JP6524600B2

JP6524600B2 - 糸状真菌における微生物二次代謝産物の少なくとも１つのシンテターゼの異種発現により、前記二次代謝産物またはその誘導体を得るための方法

Info

Publication number: JP6524600B2
Application number: JP2017500432A
Authority: JP
Inventors: ベッカー，ジモン; ストルム，ディルク; メイヤー，ヴェラ; リヒター，レンナルト; ツォーベル，ゾフィア; ヴァンカ，フランツィスカ; ジェスムート，ロデリッヒ; メーレンヴェーグ，アグネス
Original assignee: テヒーニィシエウニヴェルジテートベルリン
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2019-06-12
Anticipated expiration: 2035-03-20
Also published as: CN106414481A; US10738316B2; WO2015140315A2; EP3119900A2; CA2943240C; WO2015140315A3; IL247880A0; DK3119900T3; US20170137832A1; IL247880B; JP2017508481A; EP3119900B1; CA2943240A1; ES2682743T3

Description

本発明は、請求項１に記載の微生物二次代謝産物、請求項１６に記載の発現カセット、請求項１７に記載のプラスミドベクター、請求項１８に記載のシクロデプシペプチド、請求項１９に記載の発現宿主および請求項２０に記載のキメラシクロデプシペプチドシンテターゼを得るための方法に関する。

近年のゲノム発掘の努力によって、糸状真菌のゲノムが、商業的に適用可能性がある予想外の豊富な低分子量化合物のレパートリーをコードすることが明らかになった。二次代謝産物として知られるこれらの天然産物は、薬理学的影響がある非リボソームペプチド、ポリケタイドおよびリポペプチドを含む。しかし、二次代謝経路に関与する遺伝子の殆どは、標準的な実験室または工業的条件下では発現されず、これにより天然産物の適用が妨げられる。したがって、分子的因子および培養方法に基づく様々な戦略がとられてきた。しかし、生産率が低いなど、克服すべき大きな障害が依然として存在する。

したがって、本発明は、微生物二次代謝産物またはその誘導体、特にシクロデプシペプチドを合成するための新規アプローチを記載する。

本方法は、少なくとも１つの糸状真菌における前記二次代謝産物の少なくとも１つのシンテターゼの異種発現の工程を含む。

糸状真菌は、好ましくは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐ．）、ペニシルム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍｓｐ．）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ．）およびリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐｐ．）の群から選択される。特に、好ましい発現宿主は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）である。

本方法の実施形態において、シンテターゼは、非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）、リボソーム合成および翻訳後修飾ペプチド（ＲｉＰＰ）、ポリケタイドシンテターゼ（ＰＫＳ）、テルペンシクラーゼまたはそのハイブリッドの群から選択される。シンテターゼがシクロデプシペプチドシンテターゼ、特に反復型のシクロデプシペプチドシンテターゼであれば特に好ましい。例えば、シンテターゼは、エンニアチン、ＰＦ１０２２、ボーベリシンおよびバシアノリドシンテターゼを含む群から選択されるシクロデプシペプチドシンテターゼである。

一般に、言及される真菌の１つにおいてさらなるＮＲＰＳ、例えばエポチロン、アクチノマイシン、ダプトマイシン、バリノマイシン、フンギスポリン（ｆｕｎｇｉｓｐｏｒｉｎ）またはブレオマイシンのＮＲＰＳなどを発現することも可能であり、かつ考え得る。

別の変異体において、真菌発現宿主におけるエリスロマイシン、ドキシサイクリンまたはゲルダナマイシンに対するものなど、ＰＫＳ系を発現させることが望ましい。

ネイティブシクロデプシペプチドシンテターゼは一般に、２つのモジュール：Ｄ−ヒドロキシカルボン酸を組み込むためのモジュール１、Ｌ−アミノ酸を組み込むためのモジュール２、およびさらに一般的にｎ＝６および８である環の大きさｎを決定するための第三のＰＣＰおよびＣ−ドメイン（モジュール３）を含む。エンニアチンシンテターゼなどのシクロデプシペプチドシンテターゼの典型例を図１に示す。

エンニアチンは、３Ｄ−ヒドロキシカルボン酸および３Ｌ−アミノ酸からなるヘキサシクロデプシペプチドである。主要な生成物は、エンニアチンＡ、ＢおよびＣであり、エンニアチンＡは３ｘＤ−Ｈｉｖ、３ｘＬ−Ｉｌｅを含み、エンニアチンＢは、３ｘＤ−Ｈｉｖ、３ｘＬ−Ｖａｌを含み、エンニアチンＣは３ｘＤ−Ｈｉｖ、３ｘＬ−Ｌｅｕを含む。Ｎ原子は何れの場合もメチル化されている。

エンニアチンは、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ．）、ベルトシリウム・ヘミプテリゲヌム（Ｖｅｒｔｃｉｌｌｉｕｍｈｅｍｉｐｔｅｒｉｇｅｎｕｍ）、ハロサルフェイア属（Ｈａｌｏｓａｒｐｈｅｉａｓｐ）に存在するエンニアチンシンテターゼにより合成される。エンニアチンＢの場合、モジュール１は、Ｄ−ヒドロキシ吉草酸に特異的であり、モジュール２はＬ−バリンに特異的であり、ＰＣＰ／Ｃ−ドメイン（モジュール３）は環数ｎ＝６を決定する。

例えばミセリア・ステリリア（Ｍｙｃｅｌｉａｓｔｅｒｉｌｉａ）に存在するＰＦ１０２２シンテターゼは、Ｄ−フェニル乳酸および／またはＤ−乳酸に特異的なモジュール１、Ｌ−ロイシンに特異的なモジュール２および環数ｎ＝８を決定するＰＣＰ／Ｃ−ドメイン（モジュール３）を含む。

例えばボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａｂａｓｓｉａｎａ）株ＡＴＣＣ７１５９からのボーベリシンシンテターゼは、Ｄ−ヒドロキシ吉草酸に特異的なモジュール１、Ｌ−フェニルアラニンに特異的なモジュール２およびｎ＝６である環数を決定するＰＣＰ／Ｃ−ドメイン（モジュール３）を含む。

別の好ましい実施形態において、キメラシクロデプシペプチドシンテターゼが使用され、このシンテターゼは、少なくとも２つの異なるシクロデプシペプチドシンテターゼのモジュールおよび／またはドメインから構成される。少なくとも１つのモジュールが第一のシクロデプシペプチドシンテターゼから選択され、少なくとも１つの第二のモジュールが別のシクロデプシペプチドシンテターゼから選択されると好ましい。例えば、シンテターゼが１つのシクロデプシペプチドシンテターゼのモジュール１と、別のシクロデプシペプチドシンテターゼのモジュール２および３とを含むことが可能である。

このようなハイブリッドまたはキメラシクロデプシペプチドシンテターゼの好ましい実施形態は次の配置を有し得る：
ａ）Ｄ−フェニル乳酸／Ｄ−乳酸に特異的なＰＦ１０２２シンテターゼからのモジュール１（例えばミセリア・ステリリア（Ｍｙｃｅｌｉａｓｔｅｒｉｌｉａ）から）、Ｌ−バリンおよびｎ＝６に特異的なエンニアチンシンテターゼからのモジュール２およびＰＣＰ／Ｃ−ドメイン（モジュール３）（例えばフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から；図１４、配列番号１参照）、または
ｂ）Ｄ−フェニル乳酸／Ｄ−乳酸に特異的なＰＦ１０２２シンテターゼからのモジュール１、Ｌ−フェニルアラニンおよびｎ＝６に特異的なボーベリシンシンテターゼからのモジュール２およびＰＣＰ／Ｃ−ドメイン（モジュール３）（図１８、配列番号２参照）。

一般に、何らかの他のモジュール／ドメインの組み合わせが可能である。例えば、モジュール１がエンニアチンまたはボーベリシンシンテターゼから選択され、モジュール２およびＰＣＰ／Ｃ−ドメイン（モジュール３）がＰＦ１０２２シンテターゼから選択されることが考えられ、かつ可能である。

しかし、ボーベリシンシンテターゼからのモジュール１およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で発現されることが示されている、シンテターゼ系としてのバシアノリドシンテターゼからのモジュール２およびＰＣＰ／Ｃ−ドメイン（モジュール３）を含むハイブリッドシクロデプシペプチドシンテターゼ系が既に知られており、本明細書により除外される（Ｙｕｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１３，４９：６１７６−６１７８）。しかし、この特異的なキメラシクロデプシペプチドシンテターゼは、糸状真菌での発現から除外されない。

本発明のさらなる実施形態において、少なくとも１つの糸状真菌の染色体に組み込まれる誘導性発現系は、少なくとも１つのシンテターゼの異種発現のために使用される。このような誘導性発現系は代謝に対して独立している。また構成的発現も一般に可能である。

変異体において、発現系は、少なくとも３つのモジュールからなる少なくとも１つの発現カセットを含む。この発現カセットは、テトラサイクリン依存性トランス活性化因子ｒｔＴＡ２の構成的発現のための第一のモジュールと、少なくとも１つの二次代謝産物シンテターゼの誘導性発現のためのｒｔＴＡ２依存性プロモーターを有する第二のモジュール（Ｔｅｔ−ｏｎ系）と、相同組み換えによる真菌ゲノムへのカセットの組み込みための第三のモジュールとを含み得る。

最も好ましい実施形態において、第一のモジュールは構成的プロモーターＰｇｐｄＡ−ｒｔＴＡ−ターミネーターＴｃｇｒＡを含み、第二のモジュールはオペレーター配列ｔｅｔＯ７−（ｔｅｔＯ配列の７個のコピー）−最小プロモーターＰｍｉｎ−二次代謝産物シンターゼ（ｅｓｙｎｌ）−ターミネーターｔｒｐＣ（ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２依存性プロモーターとしてのｔｅｔＯ７：：Ｐｍｉｎ付き）を含み、第三のモジュールは、ｐｙｒＧ遺伝子座でのプラスミドの相同組み込みのためのｐｙｒＧ^＊を含む。好ましいプロテアーゼ−陰性（ｐｒｔＴ）およびウラシル栄養要求体（ｐｙｒＧ）Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株への前記発現カセットを含むプラスミドベクターの形質転換後、ウリジン原栄養体形質転換体を選択し、精製し、サザン分析に供した。発現カセットを典型例として図２に示す。

他の選択系は、糸状真菌に対して確立された優性の（ハイグロマイシンまたはフレオマイシンなどの抗生物質）、栄養要求性または栄養性選択マーカーに基づき得る。

発現カセットの少なくとも１個のコピーを真菌ゲノムに組み込む。複数の発現カセットが真菌ゲノムに存在可能である。

本発明の別の変異体において、発現カセットは、代謝前駆体または代謝中間体の生合成酵素、特にデヒドロゲナーゼをコードするさらなる遺伝子を含む。例えば、アミノ酸を構成的に発現されるヒドロキシカルボン酸に変換するためにデヒドロゲナーゼを使用することにより、様々なヒドロキシカルボン酸の独立した合成が可能になる。

このさらなる遺伝子はまた、発現カセットの一部でなくてもよく、少なくとも１つの構成的、誘導性または抑制性のプロモーターを用いることによって、異なる染色体位置から発現され得る。

形質転換した真菌発現宿主を適切な培地中で増殖させる。前記シンテターゼの異種発現のために使用される培地は、タルカム、チタン、シリカまたは酸化アルミニウム粒子を含み得、タルカム粒子が特に好ましい。これらの粒子は、より小さい真菌ペレットの形成を支持する。

この培地は、グルコース、微量元素、カザミノ酸、ＭｇＳＯ_４、酵母抽出物をさらに含む。本方法のある改変形態において、グルコース濃度は１〜１０％、好ましくは２．５〜７．５％、最も好ましくは５％である。

シンテターゼの異種発現のために使用される培地が、５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭの少なくとも１つのヒドロキシカルボン酸またはその誘導体（例えば２０ｍＭＤ−ヒドロキシ吉草酸）および１０〜３０ｍＭ、好ましくは１５〜２５ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭの少なくとも１つのアミノ酸またはその誘導体（例えばＬ−バリン）を含むと好ましい。

それらの対応するエステルにより、Ｏ−アシル化ヒドロキシカルボン酸およびそれらの対応するエステルによりヒドロキシカルボン酸を置き換えることも一般に可能である。それによりメチルエステルが好ましい。

適切な誘導因子、例えば５〜２００μｇ／ｍＬ、特に１０〜１００μｇｍＬ、最も好ましくは１０〜５０μｇ／ｍＬドキシサイクリンまたは他の誘導因子、例えばテトラサイクリンまたはその誘導体を添加することによって発現の誘導が起こる。１０μｇ／ｍＬドキシサイクリンの添加が特に好ましい。誘導は、好ましくは、対数期に、特に回分培養または流加培養において行われる。誘導因子を１回または繰り返し添加し得る。

本発明のさらなる実施形態において、シンテターゼの異種発現のために使用される培地は、一般式（Ｉ）Ｒ^１−ＣＨＯＨ−ＣＯ_２Ｈ（式中、Ｒ^１は、
− それぞれの場合に１つ以上の酸素原子、硫黄原子、置換または一置換窒素原子、二重結合によって、および／またはタイプ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−および／または−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−の１つ以上の基によって割り込まれ得る、置換および非置換Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルケニル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルキニル、置換および非置換Ｃ_３〜Ｃ_１０−シクロアルキル、置換および非置換Ｃ_５〜Ｃ_７−シクロアルケニル、または
− アリール、ヘテロアリール、−ＣＨ_２−アリールまたは−ＣＨ_２−ヘテロアリール（ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されているかまたは非置換である）
を含む群から選択され得る）の少なくとも１つのＤ−またはＬ−ヒドロキシカルボン酸（またはそのラセミ混合物）を含む。

したがって、発現宿主の増殖中に培地にヒドロキシカルボン酸を供給し得る。しかし、ヒドロキシカルボン酸の少なくとも一部を発現宿主自体により合成させることも可能である。

部分Ｒ^１は、置換および非置換Ｃ_１〜Ｃ_１２−アルキル、置換および非置換Ｃ_３〜Ｃ_７−シクロアルキル、ならびに置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_１２−アルケニル、ならびに置換および非置換Ｃ_６〜Ｃ_１２アリール、特に−Ｃ_６Ｈ_５を含む群から選択することができる。

「置換される」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルケニルに関連して、次の置換基：ハロゲン、特にＦ、ＣＩ、Ｂｒ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、オキソ、保護オキソ、−Ｎ_３、Ｃ_３〜Ｃ_７−シクロアルキル、フェニル、ナフチル、アミノ、保護アミノ、一級、二級または三級アミノ、複素環、イミダゾリル、インドリル、ピロリジニル、Ｃ_１〜Ｃ_１２−アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_１２−アシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２−アシルオキシ、ニトロ、カルボキシ、カルバモイル、カルボキサミド、Ｎ−（Ｃ_１〜Ｃ_１２−アルキル）カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ_１〜Ｃ_１２−アルキル）カルボキサミド、シアノ、メチルスルホニルアミノ、チオール、Ｃ_１〜Ｃ_１０−アルキルチオおよびＣ_１〜Ｃ_１０−アルキルスルホニルのうち１つ以上による、１つ以上の原子、通常はＨ原子の置換に関する。置換される基は、同じまたは異なる置換基で１回または２回置換され得る。

上記の置換アルキル基の例には、２−オキソ−プロプ−１−イル、３−オキソ−ブト−１−イル、シアノメチル、ニトロメチル、クロルメチル、ヒドロキシメチル、テトラヒドロピラニルオキシメチ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｎｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙ）、トリチルオキシメチル、プロピオニルオキシメチル、アミノメチル、カルボキシメチル、アリルオキシカルボニルメチル、アリルオキシカルボニルアミノメチル、メトキシメチル、エトキシメチル、ｔ−ブトキシメチル、アセトキシメチル、クロルメチル、ブロムメチル、ヨードメチル、トリフルオルメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｒｍｅｔｈｙｌ）、６−ヒドロキシヘキシル、２，４−ジクロル（ｎ−ブチル）、２−アミノプロピル、１−クロルエチル、２−クロルエチル、１−ブロムエチル、２−ブロムエチル、１−フルオルエチル（ｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ）、２−フルオルエチル（ｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌ）、１−ヨードエチル、２−ヨードエチル、１−クロルプロピル、２−クロルプロピル、３−クロルプロピル、１−ブロムプロピル、２−ブロムプロピル（ｂｒｏｍｐｒｏｐｙｌ）、３−ブロムプロピル（ｂｒｏｍｐｒｏｐｙｌ）、１−フルオルプロピル（ｆｌｕｏｒｐｒｏｐｙｌ）、２−フルオルプトピル（ｆｌｕｏｒｐｔｏｐｙｌ）、３−フルオルプロピル（ｆｌｕｏｒｐｒｏｐｙｌ）、１−ヨードプロピル、２−ヨードプロピル、３−ヨードプロピル、２−アミノエチル、１−アミノエチル、Ｎ−ベンゾイル−２−アミノエチル、Ｎ−アセチル−２−アミノエチル、Ｎ−ベンゾイル−１−アミノエチル、Ｎ−アセチル−１−アミノエチルなどが含まれる。

上記の置換アルケニル基の例には、スチロリル、３−クロル−プロペン−１−イル、３−クロル−ブテン−１−イル、３−メトキシ−プロペン−２−イル、３−フェニル−ブテン−２−イル、１−シアノ−ブテン−３−イルなどが含まれる。

「アルキニル」という用語は、本明細書中で使用される場合、式Ｒ−Ｃ≡Ｃ−の部分、特にＣ_２〜Ｃ_５０−アルキニルに関する。Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルキニルに対する例には、エチニル、プロピニル、２−ブチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、２−ヘプチニル、３−ヘプチニル、４−ヘプチニル、５−ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル、ウンデシニル、ドデシニルならびに直鎖または分岐状アルキル鎖のジ−およびトリ−インが含まれる。

「オキソ」という用語は、二重結合を介して酸素原子と連結され、それによりケトまたはアルデヒド基が形成される炭素原子に関する。「保護オキソ」という用語は、２個のアルコキシ基により置換されるかまたは非環状または環状ケタール基を形成する置換ジオールと２回連結される炭素原子に関する。

「アルコキシ」という用語は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどのような部分に関する。好ましいアルコキシ基はメトキシである。

「Ｃ_３〜Ｃ_７−シクロアルキル」という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシルおよびシクロヘプチルのような基を含む。「Ｃ_５〜Ｃ_７−シクロアルケニル」という用語は、１，２もしくは３−シクロペンテニル環、１，２，３もしくは４−シクロヘキセニル環または１，２，３，４もしくは５−シクロヘプテニル環に関する。

好ましくはＲ^１は、メチル、エチル、−ＣＨ（ＣＨ_３）_２、プロピル、イソプロピル、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）_２、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）_３、ペンチル、ヘキシル、−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_５、−ＣＨ_２−Ｃｌ、−ＣＨ_２−Ｂｒ、−ＣＨ_２−Ｆ、−ＣＨ_２−Ｉ、−ＣＨ_２−Ｎ_３、−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２ＣＨ_３または−ＣＨ_２−シクロＣ_３Ｈ_５である。

本発明の別の好ましい実施形態において、シンテターゼの異種発現のために使用される培地は、少なくとも１つの一般式（ＩＩ）Ｒ^２−ＣＨＮＨ_２−ＣＯ_２Ｈ（式中、Ｒ^２は、
− それぞれの場合に１つ以上の酸素原子、硫黄原子、置換または一置換窒素原子、二重結合によって、および／またはタイプ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−および／または−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−の１つ以上の基によって割り込まれ得る、置換および非置換Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルケニル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルキニル、置換および非置換Ｃ_３〜Ｃ_１０−シクロアルキル、置換および非置換Ｃ_５〜Ｃ_７−シクロアルケニル
を含む基から選択され得る）の少なくとも１つのＤ−またはＬ−アミノ酸を含む。特にＲ^２は、−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_５（フェニル）、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）_２、−ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２である。

したがって、発現宿主の増殖中にアミノ酸を培地に供給し得る。培地へのアミノ酸の供給は、単に補助的な性質のものであり、全体的な発現収率を向上させる。しかし、アミノ酸、好ましくは天然のアミノ酸の少なくとも一部を発現宿主自体により合成させることも可能（および一般的）である。

発現宿主への形質転換前に、発現カセットはプラスミドベクターの一部となっている。

エンニアチンシンターゼとともに発現カセットを含むこのようなプラスミドベクターに対する例を図３に示す。この特定のプラスミドベクターにおいて、Ｅｓｙｎ遺伝子（エンニアチンシンテターゼ）をＴｅｔ−Ｏｎ発現ベクターｐＶＧ２．２にクローニングした。大型の遺伝子（９．４ｋｂ）のために、クローニングは、選択マーカーとしてｐｙｒＧを用いてＳＬＩＣおよび相同組み換え法により行った。しかし、他の適切なクローニング技術も適用可能である。

真菌、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの染色体への発現カセットの組み込み過程を典型例として図４に示す。ゲノムへの組み込みは、相同または異種組み換えによるものであり得、したがってこれにより、発現カセットの単一または多コピー組み込みの何れかを保有する形質転換体が得られる。

本方法によって、次の一般式（ＩＩＩ）

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は上記の意味を有し、Ｒ^３は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル部分、特に−ＣＨ_３部分であり、かつｍ＝３または４である）を含む、少なくとも１つのシクロデプシペプチドまたはその誘導体を合成できるようになる。好ましいシクロデプシペプチドを図１０に示す。図１１において、クロロ酢酸を供給することにより得られるクロロエンニアチンの分析データを示す。

好ましい変異体は、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−）（［３Ｃｌ−Ｌａｃ］３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［３Ｃｌ−Ｌａｃ］_２［Ｌａｃ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［３Ｃｌ−Ｌａｃ］_１［Ｌａｃ］_２エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−）（［３Ｃｌ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ２）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］２［Ｌａｃ］１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_２［Ｌａｃ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_１［Ｌａｃ］_２エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ２）、
− シクロ（−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−２−ヒドロキシイソバレリル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_２［Ｄ−Ｈｉｖ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−２−ヒドロキシ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_１［Ｄ−Ｈｉｖ］_２エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−アジドラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−アジドラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−アジドラクチル−）（［３Ｎ３−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−アジドラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−アジドラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［３Ｎ３−Ｌａｃ］２［Ｌａｃ］１エンニアチン）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−フルオロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−フルオロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−フルオロラクチル−）（［３Ｆ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−フルオロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−フルオロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−フルオロラクチル−）（［３Ｆ−Ｌａｃ］_２［Ｌａｃ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ヨードラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ヨードラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ヨードラクチル−）（［３Ｉ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ヨードラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ヨードラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［３Ｉ−Ｌａｃ］_２［Ｌａｃ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ヨードラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［３Ｉ−Ｌａｃ］_１［Ｌａｃ］_２エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−シクロプロピルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−シクロプロピルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−シクロプロピルラクチル−）（［３Ｃｐ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_１［３ＣｌＬａｃ］_２エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_２［３ＣＩＬａｃ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−プロパギルラクタト（ｐｒｏｐａｇｙｌｌａｃｔａｔ）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−プロパギルラクタト（ｐｒｏｐａｇｙｌｌａｃｔａｔ）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−プロパギルラクチル（ｐｒｏｐａｇｙｌｌａｃｔｙｌ）−）（［３Ｐｒ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ブロモラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−クロロラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−３−ラクチル−）（［３Ｂｒ−Ｌａｃ］_１［３ＣｌＬａｃ］_１［Ｌａｃ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｌ−バリル−ｄ_６−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−ｄ_６−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−ｄ_６−Ｄ−２−ヒドロキシ−イソバレリル−）（ｄ_１８エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルラクチル−）（［Ｐｈｅｌａｃ］_３ボーベリシン）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−フェニルラクチル−）（［Ｐｈｅｌａｃ］_３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［Ｐｈｅｌａｃ］_２［Ｌａｃ］_１エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−ラクチル−）（［Ｌａｃ］_３エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−Ｄ−バリル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｄ−ラクチル−）（［Ｐｈｅｌａｃ］_１［Ｌａｃ］_２エンニアチンＢ）、
− シクロ（−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−フェニルラクチル−Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−ラクチル−）（［Ｐｈｅｌａｃ］_２［Ｌａｃ］_１ボーベリシン）
である。

上記およびさらなる変異体の一部の化学構造を下記に示す：

分析適用、例えばマイコトキシン分析において標準物質として使用することができる同位体標識された、および／または特に重水素化された化合物を作製するために本方法を使用することがさらに可能であり、かつ好ましい。

図面を参照して次の実施例により本発明をさらに説明する。

図１は、シクロヘキサデプシペプチドシンテターゼ（本明細書ではエンニアチンシンテターゼ）のモジュール配置の概略図である。図２は、糸状真菌における組み込まれた、および誘導性の発現系の概略的な概観である。図３は、エンニアチンシンテターゼが入った発現プラスミドのベクターマップである。図４は、ｐｙｒＧ遺伝子座における単一および多重組み込み事象の概観である。図５は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における対応するシンターゼの異種発現により得られたエンニアチンＢの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図６は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における対応するシンターゼの異種発現により得られたエンニアチンＢのＭＳスペクトルである。図７は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における対応するシンターゼの異種発現により得られたエンニアチンＢのＭＳ／ＭＳスペクトルである。図８は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における対応するシンターゼの異種発現により得られたエンニアチンＢの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。図９は、エンニアチンＢのＸ線結晶構造である。図１０は、好ましいエンニアチン誘導体である。図１１は、クロロエンニアチンの分析データである。図１１ａは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から得られたボーベリシンに対する分析データである。図１２は、２つの真菌ＮＲＰＳコード配列間のモジュール全体の交換のためのストラテジーである。図１３は、ＰＦ１０２２−とエンニアチン／ボーベリシンシンテターゼとの間のモジュールを活性化するヒドロキシカルボン酸の交換のための選択された相同領域である。図１４は、ハイブリッド真菌ＮＲＰＳ作製の概観：ＰＦＳＹＮからのモジュール１とＥＳＹＮからのモジュール２とを含有するハイブリッドＰＦＳＹＮ／ＥＳＹＮの概略図である。新しいシクロヘキサデプシペプチドを作製するために、ヒドロキシカルボン酸特異性はＰＦ１０２２（Ｄ−ＰｈｅＬａｃ／Ｄ−Ｌａｃ）に由来し、アミノ酸特異性はＥＳＹＮ（Ｌ−Ｌｅｕ）に由来する。図１５は、キメラ［ＰｈｅＬａｃ］_０〜３−エンニアチン誘導体のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳである。溶媒Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨ入りの水、溶媒Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨ入りのＡＣＮ入りアセトニトリル。流速：０．２ｍＬ／分。ＥＳＩ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳ，Ｅｘａｃｔｉｖｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＨＰＬＣ１２００シリーズ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、１〜８分で５％〜１００％および次にさらに５分間で１００％Ｂの勾配とを用いて測定を行った。カラム：ＧｒａｃｅＧｒｏｍ−Ｓｉｌ１２０ＯＤＳ−４ＨＥ、２×５０ｍｍ、３μｍ。ＴＣＣ＝２０℃。図１６は、タンデムＭＳ測定によるキメラ［ＰｈｅＬａｃ］_０〜３−エンニアチンシクロデプシペプチドの同定である。ｍ／ｚ分率（ペプチドまたはエステル結合での切断）は、示されるような１個またはいくつかのアミノまたはヒドロキシ酸の喪失に対応する。溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：イソプロパノール。流速：０．４ｍＬ／分。ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＥＳＩ−Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄｒｕｐｏｌ−ＭＳ，６４６０シリーズ、ＵＨＰＬＣ１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。カラム：ＡｇｉｌｅｎｔＰｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ＥＣ−Ｃ１８３．０×５０ｍｍ。ＴＣＣ＝４５℃。図１７は、［ＰｈｅＬａｃ］_３−エンニアチンの構造式および分子式の決定のためのＨＲ−ＥＳＩ−ＯｒｂｉｔｒａｐＭＳである。図１８は、ボーベリシン（Ｄ−Ｈｉｖ）からＰＦ１０２２（Ｄ−ＰｈｅＬａｃ／Ｄ−Ｌａｃ）へのヒドロキシカルボン酸の仕様の変化である。図１９は、キメラ［ＰｈｅＬａｃ］_２〜３−ボーベリシン誘導体のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳである。溶媒Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨ入りの水、溶媒Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨ入りのＡＣＮ入りアセトニトリル。流速：０．２ｍＬ／分。ＥＳＩ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳ，Ｅｘａｃｔｉｖｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＨＰＬＣ１２００シリーズ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、１〜８分で５％〜１００％および次にさらに５分間で１００％Ｂの勾配とを用いて測定を行った。カラム：ＧｒａｃｅＧｒｏｍ−Ｓｉｌ１２０ＯＤＳ−４ＨＥ，２×５０ｍｍ，３μｍ。ＴＣＣ＝２０℃。図２０は、タンデムＭＳ測定によるキメラ［ＰｈｅＬａｃ］_２〜３−ボーベリシンシクロデプシペプチドの同定である。ｍ／ｚ分率（ペプチドまたはエステル結合での切断）は、示されるような１個またはいくつかのアミノまたはヒドロキシ酸の喪失に対応する。溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：イソプロパノール。流速：０．４ｍＬ／分。ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＥＳＩ−Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄｒｕｐｏｌ−ＭＳ、６４６０シリーズ、ＵＨＰＬＣ１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。カラム：ＡｇｉｌｅｎｔＰｏｒｏｓｈｅｌｌ１２０ＥＣ−Ｃ１８３．０×５０ｍｍ。ＴＣＣ＝４５℃。図２１は、供給依存性Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株から得られたｄ１８エンニアチンＢの抽出イオンクロマトグラムである。回収物中のエンニアチンの同定のために、この物質を内部標準として使用することができる。重水素化標準物質は依然として報告されていない。この系によって、重水素化エンニアチン変異体ならびにボーベリシン変異体の合成が可能となる。図２２は、［３−Ｂｒ−Ｌａｃ］_１［Ｌａｃ］_２エンニアチンＢの総イオンクロマトグラムおよび［３−Ｂｒ−Ｌａｃ］_１［Ｌａｃ］_２エンニアチンＢのタンデムＭＳである。図２３は、［３−Ｆ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢのタンデムＭＳである。図２４は、タンデムＭＳ［３−Ｎ_３−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢである。アジド基によって、エンニアチン変異体のさらなる化学的修飾のための１，３双極性シクロ付加が可能になる。図２５は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における前駆体依存型生合成（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｄｉｒｅｃｔｅｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）により得られた［３−Ｉ−Ｌａｃ］_３エンニアチンＢのタンデムＭＳである。ヨウ素含有エンニアチン変異体は脱離および置換反応を受ける。

Ａ．発現宿主としての糸状真菌
１．用語および定義：
・宿主：
〇アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する糸状真菌。
・依存性宿主：
〇前駆体（ヒドロキシ酸）を培地に添加した場合にのみシクロデプシペプチドを合成することができる宿主（例：Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株ＤＳ３．１）。
・非依存性宿主：
〇前駆体の添加なくシクロデプシペプチドを合成することができる宿主（例：Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株ＯＶ３．４）。

２．プロトコール：Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＰＥＧ介在性形質転換
Ｆ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕ）のｅｓｙｎ１遺伝子をプラスミドｐＶＧ２．２において組み込んで、Ｔｅｔ−ｏｎ系の３つ全ての構成成分：トランス活性化因子ｒｔＴＡの構成的発現のためのＰｇｐｄＡ：：ｒｔＴＡ２Ｓ−Ｍ２と、Ｄｏｘ依存性にｅｓｙｎ１発現に介在するｔｅｔＯ７：：Ｐｍｉｎ：：ｅｓｙｎ１と、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｐｙｒＧ遺伝子座に対する系の選択および標的化に必要なｐｙｒＧ^＊カセットとを含む、プラスミドｐＤＳ４．２（図３）を得た。

実施したＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の形質転換は、Ｐｕｎｔらにより記載される方法に基づく。使用された受容株はプロテアーゼ陰性（ｐｒｔＴ⁻）およびウラシル栄養要求体（ｐｙｒＧ⁻）であった。使用したコンストラクトは、突然変異ｐｙｒＧ遺伝子（ｐｙｒＧ^＊）を保有し、これにより、外来ＤＮＡの取り込み後および突然変異ｐｙｒＧ遺伝子バージョンのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（両突然変異が異なる位置にある）でのｐｙｒＧ^＊の相同組み換え後のみ、ウリジンを欠く培地上で形質転換体を増殖させることができるようになる。Ｔｅｔ−Ｏｎ発現系の調節下でエンニアチンシンテターゼを発現させた。

３．材料および溶液：
ＳＭＣ：
１．３３Ｍソルビトール
５０ｍＭＣａＣ１_２
２０ｍＭＭＥＳ緩衝液
ｐＨ５．８
ＴＣ：
５０ｍＭＣａＣ１_２
１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ
ｐＨ７．５
ＳＴＣ：
ＴＣ中１．３３Ｍソルビトール
ＰＥＧ緩衝液：
７．５ｇＰＥＧ−６０００
ＴＣ３０ｍＬまで
ＡＳＰ＋Ｎ（５０×）：
３５０ｍＭＫＣｌ
５５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４
３．５ＭＮａＮＯ_３
ｐＨ５．５
ビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）：
７６ｍＭＺｎＳＯ_４
１７８ｍＭＨ_３ＢＯ_３
２５ｍＭＭｎＣ１_２
１８ｍＭＦｅＳＯ_４
７．１ｍＭＣｏＣｌ_２
６．４ｍＭＣｕＳＯ_４
６．２ｍＭＮａＭｏＯ_４
１７４ｍＭＥＤＴＡ
プロトプラステーション（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏｎ）溶液：
トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）からの２５０ｍｇ分解酵素（Ｓｉｇｍａ）
ＳＭＣ１０ｍＬまで
ｐＨ５．６
ＭＭ：
２０ｍＬＡＳＰ＋Ｎ（５０×）
２０ｍＬグルコース（５０％）
２ｍＬＭｇＳＯ_４
１ｍＬビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）
Ｈ_２Ｏ１Ｌまで
（固形培地に対しては２％寒天を添加）
ＣＭ：
ＭＭ、次のものを供給：
１０ｍＬカザミノ酸（１０％）
５０ｍＬ酵母抽出物（１０％）
Ｈ_２Ｏ１Ｌまで
（固形培地に対しては２％寒天を添加）
形質転換プレート：
３２５．１９ｇスクロース
２０ｍＬＡＳＰ＋Ｎ
２ｍＬＭｇＳＯ_４
１ｍＬビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）
１２ｇ寒天
上層寒天：
３２５．１９ｇスクロース
２０ｍＬＡＳＰ＋Ｎ
２ｍＬＭｇＳＯ_４
１ｍＬビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）
６ｇ寒天

４．実験手順：
１００ｍＬのＣＭ（＋１０ｍＭウリジン）中で３０℃にて１２０ｒｐｍで１０〜１６時間、受容株（例えばＭＡ１６９．４またはＡＢ１．１３）を培養した。ミラクロスフィルター上で菌糸体を回収し、ＳＭＣで１回洗浄した。その後、回収した菌糸体をプロトプラステーション溶液（５０ｍＬ試験管中）に添加し、３７℃および８０ｒｐｍで１〜１．５時間温置した。顕微鏡によりプロトプラステーション（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏ）を確認した。次いで、ミラクロスフィルターに通してプロトプラストを回収し、ＳＴＣで１回洗浄した。１０℃および２０００ｒｐｍで１０分間、懸濁液を遠心した。上清をデカントし、１ｍＬのＳＴＣ中でペレットを穏やかに再懸濁した。懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、１０℃および６０００ｒｐｍで５分間遠心した。再び上清をデカントし、１ｍＬのＳＴＣ中でプロトプラストを再懸濁した。洗浄工程を２回繰り返した。各形質転換に対して、１００μＬのプロトプラスト、１０μｇプラスミドｐＤＳ４．２（１０μＬＨ_２Ｏ中）および２５μＬＰＥＧ緩衝液を５０ｍＬ試験管に添加し、穏やかに混合した。１ｍＬのＰＥＧ緩衝液を添加し、チューブを穏やかに混合した。５分後、２ｍＬのＳＴＣを添加し、混合した。２０〜２５ｍＬの上層寒天（４０℃に冷却）を混合物に添加し、調製した形質転換プレート（直径１５ｃｍ）上に注いだ。プレートを３０℃で３〜４日間温置した。その後、コロニー単離のためにＭＭプレート上に胞子を画線することによって形質転換体を２回精製した。精製した株をＰＣＲおよびサザンブロットにより分析して、受容株のゲノムへのプラスミドｐＤＳ４．２の適正な取り込みおよび挿入を確認した（図３参照）。

５．エンニアチンおよびクロロエンニアチンを合成する依存性宿主突然変異体ＤＳ３．１に対する分析データ（図９５〜１１）。
培養条件：エンニアチンの高収率産生のための最適条件を同定するために、統計ソフトウェアプログラムＭＯＤＥを用いて実験設計アプローチに従った。エシン１発現株ＤＳ３．１の振盪フラスコ培養において次のパラメーターを変動させた：培地組成（最小培地、完全培地、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）限定培地）、アミノ酸（特にＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン）補給（０〜２０ｍＭ）、ヒドロキシ酸（特にＤ−Ｈｉｖ）補給、０〜５０ｍＭ）、グルコース濃度（１〜５％）、温度、培養時間（１〜９２ｈ）およびＤｏｘ濃度（０〜２０μｇ／ｍＬ）。エンニアチン収率に主に影響したパラメーターはＤｏｘおよびＤ−Ｈｉｖであった。同定された最良の培地は、２０ｍＭＤ−Ｈｉｖ、２０ｍＭのアミノ酸のうち１つおよび１０μｇ／ｍＬＤｏｘを含有した。この培地組成によって、２００の係数でエンニアチン収率が向上した。グルコース濃度を５％に向上させることによって、およびタルカムを添加することによって、エンニアチン収率が約４．７５倍さらに上昇した。

エンニアチン産生培地（ＥＭ）：
２０ｍＬ＿ＡＳＰ＋Ｎ（５０×）
１００ｍＬグルコース（５０％）
２ｍＬＭｇＳＯ_４
１ｍＬビシュニアック（Ｖｉｓｈｎｉａｃ）
１０ｍＬカザミノ酸（１０％）
５０ｍＬ酵母抽出物（１０％）
１００ｍＬタルク（５０ｍＭＮａ−酢酸緩衝液、ｐＨ６．５中１０％）
Ｈ_２Ｏ１Ｌまで。

株ＤＳ３．１（５×１０^６個の胞子／ｍＬで接種）をＥＭ中２６℃および２５０ｒｐｍで培養した。１６時間後、１０ｍＭまたは２０ｍＭＤ−Ｈｉｖ、２０ｍＭＩ−Ｖａｌおよび１０μｇ／ｍＬＤｏｘを添加した。９２時間後にバイオマスを回収し、凍結乾燥し、エンニアチンＢを酢酸エチルで抽出した。

分析方法（図５〜９、１１参照）：
ＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅ４００ＮＭＲ分光計上でエンニアチンＢの^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを記録した。化学シフトは溶媒シグナルに対するδ−単位（ｐｐｍ）で与えられる。ＪａｓｃｏＦＴ−ＩＲ４１００分光計上でＩＲスペクトルを記録した。ＬＴＱＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ装置上でＥＳＩ−技術を用いたＨＲＭＳを行った。エンニアチン試料を直接質量分析計に注入した。

ＣＣＤ面積検出器ＳａｐｐｈｉｒｅＳおよびＭｏＫ_α線（λ＝０．７１０７３Å）を利用したグラファイト単色光分光器を備えたＯｘｆｏｒｄ−ＤｉｆｆｒａｃｔｉｏｎＸｃａｌｉｂｕｒ回折計上でエンニアチンＢの一次結晶構造決定のためのデータを回収した。フルオロポリアルキルエーテル油（ＡＢＣＲ）を用いて適切な結晶をグラスファイバーに接着させ、ゴニオスタットに移し、そこでデータ回収のために１５０Ｋに冷却した。使用したソフトウェアパッケージ：データ回収用のＣｒｙｓＡｌｉｓＣＣＤ、細胞精製およびデータ整理用のＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏ。

結果：
エンニアチンＢ：株ＤＳ３．１における１０００ｍｇ／ＬまでのエンニアチンＢの産生を得ることができ、ＭＲＭ分析によって検証した。

バイオマス（２７．５ｍｇ）および培地に１０ｍＭｄ−Ｈｉｖおよび２０ｍＭＩ−Ｖａｌが補給された形質転換体ＤＳ３．１の１Ｌ培養のブロスから３９３ｍｇの精製エンニアチンＢを単離することができた。

ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＩＲ、ＮＭＲおよびＸ線結晶解析によって単離エンニアチンＢを分析した（図５〜１０参照）：
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００．１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ＝５．１１（ｄ，^３Ｊ_Ｈ，Ｈ＝８．７Ｈｚ，３Ｈ），４．４９（ｄ，^３Ｊ_Ｈ，Ｈ＝９．７Ｈｚ，３Ｈ），３．１１（ｓ，９Ｈ），２．３２−２，２１（ｍ，６Ｈ），１．０５−０．８６ｐｐｍ（ｍ，３６Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ＝１７０．２５，１６９．３１，７５．６７，６３．２０，３３．２６，２９．９１，２７．９２，２０．４２，１９．３４，１８．７２，１８．５０ｐｐｍ；ＩＲ（ニート）：ｖ＝２９６３．６−２８７３．４（Ｃ−Ｈ，ＣＨ_３およびＣＨ），１７３６．１（Ｃ＝Ｏ，エステル），１６６０．９（Ｃ＝Ｏ，アミド），１１８３．６（Ｃ−Ｈ，イソプロピル）１０１１．０（ＣＯ，α−ヒドロキシカルボン酸）；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ［Ｃ_３３Ｈ_５７Ｎ_３Ｏ_９＋Ｎａ］^＋に対して計算：６６２．３９８７０；実測：６６２．３９８５９。

エンニアチン類似体の作製：
供給実験に対するプロトコール：
上記と同じ条件下で株ＤＳ３．１を培養した。Ｄ−Ｈｉｖの代わりに、対応するヒドロキシ酸クロロ酢酸を添加した（１０ｍＭ最終濃度）。回分または流加培養中に１回または異なる時間間隔で繰り返し供給を行った。

均等なアプローチによりボーベリシンが得られた（図１１ａ参照）。

Ｂ）ハイブリッドシンテターゼの生成のための方法および分析データ
１．キメラシンテターゼを作製するためのクローニングストラテジー（図１２〜１４、１８参照）：
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での異種発現のためにＴ７プロモーターを用いた発現プラスミドをＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。制限部位を介した高コピーｐＲＳＦ−Ｄｕｅｔ１プラスミドへの挿入によって、ＮＲＰＳをコードする全てのハイブリッド遺伝子のタンパク質発現をクローニングした。λ組み換え介在系によってコンビナトリアル生合成を行った。ＰＣＲ（Ｑ５−ポリメラーゼ、高フィデリティー、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を介して所望のドメインまたはモジュールの配列を増幅し、ｐＲＳＦ−Ｄｕｅｔ１にサブクローニングした。組み換え後に必要とされる選択マーカー（ストレプトマイシン耐性に対するコード配列）をサブクローニングした断片に１つの制限部位で組み込んだ。ストレプトマイシン耐性について陽性クローンをスクリーニングし、続いて隣接している１つのカッター部位（ｃｕｔｔｅｒｓｉｔｅ）の制限および自己ライゲーションによって耐性を除去した。３０℃で培養した元のＮＲＰＳ遺伝子がある所望のベクターでエレクトロコンピーテントであるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３細胞を形質転換して、λ−リコンビナーゼＲＥＤ（ｇａｍ、ｂｅｔ、ｅｘｏ）および１つのＤＮＡ保護タンパク質を有する熱不安定性プラスミドｐＩＪ７９０を確保する。アラビノースの添加によってリコンビナーゼ発現を誘導し、その後、７０塩基対以下のモジュール含有プラスミドを用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３細胞を形質転換して、重複相同領域として選択した（Ｇｕｓｔｅｔａｌ．／Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．１９９８後に改変）。

２．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるキメラシンテターゼでのキメラエンニアチンおよびボーベリシンの作製：
培養条件および抽出
３７℃で２０ｍＬのＬＢ培地中、２００ｒｐｍで一晩、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｌ２１ｇｏｌｄ細胞を予備培養した。比率１：１００で、主な培養物（５０ｍＬＬＢ培地）と予備培養物との接種物を３７℃で０．６のＯＤ_６００になるまで温置し、０．２５ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（ＣａｒｌＲｏｔｈ）で誘導し、タンパク質発現およびペプチド生成のために１８℃で２４〜４８時間、２００ｒｐｍでさらに温置した。細胞を回収し、細胞ペレットを５ｍＬのＭｅＯＨ（工業グレード）で抽出した。懸濁液を５分間にわたり超音波処理し、上清を蒸発させた。

ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳおよびタンデムＭＳでの分析（図１５〜１７、１９〜２５を参照）
複素解析のために、粗製抽出物を２００〜５００μＬのＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）中で溶解させ、懸濁し、固形物を１４０００×ｇで遠心した。新しい誘導体をスキャンするためにＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを行った。全測定に対して、本発明者らは、カラムおよびＨＰＬＣ／ＭＳ機器（ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８，２．１×５０ｍｍ；ＵＨＰＬＣ１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ、ＥＳＩ−Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄｒｕｐｏｌ−ＭＳ，６４６０シリーズ）に関してＡｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを使用した。移動相系を使用することによって、本発明者らは、Ｈ_２Ｏ中の０．１％のＨＣＯＯＨ（Ａ）およびＡＣＮ（Ｂ）を、２．５分間にわたり５％〜１００％および続いてさらに５．５分間で１００％Ｂの勾配で添加した。

Claims

少なくとも１つの非リボソーム性ペプチドまたはその放射性同位体標識されたものを得るための方法において、
糸状真菌アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ）において前記非リボソーム性ペプチドの少なくとも１つの非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）の異種発現の工程を含み、
前記非リボソーム性ペプチドシンテターゼが、エンニアチン、ＰＦ１０２２、ボーベリシンおよびバシアノリドシンテターゼを含む群から選択されるシクロデプシペプチドシンテターゼであり、
前記糸状真菌アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ）のゲノムに組み込まれる誘導性発現系が、前記少なくとも１つのシンテターゼの異種発現のために使用され、
前記発現系が、少なくとも１つの発現カセットを含み、前記少なくとも１つの発現カセットが、テトラサイクリン依存性トランス活性化因子ｒｔＴＡ２の構成的発現のための第一のモジュールと、少なくとも１つの二次代謝産物シンテターゼの誘導性発現のためのｒｔＴＡ２依存性プロモーターを有する第二のモジュールと、適切な選択マーカーを用いた相同または異種組み換えによる前記真菌ゲノムへの前記カセットの組み込みのための第三のモジュールとを含むことを特徴とする、方法。
請求項１に記載の方法において、前記非リボソーム性ペプチドシンテターゼが、少なくとも２つの異なるシクロデプシペプチドシンテターゼのモジュールおよび／またはドメインを含むことを特徴とする、方法。
請求項２に記載の方法において、前記非リボソーム性ペプチドシンテターゼが、１つのシクロデプシペプチドシンテターゼのモジュール１と、別のシクロデプシペプチドシンテターゼのモジュール２およびＰＣＰ／Ｃ−ドメインとを含むことを特徴とする、方法。
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記発現カセットが、代謝前駆体または代謝中間体の生合成酵素をコードするさらなる遺伝子を含むことを特徴とする、方法。
請求項４に記載の方法において、デヒドロゲナーゼをコードする前記さらなる遺伝子を含むことを特徴とする、方法。
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記シンテターゼの異種発現のために使用される培地が、タルク、チタン、シリカまたは酸化アルミニウム粒子を含むことを特徴とする、方法。
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記シンテターゼの異種発現のために使用される培地が、５〜２０ｍＭの少なくとも１つのヒドロキシカルボン酸および１０〜３０ｍＭの少なくとも１つのアミノ酸を含むことを特徴とする、方法。
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記シンテターゼの異種発現のために使用される培地が、一般式Ｒ^１−ＣＨＯＨ−ＣＯ_２Ｈ（式中、Ｒ^１は、
− それぞれの場合に１つ以上の酸素原子、硫黄原子、置換または一置換窒素原子、二重結合によって、および／またはタイプ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−および／または−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−の１つ以上の基によって割り込まれ得る、置換および非置換Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルケニル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルキニル、置換および非置換Ｃ_３〜Ｃ_１０−シクロアルキル、置換および非置換Ｃ_５〜Ｃ_７−シクロアルケニル、
− アリール、ヘテロアリール、−ＣＨ_２−アリールまたは−ＣＨ_２−ヘテロアリール（ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されているかまたは非置換である）
を含む群から選択され得る）の少なくとも１つのＤ−またはＬ−ヒドロキシカルボン酸を含むことを特徴とする、方法。
請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、前記シンテターゼの異種発現のために使用される培地が、一般式Ｒ^２−ＣＨＮＨ_２−ＣＯ_２Ｈ（式中、Ｒ^２は、
− それぞれの場合に１つ以上の酸素原子、硫黄原子、置換または一置換窒素原子、二重結合によって、および／またはタイプ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−および／または−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−の１つ以上の基によって割り込まれ得る、置換および非置換Ｃ_１〜Ｃ_５０−アルキル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルケニル、置換および非置換Ｃ_２〜Ｃ_５０−アルキニル、置換および非置換Ｃ_３〜Ｃ_１０−シクロアルキル、置換および非置換Ｃ_５〜Ｃ_７−シクロアルケニル
を含む群から選択され得る）の少なくとも１つのＤ−またはＬ−アミノ酸を含むことを特徴とする、方法。