伝学的に改変された植物中で産生することができる。

非ヒトプロリルヒドロキシル化または植物特異的プロリルヒドロキシル化を含まないため、本発明の開示の組換えタンパク質は、バイオ医薬品として使用することができることを意味する。

実験１：ヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）の同定
ヒメツリガネゴケのプロリル−４−ヒドロキシラーゼホモログを同定するために、アラビドプシス・タリアナのＰ４Ｈ１（ＡＴ２Ｇ４３０８０．１）のアミノ酸配列を使用してヒメツリガネゴケのリソースの遺伝子モデル（ｗｗｗ．ｃｏｓｍｏｓｓ．ｏｒｇ）に対してＢＬＡＳＴ（基本的な局所アライメント検索ツール）検索を行った。Ｐ４Ｈ酵素と相同性を有するヒメツリガネゴケゲノムの６つの配列が同定された：Ｐｐ１ｓ８＿１１４Ｖ６．１（ＰｐＰ４Ｈ１）、Ｐｐ１ｓ１９２＿５１Ｖ６．１（ＰｐＰ４Ｈ２）、Ｐｐ１ｓ１９＿３２２Ｖ６．１（ＰｐＰ４Ｈ３）、Ｐｐ１ｓ１７２＿９１Ｖ６．１（ＰｐＰ４Ｈ４）、Ｐｐ１ｓ１２＿２４７Ｖ６．１（ＰｐＰ４Ｈ５）およびＰｐ１ｓ３２８＿２９Ｖ６．１（ＰｐＰ４Ｈ６）。Ｐｐｐ４ｈ２、３および６のｍＲＮＡについての配列情報が完全でなかったため、完全長配列を得るために製造業者のプロトコルに従って５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）−ＰＣＲ（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）を利用した。Ｐｐｐ４ｈ６遺伝子に関して、ｍＲＮＡの選択され得るスプライシング型に対応する２つの異なるｃＤＮＡを増幅した。このｍＲＮＡからは、異なるＮ末端を有する２つのタンパク質変異体が予測され得る（Ｐｐｐ４ｈ６ａおよびＰｐｐ４ｈ６ｂ）。

以下の配列が同定された：
Ｐ４Ｈ１ｃＤＮＡ（Ｐｐ１ｓ８＿１１４Ｖ６．１ 受託番号：ＸＭ＿００１７５３１８５；配列番号１）
GCAAGATCGTCTGATTGCGCGCACGTCGGAGATCGCTTAAAGTGAAGGTTGCATTGCTCTGGCAAGAAGTATTTGCAGGTAGGACGGTAGAGTCTGGATGCGCCAGAGTTGTCGGTTTGGCCTTCTTCGCAAGGGAGAAGAAGTCATGATGCTTGGATTTAGCGAATTCGAAGAGCTGATCCTTGTTTTTCCGTCAGACTGGCAAGGGATGGAGTAATTCTACGAAGCGAGCGCGTCAGGGTTTGGTTTTAGGAAGCTGGGCTGCCACAGACACTTTTGACGATGGGTCCCTCTAGATATGTCATTGTGCTCCTCACATTTGTGACGATCGGCATGGCTGGGGGGGCGTTATTGCAGCTGGCTTTCTTGAAGAAGCTAGAACAAAGTAGTGGAGCTGGGATTTACAATTATAGAAGAGAGATAGGGGAATACGAAAACCAAACATTTGGATCGGGATTGTCCCTTTGGGCTAATGATGAAGATGCGAGAACACTACGTGTTGGACTGGTTAAGCAAGAAGTTATTAGCTGGCAACCCAGAATCATTCTCCTGCACAATTTCCTTAGTGCTGATGAATGTGATCACCTGATAAATCTTGCTCGCCCCAGGCTCGTGAAGTCAACAGTCGTGGATGCAACCACAGGCAAGGGAATCGAGAGTAAGGTTCGAACAAGCACAGGCATGTTCCTTAATGGAAATGACCGCAGACATCACACTATTCAGGCAATCGAAACCCGTATTGCTGCGTATTCTATGGTACCTGTTCAAAATGGGGAGCTCCTCCAAGTTTTACGATATGAATCTGATCAATATTACAAGGCACATCACGACTACTTTTCAGATGAGTTCAATTTAAAAAGGGGTGGGCAACGTGTGGCGACAATGCTTATGTACTTGACCGAGGGGGTCGAGGGAGGCGAAACAATATTTCCGCAGGCTGGAGATAAAGAGTGTAGCTGTGGCGGTGAAATGAAAATCGGCGTCTGTGTGAAACCTAAACGAGGGGATGCTGTCCTGTTTTGGAGCATTAAGCTGGATGGACAAGTTGATCCAACAAGCCTTCATGGTGGATGCAAAGTTTTGTCAGGAGAGAAATGGTCGTCTACCAAATGGATGAGGCAGCGAGCCTTTGATTAGGGTGAACTTTGGATGGTAGGAGCTGTAATCATAGTAGAAGACCAATAATAGCGATTATGCCTCATCATTCCGGAAGCTTTGCGGGCTTTTCCCGATGCATCTAAGAATGTATGTAATGAGCAACTTTGAATACTGTCAGTGATTCGTAACAAGAAAAAAATCGATTTAGTGGTATTGTGGACTTTGAAATGAAGGTTAAGATCACGAAGAGCTTT
Ｐ４Ｈ１ｃＤＮＡに対応する翻訳（配列番号２）
MGPSRYVIVLLTFVTIGMAGGALLQLAFLKKLEQSSGAGIYNYRREIGEYENQTFGSGLSLWANDEDARTLRVGLVKQEVISWQPRIILLHNFLSADECDHLINLARPRLVKSTVVDATTGKGIESKVRTSTGMFLNGNDRRHHTIQAIETRIAAYSMVPVQNGELLQVLRYESDQYYKAHHDYFSDEFNLKRGGQRVATMLMYLTEGVEGGETIFPQAGDKECSCGGEMKIGVCVKPKRGDAVLFWSIKLDGQVDPTSLHGGCKVLSGEKWSSTKWMRQRAFD
Ｐ４Ｈ２ｃＤＮＡ（Ｐｐ１ｓ１９２＿５１Ｖ６．１ 受託番号：ＪＸ９６４７８０；配列番号３）
GTGATGCGTGATCCTGTGCTGCTGAGCGTGGGTTTTACCGACTTTAATCGGGCAAGGGCGTTGATGTTAACTTCTGCATCGTACTGGGAGGTTTGTCTACATCTCCGCGGGAATTTTCTGCGTCTTTTGGTGTGGATCCACAGCATGGCGTTGAGAGATAGAAGATGTAGTCTTATTCTAGCTCTCTTATTACTATCGGGATTACAAGCATTGGGAGCTCGTGTGGAAGACTTGCCTGGTTGGATGGAAGAAATCAATGAGGTGAAGGATGCTGAGGGTGGCGTGATTCAACAAGTTTCTAGGATTGATCCCACTCGTGTCAAGCAGCTTTCGTGGAAACCGCGTGCATTTCTATATTCAAACTTTTTGTCAGATGCAGAGTGTGATCATATGATATCGTTGGCAAAGGACAAGCTGGAGAAGTCAATGGTGGCCGATAATGAATCTGGGAAGAGTGTGAAGAGTGAAATTCGCACTAGCTCAGGTATGTTTTTGATGAAGGGTCAGGATGATATCATATCAAGGATTGAGGATAGGATTGCTGCATGGACCTTTCTACCGAAGGAGAATGGGGAGGCAATCCAGGTCTTGAGGTACCAAGATGGGGAGAAGTATGAGCCACATTTTGATTATTTCCACGATAAGAACAATCAGGCTCTTGGAGGTCACCGCATTGCCACTGTGTTAATGTACCTCTCCGACGTCGTCAAAGGTGGAGAGACAGTATTTCCTTCTTCTGAAGATCGAGGTGGTCCCAAGGATGATTCGTGGTCTGCTTGTGGGAAAACTGGGGTGGCCGTGAAACCAAGGAAAGGCGATGCCCTGCTCTTCTTCAGCCTACACCCCTCTGCAGTTCCAGATGAGTCAAGCTTACACACAGGATGCCCAGTTATCGAAGGGGAGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGATCCATGTTGCTGCATTTGAAAAGCCGCGTCCTAAGAATGGTGCATGTGTAAATGAGGTCGACAGTTGCGAAGAGTGGGCAGCTTATGGGGAATGTCAGAAAAATCCAGCCTACATGGTTGGGACAAAAGAGTGGCCAGGCTATTGCCGGAAAGCATGCCATGTGTGCTAGGTAGGGATATACCGTATTTCTTGGTTGCACTCTGTTGGGTTAGGGTAGGATATTTAATGTATTTGTGTCATCATCTAAGTATTAGGTCAGTTTCCAAACCAAGGAATCAGAGTTGTGGCTTTTGAAGAAGTATTATAGATCTTACGTACTAATTAAAAGGCTTGTGACCCTTGAGATGCACTTTATAAT
Ｐ４Ｈ２ｃＤＮＡに対応する翻訳（配列番号４）
MRDPVLLSVGFTDFNRARALMLTSASYWEVCLHLRGNFLRLLVWIHSMALRDRRCSLILALLLLSGLQALGARVEDLPGWMEEINEVKDAEGGVIQQVSRIDPTRVKQLSWKPRAFLYSNFLSDAECDHMISLAKDKLEKSMVADNESGKSVKSEIRTSSGMFLMKGQDDIISRIEDRIAAWTFLPKENGEAIQVLRYQDGEKYEPHFDYFHDKNNQALGGHRIATVLMYLSDVVKGGETVFPSSEDRGGPKDDSWSACGKTGVAVKPRKGDALLFFSLHPSAVPDESSLHTGCPVIEGEKWSATKWIHVAAFEKPRPKNGACVNEVDSCEEWAAYGECQKNPAYMVGTKEWPGYCRKACHVC
Ｐ４Ｈ３ｃＤＮＡ（Ｐｐ１ｓ１９＿３２２Ｖ６．１ 受託番号：ＪＸ９６４７８１；配列番号５）
CGGCGCTTTGCAACTCCAATTTTGACCAGGCGAAGTGCACTTTGACATCTTGTTGAATGTCCTCTTCTAGAGCATTGAACGGCCCTTCTGTGAACATTTTAAACTATTCAACGGATGCCATTGACAGTCGTGGTTTTTGAAGTTCGAATCCAGAGCCCTCGCCATCAAATCGTTGCAGTAATCCTTGGTGATTTAGCAAGCTCGGGATCACTTCATGGATTTGGGGTCCTTCCTCTGCAGAGGCTGTTAGTACACACACACTGCATCAACTCCTACTGGTCTGGAAGCTTTTGAGGTTGGAAATAGTATGAAAGAGTCCCAGACAATTGGTGTATTGAGTGGAAGAGGGTTGTGAAGTTTGGGCGCTCGACTGAAATGACCTGCGTGGATGTTAGAAAATAAGCCAATTGGTGTTATGTAGAGATTCGTCACAACGCCCTCATTCCTCCAACCCTTAAATGCCTTGCCCTATTTGTGTACTCTCGTGTGCGGGAATGACGCTGTCCTTATACAATATGAAGTCATCGAAAAACAAAGGAAGAAAATGGAATCCTTTTACATACAAGCTCAGTTTGCCACAGGTGCTATTGTGGTGCACAATCTGCCTCTTAGCAGGCTATGCCGCCTCCAATTTCTTCCCCCAGAAAATAGAAGAGGAAGCAATATATCAGCCGTATCGGAAATCGGCTCAGCAAGAAGGGGAATTTCCATTTGGTGAATTCAGTGAAAAAGTGGTGTTAGATCATGGTAGCACTGGGGACAACTTCATCGCTGACATTCCTTTCCAGGTGTTGAGCTGGAAGCCTCGTGCGCTCTTGTATCCGAGATTTGCTAGCAAGGAGCAATGCGAGGCCATCATGAAGCTTGCAAGGACTCGTCTTGCTCCTTCTGCTCTGGCTTTGAGGAAAGGGGAGAGTGAAGACTCAACGAAAGACATCCGAACTAGTTCCGGGACTTTCTTGAGAGCCGACGAAGACACGACGCGGAGTTTGGAGCAAGTTGAAGAGAAGATGGCGAAAGCAACCATGATACCTCGCGAGAATGGAGAGGCTTTCAATGTGTTGAAGTACAATGTGGGACAAAAATACGACTGCCATTATGATGTTTTTGACCCAGCTGAGTATGGACCTCAACCAAGCCAACGGATGGCCTCCTTTCTCTTATATCTATCGGATGTGGAAGAGGGTGGAGAGACCATGTTTCCCTTCGAAAATTTTCAAAACATGAACATAGGCTTTGACTACAAGAAGTGCATTGGAATGAAAGTCAAGCCCCGCCAAGGTGATGCATTGCTTTTCTACTCAATGCATCCTAACGGCACATTTGATAAGAGCGCTCTGCATGGAAGCTGCCCTGTAATCAAAGGCGAGAAATGGGTTGCCACAAAGTGGATTCGCAACACTGACAAATTTTGATCACCACCATGCGAACGTTTTTACGTCCAAAATTAGGACATAGGAATCTGTCAATCAAATTAAAGGACATATCTTTTATATCATTTAAAAATTCTGAAACTGAGAACTCATATGAACACCAGTTGAAACATTCGGGTCAACCGGATTATCGACAT
Ｐ４Ｈ３ｃＤＮＡに対応する翻訳（配列番号６）
MPCPICVLSCAGMTLSLYNMKSSKNKGRKWNPFTYKLSLPQVLLWCTICLLAGYAASNFFPQKIEEEAIYQPYRKSAQQEGEFPFGEFSEKVVLDHGSTGDNFIADIPFQVLSWKPRALLYPRFASKEQCEAIMKLARTRLAPSALALRKGESEDSTKDIRTSSGTFLRADEDTTRSLEQVEEKMAKATMIPRENGEAFNVLKYNVGQKYDCHYDVFDPAEYGPQPSQRMASFLLYLSDVEEGGETMFPFENFQNMNIGFDYKKCIGMKVKPRQGDALLFYSMHPNGTFDKSALHGSCPVIKGEKWVATKWIRNTDKF
Ｐ４Ｈ４ｃＤＮＡ（Ｐｐ１ｓ１７２＿９１Ｖ６．１ 受託番号：ＸＭ＿００１７７４１１５；配列番号７）
GTTACACAAATTCATCAACCTCGAGGCATTTGGTTCATCAGTGGATCCATTTGTTGGGGTTTCGTGTGGATTGAGCTTGTGGGTTTCCTTCTCCGACTCGGAAATCGCTCCTGACAGAGTTTTCACGGAAGCTTTTGAGGCTGGAAACGGAGAAGGATTATTCCAAAGAATCGGTTTTTTAAAGTGTCACTTATCTTGTTTTCAAGGACAGTCTCAATAACAATTTGGCGCAATTATCTGCAATGATTTACATGGATTGAATCGATTTTCAGTAGCTAAATGTAGGGTCTGCTAGGCCCTCTATATTCCGACCCTTGAGTGAAGACACTGCCTCCCAGGCAGTCCGTGCCTTATTTTAATCTCCTTGCGTGCAAAGAACAGGAAGGCTGACACCGATTATAAACGGTTGAGACATGAAAACGCCAAAGGTCCGGGCAAGGAGTGCAAACCCTTTAAGATACAAGCTTGGTTTTCCTCTGGTGCTCTTGTGTTGCACATTCTTCTTCTTGGTCGGCTTTTACGGTTCCAATTCCCTCTCCAAGGAAGAAAAACATGTGGTGATTGACCCCGTCACCAATGAGAAACTTGTGTTCGAACATGGCCGTACTGGAGACAGTTCTGTTACTGACATTCCTTTCCAGGTGTTAAGTTGGAAACCACGTGCCCTTTTGTATCCGAATTTTGCAAGCAAAGAGCAATGTGAAGCCATCATCAAGCTTGCGAGGACACGTCTTGCTCCTTCTGGTCTGGCTTTGAGGAAAGGGGAGAGTGAAGCCACAACGAAAGAAATCAGAACTAGTTCTGGAACTTTCTTGAGAGCCAGTGAAGATAAAACACAGAGTTTAGCGGAGGTTGAGGAGAAGATGGCCAGAGCAACCATGATACCTCGGCAGAATGGGGAGGCTTTTAATGTGTTGCGGTACAACCCAGGTCAAAAATACGATTGTCACTATGATGTTTTTGATCCAGCTGAGTATGGTCCTCAACCAAGCCAGCGGATGGCTTCCTTTCTCCTTTATTTATCAGACGTCGAAGAGGGCGGAGAAACGATGTTTCCCTTCGAAAACTTTCAAAATATGAACACAGGCTATAATTATAAGGACTGTATTGGGTTGAAAGTGAAACCCCGCCAAGGCGATGCTCTTCTTTTCTATTCAATGCATCCTAACGGTACATTTGACAAGACCGCATTGCATGGAAGCTGTCCAGTTATCAAAGGCGAAAAATGGGTCGCCACGAAGTGGATACGCAATACCGACAAATTTTAATCTGAAAGATCCCACTGGTGACTGTTATAACTTGCTGCCTTCTTAAAGTTCTTTCGGTAGTACTCTAGGAGCTTCAGGTTATCTTACAAAAGTATCGGGTCTGAGAAAGTGTAAAATCTGTGCGTACCTGAATCCATCAATTAAGTCATGGGTGTTATCTTTTAACATTCCTGGTCTCTGCCAACCAGAGTTCCAGAGAAACGGTTGTTCGCTGGATTATTGCCAGCTTAAAGTTCACTTAAGAAATTCTAAACTCTTCAACTAAGAAGACATTGTCCTTG
Ｐ４Ｈ４ｃＤＮＡに対応する翻訳（配列番号８）
MKTPKVRARSANPLRYKLGFPLVLLCCTFFFLVGFYGSNSLSKEEKHVVIDPVTNEKLVFEHGRTGDSSVTDIPFQVLSWKPRALLYPNFASKEQCEAIIKLARTRLAPSGLALRKGESEATTKEIRTSSGTFLRASEDKTQSLAEVEEKMARATMIPRQNGEAFNVLRYNPGQKYDCHYDVFDPAEYGPQPSQRMASFLLYLSDVEEGGETMFPFENFQNMNTGYNYKDCIGLKVKPRQGDALLFYSMHPNGTFDKTALHGSCPVIKGEKWVATKWIRNTDKF
Ｐ４Ｈ５ｃＤＮＡ（Ｐｐ１ｓ１２＿２４７Ｖ６．１ 受託番号：ＪＸ９６４７８２；配列番号９）
GCTGCTTCAGGGTAGGACAAACCATCGTCGAAGGGGATGTGGGTCGACCTATTTTGGTCAACTTTATCTGTCTTTCTACTTCCGATGAATTGCCGTTTTTGTTGTAAGCGTTTGCACATGCAGGTTGGAGGCTGGTGAACTGCATACACAAATTTGATAGTCGGGGAGAAAGAGGAGTTTCTCACAGTGTCTTTGGTGATTGGATCATCCTCGAGGAGCTTTTAGCTCGAAGGGTTTCCTGATTTTAAGTTTGGAACCGAGGTATTTCAATCGTGAGAGTGGTTCTTAGCATGCATACATTTTGAGTGTGTAGGTATGGATCTCTATTCTAGAAGCCGTAGAGGCTGAGTAACTATTGCATTCTCTGAAATCCTGTTTACCTCGGCGCGGCCACATCTCGAAGTAGTCGGTAATTTTCTTCCTTGGGTTTCGTGGGAGCCGGGCGAAGTTCGTAACTATGGCGAAGCTGAGTCGAGGTCAAAGGAGAGGAGCTGGCACGATGGCTTTGTTGGTGCTGGTCCTGTTGTCTCTAGCGCTCATGCTCATGTTGGCACTTGGCTTTGTAGCCATGCCATCGGCGTCCCACGGGAGTTCGGCTGACGTTGTGGAAATCAAGCTGCCCTCACACAGGCATTTTGGTGCCAACCCCTTATCACGTTGGGTTGAAGTCCTCTCTTGGGAGCCCAGAGCCTTTCTATATCACCACTTTCTGACAGAAGAGGAATGCAATCATCTAATTGAAGTGGCCAGGCCAAGTCTGGTGAAGTCAACGGTTGTAGATAGTGATACAGGAAAGAGCAAAGACAGCAGAGTACGCACAAGTTCAGGTACATTTTTGATGCGAGGCCAAGATCCTGTGATCAAAAGAATCGAGAAGCGAATAGCTGACTTCACATTTATACCTGCTGAGCAAGGTGAAGGCTTACAAGTTCTGCAGTACAAAGAAAGTGAAAAATACGAGCCCCATTATGATTACTTCCACGATGCATACAATACCAAAAATGGCGGCCAAAGAATTGCTACCGTACTGATGTACCTGTCAAATGTCGAGGAAGGAGGAGAAACAGTTTTTCCAGCTGCTCAGGTGAACAAGACTGAAGTTCCCGATTGGGATAAATTATCTGAGTGTGCTCAGAAAGGTCTTTCTGTGCGACCACGCATGGGAGATGCCTTGCTTTTCTGGAGCATGAAACCAGATGCGACACTTGATTCCACTAGCTTGCATGGTGGCTGCCCCGTGATCAAGGGTACCAAATGGTCTGCTACTAAGTGGTTACATGTAGAAAACTATGCAGCCTGATGAGGATGGTACAAGATGTCTTCTGCAGGAAGTGAATTGTCACAAGCACCTGGTACAAGCAGATTCGAAATGCTTGGATGTAATGCATGGATGTTGGGAGAGGACAAACATACAAATTTATGATTCTGCATTACGTGAGATGTAATGATGAACCACCTCGTGCCTATCTGAATTCATATGAACAAACGAATAGATTTCCAATTCATACCAATAAAACAGAAAAGCCGCTTAACTTATTTGTTAACTTAGGCAGTTTTTTTGTTTTATTATTGGTGGTTTGCAATCGACCTTAACGACCATTTCTTGTAATCACCACAAACAAGCAAAATGCATATCTGATTTCATTCAAAATATACTTATAAAGACTGCTGAATCTATAACAAACAAAA
Ｐ４Ｈ５ｃＤＮＡに対応する翻訳（配列番号１０）
MAKLSRGQRRGAGTMALLVLVLLSLALMLMLALGFVAMPSASHGSSADVVEIKLPSHRHFGANPLSRWVEVLSWEPRAFLYHHFLTEEECNHLIEVARPSLVKSTVVDSDTGKSKDSRVRTSSGTFLMRGQDPVIKRIEKRIADFTFIPAEQGEGLQVLQYKESEKYEPHYDYFHDAYNTKNGGQRIATVLMYLSNVEEGGETVFPAAQVNKTEVPDWDKLSECAQKGLSVRPRMGDALLFWSMKPDATLDSTSLHGGCPVIKGTKWSATKWLHVENYAA
Ｐ４Ｈ６＿ａ＿ｃＤＮＡ（Ｐｐ１ｓ３２８＿２９Ｖ６．１ 受託番号：ＪＸ９６４７８３；配列番号１１）
GAAAAAGAGCAGCAGTTGGAGTTGGAGTAGGCCAGATCGATGCTCCTCCTCCTCCCATGATGATAGATGACGAAGATTATGCTGTTGTTGTCGATGTTGTTGCTCGCTGATCATCAACACGAAGTTGCCGTTGCAGCTGCTCTTGCTCTTCACCGTCGACTCGGCAGAGGGGCACAGCTCAGCTGGTAATTTATTATTAGTGCCCATGGGTGGGATGGATGTGAGTGACATCGGCGCTTCTACCGACAGTGTGAAACCCCAGCGAGGCTGTGCCTTGCCTTGCCTTGGCTTGTGTGCATTGCCTCTCCCCTCCAGTTTTTTGGTGGGTTGGTGTTTGTGTGAGGGGGGAACAGAGGAGAGGGCGGGGGCAAGGGCTGTGGCAGCTATGGCGAGGTTGAGTAGGGGGCAAAGGACTGGAGTTGGCACGATGGCATTGCTGGTGTTCGCGTTTTTGTCTTTGATAGTCATGGTCATGTTGCTTCTGGACGTGGTAGCAATGCCATCGGGACGTCGAGGCTCGATTGACGAGGGAGCCGAAGTGGAATTGAAGCTGCCTACCCACAGGCATGTGGATGAAAATCCACTGGCACCTTGGGTTGAGGTCCTTTCCTGGGAGCCCAGAGCTTTTCTGTATCACCACTTTCTGACACAAGTGGAATGCAACCATCTTATTGAGGTGGCCAAGCCTAGCCTGGTGAAGTCAACAGTTATAGATAGTGCTACGGGAAAAAGCAAAGACAGCAGGGTTCGCACAAGTTCAGGGACATTTTTGGTGCGGGGCCAAGATCACATCATTAAGAGGATTGAGAAACGTATCGCTGACTTCACATTCATACCTGTTGAACAAGGTGAAGGCTTGCAAGTTTTGCAGTATAGAGAGAGTGAGAAATACGAGCCTCATTATGACTACTTTCACGATGCTTTCAATACTAAAAATGGTGGTCAGCGGATTGCTACCGTACTGATGTATCTGTCAGACGTTGAGAAAGGGGGAGAAACAGTTTTCCCGGCTTCTAAAGTGAACGCTAGTGAGGTTCCTGATTGGGATCAGCGATCCGAATGCGCTAAACGGGGCCTTTCTGTACGACCACGTATGGGAGATGCCTTACTTTTTTGGAGCATGAAACCAGATGCGAAGCTTGACCCTACCAGTTTGCATGGCGCTTGCCCTGTGATTCAAGGTACGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGTTACATGTTGAAAAATACGCAGCACGGTAAACATCCTTCTAGAAGTCTTCAACAGGATTACATGAATTATGCGAGCAGTCTTCTGGCATGAGCAGAGGTGAACTTGCCCAAACTTGCTCATGGAACAACAGAATCAGCTTGCGAGTTATTTACAAGGAGCGAGTGTCCATGCCTGAATGCTGGAACACCAGCGTGATGAGAACGCTTAGGAATACCAATTCTTCACTGATTTTACAAACCACACTAGCTACTACACATGACAAATTTCATGCTTTGACTTGGTTGATCTGCTTTTGTGTGAGGATCAGTATTTTATAAATAGGGGATGGAGCTCTTCAGCTCCTAATGTGCGATTTCG
Ｐ４Ｈ６＿ａ＿ｃＤＮＡに対応する翻訳（配列番号１２）
MGGMDVSDIGASTDSVKPQRGCALPCLGLCALPLPSSFLVGWCLCEGGTEERAGARAVAAMARLSRGQRTGVGTMALLVFAFLSLIVMVMLLLDVVAMPSGRRGSIDEGAEVELKLPTHRHVDENPLAPWVEVLSWEPRAFLYHHFLTQVECNHLIEVAKPSLVKSTVIDSATGKSKDSRVRTSSGTFLVRGQDHIIKRIEKRIADFTFIPVEQGEGLQVLQYRESEKYEPHYDYFHDAFNTKNGGQRIATVLMYLSDVEKGGETVFPASKVNASEVPDWDQRSECAKRGLSVRPRMGDALLFWSMKPDAKLDPTSLHGACPVIQGTKWSATKWLHVEKYAAR
Ｐ４Ｈ６＿ｂ＿ｃＤＮＡ（Ｐｐ１ｓ３２８＿２９Ｖ６．１ 受託番号：ＪＸ９６４７８４；配列番号１３）
GAAAAAGAGCAGCAGTTGGAGTTGGAGTAGGCCAGATCGATGCTCCTCCTCCTCCCATGATGATAGATGACGAAGATTATGCTGTTGTTGTCGATGTTGTTGCTCGCTGATCATCAACACGAAGTTGCCGTTGCAGCTGCTCTTGCTCTTCACCGTCGACTCGGCAGAGGGGCACAGCTCAGCTGGTAATTTATTATTAGTGCCCATGGGTGGGATGGATGTGAGTGACATCGGCGCTTCTACCGACAGTGTGAAACCCCAGCGAGGCTGTGCCTTGCCTTGCCTTGGCTTGTGTGCATTGCCTCTCCCCTCCAGTCGTAATTGAGACGTACTATTAAACACGTAGGCGGTAGTTTTTGGTGGGTTGGTGTTTGTGTGAGGGGGGAACAGAGGAGAGGGCGGGGGCAAGGGCTGTGGCAGCTATGGCGAGGTTGAGTAGGGGGCAAAGGACTGGAGTTGGCACGATGGCATTGCTGGTGTTCGCGTTTTTGTCTTTGATAGTCATGGTCATGTTGCTTCTGGACGTGGTAGCAATGCCATCGGGACGTCGAGGCTCGATTGACGAGGGAGCCGAAGTGGAATTGAAGCTGCCTACCCACAGGCATGTGGATGAAAATCCACTGGCACCTTGGGTTGAGGTCCTTTCCTGGGAGCCCAGAGCTTTTCTGTATCACCACTTTCTGACACAAGTGGAATGCAACCATCTTATTGAGGTGGCCAAGCCTAGCCTGGTGAAGTCAACAGTTATAGATAGTGCTACGGGAAAAAGCAAAGACAGCAGGGTTCGCACAAGTTCAGGGACATTTTTGGTGCGGGGCCAAGATCACATCATTAAGAGGATTGAGAAACGTATCGCTGACTTCACATTCATACCTGTTGAACAAGGTGAAGGCTTGCAAGTTTTGCAGTATAGAGAGAGTGAGAAATACGAGCCTCATTATGACTACTTTCACGATGCTTTCAATACTAAAAATGGTGGTCAGCGGATTGCTACCGTACTGATGTATCTGTCAGACGTTGAGAAAGGGGGAGAAACAGTTTTCCCGGCTTCTAAAGTGAACGCTAGTGAGGTTCCTGATTGGGATCAGCGATCCGAATGCGCTAAACGGGGCCTTTCTGTACGACCACGTATGGGAGATGCCTTACTTTTTTGGAGCATGAAACCAGATGCGAAGCTTGACCCTACCAGTTTGCATGGCGCTTGCCCTGTGATTCAAGGTACGAAATGGTCTGCTACAAAGTGGTTACATGTTGAAAAATACGCAGCACGGTAAACATCCTTCTAGAAGTCTTCAACAGGATTACATGAATTATGCGAGCAGTCTTCTGGCATGAGCAGAGGTGAACTTGCCCAAACTTGCTCATGGAACAACAGAATCAGCTTGCGAGTTATTTACAAGGAGCGAGTGTCCATGCCTGAATGCTGGAACACCAGCGTGATGAGAACGCTTAGGAATACCAATTCTTCACTGATTTTACAAACCACACTAGCTACTACACATGACAAATTTCATGCTTTGACTTGGTTGATCTGCTTTTGTGTGAGGATCAGTATTTTATAAATAGGGGATGGAGCTCTTCAGCTCCTAATGTGCGATTTCG
Ｐ４Ｈ６＿ｂ＿ｃＤＮＡに対応する翻訳（配列番号１４）
MARLSRGQRTGVGTMALLVFAFLSLIVMVMLLLDVVAMPSGRRGSIDEGAEVELKLPTHRHVDENPLAPWVEVLSWEPRAFLYHHFLTQVECNHLIEVAKPSLVKSTVIDSATGKSKDSRVRTSSGTFLVRGQDHIIKRIEKRIADFTFIPVEQGEGLQVLQYRESEKYEPHYDYFHDAFNTKNGGQRIATVLMYLSDVEKGGETVFPASKVNASEVPDWDQRSECAKRGLSVRPRMGDALLFWSMKPDAKLDPTSLHGACPVIQGTKWSATKWLHVEKYAAR

推定されたすべてのタンパク質配列は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼアルファサブユニット触媒ドメイン（ＳＭＡＲＴ ０７０２）を有していた。Ｐ４Ｈ２を除くすべてのホモログについて、Ｎ末端膜貫通ドメインが予測された（ＴＭＨＭＭ ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）。

予測されたＰ４Ｈ酵素についてのさらなる情報を得るために、推定されたアミノ酸配列を既に特徴づけられている、ヒト、アラビドプシス・タリアナおよびニコチアナ・タバクムのＰ４Ｈの配列に対してアライメントした。タンパク質配列アライメントをプログラムＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／）を用いて行い、Ｊａｌｖｉｅｗ（ｗｗｗ．ｊａｌｖｉｅｗ．ｏｒｇ／）を用いて視覚化した。タンパク質のＣ末端にある触媒ドメインは、７つのヒメツリガネゴケホモログすべてにおいて高度に保存されている（図１）。７つの推定上のＰ４Ｈは、ヒト触媒α（Ｉ）サブユニットと１６〜２４％の同一性を有し、ＡｔＰ４Ｈ１と３０〜６３％の同一性を有している。コケ配列中で同一性の程度は、３０から８１％の間である。すべての配列がモチーフＨＸＤおよび遠位ヒスチジンを含有し、これらは、補因子Ｆｅ^２＋と結合するのに不可欠である。さらに、これらは、塩基性残基リシンを含有し、これは、２−オキソグルタレートのＣ−５カルボキシル基と結合する（図１）。これらの残基は、コラーゲンＰ４Ｈの活性（ＫｉｖｉｒｉｋｋｏおよびＭｙｌｌｙｈａｒｊｕ、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．、１６：３５７〜３６８ページ、１９９８年）およびＡ．タリアナのＰ４Ｈ１の活性（ＨｉｅｔａおよびＭｙｌｌｙｈａｒｊｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２３９６５〜２３９７１ページ、２００２年）のために必須であり、これは、ヒメツリガネゴケの７つの配列すべてが機能的なプロリル−４−ヒドロキシラーゼであることを示す。

実験２：細胞内局在のコンピュータによる予測
組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）は、以下の例において、組換えヒトタンパク質の例と同様の役割を果たす。組織からコケバイオリアクター培養の培地に分泌されたコケ由来のｒｈＥＰＯにおいて、非ヒトプロリルヒドロキシル化が生じた。したがって、翻訳後のｒｈＥＰＯ改変に関与するＰ４Ｈ酵素は、分泌に関する区画、すなわち小胞体（ＥＲ）またはゴルジ装置に存在することと結論づけられた。それに応じて、７つのヒメツリガネゴケＰ４Ｈホモログの細胞内局在を調べた。まず、それらの推定上の細胞内局在を、異なるアルゴリズムに基づく異なる４つプログラムを用いてコンピュータで分析した：Ｔａｒｇｅｔ Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ／）、ＭｕｌｔｉＬｏｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｂｉ．ｉｎｆ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＭｕｌｔｉＬｏｃ）、ＳｈｅｒＬｏｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｂｉ．ｉｎｆ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｈｅｒＬｏｃ２）およびＷｏｌｆ ＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ．ｏｒｇ／）。このアプローチによっては、整合性のある予測が得られなかった（表１）。

実験３：細胞内局在のインビボ分析
ＧＦＰ融合タンパク質（緑蛍光タンパク質、Ｐ４Ｈ−ＧＦＰ）としてＰ４Ｈをヒメツリガネゴケ細胞内で発現させることによって、７つのヒメツリガネゴケＰ４Ｈのそれぞれのインビボにおける細胞内局在を調査した（プラスミドの形成および植物材料ならびにトランスフォーメーション手順に関する詳細については、下記参照）。異なる７つのＰ４Ｈ−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を、トランスフェクションの３から１４日後に共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）（５１０ ＭＥＴＡ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、イェーナ、ドイツ）および対応するソフトウェア（バージョン３．５）によって分析した。アルゴンレーザーにより４８８ｎｍにおける励起を達成し、発光はＭＥＴＡ検出器を用いて、ＧＦＰに関しては４９４〜５５８ｎｍにおいて、クロロフィルに関しては６０１〜７１９ｎｍにおいて測定した。細胞をＣ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３×／１．２ Ｗ ｃｏｒｒ液浸対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ）を用いて調べた。共焦点面をＺＥＮ２０１０ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ）からエクスポートした。

光学的断面において、異なる７つのＰ４Ｈ融合タンパク質のすべてからのＧＦＰシグナルを、核のまわりの限定された環状構造として主に検出した。これは、核膜の標識を示している（図２）。核膜は真核細胞の内膜連続体の一部であるため、こうしたシグナルは、７つのコケＰ４Ｈすべてが分泌に関する区画を標的としていたことを明らかにしている。ＥＲ標的ＧＦＰタイプ（ＡＳＰ−ＧＦＰ−ＫＤＥＬ、Ｓｃｈａａｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８３：１４５〜１５２ページ、２００４年）ならびに細胞質および核においてＧＦＰ蛍光を呈するいかなるシグナルペプチドも含まないＧＦＰ（Ｓｃｈａａｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８３：１４５〜１５２ページ、２００４年）が対照の役割を果たした。したがって、これらの実験からは、ヒメツリガネゴケにおいて分泌されたｒｈＥＰＯにＨｙｐを形成させる特定のＰ４Ｈの明確な徴候はもたらされなかった。

実験４：ヒメツリガネゴケＰ４Ｈホモログのそれぞれの遺伝子機能の破壊
コケ産生ｒｈＥＰＯの植物に典型的なプロリルヒドロキシル化に関与するこれらのホモログを最終的に同定するために、各ヒメツリガネゴケＰ４Ｈホモログの遺伝子の機能を破壊した。したがって、６つのｐ４ｈ遺伝子に対する遺伝子標的化コンストラクトを設計した（図３）。

その遺伝子標的化コンストラクトを、その後、ｒｈＥＰＯ産生コケ株１７４．１６（Ｗｅｉｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、５：３８９〜４０１ページ、２００７年）に導入して、各Ｐ４Ｈ遺伝子についての特定のノックアウト（ＫＯ）株を形成した。抗生物質選択の後、生き残った植物を、ＫＯコンストラクトの正しいゲノムの位置への相同組込みに関してスクリーニングした（トランスフォームされた植物のスクリーニングについての詳細は、下記参照）。

それぞれの転写物の喪失は、ＲＴ−ＰＣＲによって証明され（図４ａ）、遺伝子破壊が成功していることを確認した。それぞれの遺伝子改変に対して一株をさらなる分析のために選択し、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｓｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｓｓ−ｓｔｏｃｋ−ｃｅｎｔｅｒ．ｏｒｇ；表２）に保管した。

実験５：マススペクトロメトリーによる組換えタンパク質の分析
コケ産生ｒｈＥＰＯに見られるプロリルヒドロキシル化に対するｐ４ｈ破壊のそれぞれの影響を確かめるために、各ＫＯ株（Δｐ４ｈ）由来の組換えタンパク質をマススペクトロメトリーにより分析した。このために、全可溶性タンパク質を、親植物１７４．１６および各ｐ４ｈホモログの１つのノックアウト株の培養上清から沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。続いて、主要なｒｈＥＰＯを含有するバンドをクマシーにより着色されたゲルから切りとり、トリプシンにより消化し、トリプシン処理ペプチドＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲ（１４４〜１５８）の分析のためにマススペクトロメトリーに供した（タンパク質およびペプチド分析の詳細については、下記参照）。親植物１７４．１６では、ｒｈＥＰＯのほぼ半分は、主にＳＰＰモチーフの２番目のプロリンがヒドロキシル化されており（図５）、それは、ＭＳ／ＭＳによって示されるとおりであった（図６）。驚くべきことに、それぞれ、ｐ４ｈ２、ｐ４ｈ３、ｐ４ｈ４、ｐ４ｈ５またはｐ４ｈ６が破壊されたコケ株において産生されたｒｈＥＰＯは、親植物に見られるのと同様のレベルでヒドロキシル化されていたが、ｐ４ｈ１遺伝子の破壊に限って、バイオ医薬品のプロリルヒドロキシル化を完全に止めるのに十分であった（図５）。これらのノックアウト植物の生育速度、ｒｈＥＰＯ産生力および培養培地へのタンパク質の分泌は、親株１７４．１６と比較して損なわれていなかった（データは示していない）。したがって、Δｐ４ｈ１株によって産生されたｒｈＥＰＯにはＨｙｐが完全にないことが示された。

７つのタンパク質の配列分析または細胞内局在も、どの遺伝子がｒｈＥＰＯの有害なＯ−グリコシル化に関与しているかを明らかにしなかったことに留意されたい。驚くべきことに、７つの遺伝子のそれぞれの破壊のみが原因遺伝子を明らかにした。

実験６：Ｐ４Ｈ１酵素活性の検証
プロリルヒドロキシル化のＰ４Ｈ１酵素活性を検証するために、この遺伝子をΔｐ４ｈ１ノックアウト株１９２号において異所的に発現させた。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、得られた株においてｐ４ｈ１転写物の強い過剰発現が確認された（図４ｂ）。５種類のｐ４ｈ１過剰発現株（ｐ４ｈ１ＯＥ）をｒｈＥＰＯ−Ｐｒｏ−ヒドロキシル化について分析した。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの結果から、ｐ４ｈ１の過剰発現がコケ産生ｒｈＥＰＯのプロリルヒドロキシル化を元に戻したことが明らかになった（図７）。ヒドロキシル化されたｒｈＥＰＯの割合ならびにヒドロキシル化パターンが、この遺伝子の高い発現レベルによって変更された。天然Ｐ４Ｈ１活性を有する親植物１７４．１６では、ｒｈＥＰＯのおよそ半分がＨｙｐを示したが（図５）、ｐ４ｈ１過剰発現体のほぼすべてのｒｈＥＰＯは酸化されていた（図７）。さらに、これらの過剰発現体では、親植物１７４．１６において見られるように、モチーフＳＰＰの１つのプロリンがヒドロキシル化されただけでなく、両隣のプロリンもＨｙｐに変換されていた（図７）。したがって、ｐ４ｈ１の発現が、コケ産生ｒｈＥＰＯのプロリルヒドロキシル化に必須で十分であること、およびその発現レベルがその酵素活性、ヒドロキシル化されたタンパク質分子の割合だけでなく、ヒドロキシル化のパターンにも影響を与えることが示された。

実験７：ヒメツリガネゴケにおけるプロリルヒドロキシル化に関するｒｈＥＰＯのＮ末端ペプチドＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬの分析
Ｎ．ベンタミアナでの発現時に、ヒト上皮のムチンＭＵＣ１の配列ＡＰＰにおけるヒドロキシル化およびアラビノシル化が報告されたため（Ｐｉｎｋｈａｓｏｖら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、９：９９１〜１００１ページ、２０１１年）、ヒメツリガネゴケのｒｈＥＰＯのＮ末端ペプチドＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬをプロリルヒドロキシル化について分析した。親植物１７４．１６、ノックアウト植物ｐ４ｈ１第１９２号および過剰発現体ｐ４ｈ１ＯＥ−４５１由来のｒｈＥＰＯをキモトリプシン消化した後、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析によりこのペプチドがいずれの場合にもヒドロキシル化されなかったことが明らかにされた（図８）。これは、アラニンが先行する連続したプロリン残基が存在するだけではコケのプロリルヒドロキシラーゼが認識するには十分でないことを明示している。

実験８：植物のプロリル−４−ヒドロキシラーゼの配列の系統発生学的比較
プログラムＪａｌｖｉｅｗ（ＭＡＦＦＴバージョン５．０）を使用することによってさまざまな植物（例えば、Ｐｏｐｕｌｕｓ、Ｏｒｙｚａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）のプロリル−４−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列から複数の配列アライメントを生成した。ＱｕｉｃｋＴｒｅｅ（Ｈｏｗｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１８：１５４６〜１５４７ページ、２００２年）を用いて系統樹を予測した。その系統樹を図９に示す。

上記実験に関する方法
プラスミドコンストラクトの形成
ヒメツリガネゴケで同定された７つのＰ４Ｈホモログに対応するｃＤＮＡを、表３に挙げたプライマーを使用して増幅した（下記参照）。

ｃＤＮＡをｐＪＥＴ １．２（ＣｌｏｎｅＪＥＴ（商標）ＰＣＲ ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ザンクト・レオン＝ロート、ドイツ）にクローン化した。続いて、５’ＵＴＲの部分を含むｐ４ｈコード配列を、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの支配下においてＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位を使用してプラスミドｍＡＶ４ｍｃｓ（Ｓｃｈａａｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８３：１４５〜１５２ページ、２００４年）にクローン化し、Ｎ末端融合Ｐ４Ｈ−ＧＦＰタンパク質を生じさせた。細胞質内および核内局在についての対照として改変されていないｍＡＶ４ｍｃｓを使用した。ＥＲ局在についての陽性対照として、ｐＡＳＰ−ＧＦＰ−ＫＤＥＬを採用した（Ｓｃｈａａｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８３：１４５〜１５２ページ、２００４年）。

ｐ４ｈノックアウトコンストラクトを形成するために、プロリル−４−ヒドロキシラーゼに対応するヒメツリガネゴケのゲノムＤＮＡフラグメントを、表３に挙げたプライマーを使用して増幅し、ｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）またはｐＥＴＢｌｕｅ−１ ＡｃｃｅｐＴｏｒ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）のいずれかにクローン化した。ｐＴＯＰＯ＿ｐ４ｈ１ゲノムのフラグメントを、まずＢｓｔＢＩおよびＳａｃＩを使用して直線化し、それにより２７３ｂｐのフラグメントを除去し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに対する制限部位を含有する二重鎖オリゴヌクレオチドを連結することによって再環状化した。これらの部位をゼオマイシン耐性カセット（ｚｅｏ−カセット）の挿入のために使用した。ｚｅｏ−カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによる消化によってｐＵＣ−ｚｅｏ（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）から得た。ｐ４ｈ５ ＫＯコンストラクトに関しては、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位を使用してｐＴＯＰＯ＿ｐ４ｈ５から１４８７ｂｐのフラグメントを切り出し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに対する制限部位を含有する二重鎖オリゴヌクレオチドで置換した。これらの制限部位を、ｐＵＣ−Ｚｅｏプラスミドから得られたｚｅｏ−カセットの挿入のために使用した。ｐ４ｈ２ ＫＯコンストラクトを、ｐＥＴＢｌｕｅ−１ ＡｃｃｅｐＴｏｒ（商標）にクローン化し、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって除去された２７０ｂｐのゲノムフラグメントをｚｅｏ−カセットで置換した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化によってｐＲＴ１０１−ｚｅｏから得られたｚｅｏ−カセット（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）を、同じ酵素により消化されたｐＥＴ＿ｐ４ｈ３およびｐＴＯＰＯ＿ｐ４ｈ４ ＫＯコンストラクトに挿入して、それぞれ９９０ｂｐおよび１１８３ｂｐのゲノムフラグメントを置換した。ｐ４ｈ６ ＫＯコンストラクトに関しては、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩによる消化によりｐＵＣ−ｚｅｏからｚｅｏ−カセットを得て、ｐＴＯＰＯ＿ｐ４ｈ６に挿入して、１３２６ｂｐのゲノムフラグメントを置換した。すべてのＫＯコンストラクトにおいて、標的遺伝子と相同である領域は、選択カセットの両端においてほぼ同じ大きさであり、５００から１０００ｂｐの間を含む。

過剰発現コンストラクトに関しては、コケＷＴのｃＤＮＡからｐ４ｈ１コード配列および７９ｂｐの５’ＵＴＲを表３に挙げたプライマーを用いて増幅し、３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターの支配下においてｍＡＶ４ｍｃｓベクターにクローン化した（Ｓｃｈａａｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８３：１４５〜１５２ページ、２００４年）。このために、Ｅｃｌ１３６ＩＩおよびＳｍａＩによる消化によってベクターからＧＦＰ遺伝子を除去した後ベクターを再連結した。ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を介してｐ４ｈ１のｃＤＮＡをベクターに挿入した。ｐ４ｈ１過剰発現コンストラクトをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩによる消化により直線化し、スルファジアジン選択のためにｐＵＣ １８ ｓｕｌ（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）とともにΔｐ４ｈ１株１９２号に導入した。

植物材料およびトランスフォーメーション手順
ヒメツリガネゴケ［Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂｒｕｃｈ＆Ｓｃｈｉｍｐ］を過去に記載されたとおりに培養した（Ｆｒａｎｋら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、７：２２０〜２２７ページ、２００５年）。コケ産生ｒｈＥＰＯは、プロリルヒドロキシル化共通モチーフＳＰＰ（アミノ酸１４７〜１４９）でヒドロキシル化されることが示された。したがって、ｒｈＥＰＯ産生ヒメツリガネゴケ株１７４．１６（Ｗｅｉｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、５：３８９〜４０１ページ、２００７年）をｐ４ｈノックアウトの形成のための親株として使用し、Δｐ４ｈ１株１９２号をｐ４ｈ１過剰発現株の形成のために使用した。これらのコケ株では、α１，３フコシルトランスフェラーゼおよびβ１，２キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されている（Ｋｏｐｒｉｖｏｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、２：５１７〜５２３ページ、２００４年）。細胞内局在の実験のためにＰ４Ｈ−ＧＦＰとともに野生型のコケを使用した。

プロトプラストの単離およびＰＥＧ介在トランスフェクションを過去に記載されたとおりに行った（Ｆｒａｎｋら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、７：２２０〜２２７ページ、２００５年；Ｒｏｔｈｅｒら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１４３：７２〜７７ページ、１９９４年）。Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または前述のスルファジアジン（Ｓｉｇｍａ）により変異体選択を行った（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）。

ｒｈＥＰＯ産生に関しては、過去に記載されたとおりにヒメツリガネゴケを培養した（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）。

トランスフォームされた植物のスクリーニング
過去に記載されたとおりに抽出されたゲノムＤＮＡ（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）を用いたダイレクトＰＣＲにより安定なトランスフォームされた植物のスクリーニングを行った（Ｓｃｈｗｅｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２０：４３〜４７ページ、２００２年）。これらの抽出物から２μｌをＰＣＲのための鋳型として使用した。それぞれ、ノックアウトコンストラクトの正しいゲノムの位置への５’および３’組込みを調べるため、および過剰発現コンストラクトのコケゲノムへの組込みを調べるために、表３に挙げたプライマーを使用した。予期されるＰＣＲを示した植物の産物を、それぞれ推定上のノックアウトまたは過剰発現株と考え、続いて分析を行った。表３に挙げたプライマーを使用して過去に記載されたとおりのＲＴ−ＰＣＲ（Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、１０：８５１〜８６１ページ、２０１２年）により、ＫＯ株にはｐ４ｈ転写物がないことが分析された。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより過剰発現株におけるｐ４ｈ１の発現を分析した。このために、１５０ｎｇのＲＮＡに相当するｃＤＮＡを２４、２６および２８サイクルで表３に挙げたｐ４ｈ１プライマーを使用して増幅した。対照として、構成的に発現されるＴＡＴＡボックス結合タンパク質に対するプライマー、ＴＢＰ ｆｗｄおよびＴＢＰ ｒｅｖ（表３）を使用した。

タンパク質およびペプチド分析
記載されるとおりに（Ｂｕｔｔｎｅｒ−Ｍａｉｎｉｋら、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．、９：３７３〜３８３ページ、２０１１年）、１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダイゼンホーフェン、ドイツ）による沈殿によって全可溶性タンパク質を１６０ｍｌの１６日目の培養上清から回収した。ペレットをサンプルＬａｅｍｍｌｉローディングバッファー（Ｂｉｏｒａｄ、ミュンヘン、ドイツ）に再懸濁し、１５０Ｖで１時間、非還元条件下で１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＢｉｏＲａｄ）においてタンパク質の電気泳動分離を行った。

ペプチド分析に関しては、ゲル中のタンパク質をＰａｇｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で着色し、２５ｋＤａに対応するバンドを切り取り、Ｓ−アルキル化し、トリプシンまたはキモトリプシンにより消化した（Ｇｒａｓｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４００：２４２７〜２４３８ページ、２０１１年）。過去に記載されたとおりにＱ−ＴＯＦ装置におけるエレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーと連結した逆相液体クロマトグラフィーによって分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ）を行った（Ｇｒａｓｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４００：２４２７〜２４３８ページ、２０１１年）。

製造業者のプロトコルに従ってｈＥＰＯ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＥＰ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、コケ産生ｒｈＥＰＯの定量を行った。

図の詳細な説明
図１は、ヒメツリガネゴケの推定上のプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、アラビドプシス・タリアナのＰ４Ｈ１（ＡＴ２Ｇ４３０８０．１）、ニコチアナ・タバクムのＰ４Ｈ（ＢＡＤ０７２９４）およびヒトコラーゲン−Ｐ４Ｈのα（Ｉ）サブユニット（ＮＰ＿０００９０８）のタンパク質配列の比較を示す。少なくとも５つの配列で一致するアミノ酸には、それぞれの位置の上に破線で印がつけられている。Ｆｅ^２＋および２−オキソグルタレートのＣ−５カルボキシル基との結合に関与する保存されている残基には、それぞれの位置の下にアスタリスクで印がつけられている。他のどの分析配列とも整列しなかったヒトα（Ｉ）サブユニットの最初の１４７個のアミノ酸は示していない。

図２は、ヒメツリガネゴケＰ４Ｈホモログのインビボにおける細胞内局在を示す。トランスフェクションの３から１４日後にヒメツリガネゴケのプロトプラストにおいてＰ４Ｈ−ＧＦＰ融合タンパク質の蛍光が共焦点顕微鏡によって観察された。ＰｐＰ４Ｈ１−ＧＦＰ、ＰｐＰ４Ｈ３−ＧＦＰおよびＰｐＰ４Ｈ４−ＧＦＰについて得られた画像が、すべてのホモログに関して観察された蛍光パターンの例として採用される。（ａ〜ｃ）ＰｐＰ４Ｈ１−ＧＦＰ、（ｄ〜ｆ）ＰｐＰ４Ｈ３−ＧＦＰ、（ｇ〜ｉ）ＰｐＰ４Ｈ４−ＧＦＰ、（ｊ〜ｌ）対照としてＥＲ局在に関するＡＳＰ−ＧＦＰ−ＫＤＥＬ、（ｍ〜ｏ）対照としてサイトゾル局在に関するいかなるシグナルペプチドも含まないＧＦＰ、（ａ、ｄ、ｇ、ｊおよびｍ）ＧＦＰ蛍光を発している単一の光学的断面（４９４〜５５８ｎｍ）、（ｂ、ｅ、ｈ、ｋおよびｎ）クロロフィルの自己蛍光（６０１〜７１９ｎｍ）とＧＦＰ蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）の合成、（ｃ、ｆ、ｉ、ｌおよびｏ）透過光画像。矢印は、細胞の核膜を示している。

図３は、ｐ４ｈノックアウトコンストラクトの略図を示している。エクソンは、長方形で、イントロンは線で示されている。白い長方形はコンストラクトに使用される遺伝子の領域を表わし、縞模様の長方形は選択カセット表わす。選択カセットを挿入するために使用される制限部位には、ＲＳと印がつけられている。矢印は、ゲノムの組込みのスクリーニングに使用されるオリゴヌクレオチドを表わす。

図４ａおよび４ｂは、組換えコケ株におけるｐ４ｈ遺伝子の発現分析を示している。図４ａは、ノックアウトと推定される植物のそれぞれｐ４ｈ１、ｐ４ｈ２、ｐ４ｈ３、ｐ４ｈ４、ｐ４ｈ５およびｐ４ｈ６の発現分析である。効率的なｍＲＮＡ単離の対照として、構成的に発現されるリボソームタンパク質Ｌ２１（対照）の遺伝子に対応するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。図４ｂは、野生型のコケ（ＷＴ）、ｒｈＥＰＯ産生株１７４．１６、およびｐ４ｈ１を過剰発現する５つの推定コケ株（１２、１６、３２、４１および４５号）におけるｐ４ｈ１の発現分析である。サイクル数を増やし（２４、２６および２８）、ｐ４ｈ１に特異的なプライマーを用いて、同様に、対照をＴＡＴＡ−ボックス結合タンパク質ＴＢＰをコードする構成的に発現される遺伝子に対応するプライマーを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。

図５ａおよび５ｂは、コケ産生ｒｈＥＰＯのヒドロキシル化のマススペクトロメトリー分析を示している。図５ａは、コケ株１７４．１６（対照の親植物）、Δｐ４ｈ１株１９２号、Δｐ４ｈ２株６号、Δｐ４ｈ３株２１号、Δｐ４ｈ４株９５号、Δｐ４ｈ５株２９号およびΔｐ４ｈ６株８号において産生されたｒｈＥＰＯ由来の酸化されたおよび酸化されていないペプチドＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲ（１４４〜１５８）のピークを示すトリプシン処理ペプチドの逆相液体クロマトグラフィーを示している。酸化されていない（ｍ／ｚ＝７３３．４）および酸化されたペプチド（ｍ／ｚ ７４１．４）の二重荷電イオンについての選択イオンクロマトグラムを示している。図５ｂは、ペプチド１４４〜１５８についての広帯域の全スペクトルを示し、例として、Δｐ４ｈ１株１９２号ではプロリルヒドロキシル化（Ｐｒｏ）がないこと、およびΔｐ４ｈ４株９５号ではヒドロキシル化されたペプチド（Ｈｙｐ）があることを示している。「Ｐｒｏ」および「Ｈｙｐ」の間のピークは、偶然にともに溶出されたペプチドＹＬＬＥＡＫである。保持時間のずれは、技術的なアーチファクトである。

図６は、コケ産生ｒｈＥＰＯからのペプチドＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲ（１４４〜１５８）のＭＳ／ＭＳ分析を示している。一方のスペクトル（図６ａ）は、酸化されていないペプチド（ｍ／ｚ ９３３．４５）によるものであり、正確に部分配列ＳＰＰＤＡＡＳを示していた。もう一方のスペクトル（図６ｂ）は、酸化された２つのペプチドのうちの１つによるものであった（ｍ／ｚ ９４１．４５）。それは、Ｈｙｐ（Ｏ）およびＬｅｕ同重体としてＳＰＯＤＡＡＳを表わす明白な部分配列ＳＰＬＤＡＡＳを示した。ｍ／ｚ ９４１．４５のやや小さな第２のピークがやや後に溶出された。これは、おそらく、ヒドロキシル化モチーフＳＰＰのもう１つのプロリンのヒドロキシル化から生じたものであった。

図７は、プロリルヒドロキシラーゼ遺伝子ｐ４ｈ１の過剰発現の影響を示している。逆相クロマトグラムの比較から、ノックアウトコケΔｐ４ｈ１株１９２号（図７ａ）および過剰発現ｐ４ｈＯＥ株３２号（図７ｂ）における、コケ産生ｒｈＥＰＯペプチドＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲ（１４４〜１５８）とそのヒドロキシル化型に関する保持時間が示された。スペクトルのそれぞれのピークは、クロマトグラムの下に示されている。過剰発現株では、二重にヒドロキシル化されたペプチドおよび２つのうちの１つだけがヒドロキシル化されたアイソマー（親ペプチドとともに溶出している）が見られた。

図８は、コケ産生ｒｈＥＰＯのＮ末端ペプチドのヒドロキシル化状態に関する分析を示す。Ｎ末端配列ＡＰＰもまた、コケのプロリルヒドロキシラーゼに対する標的配列を成す場合もある。したがって、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリーと連結した逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）によってキモトリプシン処理ペプチドのコケ産生ｒｈＥＰＯのＮ末端を分析した。コケの対照株１７４．１６、ノックアウトΔｐ４ｈ１株１９２号および過剰発現株ｐ４ｈ１ＯＥ株４５号において産生されたｒｈＥＰＯからの酸化されていないならびに酸化されたペプチドＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬ（１〜１２）の質量に関するスクリーニングは、このペプチドのＰｒｏヒドロキシル化を示すものがないことを明らかにした。

したがって、この実験は、コケバイオリアクターで産生される組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）の非ヒトプロリルヒドロキシル化に関与する植物の遺伝子の同定および機能的な特徴づけを示す。この遺伝子の標的破壊は、ｒｈＥＰＯの望ましくないプロリルヒドロキシル化を無効にした。そのため、植物ベースの系で産生され、糖鎖工学によりヒト化された組換えヒトタンパク質の道を開くものである。

図９は、さまざまな植物のプロリル−４−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列の系統樹を示す。これは、さまざまなフィスコミトレラのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子が系統発生学的にその他の植物と分かれていないことを示している。むしろ、配列分析により、緑藻類、蘚類および種子植物のさまざまなプロリル−４−ヒドロキシラーゼは互いに非常に類似しており、さらに全く同一の種内よりも互いに類似していることが示されている。したがって、開示した方法は、フィスコミトレラにおいてのみ機能する訳ではなく、その他の植物でも機能することは当業者には自明である。

組換えヒトタンパク質が、有害なプロリルヒドロキシル化を伴わないで植物ベースの系で産生されることが意図される任意のタンパク質であってもよいことは当業者には自明であるため、本発明の開示は開示された実施形態に限定されるものではない。開示した発明は、組換えヒトタンパク質にも制限されず、動物または植物のような他の種のタンパク質の製造に使用されてもよい。さらに、他の植物ベースの系も可能である。異なるプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子が異なる組換えヒトタンパク質または別の種のタンパク質に関与すること、および組換えタンパク質の産生のために異なる植物を使用する場合も考えられる。

Claims (22)

1. 組換えタンパク質の製造のための方法であって、
   − 植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む植物ベースの系を準備するステップと、
   − 組換えタンパク質をコードする遺伝子を植物ベースの系に送達するステップと、
   − 組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現のために植物ベースの系を培養するステップと
   を含む方法。
2. プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションが、遺伝子のノックアウト、下方調節または過剰発現を含む、請求項１に記載の方法。
3. 使用する植物細胞が、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）由来のものである、請求項１または２に記載の方法。
4. ヒメツリガネゴケの植物細胞が、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含む、請求項３に記載の方法。
5. 組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）の製造ための、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを使用して、少なくとも１つの植物特異的プロリルヒドロキシル化部位におけるプロリルヒドロキシル化を回避する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを使用することが、ヒト特異的プロリルヒドロキシル化をもたらす、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項１から７のいずれか一項に記載の方法に係る植物ベースの系で産生された、組換えタンパク質。
9. プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションが、遺伝子のノックアウト、下方調節または過剰発現を含む、請求項８に記載のタンパク質。
10. 植物ベースの系が、ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含む、請求項８または９に記載のタンパク質。
11. ヒメツリガネゴケの植物細胞が、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含む、請求項１０に記載のタンパク質。
12. 組換えタンパク質が、組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）である、請求項８から１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
13. 少なくとも１つの植物特異的プロリルヒドロキシル化部位において、プロリルヒドロキシル化がない、請求項８から１２のいずれか一項に記載のタンパク質。
14. 組換えタンパク質が、ヒト、動物または植物タンパク質である、請求項８から１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
15. 植物内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子のモジュレーションを含む、植物ベースの系。
16. 植物ベースの系が、ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞を含む、請求項１５に記載の植物ベースの系。
17. ヒメツリガネゴケ由来の植物細胞が、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００１７５３１８５のプロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含む、請求項１６に記載の植物ベースの系。
18. 植物ベースの系が、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｓｓ Ｓｔｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒにＩＭＳＣ番号４０２１８として寄託されているヒメツリガネゴケ変異体である、請求項１６に記載の植物ベースの系。
19. 組換えタンパク質の産生のための、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の植物ベースの系の使用。
20. 組換えタンパク質が、少なくとも１つの植物特異的プロリルヒドロキシル化部位においてプロリルヒドロキシル化されていない、請求項１９に記載の使用。
21. 医薬品またはバイオ医薬品の製造のための、請求項８から１４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の使用。
22. 組換えタンパク質の製造のための、ヒメツリガネゴケのモジュレートされた内在性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子の使用。

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