ES2682743T3 - Procedimiento de obtención de péptidos no ribosómicos mediante expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico en Aspergillus niger - Google Patents
Procedimiento de obtención de péptidos no ribosómicos mediante expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico en Aspergillus niger Download PDFInfo
- Publication number
- ES2682743T3 ES2682743T3 ES15716435.1T ES15716435T ES2682743T3 ES 2682743 T3 ES2682743 T3 ES 2682743T3 ES 15716435 T ES15716435 T ES 15716435T ES 2682743 T3 ES2682743 T3 ES 2682743T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- synthetase
- substituted
- module
- expression
- enniatin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 title claims abstract description 15
- 108010019477 S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 108010000785 non-ribosomal peptide synthase Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 229930001118 polyketide hybrid Natural products 0.000 title claims abstract description 12
- 125000003308 polyketide hybrid group Chemical group 0.000 title claims abstract description 12
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 49
- -1 PF1022 Chemical compound 0.000 claims abstract description 47
- 108010002156 Depsipeptides Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229930191716 enniatin Natural products 0.000 claims abstract description 11
- MIZMDSVSLSIMSC-OGLSAIDSSA-N enniatin Chemical compound CC(C)C1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C1=O MIZMDSVSLSIMSC-OGLSAIDSSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 7
- 108010079684 beauvericin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- GYSCAQFHASJXRS-FFCOJMSVSA-N beauvericin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@@H](C(N(C)[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)O[C@@H](C(=O)N(C)[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)O[C@@H](C(=O)N1C)C(C)C)C(C)C)=O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GYSCAQFHASJXRS-FFCOJMSVSA-N 0.000 claims abstract description 7
- GYSCAQFHASJXRS-UHFFFAOYSA-N beauvericin Natural products CN1C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GYSCAQFHASJXRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- QVZZPLDJERFENQ-UHFFFAOYSA-N Bassianolide Natural products CC(C)CC1N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC1=O QVZZPLDJERFENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108010076663 bassianolide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108010081513 enniatins Proteins 0.000 claims description 34
- MIZMDSVSLSIMSC-UHFFFAOYSA-N Enniatin-B Natural products CC(C)C1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)C)N(C)C1=O MIZMDSVSLSIMSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- MIZMDSVSLSIMSC-VYLWARHZSA-N enniatin B Chemical compound CC(C)[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C1=O MIZMDSVSLSIMSC-VYLWARHZSA-N 0.000 claims description 30
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010083613 enniatin B synthetase Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 101710139235 PF 1022-synthetase Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 108010025723 beauvericin synthetase Proteins 0.000 claims description 5
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 5
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 4
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 239000000454 talc Substances 0.000 claims description 3
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 2
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 4
- 101001009851 Rattus norvegicus Guanylate cyclase 2G Proteins 0.000 claims 3
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 claims 3
- BCOSEZGCLGPUSL-UHFFFAOYSA-N 2,3,3-trichloroprop-2-enoyl chloride Chemical compound ClC(Cl)=C(Cl)C(Cl)=O BCOSEZGCLGPUSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims 2
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 claims 2
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims 2
- 101100480489 Arabidopsis thaliana TAAC gene Proteins 0.000 claims 2
- 102100034330 Chromaffin granule amine transporter Human genes 0.000 claims 2
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 claims 2
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 claims 2
- 101000641221 Homo sapiens Chromaffin granule amine transporter Proteins 0.000 claims 2
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 claims 2
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 claims 2
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 claims 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 claims 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims 2
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- 101100437998 Arabidopsis thaliana BZIP2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000651036 Arabidopsis thaliana Galactolipid galactosyltransferase SFR2, chloroplastic Proteins 0.000 claims 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101100119179 Fusarium oxysporum ESYN1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 claims 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 102100022662 Guanylyl cyclase C Human genes 0.000 claims 1
- 101710198293 Guanylyl cyclase C Proteins 0.000 claims 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 claims 1
- 101000957437 Homo sapiens Mitochondrial carnitine/acylcarnitine carrier protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000829958 Homo sapiens N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000724418 Homo sapiens Neutral amino acid transporter B(0) Proteins 0.000 claims 1
- 102100038738 Mitochondrial carnitine/acylcarnitine carrier protein Human genes 0.000 claims 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 claims 1
- 102100028267 Neutral amino acid transporter B(0) Human genes 0.000 claims 1
- ILQZHPWFOWCYND-SQZSLCRCSA-N PF1022B Chemical compound CC(C)C[C@@H]1N(C)C(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)OC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)OC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)OC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)OC1=O ILQZHPWFOWCYND-SQZSLCRCSA-N 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 claims 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 claims 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 abstract 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 3
- VOXXWSYKYCBWHO-QMMMGPOBSA-N (S)-3-phenyllactic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC1=CC=CC=C1 VOXXWSYKYCBWHO-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- NGEWQZIDQIYUNV-UHFFFAOYSA-N L-valinic acid Natural products CC(C)C(O)C(O)=O NGEWQZIDQIYUNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 3
- 125000005518 carboxamido group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- WICJNWLMJRLFKQ-NHODMIADSA-N (3s,6r,9s,12r,15s,18r)-4,10,16-trimethyl-3,9,15-tris(2-methylpropyl)-6,12,18-tri(propan-2-yl)-1,7,13-trioxa-4,10,16-triazacyclooctadecane-2,5,8,11,14,17-hexone Chemical compound CC(C)C[C@@H]1N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC1=O WICJNWLMJRLFKQ-NHODMIADSA-N 0.000 description 2
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 2
- WICJNWLMJRLFKQ-UHFFFAOYSA-N Enniatin-C Natural products CC(C)CC1N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC1=O WICJNWLMJRLFKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 2
- TWHBYJSVDCWICV-BHZTXFQCSA-N enniatin A Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)OC1=O TWHBYJSVDCWICV-BHZTXFQCSA-N 0.000 description 2
- TWHBYJSVDCWICV-UHFFFAOYSA-N enniatin A Natural products CCC(C)C1N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)OC1=O TWHBYJSVDCWICV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- OWKLJRMFTXDULF-NAVOZUGXSA-N (3S,6R,9S,12R)-3,6-dibenzyl-9,12-di(propan-2-yl)-1,4,7,10-tetrazacyclododecane-2,5,8,11-tetrone Chemical compound CC(C)[C@H]1NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H](NC1=O)C(C)C OWKLJRMFTXDULF-NAVOZUGXSA-N 0.000 description 1
- 125000004642 (C1-C12) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- LLAPDLPYIYKTGQ-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethyl Chemical group C[CH]N LLAPDLPYIYKTGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006083 1-bromoethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001478 1-chloroethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- 125000004776 1-fluoroethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(F)* 0.000 description 1
- HNEGJTWNOOWEMH-UHFFFAOYSA-N 1-fluoropropane Chemical group [CH2]CCF HNEGJTWNOOWEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005999 2-bromoethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000069 2-butynyl group Chemical group [H]C([H])([H])C#CC([H])([H])* 0.000 description 1
- KKZUMAMOMRDVKA-UHFFFAOYSA-N 2-chloropropane Chemical group [CH2]C(C)Cl KKZUMAMOMRDVKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004777 2-fluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(F)C([H])([H])* 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000751139 Beauveria bassiana Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 description 1
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241001149959 Fusarium sp. Species 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000243820 Polychaeta Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067973 Valinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005997 bromomethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- FCFNRCROJUBPLU-UHFFFAOYSA-N compound M126 Natural products CC(C)C1NC(=O)C(C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C)OC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)OC1=O FCFNRCROJUBPLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N daptomycin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 description 1
- 229960005484 daptomycin Drugs 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229930013356 epothilone Natural products 0.000 description 1
- 150000003883 epothilone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000005745 ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 125000005504 styryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000005017 substituted alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- FCFNRCROJUBPLU-DNDCDFAISA-N valinomycin Chemical compound CC(C)[C@@H]1NC(=O)[C@H](C)OC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)OC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)OC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)OC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)OC1=O FCFNRCROJUBPLU-DNDCDFAISA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K11/02—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof cyclic, e.g. valinomycins ; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Procedimiento de obtención de al menos un péptido no ribosómico, (NRP), o uno marcado isotópicamente, comprendiendo el procedimiento la etapa de expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico (NRPS) de dicho péptido no ribosómico en el hongo filamentoso Aspergillus niger, en el que la NRP sintetasa es una ciclodepsipéptido sintetasa seleccionada de entre el grupo que contiene Enniatin, PF1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa, en el que se utiliza un sistema de expresión inducible integrado en el genoma del hongo filamentoso Aspergillus niger para la expresión heteróloga de la al menos una sintetasa, en el que el sistema de expresión comprende al menos un casete de expresión que comprende un primer módulo para la expresión constitutiva del trans-activador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo módulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresión inducible de la al menos una sintetasa secundaria de un metabolito y un tercer módulo para la integración del casete en el genoma fúngico por recombinación homóloga o heteróloga utilizando marcadores de selección apropiados.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Procedimiento de obtencion de peptidos no ribosomicos mediante expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico en Aspergillus niger
La presente invencion se refiere a un procedimiento para obtener al menos un peptido no ribosomico, o uno marcado isotopicamente, comprendiendo el procedimiento:
la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de un peptido no ribosomico (NRPS) de dicho peptido no ribosomico en el hongo filamentosos Aspergillus niger,
en el que la NRP sintetasa es una ciclodepsipeptido sintetasa seleccionada de entre el grupo que contiene Enniatin, PF1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa,
en el que se utiliza un sistema de expresion inducible integrado en el genoma del hongo filamentoso Aspergillus niger para la expresion heterologa de al menos una sintetasa,
en el que el sistema de expresion comprende al menos un casete de expresion que comprende un primer modulo para la expresion constitutiva del transactivador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de al menos una sintasa de un metabolito secundario y
un tercer modulo para la integracion del casete en el genoma fungico por recombinacion homologa o heterologa utilizando los marcadores geneticos apropiados.
Descripcion
Los recientes esfuerzos de busqueda en el genoma han descubierto que los genomas de hongos filamentosos codifican un repertorio inesperadamente rico en compuestos de bajo peso molecular de relevancia comercial. Estos productos naturales conocidos como metabolitos secundarios incluyen peptidos no ribosomicos, poliquetidos y lipopeptidos con impacto farmacologico. Sin embargo, la mayona de los genes implicados en las rutas metabolicas secundarias no se expresan en condiciones convencionales de laboratorio o industriales, lo que impide la aplicacion de estos productos naturales. se han emprendido diferentes estrategias basadas en factores moleculares y procedimientos de cultivo. Sin embargo, hay aun obstaculos grandes para superarlo tal como las bajas tasas de produccion.
El documento de patente EP 1 215 281 A1 desvela un procedimiento para obtener al menos un peptido no ribosomico que comprende:
la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico (NPRS) de dicho peptido
no ribosomico en el hongo filamentoso Mycelia sterilia,
en el que la NRPS es la ciclodepsipeptido sintetasa PF100 sintetasa,
en el que se utiliza un sistema de expresion no integrado, no inducible para la expresion heterologa de la PF1022 sintetasa.
El documento MEYER, V. Y COL.: "Fungal Gene Expression on Demand: An Inducible, Tunable, and Metabolism- Independent Expression System for Aspergillus niger' (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 77, n° 9, May 2011, paginas 2975-2983) desvela un sistema de expresion integrado e inducible para Aspergillus niger que comprende un casete de expresion que comprende un primer modulo para la expresion constitutiva del transactivador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de al menos un polipeptido y un tercer modulo para la integracion del casete en el genoma fungico por recombinacion homologa o heterologa utilizando los marcadores geneticos apropiados. Este sistema de expresion se describe como una herramienta util para la sobreproduccion proteica en Aspergillus niger.
La presente invencion describe de esta manera una nueva estrategia para la smtesis de peptidos no ribosomicos, en particular ciclodepsipeptidos.
La presente invencion comprende la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico (NRPS). El hongo filamentoso es Aspergillus niger. La ciclodepsipeptido sintetasa es en particular una ciclodepsipeptido sintetasa del tipo iterativo. La ciclodepsipeptido sintetasa se selecciona de entre el grupo de Enniatin, Pf1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa.
En general tambien es posible y concebible expresar NRPS adicionalmente en uno de los hongos mencionados, tales como una NRPS de epotilona, actinomicina, daptomicina, valinomicina, fungisporina o bleomicina.
La ciclodepsipeptido sintetasa nativa normalmente comprende dos modulos: el modulo para la integracion de un acido D-hidroxicarboxflico, el modulo 2 para la integracion de un L-aminoacido y adicionalmente un tercer PCP y dominio C (modulo 3) para la determinacion del tamano del anillo n, normalmente n = 6 y 8. Un ejemplo tfpico de una ciclodepsipeptido sintetasa, tal como la Enniatin sintetasa se muestra en la Figura 1.
La Enniatin es un hexaciclodepsipeptido que consiste en 3 acidos D-hidroxicarboxflicos y 3 L-aminoacidos. Los principales productos son la Enniatin A, B y C, comprendiendo la Enniatin A 3x D-Hiv, 3x L-Ile, comprendiendo la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Enniatin B 3x D-Hiv, 3x L-Val y comprendiendo la Enniatin C 3x D-Hiv, 3x L-Leu. El atomo N esta metilado en cada caso.
La Enniatin se sintetiza por una Enniatin sintetasa que esta presente en Fusarium sp., Verticillium hempterigenum, Halosarpheria sp. En el caso del modulo 1 de la Enniatin B es espedfico para D-hidroxivalerato, el modulo 2 es espedfico para L-valina y PCP/dominio C (modulo 3) determinando el numero de anillo n = 6.
La PF1022 sintetasa, que es en el momento presente en Mycelia sterilia, comprende un modulo 1 espedfico para D- fenil-lactato y/o D-lactato, un modulo 2 espedfico para L-leucina y un PCP/dominio C (modulo 3) que determina un numero de anillo n = 8.
La Beauvericin sintetasa, por ejemplo, de la cepa ATCC7I59 de Beauveria bassiana, comprende un modulo 1 espedfico de D-hidroxivalerato, un modulo 2 espedfico para L-fenilalanina y un PCT/dominio C (modulo 3) que determina que el numero de anillo sea n = 6.
En otra realizacion preferida se utiliza una ciclodepsipeptido sintetasa quimerica, en la que la sintetasa esta fabricada de modulos y/o dominios de al menos dos ciclodepsipeptido sintetasas. Se prefiere que se escoja al menos un modulo de entre una primera ciclodepsipeptido sintetasa y se escoja al menos un segundo modulo de otra ciclodepsipeptido sintetasa. Por ejemplo, es posible que la sintetasa comprenda un modulo de una ciclodepsipeptido sintetasa y el modulo 2 y 3 de otra ciclodepsipeptido sintetasa.
Las realizaciones preferidas de dichas ciclodepsipeptido sintetasas hubridas o quimericas pueden tener las siguientes disposiciones:
a) un modulo 1 de la PF1022 sintetasa espedfica para el D-fenil-lactato/D-lactato (por ejemplo, de Mycelia sterilia), un modulo 2 y PCP/dominio C (modulo 3) de Enniatin sintetasa espedfica para L-valina y n = 6 (por ejemplo, de Fusarium oxysporum; vease la Figura 14, SEQ ID NO: 1), o
b) un modulo 1 de PF1022 sintetasa espedfica para D-fenil-lactato/D-lactato, un modulo 2 y PCR/dominio C (modulo 3) de Beauvericin Sintetasa espedfica para L-Fenilalanina y n = 6 (vease la Figura 16, SEQ ID NO: 2).
En general, es posible cualquier otra combinacion de modulo/dominio. Por ejemplo, se puede concebir y es posible que el modulo 1 se escoja de una Enniatin o Beauvericin sintetasa y el modulo 2 y PCP/dominio C (modulo 3)se escogen de la PF1022 sintetasa.
Sin embargo, ya se conoce un sistema de ciclodepsipeptido sintetasa hubrida comprende un modulo 1 de Beauvericin sintetasa y el modulo 2 y PCP/dominio C (modulo 3) de Bassianolide sintetasa como sistema de sintetasa, que se ha demostrado que se expresa en Saccharomyces cerevisiae, y por lo tanto esta exento (Yu y col., ChemComm., 2013, 49:6176-6178). Esta ciclodepsipeptido sintetasa quimerica espedfica no esta, sin embargo, exenta de expresion en hongos filamentosos. Se utiliza un sistema de expresion inducible integrado en el cromosoma de Aspergillus niger para la expresion heterologa de al menos una ciclodepsipeptido. Dicho sistema de expresion inducible es independiente del metabolismo. El sistema de expresion comprende al menos un casete de expresion que consiste en al menos tres modulos. El casete de expresion puede comprender un primer modulo para la expresion constitutiva del transactivador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo (sistema Tet-on) que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de al menos una metabolito sintetasa secundaria y un tercer modulo para integrar el casete en el genoma fungico por recombinacion homologa.
En una realizacion mas preferida el primer modulo comprende el promotor constitutivo PgpdA - rtTA - terminador TcgrA, el segundo modulo comprende la secuencia operadora tetO7 - (siete copias de la secuencia tetO) - el promotor mmimo Pmin - terminador trpC de la metabolito sintasa (esyn1) secundaria (con tetO7::Pmin como promotor dependiente de rtTA2S-M2) y el tercer modulo comprende pyrG* para la integracion del plasmido en el locus pyrG. Despues de la transformacion del vector plasirndico que comprende dicho casete de expresion en un negativo proteasa (prtT-) preferible y auxotrofo a uracilo (pyrG') se selecciono una cepa de A. niger de transformantes prototrofas de uridina, se purificaron y se sometieron a analisis de Southern. El casete de expresion se muestra ejemplarmente en la Figura 2.
Al menos una copia del casete de expresion se integra en el genoma fungico. Es posible que esten presentes en el genoma fungico multiples casetes de expresion.
En otra variante de la presente invencion el casete de expresion comprende enes adicionales que codifican enzimas biosinteticas de precursores metabolicos o intermediarios metabolicos, en particular deshidrogenasas. Por ejemplo, utilizando deshidrogenasas para la transformacion de aminoacidos en acidos hidroxicarboxflicos, que se expresan constitutivamente, que permite una smtesis independiente de diferentes acidos hidroxicarboxflicos.
Dichos genes adicionales puede que tampoco sean parte del casete de expresion y se pueden expresar desde diferentes localizaciones cromosomicas utilizando al menos un promotor constitutivo, inducible o represible.
El huesped de expresion Aspergillus niger transformado se cultiva en un medio de cultivo adecuado. El medio de cultivo que se utiliza para la expresion heterologa de la sintetasa puede comprender partfculas de talco, titanio, sflice
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
u oxido de aluminio, entre los que se prefieren las partfculas de talco. Estas partfculas soportan la formacion de pequenos aglomerados fungicos.
El medio de cultivo comprende, ademas, glucosa, elementos traza, aminoacidos, MgSO4, extractos de levadura. En una variante del presente procedimiento la concentracion de glucosa es del 1-10%, preferentemente del 2,5 al 7,5 %, mas preferentemente del 5 %.
Tambien que el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la ciclodepsipeptido comprende 5-50 mM, preferentemente 10-30 mM, mas preferentemente 20 mM de al menos un acido hidroxicarboxflico (por ejemplo 20 mM de D-hidroxivalerato) y 10-30 mM, preferentemente 15-25 mM, mas preferentemente 20 mM de al menos un aminoacido (por ejemplo, L-valina).
Tambien es posible en general tambien es posible remplazar el acido hidroxicarboxflico por sus esteres correspondientes, por acidos hidroxicarboxflicos O-acilados y sus esteres correspondientes. Por esto, se prefieren los metil esteres.
La induccion de la expresion se produce anadiendo el inductor apropiado, por ejemplo, 5-200 pg/ml, en particular 10100 pg/ml, mas preferentemente 10-50 pg/ml de doxiciclina u otros inductores tales como la tetraciclina o derivados de la misma. Se prefiere en particular la adicion de 10 pg/ml de doxiciclina. La induccion se lleva a cabo preferentemente en la fase exponencial, en particular en cultivo discontinuo o semi-continuo. El inductor se puede anadir una vez o repetidamente.
En una realizacion adicional de la presente invencion el medio de cultiva que se utiliza para la expresion heterologa de la ciclodepsipeptido sintetasa comprende al menos un acido D- o L-hidroxicarboxflico (o una mezcla racemica de los mismos) de formula general (I) R1-CHOH-CO2H, en el que R1 se selecciona de entre un grupo que comprende
- un C-i-C50-alquilo sustituido y no sustituido, un C2-C50-alquenilo sustituido y no sustituido, un C2-C50-alquinilo sustituido o no sustituido, un C3-C10-cicloalquilo sustituido y no sustituido, un Cs-Cz-cicloalquenilo sustituido o no sustituido, que en cada caso puede estar interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o mono-sustituidos, dobles enlaces y/o por uno o mas grupos del tipo -C(O)O-, - OC(O)-, -C(O)-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-, o
- un arilo, heteroarilo, -CH2-arilo, o -CH2-heteroarilo, en los que el arilo y heteroarilo estan sustituidos o no sustituidos.
Por lo tanto, se pueden anadir los acidos hidroxicarboxflicos al medio de cultivo durante el crecimiento del huesped de expresion. Sin embargo, tambien es posible que al menos uno de los acidos hidroxicarboxflicos se sintetice por el propio huesped de expresion.
El resto R1 se puede seleccionar de entre un grupo que comprende C-i-C-^-alquilo sustituidos o no sustituido, C3-C7- cicloalquilo sustituido y no sustituido y C2-C12-alquenilo sustituido y no sustituido y un C6-C-i2-arilo sustituido y no sustituido, en particular -C6-H5.
El termino “sustituido” en conexion con alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquenilo se refiere a la sustitucion de uno o mas atomos, habitualmente atomos de H, por uno o mas de los siguientes sustituyentes: un halogeno, en particular, F, Cl, Br, hidroxilo, hidroxilo protegido, oxo, oxo protegido, -N3, C3-C7 cicloalquilo, fenilo, naftilo, amino, amino protegido, amino primario, secundario o terciario, un anillo heterodclico, imidazolilo, indolilo, pirrolidinilo, C1-C12- alcoxilo, C1-C12-acilo, C1-C12-aciloxi, nitro, carboxi, carbamoilo, carboxamido, N-(C1-C12-alquilo) carboxamido, N,N- Di(C1-C12-alquilo) carboxamido, ciano, metil-sulfonilamino, tiol, C1-C10-alquiltio y C1-C10-alquilsulfonilo. Los grupos sustituidos pueden sustituirse una vez o dos veces con el mismo o diferentes sustituyentes.
Ejemplos para los grupos alquilo sustituidos anteriores comprenden 2-oxo-prop-1-ilo, 3-oxo-but-1-ilo, cianometilo, nitrometilo, clorometilo, hidroximetilo, tetrahidropiraniloximetilo, trietiloximetilo, propioniloximetilo, aminometilo, carboximetilo, aliloxicarbonilmetilo, aliloxicarbonilaminometilo, metoximetilo, etoximetilo, t-butoximetilo, acetoximetilo, clorometilo, bromometilo, yodometilo, trifluorometilo, 6-hidroxihexilo, 2,4-dicloro(n-butilo), 2-aminopropilo, 1 -cloretilo, 2-cloretilo, 1-bromoetilo, 2-bromoetilo, 1 -fluoroetilo, 2-fluoroetilo, 1-yodoetilo, 2-yodoetilo, 1-cloropropilo, 2- cloropropilo, 3-cloropropilo, 1-bromopropilo, 2-bromopropilo, 3-bromopropilo, 1 -fluoropropilo, 2-fluoroptopilo, 3- fluoropropilo, 1-yodopropilo, 2-yodopropilo, 3-yodopropilo, 2-aminoetilo, 1-aminoetilo, N-benzoilo-2-aminoetilo, N- acetilo-2-aminoetilo, N-benzoilo-1-aminoetilo, N-acetilo-1-aminoetilo y similares.
Ejemplos de los grupos alquenilo sustituidos anteriores comprenden estirolilo, 3-cloro-propen-1-ilo, 3-cloro-buten-1- ilo, 3-metoxi-propen-2-ilo, 3-fenilo-buten-2-ilo, 1-ciano-buten-3-ilo y similares.
El termino “alquinilo” como se utiliza en el presente documento se refiere a un resto de formula R-CEC-, en particular a un “C2-C50-Alquinilo”. Ejemplos de un C2-C50-alquinilo comprenden etinilo, propinilo, 2-butinilo, 2-pentinilo, 3- pentinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo, 2-heptinilo, 3-heptinilo, 4-heptinilo, 5-heptinilo, octinilo, noninilo, decinilo, undecinilo, dodecinilo, asf como di- y tri-inas de cadenas de alquilo lineales o ramificadas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El termino “oxo” se refiere a un atomo de carbono, que esta conectado con un atomo de ox^geno mediante un doble enlace formando de esta manera un grupo ceto o aldehido. El termino “oxo protegido” se refiere a un atomo de carbono, que esta sustituido por dos grupos alcoxi o esta conectado dos veces con un diol sustituidos que forma un grupo cetal no ciclico o ciclico.
El termino “alcoxi” se refiere a restos como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi y similares. Un grupo alcoxi preferido es metoxi.
El termino “C3-C7-cicloalquilo” comprende grupos como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. El termino “C5-C7-cicloalquenilo” se refiere a un anillo 1,2 o 3-ciclopentenilo, un anillo 1,2, 3, o 4-ciclohexinilo, o un anillo 1, 2, 3, 4 o 5-cicloheptenilo.
Preferentemente R1 es un metilo, etilo, -CH(CH3)2, propilo, isopropilo, -CH2-CH(CH3)2, butilo, isobutilo, tert-butilo, - CH2-C(CH3)3, pentilo, hexilo, -CH2-C6H5 -CH2-Cl, -CH2-Br, -CH2-F, -CH2-I, -CH2N3, -CH2-CECH, -CH2CH=CH2CH3 o - CH2-cicloC3H5.
En otra realization preferida de la presente invention el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la ciclodepsipeptido sintetasa comprende la menos un D- o L-aminoacido de formula general (II) R2-CHNH2-CO2H, en la que R2 se selecciona de entre el grupo que comprende
- C1-C50-alquilo sustituido o no sustituido, C2-C50-alquenilo sustituido o no sustituido, C2-C50-alquinilo sustituido o no sustituido, C3-C10-cicloalquilo sustituido o no sustituido, C5-C7-cicloalquenilo sustituido o no sustituido, que en cada caso pueden interrumpirse por uno o mas atomos de oxigeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o mono-sustituidos, dobles enlaces y/o por uno o mas de los grupos del tipo -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-. En particular R2 es -CH2-C6H5 (fenilo), - CH2-CH(CH3)2, - CH2(CH3)2.
Por lo tanto, el aminoacido se puede anadir al medio de cultivo durante el crecimiento del huesped de expresion. La alimentation de un aminoacido al medio de cultivo tiene solo un caracter de soporte y mejora el rendimiento total de expresion. Sin embargo, tambien es posible (y comun) que al menos uno de los aminoacidos, preferentemente los aminoacidos de origen natural son sintetizados por el propio huesped de expresion.
Antes de la transformation en el huesped de expresion, el casete de expresion es parte de un vector plasmidico.
Un ejemplo de dicho vector plasmidico comprende un casete de expresion con una Enniatin sintetasa se muestra en la Figura 3. En este vector plasmidico el gen Esyn (Enniatin sintetasa) estaba clonada en el vector de expresion TetOn pVG2.2. Debido que el gen es grande (9,4 kb) la donation se llevo a cabo por el procedimiento de recombination SLIC y homologo utilizando pyrG como marcador genetico. Sin embargo, tambien son aplicables otras tecnicas de clonacion adecuadas.
El proceso de integration del casete de expresion en el cromosoma de los hongos, tales como A. niger se muestra ejemplarmente en la Figura 4. La integracion en el genoma puede ser por recombinacion homologa o heterologa resultando de esta manera en transformantes que albergan integracion de una o multiples copias del casete de expresion.
El presente procedimiento permite la smtesis de al menos un ciclodepsipeptido que comprende la siguiente formula general (III)
en la que R1 y R2 tiene los siguientes significados, R3 es un resto C1-C3 alquilo, en particular un resto -CH3 y m = 3 o 4. Los ciclodepsipeptidos preferidos se muestran en la Figura 10. En la Figura 11, se muestran los datos analfticos de CloroEnniatin obtenidos por adicion de clorolactato.
Las variantes preferidas son
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-) ([3Cl-Lac]3
Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-)([3 C-Lac]2 [Lac]1 Enniatin
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-dorolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 Cl - Lac]i [Lac]2 Enniatin B)
- Cido(-L-valil-D-3-dorolactil-N-metil-L-valil-D-3-dorolactil-N-metil-L-valil-D-3-dorolactil-) ([3 Cl - Lac]3 Enniatin B 2)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil)([3Br-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 Br-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 Br - Lac]i [Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo(-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-) ([3 Br - Lac]3 Enniatin B 2)
- Ciclo(-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-2-hidroxiisovaleril-) ([3 Br-Lac]2 [D- Hiv]i Enniatin B)
- Ciclo(-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-2-hidroxi-lactil-N-metil-L-valil-D-2-hidroxi-isovaleril-) ([3 Br-Lac]i [D- Hiv]2 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-) ([3 N3-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 N3-Lac]2 [Lac]i Enniatin)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-) ([3 F-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-) ([3 F-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Cido(-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-) ([3 I-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 I-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 I-Lac]i [Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-ciclopropillactil-N-metil-L-valil-D-3-ciclopropillactil-N-metii-L-valil-D-3-ciclo-propillactil-)
([3 Cp-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-) ([3 Br-Lac]i [3 Cl Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-) ([3 Br-Lac]2 [3 Cl Lac]i Enniatin B)
- Cido(-N-metil-L-valil-D-propagillactat-N-metil-L-valil-D-propagillactat-N-metil-L-valil-D-propagillactil-) ([3 Pr-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-lactil-) ([3 Br-Lac]i [3 Cl Lac]i [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-L-valil-d6-D-2-hidroxi-isovaleril-N-metil-L-valil-d6-D-2-hidroxi-isovaleril-N-metil-L-valil-de-D-2- hidroxiisovaleril-) (di8 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-)
([PheLac]3 Beauvericin)
- Ciclo (-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-fenillactil-) ([PheLac]3 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([PheLac]2 [Lac]1 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-lactil-) ([Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-D-valil-D-fenilalanil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([PheLac]1 [Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-lactil-) ([PheLac]2 [Lac]1 Beauvericin)
Las estructuras qmmicas de algunas de las anteriores y variantes adicionales se muestran posteriormente:
Claims (17)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Procedimiento de obtencion de al menos un peptido no ribosomico, (NRP), o uno marcado isotopicamente, comprendiendo el procedimiento la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico (NRPS) de dicho peptido no ribosomico en el hongo filamentoso Aspergillus niger,en el que la NRP sintetasa es una ciclodepsipeptido sintetasa seleccionada de entre el grupo que contiene Enniatin, PF1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa,en el que se utiliza un sistema de expresion inducible integrado en el genoma del hongo filamentoso Aspergillus niger para la expresion heterologa de la al menos una sintetasa, en el que el sistema de expresion comprende al menos un casete de expresion que comprende un primer modulo para la expresion constitutiva del trans-activador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de la al menos una sintetasa secundaria de un metabolito y un tercer modulo para la integracion del casete en el genoma fungico por recombinacion homologa o heterologa utilizando marcadores de seleccion apropiados.
- 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque la NRP sintetasa comprende modulos y/o dominios de al menos dos ciclodepsipeptido sintetasas diferentes.
- 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado porque la NRP sintetasa comprende el modulo 1 de una ciclodepsipeptido sintetasa y el modulo 2 y el dominio PCP/C de otra ciclodepsipeptido sintetasa.
- 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el casete de expresion comprende genes adicionales que codifican las enzimas biosinteticas de los precursores metabolicos o intermediarios metabolicos.
- 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado porque los genes adicionales codifican deshidrogenasas.
- 6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende partfculas de talco, titanio, sflice u oxido de aluminio.
- 7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende 5-20 mM de al menos un acido hidroxicarboxflico y 10-30 mM de al menos un aminoacido.
- 8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende al menos un acido D- o L-hidroxicarboxflico de formula general R1-CHOH-CO2H, en la que R1 se selecciona de entre el grupo que comprende- un C-i-C50-alquilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquenilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquinilo sustituido y no sustituido, C3-C10-cicloalquilo sustituido y no sustituido, C5-C7-cicloalquenilo sustituido y no sustituido, que en cada caso puede estar interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o no sustituidos, enlaces dobles y/o por uno o mas grupos del tipo -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)- ,-NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-- arilo, heteroarilo,-CH2-arilo o -CH2-heteroarilo, en el que el arilo y heteroarilo estan sustituidos o no sustituidos.
- 9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende al menos un D- o L-aminoacido de formula general R2-CHNH2-CO2H,en la que R2 se selecciona de entre el grupo que comprende- un C1-C50-alquilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquenilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquinilo sustituido y no sustituido, C3-C10-cicloalquilo sustituido y no sustituido, C5-C7-cicloalquenilo sustituido y no sustituido, que en cada caso puede estar interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o no sustituidos, enlaces dobles y/o por uno o mas grupos del tipo -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)- ,-NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-
imagen1 metilacidnlP/rG*L-amino-acidohidroxi-carboxihcoModulo 1Modulo 2ciclacionenmatinKipactivacionCondensacionFigura 1Figura 2imagen2 PgpdA16000rtTA2S-M214000pDS 4.217244 pbTcgrAPmintetOT,isooo10000ESYNFigure 3IntegracionunicaNcoi NcolNcolNcol12,2 kb - 8.1kbIntegracionmultipleNcolNcolNcol12 2 kb17,2 kb8,1 ktFigura 4
imagen3 662,39851iOTO3COimagen4 .S sM ** Z S* zVP Bt-o ozz.«2> Hij2 SZ®"DOiw>as3S3*V:-simagen5 3imagen6 -g£*“*Simagen7 pep;su3)U|imagen8 toIT!COooCMAbundancia relativat-trwi-Kmtail-CtUWO-NCtlZ Sprite #1 KI.0,U1 AV I NLY.Zlfca T:FTM3 ♦ c ESI Fu* ms2 640,40@od12.001175,00-660,00]imagen9 Figura 7imagen10 heteroci'clicoimagen11 oyjV^(lA) soumbiv^^9Figura 10,\\acio (III)imagen12 ■65B/.eat Tiempo (min)Recuento vs Masa respecto a carga (mIt)(Chpa-N-Me-val)1001 9080ro1 ™E «irag 50I 40-•BW ;-(N-Me-Val-Chp3-N-Me-Val).(Chp*N-M»-Mal)-{N-Me-Van5452§ 30MS en tandem (Triple Quadrupol)HPLC-MS analitica (Orbitrap)[3-Cl-LacE enniatin BHPLC preparativa (fase inversa C18)Espectro de NMRFigura 11imagen13 BeauvcridnEICRecuento vs. Tiempo de adquisicion (min)jM+Na]806,4 - 2.75
- 2.251,250,75
- 772.4 [M+NH„r I H? 40,25[M+H]'Recuento vs. Masa respecto a carga m/z)x10 3(W-Me-Fhe-Hiv-fV-Me-Ptie-HIv-iV-Ms-Phe}
- 4.524*1-(Hiv-W-Me-POe-Hiv-M-Me-Phe)
- 3.5-(/V-Me-Phe-Hrv-W-Me- Phe)2 5-(Hiv-Af-Me-Phc)1.5(W-Me-Phe)133,8
- 523.10,5362,1 440,9784,3023 1100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800Recuento vs. Masa respecto a carga (m/zFigura 11a
imagen14 Estrep,EcoRi14152 pbplJ790Estrategia de intercambioRecombinacion en E. conRegion del vectorRegion ESynde protuberancia PCRprotuberancia PCRE, coliPlasmidosA-recombinasaProducto PCRModulo PF l/SmFigura 12imagen15 imagen16 Ciclodepsipeptidos - Intercambio de modulosPF1022-SintetasaEnniatin-SintetasaD-Lac/PheLacPF1022BEnniatin B[D-PheLac[3 EnniatinFigura 14CO-'J(Qamcnimagen17 Abundancia relativa (%)uAUimagen18 imagen19 COCDimagen20 PF1022Sintetasa Beauvericin-Sintetasaimagen21 Abundancia relativaimagen22 I!oH*NJAbundancia arelativa (%)imagen23 10& EIC 5,48E5 m/z 874lt= 12,87 50“12 87JLIOOt 50 ■: O'EIC 7,37E5 m/z 950t= 12,4513,451 ■2-f-rr-r-4Tttttttt-t6 8 . . 10Tiempo (min)11,85 |■ it i I'n1214n-|—i16imagen24 Figura 19[M+HrMS hj.D 4D I>*! I,= 2,815 rtf—;--------------------------------------------------------*i1 -[K,Q-D-PiM a'>L Nae-PlMMW-at-L-W-Wt -Phr] iaio^o ■[P*Phe!Laci,L’M''|i4g-Phg,&'iac4n«(V'si^g’Phe^5«[L -iV-M 0 - P h -S *0 ’Ph ft L SC.* L.»e j •-[D-PfMLsc-L-AWaft-PfteJ Iimagen25 f PheLac^Beauve ric inMSJt= 3,5 3& min-[H,0-D>^heLflC-L-iV'fiS&'Ph«-D-PheLaC'L«"Wfi-Ptse] [[M+4H]'- jny
- -JD4 PhtiLac4_^^j»h««JHi*Lac>L>W-M*.Ph6) j
- 4t,-fHMa-P!,»-Q44iaLac-LJMSK4»!is] j
- y -cn-piin! 31,-1.-!V.yi~fhe| j
xn WO «0 4» MO S» ®!) B5 TO TK *Recuento vs. Masa respecto de carga (mte)*50 m mimagen26 [PheLacJj-BeauvericinFigura 20imagen27 100658,5 - 202.1(d6 D-Hiv-N-Me-Val)-(N-Me-Val-d6 D-Hiv-N-Me-Va!)70326,1-(d6 D-Hiv-N-Me-Vat)■s SO439,25453020100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Recuento vs. Masa respecto a carga (m/z)Abundancia relativaFigura 21Abundancia relativa
imagen28 imagen29 imagen30 _ s idTiempo (min)imagen31 imagen32 Relative Abundance -n Abundancia relativaimagen33 imagen34 Figura 24imagen35 Seq ID No 1Sintetasa quimerica PF/Enniatin>PF/ESynATGTCAAACATGGCACCACTCCCTACGATGGGCGTTGAGCAGCAAGCCCT ATCACTTTCATGCCCCTTACTCCCTCATGACGATGAGAAACACTCAGACA ACCTTTACGAGCAAGCAACTCGGCACTTCGGCTTGAGCCGAGACAAGATC GAAAATGTCTTACCATGTACTTCCTTTCAATGTGATGTCATAGATTGCGC CGTC GACGAT CGGC G G CA TG CT AT CGGTCACGTCGTCTAT GATATC CCCA ATACAGTG GACATCCAGCGTTTAGCCGCAGCCTGGAAAGAGGTTGTGCGG CAGACACCAATCTT GAGGAC CGGCAT CT TT AC AT C AGAAACCGGCGACT C TTTTCAGATCGTCTTGAAAGAAGGCTGCCTACCGTGGATGTACGCGACAT GTCTCGGCATGAAGGGGGCAGTGATACAAGATGAAGCAGTCGCCGCTATG ACTGGACCGCGTTGCAATCGATATGTCGTCCTGGAGGACCCGAGTACGAA GCAAAG GC TG CT CATC T G GA.CATT CAGC CATGCT TT AGT G GATTATACAG TCCAGGAACGCATCCTTCAGCGGGTTCTCACAGTATACGACGGCCGGGAC GTCGAGTGCCCTCGCATCAAGGATACAGAACATGTCTCTCGGTTTTGGCA ACAACACTTTGAAGGCTTAGATGCCTCCGTATTTCCCCTTCTACCATCTC ACCTAACT GT GT GCAAT C CC AATG C G CG CG CAGAAC AT CATATC T CAT AC ACGGGACCAGTCCAGAGGAAGTGGTCCCATACAAGTATCTGTCGGGCTGC ACTCGCAGTTCTTCTATCTCGCTTTACACACTCTTCGGAGGCCCTCTTCG GTGTTGTGACAGAACAATCTCACAACTCCGAGGACCAAAGACGGTCAATT GATGGCCCCGCAAGGACAGTAGTGCCTATCCGCGTCCTTTGTGCCCCAGA TCAATATGTGTCGGATGTC ATTGGGGCAA.TC ACC GC AC ACGAAC AC GCC A TGCGCGGGTTTGAGCACGCTGGACTTCGCAATATCCGCCGTACCGGAGAC GACGGGTCTGCTGCTTGTGGATTCCAGACCGTGCTACTGGTGACTGACGG TGATGCTCCCAAGACCCCTGGGAGTGTACTTCATCGAAGTGTAGAAGAAT CGGATAGATTCATGCCCTGCGCTAATCGTGCCCTTCTGCTCGACTGCCAG ATGGCTGGCAACTCGGCATCCCTAGTCGCACGATATGATCATAATGTGAT CGAC CCAC GC CAGAT G TCTCGCTTCCTGCGACAGCTAGGATACC TGATCC AACAAT TT CAT CAT CACG T C GATC T G CC TC TGGT CAAAGAACTG GACGT C GTGACGGCGGAGGATTGTGC GGAAATCGAGAAATGGAATTCAGAAC GCCT AACAATGCAAGACGCCTTAATCCACGACACCATATCCAAGTGGGCTGCTG GCGATCCCAACAAAGC TGCAGTTTTC GC TTGGGATGGGGAATGGACATAC GCCGAGCTAGACAACATATCCTCCCGTCTCGCCGTGTATATCCAATCCCT GGAC TTGAGACCAGGA CAAGCAATACTCCCACTCTGCTTCGAGAAGTCAAAATGGGTCGTCGCCACAATTCTCGCCGTCCTCAAAGCCGGTCGGGCATTC ACACTCATCGACCCGTGCGACCCCTCGGCAAGGATGGCCCAGGTCTGTCA GCAGAC CT CCGC CACAGTCGCT CTCACC TC CAAACT CCACAACACCAC CT TACGTTCCGTCGTTTCCCGCTGCATTGTGGTCGACGACGACCTCCTTCGG TCCTTACCCCGCGCCGATGGCCGCTTAAAGGCCACCGTGAAGCCACAGGA CT T GGC CTAT GT T AT T T T CACAT C TGGCAGCACAGGAGAGCCGAAAGGCA TCATGATCGAACATCGGGGGTTCGTGTCGTGTGCTATGAAATTTGGCCCC GCGCTCGGAATGGATGAGCACACGCGCGCTCTTCAATTCGCCTCATATGC GTTTGGCGCTTGTCTGGTAGAAGTTGTGACAGCTCTGATGCACGGCGGCT GCC-TCTGCATCCCTTCCGATGACGATCGCTTGAACAATGTACCGGAGTTC ATCAAAAGGGCCCAGGTGAACTGGGTGATACTCACTCCGTCGTATATCGG GACATTCCAGCCGGAAGATGTCCCTGGACTACAAACACTGGTATTGGTTG GAGAACCTATCTCAGCGTCTATTCGGGATACCTGGGCCTCCCAGGTTCGA CTCCTGAATGCCTACGGTCAGAGTGAAAGCTCAACTATGTGCAGCGTCAC GGAAGT C A GC CC GC T CT CCC TC GAAC CG AAC AAT AT CG G TCGGGC T GT AG GCC-CACGATCCTGGATCATTGATCCCGACGAGCCTGATCGTCTTGCTCCA ATTGGCTGCATTGGAGAGCTAGTGATCGAAAGTCCGGGCATTGCGCGCGA CTATATCATCGCGCCGCCGCCGGACAAGTCCCCCTTTCTCCTAGCACCCC CGGCCTGGTATCCAGCCGGGAAATTATCCAACGCCTTTAAATTTTACAAG ACTGGAGATCTCGTGCGTTATGGACCTGACGGCACCATCGTCTGCCTGGG ACC-CAAAGATTCGCAAGTGAAGATCCGAGGGCAGCGCGTAGAGATCAGCG CAC-TGGAAGCCAGTCTACGACGACAACTACCTAGTGACATCATGCCCGTG GCCGAAGCTATCAAACGCTCGGATTCGTCAGGCAGCACAGTCTTGACTGC CTTCTTGATAGGGTCATCTAAGAGTTTATCTGCGGCAGACGCCGTTATCT TGC-ATCACGGTGCTACCAACGAGATAAACGCGAAGTTGCAGCAAATCCTT CCCCAGCATTCCGTTCCATCCTATTATATCCACATGGAAAATCTTCCTCG AACTGCCACCGGCAAAGCGGACAGGAAAATGCTTCGATCTATTGCTAGCA AGCTATTGGGTGAATTGTCTCAGAACGTGACATCTCAACCGATTGAGAAG CACGATGCCCCAGCAACTGGTATAGAGGTCAAGCTGAAGGAGCTTTGGTT TCTGAGCTTGAATCTTAATCCCAACTCTCAAGATGTCGGAGCGAGTTTCT TTC-ACTTAGGCGGAAATTCCATTATCGCCATCAAAATGGTAAACATGGCG AGGTCAGCTGGGATAGCACTGAAGGTATCCGACATATTCCAGAATCCCAC GCTCGCTGGTCTCAAGGCTATTGTCATTGGTACTTCGCTGCCATACAGCC TTATTCCCAAGGTTACCCGCCAAGGCCCTGTTAGCGAGCAGTCTTATGCG CAAAACAGAATGTGGTTCCTGGATCAGTTGTCTGAGGGTGCTTCATGGTA TCTGATTCCTTTCGCTGTGCGCATGCGAGGTCCGGTGGATGTTGATGCGT TGACGCGTGCTTTGCTCGCTCTTGAACAGCGTCATGAGACACTACGAACT ACATTTGAGAACCAAGATGGTGTTGGAGTCCAGATCATCCATGATAGACTCTCCAAAGAGCTACAAGTCATCGATGCCTTGGATGGTGACGAGGGTGGTC TCAAGACACT CT AC AAAGTAGAGACCAC CACATTC GACAT CACATCCGAA GCAGGCTGGAGCTCAACCCTCATCCGCCTCGGCAAAGACGATCACATTCT GTCTATCGTCATGCACCACATCATCTCCGACGGCTGGTCCATCGACGTTC TCCGCCGCGAACTCATCCAACTCTACGCCGCCGCTCTGCAGGGCAAGGAT CCTTCCTCCGCACTAACCCCCCTACCCATCCAGTACAGCGACTTCGCCGT GTGGCAGAAGCAGGAGGCCCAAGCAGCTGAGCACGAGAGGCAGCTCCAGT AC TGGAAGAAGCAACTCGCAGATAGTTCAC C T GC CAAGATCCCTAC CGACTTCCCCCGTCCAGATCTCCTGTCCGGTGACGCAGGCGTTGTGCCCGTTGCCATCGACGGCGAGCTGTATCAGAAACTAAGGGGCTTCTGCAACAAGCACA ACAGCACTGCCTTCTCCATCCTGCTCGCTGCTTTCCGCGCGGCGCATTAC CGTC7CACAGCCGTTGACGACGCCGTGATCGGCATCCCCATTGCAAACCG TAAC CGCT GGGAGC TGGAGAACAT GATT GGTT TCT T TGTCAACACGCAGT GTAT GC GCATCG CC GTTGAC GAGACGGATACATTT GAGAGTCTG GTGC GC CAGGT C AGAT CT AC CACT AC AG CT GC GT TT GC GC AC GAGGAT GT CC C C TT CGAGCGTGTCGTTTCAGCGCTTCAGCCTGGCCATAGAGATCTCTCGCGAA CACCGCTGGCACAGATAATGTTTGCTGTTCACTCGCAGAAGGACCTTGGA CGTTTCGAGCTGGAGGGTATCCAGTCTGAGCCTATCGCCAGCAAGGCCTA CACCAGATTCGATGTCGAGTTCCATCTGTTCCAACAGGCAGACGGACTGA AGC-GCAGTTGCAACTTTGCCACAGATCTCTTCAAGCCCGAAACTATCCAG AATGTTGTCAGCGTGTTTTTCCAGATTCTACGCCATGGCCTTGACCAGCC TGAGACGTGTATCTCGGTTCTTCCACTGACTGATGGAGTCGAGGAGCTTC GCAGGT T GGATC TGCTGGAAAT CAAGAG GACTAAC TAC CC TCGC GATT CG AGCGTGGTAGATGTCTTCCGCGAACAAGCTGCCGCCAACCCAGAGGTTAT CGCT GT TACCGACT CATCTT CT CGTCTGACTTATGCAGAGCTGGACAATA AGTC TGAGCTGC TC TCACGATGGCTTCGAC GACGTAAC TT GACG CCAGAG ACGCTGGTCAGTGTTCTTGCTCCCCGGTCTTGCGAGACTATCGTTGCCTA TGTTGGTATCCTCAAGGCGAACCTGGCGTATCTTCCTCTTGACGTGAGGT CC CC GG T G AC TC GT AT GAAG GAC ATC TT GT CG AGC G TG T C TGG AAACACC ATAGTTCTTATGGGCTCTGGGGTAGAGGATCCTGGCTTTGACTTACCGCA AC TAGAGC TC GTAC GCAT CACC GACACT TT C GATGAGAC CATC GAGGAC G TGCAAGACTCTCCCCAACCGTCTGCCACAAGCCTCGCCTACGTCGTCTTC ACAT CC GGTTCAAC TGGTAAAC CCAAGG GC GT CAT GAT CGAGCACCGGGC CATTGTGCGTCTCGTCAAGAGTGACAACTTTCCTGGCTTCCCCTCCCCCG CTCGCATGTCAAATGTCTTCAACCCTGCCTTCGACGGAGCCATCTGGGAG AT CAAC T GGATG CT CCTGAACGGCGGAACAGT CGT C TGCATCGACT AC CT GACCACCCTGGACGGCAAAGAGCTCGCTGCTGTGTTCGCCAAAGAGCGCG TCAACGCCGCCTTCTTCGCACCTGCGATGCTCAAGCTTTACCTCGTTGATGCGCGCGAGGCTTTGAAGAATCTTGACTTCCTTATTGTTGGAGGTGAGAG GTTCGATACCAAGGAAGCCGTGGAGGCCATGCCGCTTGTGAGAGGCAAGA TTGCCAATATCTATGGTCCGACTGAGGCTGGAATAATCAGCACGTGCTAT AACATC CC CAAGGATGAGGCTTACACCAAT GGTGTTCC CATTGGTGGAAG TATCTACAACTCTGGTGCCTACGTCATGGATCCTAACCAGCAACTTGTCG GCCTTGGCGTCATGGGAGAGCTTGTTGTTACCGGAGACGGTGTTGGTCGA GGCTACAC TAAC CCCGAGCT CAACAAGAAC CGCTTCATCGACAT CACCAT CGAGGGCAAGAC TTTCAAGGCTTACCGTAC TGGTGACCGGATGC GTGCAC GAC-TAGGCGACGGTCTCCTTGAGTTCTTCGGCCGCATGGACAACCAGTTC AAC-ATCCGCGGCAACCGTATCGAAGCAGGGGAAGTTGAGTCTGCCATGCT CAGCCTCAAGAATGTCCTTAACGCCGCCATTGTCGTCCGCGGGGGCGGAG AAGATGAAGGGCCACTCGAGATGGTCGGATTCATCGTCGCGGACGACAAG AAIGATAC CACGGAGGAGGAAGAGACAGGCAACCAAGT TGAGGGCTGG CA GGACCATTTCGAGAGTGGTATGTACTCGGATATCAGCACCGCCGTGGACC AATCTGCCATTGGAAACGACTTTAAGGGCTGGACTTCTATGTACGATGGT AAGGAT AT C GACAAG G GC GAGAT G CAG GAG T G GT T G GAC GACG C TA T T CA CACCCTGCATAACGGCCAGATCCCTCGCGATGTCCTCGAGATCGGTACCG GTAGTGGTATGATCCTGTTCAACCTCAACCCGGGCCTCAACAGCTACGTT GGTCTTGA.TCCATCCAAGTCAGCAGTCGAGTTCGTCAACAGAGCCGTCGA GTCCTCTCCCAAGTTCGCAGGAAAAGCCAAGGTCCACGTCGGCATGGCCA CAC-ACGTCAACAAACTCGGCGAAGTACACCCCGATCTCGTGGTCTTCAAC TCCGTTGTTCAATACTTCCCCACACCCGAGTATCTCGCCGAGGTCATCGA TGGCCTCATTGCCATCCCCAGCGTCAAGCGCATCTTCCTTGGCGATATCA GATCATATGCTACCAACGGACACTTCCTCGCCGCACGCGCCATCCACACG CTCGGCACCAATAACAACGCCACCAAGGATAG'GGTGCGCCAGAAGATCCA GGAGCTGGAGGATCGAGAGGAAGAGTTTCTCGTTGAGCCTGCCTTCTTCA CCACTCTGAAGGAGCGACGTCCAGATGTTGTCAAGCATGTTGAGATCATC CCCAAGAACATGAAGGCCACCAACGAACTCAGCGCCTATCGCTACACGGC TGTTGTGCATCTGCGGGATGAAACGGACGAACCTGTGTATCATATTGAGA AGC-ATAGCTGGGTTGACTTTGAGGCGAAGCAGATGGACAAGACGGCTCTT CrTGACCACCTGCGCCTCTCCAAGGATGCTATGAGTGTGGCGGTTAGCAA CATCACCTACGCCCACACTGCCTTTGAACGTCGTATCGTTGAGTCTCTCG ArC-AGGATAGCAAGGATGACACCAAGGGTACACTCGATGGTGCAGCCTGG CTCTCAGCAGTTCGCTCCGAAGCCGAAAACCGCGCCTCACTCACCGTCCC CGACATCCTGGAGATCGCCAAAGAGGCTGGTTTCCGAGTTGAAGTCAGCG CrC-CTCGCCAGTGGTCCCAAAGTGGTGCTTTAGACGCAGTCTTCCACCAC TrTCCACCCTCCAGCACTGACCGCACTCTAATCCAGTTCCCCACGGACAA CGAGCTTCGATCATCACTCACCCTCGCCAACCGCCCTCTCCAGAAGCTGCAGCGCCGTCGTGCCGCTCTGCAAGTCCGCGAGAAGCTCCAGACGCTGGTC CCGTCTTACATGGTTCCTCCGAATATCGTGGTGCTGGACACGATGCCTCT CAAT AC T AAC GG CAAG AT C GAC AGAAAG GA GCTTACGCGT AGAG CAC G AA CACTGCCGAAGCAGCAGACTGCGGCGCCTGTGCCGGACTTCCCTATCTCT GATATCGAGATCACGCTGTGCGAGGAGGCAACTGAGGTCTTTGGAATGAA GGTTGAAATCAGCGATCACTTCTTCCAGCTCGGCGGTCACTCTCTCCTCG CTACGAAACTCATTTCTCGCATCCAGCACCGTCTCCATGTGCGGGTTACT GT GAAGGAC GTATTC GACAGC C C T GT CTTT GC CGATC T GGCAGT CAT C AT CCC-TCAAGGACTTGCTATGCAGAACCCTGTTGCTGAAGGACAGGACAAGC AAGGCTGGTCCTCGAGAGTTGCCCCTCGTACAGAAGTCGAGAAGATGCTG TGCGAGGAGTTCGCAGCTGGTCTTGGTGTCCCGGTTGGTATCACTGACAA CTTCTTCGATCTCGGTGGTCACTCGCTCATGGCTACTAAGCTAGCTGTGC GAATTGGCCGTCGCCTTGATACCGCCATCACAGTCAAGGACATCTTCGAC TACCCTGTGCTTTTCCAATTGGCGAAGAAGTTGGAGTCTTCGCATTCCAA GAGCTACGAGGAGTCTGGCGACGATATCCAGATGGCCGATTACACTGCAT TC CAGCTC CTCGAT C TGGAAGACC CCCAAGACITTGTT CAGTCC CAGATT CGGCCTCAACTGGACTCCTGCTACGGCACCATCCAGGATGTCTACCCGTC TACGCAGATGCAAAAGGCCTTCCTCTTCGATCCCACGACCGGCGAGCCCC GAGGTCTTGTGCCTTTCTATATCGACTTCCCCAGCAATGCAGATGCCGAG ACCCTCACCAAGGCTATCGGAGCTCTAGTTGACAAGCTCGATATGTTCAG AACT GTCT TCCT GGAGGCCGCAGGCGATCT GTACCAAGTT GTCGTT GAGC AC C T C AAC T T GC C T AT T G A G A.C CAT C GA GA C T GAG AAG AAC GT C AAC ACT GCAA C C GG T GAC TACCTGGATGTTCATGGAAAGGAC CCTGTCCGTC TAGG CCACCCGTGCATCCAATTCGCCATCCTGAAGACTGCCTCCTCTGTACGTG TTCTCCTGCGAATGTCCCACGCTCTGTATGATGGTTTGAGTTTTGAGTAC ATCGTCCGTGGTCTCCACGTTCTCTACAGCGGTAGAAACCTCCCCCCACC AACACAGT T T GC GCGATACATGCAGTAT GC T G CACACAG T CGTGAAGAAG GTTATCCCTTCTGGCGCGAGGTTCTGCAGAACGCGCCCATGACAGTTCTA CACGACACCAATAACGGTATGTCTGAGCAAGAGATGCCAGCCTCCAAGGC GGTACACCTGTCAGAGGTCGTCAACGTTCCAGCGCAAGCTATTCGAAACA GTACCAACACCCAAGCGACCGTCTTCAACACCGCCTGTGCCCTTGTCCTA GCCAAGGAATCCGGCTCACAGGATGTCGTCTTCGGCCGTATTGTCTCTGG TCC-ACAAGGTCTACCAGTCGTCTGGCAGGACATCATCGGCCCCTGCACAA ACC-CCGTGCCCGTCCACGCACGCGTCGACGATGGAAACCCCCAACGCATC ATCCGCGACCTACGCGACCAATACCTCCGCACTCTGCCCTTCGAATCGCT TGC-CTTCGAGGAAATCAAGCGTAACTGCACGGACTGGCCCGAAGAATTGA CCAACTTCTCTGTCTGCGTGACGTACCACAACTTCGAGTACCACCCCGAG AGCGAAGTTGACAACCAAAAGGTTGAGATGGGAGTTTTGGCAAAGTATGTTGAGTTGAGTGAAAACGAGCCGCTGTACGATCTTGCTATTGCGGGAGAGGTTGAGGCGGATGGAGTTAACCTGAAGGTCACTGTTGTTGCAAAGGCAAGGCTTTACAATGAGGCGAGGATTAGACATGTGCTTGAGGAAGTTTGCAAAACTTTCAATGGTTTGAACGAGGCTTTGTAGSea ID No. 2Sintetasa quimerica PF/Beauvericin>PF/BeauvATGTCAAACATGGCACCACTCCCTACGATGGGCGTTGAGCAGCAAGCCCT AT CAC T TT CAT GC C CC T T AC T C C C TCAT GAC GAT GAGAAACACT C AGACA ACCTTTACGAGCAAGCAACTCGGCACTTCGGCTTGAGCCGAGACAAGATC GAAAATGrCTTACCATGTACTTCCTTTCAATGTGATGTCATAGATTGCGC CGTCGACGATCGGCGGCATGCTATCGGTCACGTCGTCTATGATATCCCCA ATACAGTGGACATCCAGCGTTTAGCCGCAGCCTGGAAAGAGGTTGTGCGG CAGACACCAATCTTGAGGACCGGCATCTTTACATCAGAAACCGGCGACTC TTTTCAGATCGTCTTGAAAGAAGGCTGCCTACCGTGGATGTACGCGACAT GTCTCGGCATGAAGGGGGCAGTGATACAAGATGAAGCAGTCGCCGCTATG ACTGGACCGCGTTGCAATCGATATGTCGTCCTGGAGGACCCGAGTACGAA GCAAAGGCTGCTCATCTGGACATTCAGCCATGCTTTAGTGGATTATACAG TCCAGGAACGCATCCTTCAGCGGGTTCTCACAGTATACGACGGCCGGGAC GTCGAGTGCCCTCGCATCAAGGATACAGAACATGTCTCTCGGTTTTGGCA ACAACACTTTGAAGGCTrAGATGCCTCCGTATTTCCCCTTCTACCATCTC ACCTAACTGTGTGCAATCCCAATGCGCGCGCAGAACATCATATCTCATAC ACGGGACCAGTCCAGAGGAAGTGGTCCCA.TACAAGTATCTGTCGGGCTGC ACTCGCAGTTCTTCTATCTCGCTTTACACACTCTTCGGAGGCCCTCTTCG GTGTTGTGACAGAACAArCTCACAACTCCGAGGACCAAAGACGGTCAATT GATGGCCCCGCAAGGACAGTAGTGCCTATCCGCGTCCTTTGTGCCCCAGA TCAATATGTGTCGGATGTCATTGGGGCAATCACCGCACACGAACACGCCA TGCGCGGGTTTGAGCACGCTGGACTTCGCAATATCCGCCGTACCGGAGAC GACGGGTCTGCTGCTTGTGGATTCCAGACCGTGCTACTGGTGACTGACGG TGATGCTCCCAAGACCCCTGGGAGTGTACTTCATCGAAGTGTAGAAGAAT CGGATAGATTCATGCCCrGCGCTAATCGTGCCCTTCTGCTCGACTGCCAG ATGGCTGGCAACTCGGCATCCCTAGTCGCACGATATGATCATAATGTGAT CGACCCACGCCAGATGTCTCGCTTCCTGCGACAGCTAGGATACCTGATCC AACAATTTCATCATCACGTCGATCTGCCTCTGGTCAAAGAACTGGACGTC GT GAC GGC GGAG GATT GT GC GGAAATCGAGAAATGGAATTCAGAAC GC CT AACAATGCAAGACGCCTTAATCCACGACACCATATCCAAGTGGGCTGCTG GCGATCCCAACAAAGCTGCAGTTTTCGCTTGGGATGGGGAATGGACATAC GCCGAGCrAGACAACATATCCTCCCGTCTCGCCGTGTATATCCAATCCCT GGACTTGAGACCAGGACAAGCAATACTCCCACTCTGCTTCGAGAAGTCAA AATGGGTCGTCGCCACAATTCTCGCCGTCCTCAAAGCCGGTCGGGCATTC ACACTCATCGACCCGTGCGACCCCTCGGCAAGGATGGCCCAGGTCTGTCAGCAGACCTCCGCCACAGTCGCTCTCACCTCCAAACTCCACAACACCACCT TACGTTCCGTCGTTTCCCGCIGCATTGTGGTCGACGACGACCTCCTTCGG TCCTTACCCCGCGCCGATGGCCGCTTAAAGGCCACCGTGAAGCCACAGGA CTTGGCCTATGTTATTTTCACATCTGGCAGCACAGGAGAGCCGAAAGGCA TCAT GATCGAACAT CGGGGG TT CGTGT C GT GT GC TATGAAATTT GGCC CC GCGCTCGGAATGGATGAGCACACGCGCGCTCTTCAATTCGCCTCATATGC GTTTGGCGCTTGTCTGGTAGAAGTTGTGACAGCTCTGATGCACGGCGGCT GCC-TCTGCATCCCTTCCGATGACGATCGCTTGAACAATGTACCGGAGTTC AT CAAAAGGGCC CAGGTGAACT GGGT GATACT CAC T C C G T C GTA TATC GG GACATT CC AG CC GG AAG AT G TC CC TGGAC T AC AA AC AC T G GTAT T G GT TG GAGAACCTATCTCAGCGTCTATTCGGGATACCTGGGCCTCCCAGGTTCGA CTCCTGAATGCCTACGGTCAGAGTGAAAGCTCAACTATGTGCAGCGTCAC GGAAGTCAGCCCGCTCTCCCTCGAACCGAACAATATCGGTCGGGCTGTAG GC G C AC GATC CT GG AT CAT T GA TCC C GAC GAG CC T G AT C G TCT T GC TC CA AT T G GC TGCATT GGAGAGC T AG TGAT C G AAAG TC C G G G CATTGC GC GC GA CTAT AT CATC GC GC CGC C GC CG GAC AAG TCCCCCTTTCTC CTAG C ACC CC CGGC CT GGTATC CAGCCGGGAAATTAT C CAAC GC CT T TAAATTT TACAAG ACTGGAGATCTCGTGCGTTATGGACCTGACGGCACCATCGTCTGCCTGGG ACGCAAAGATTCGCAAGTGAAGATCCGAGGGCAGCGCGTAGAGATCAGCG CAGT GGAAGC CAGT CTAC GA CGACAAC T AC CTAGT GACAT CAT G C C CG TG GCCGAAGCTATCAAACGCTCGGATTCGTCAGGCAGCACAGTCTTGACTGC CT T C TT GATAGG GT CATC TAAGAGTT TATC TG CGGCAGAC GCCG T TAT CT TGGATCACGGTGCTACCAACGAGATAAACGCGAAGTTGCAGCAAATCCTT CCCCAGCATT CC GT TCCATC CT ATTATATC CACATGGAAAATCT TC CT CG AACTGCCACCGGCAAAGCGGACAGGAAAATGCTTCGATCTATTGCTAGCA AGCTATTGGGTGAATTGTCTCAGAACGTGACATCTCAACCGATTGAGAAG CACGATGCCCCAGCAACTGGTATAGAGGTCAA3CTGAAGGAGCTTTGGTT TCTGAGCTTGAATCTTAATCCCAACTCTCAAGATGTCGGAGCGAGTTTCT TTGACTTAGGCGGAAATTCCATTATCGCCATCAAAATGGTAAACATGGCG AGGTCAGCTGGGATAGCACTGAAGGTATCCGACATATTCCAGAATCCCAC GCTTGCTCGTCTTCAGGCCGTGATGAGCGGCGATTCTACGCCCTCGACCA TCACGACGCCCTTTGCCACCATTCCGGCGTCGACTTGGGACGGACCCGTT GAGCAGTCTTACTCTCAAGGTCGATTGTGGTTCCTCGACCAGCTGGATAT TGGAGCrGTATGGTACCTGATACCTTATGCCGTTCGCATGCGGGGAGCTC TCAACATT GACG CT CTACGTGCTGCTCTGCTGGCGTTGGAGCAGCGACAC GAGACC CTGC GGACGACCTT TGAGAACCAAAACGGTGTAGGAGTGCAGAT TGTTCACCAAAGACTTGCCAAGGAGCTGAAAATTATCGATGCGTCGTCCC ACGG CGAT GACGGC TACCTC CAGCCACTTGAGCAGGAGCAGACCACTC CATTCGATCTGACTTGTGAGGCGGGCTGGAGGGCATCACTCATCTGCGTCGG CGAGGACCATCATGTCTTGTCTATTGTCATGCATCACATTGTCTCCGATG GCTGGTCCATTGACGTGCTGCGGCAAGAACTAGGCCAGCTCTACGCAGCG GTTTTGCATGGCGACGAGGATCCTCTGTCGGCCGTGAGCCCGCTCCCCAT ACAG TATC GAGAC T T TT C CAT GIG GCAGAGAC GT CAACAG GTCG C C GA GC ATGACAGACAGCTTCAATACTGGCGGAAACAGCTCGCAGACTGCTCGCCG GCCAAGCTGCCCACCGATTTCCCCCGACCACCCTTGCTGTCCGGCGACGC TGGCAGCGTACCGGTGGAGATTTCGGGCGAGCTGTTCCAAAAGCTGCACA GGTTCTGCAACGTGACCAGCACGACCCCGTTTGCCGTGCTTCTGGCCGCG TTTCGTGCTGCGCATTACCGACTCACCGGGGTCGACGACGCCGTCGTGGG CACGCCCATTGCCAACCGGAACCGGCCCGAGCTGGAGCGCCTGATTGGTT TCTTTGTCAACACGCAATGTATGCGCATCACCGTGGACGATGATGATACA TTTGAGGGCTTGGTACGCCAAGTCCGTAGGACAACGACTGAGGCTTTTGA AAACGAAGATGTCCCCTTTGAACGCGTCGTGTCCGCCATGCTACCGGCAG GAGGAGGATCCAGAGATTTGTCCCAGACGCCCCTGGCACAGCTCATCTTT GCCGTGCACTCGCAAGAAAATCTAGGCAAGTTTGAGCTAGAAGGTCTCGA GTCGGAACCTGTTGCGAACAAGGCATATACGCGCTTTGACGCTGAATTTC ACCTGTTCCAAACTCGTGACGGATTAAACGGCTACTTGAACTTTGCCGCG GAATTGTTCAAGCTAGAGACGATGCAAAATGTCGTCAGCGTCTTCTTACA GATTCTACGCCATGGACTGGAGCAGCCTAAATCCTTGATATCCGTTTTGC CGCTTACTGACGGGTTAAAGGAGCTCGACAGCATGGGCCTCTTGAAGATT CATCGGGGGCTTGAATATCAGCGAGACTCTAGCCTAGTCGACATCTTCCG CAGCCAGGTTGCTACTTGTCCTGATACAATTGCCGTCATTGACTCATCAG CACGTCTGACGTATGCTCAGCTGGACCATCAGTCCAACCTACTCGAGGCC TGGATTCGCCGCAAAGGCTTGCCGGCCGAATCATTGGTTGGCGTGCTTTC ACCGCGGTCCTGCGAGACAATCATCGCCTTTCTTGGTATTCTCAAAGCAA ACCTGGCATATCTGCCGCTTGATCCAAAATCCCCTGTCTCTCGTATGAGG GACGTCCTGTCCGATTTACCAGGTCACACAATCATCCTGCTTGGCTCCGA CGTGGCCGCCCCCGACCTTGAGCTACCTTGTTTGGAGCTCGTACGCATTT CTGACGCCTTGAAATCTGGTGCAAGCGCAGTCAATGGCAGTGAGACGACA GACTTGTCGGCTCCGTCGGCGAACAGTCTTGCATACGTTTTGTACACGTC AGGGTCGACTGGGCGACCAAAGGGAGTCATGGTTGAGCACCGTGCTATTG TACGGCTTGTGCAGCGCGGCGTGATACCAAACTTTCCCCCGTTGCGAGGA GCAATCATGGCACATCTCTTCAATACCGTCTTTGACGGCGCGACCTATGA AATTTTTCTCATGCTTTTGAACGGCGGCACGTTGGTCTGCATTGACTATC TGACCACATTGAGCCCCAAAGCACTCGAAACCGTCTTCCTGAGAGAAGGA ATCAACTGTGCAATCATGACACCAGCGCTGCTTAAGCTGTATCTAGCCAA TGCCCGCGATGGCTTAAAGGGACTCGACATGCTCATGGTCGCTGGAGACCGGTTCGATCCGCAGGACGCAGTCGAGGCACAGACTCTGGTCCGCGGTGAC TGCTACAACGCCTACGGCCCGACCGAGAATGGAGTCATGAGTACTCTGTA CAAAATTGATACAAGTGACTCCTTCATCAACGGCGTCCCTCTAGGTCGCG C T ATAG AC AACT CTGGAGCC TA CAT T AC CG AC CC AAAT C AGCAG C T TGTC GGCCCCGGCGTTTTGGGAGAGCTCATCGTCACCGGAGACGGGCTCGCTCG GGGGTACACGGACC CAGCAC TC GACAGAGACC GATTCGTACAAGTC GTCA TCAACGGCGAGTCTGTCAGAGCATATCGGACCGGAGACCGCATGCGCTAC CGCGCAGGCCAAGATTGTCTTTTCGAATTCTTTGGACGCATGGACTTTCA ATTCAAGATTCGAAGCAACCGCATCGAGTCGGCCGAGGTGGAAGCTGCCA TTCTCAGTCATCCTCTGGTTCGCGATGCAGCCATTGTTGTTGTTGGTGTC CAAGAGGAACAAGAGCCAGAAATGGTTGGGTTCGTTGTTGCTGCTGACGA TGCCGTTGAGCAAGAGGCCACAGACAACCAAGTCGAGGGTTGGCAAGAAC TGTTTGAGAGTAGCATGTACAACGGCATCGATGCAATAAGCCCGTCTGCT C T CGGCAAGGAC TT TACAGGGT GGAC GT CCAT GTAC GATGGAAGT GAAAT CGACAAGTCGGAGATGCAGGAGTGGCTCGACGATACGATACATACTCTAC GCGACGGTCATGTACCGGGGCATGTCCTGGAGATTGGAACCGGTACAGGT ATGATCTTGTTTAACCTCGGCTCTGTTGAGAGCTACGTAGGTCTGGAACC CACCAAGT CCGC GGT CGAGT TT GT CAACAAGGCCAT CAAGACCC TGCCAA ATCTCGCAGGAAGGGCCGAGGTTCACACTGGCACCGCCACAGATATCGAC CAGCTGAGCGGACTGCGGCCAGACCTTGTTATACTAAACTCTGTGGTTCA GIACTTTCCCACAGTAGAATATCTGACACGGGrTGTGGACGCTCTGGTCC GGATACGCGGCGTCAAACGTCTCTTCTTTGGTSATGTGCGATCACAGGCG C TACACAGACAG TT T CTTGCTGCCTGTGCGAT GCAC GCAC TAGG CAAGAC GGCGACCAGGGACGACGTGCGGAGATACATGGCAGAGCGGGAGGAGCGGG AGGAGGAGCTGCTCGTCGAGCCAGCCTTTTTCACAGCACTCATGAACCGG CATCCCAATCTGATCCAGCACGTCGAGATTCTGCCCAAGAATATAAGGGC CACAAATGAGCTGAGCGCATACCGTTATGCAGCCGTCGTCCATCTACGTG ATCCGGAGTCTGCGGCGCGGCCGGTGTATCCGATTGCGGCAGACGACTGG GTCGACTTTCAGGCCTCCCAGATGCGCAGCGACGTCCTTCGAGAATACCT GCGTCTCTCGGCCGGTGCCGATACCGTGGCTGTCTGCAATATTCCGTACG AAAAGACCATCT TT GAGAGACT GATT GT CGAGTCAC TT GATGACAACACC GGCAGTGACGCGCCACAGAGTAGGCTGCATGGCAGGTCACTAGATGGCGC GCCCTGGATATCCGCCGTCCGCTCCGACGCCGAGAGCCGGGCATCCCTCT CCGTGCCGGACCTTGTGCAGCTAGCCGCCGAGrCTGGCTTCCAGGTACAG GT GAGT GC CGCACGACAGT GGT C GCAGAGC GGCGCG CT GGACGC CGTC TT CCACCGCCGCCACGCGTCGTCCTCTCAGCCGACTATGCGCACACTCTTCC AATTCCCCGACGACAATGCACTGCGAGCTTCGGCTACCCTGACGAACCGG CCGCTGCAGCGGCTGCAGAGACGTCGCGTCGCGGCGCAGATTCGCGAACGGCT G CAGACGCT GGT GCC GT C GTACAT GAT TCCTGC CAAGATTGT GGT GC TGC-ACCAGATGCCTCTCAACGCCAATGGCAAGGTCGACCGGAAGGAGCTG GCTCGTAGAGCCCGGACGACGACGATGACGAAGAAAAAGAAGCCGCAGCG ATIGGCGTCGGAGCCAGCTTGTCCAATCAGCGACATTGAGGTTGCACTGT GCGAGGAGGCCACGGCAACGTTTGGAATGCAAGTCGGCATCAGCGATCAC THTTCAAACTCGGCGGTCATTCTCTGCTTGCTACAAAACTCATATCCCG CGICGGCGACAGACTGAAAGCGCGCCTGACGGTCAAGGATGTCTTTGATC AC-CCAAT C TTTT CC GAGCTTGC GATT GT CATACGCGAGGGGCTGCAAAAC GTCGTGCCCGTGGCTTTGAATGGTGGTGGACAAGCGAAGCAAGGGTCGGC GGGAGTAGTAGCGCCGCGCAATGAAATGGAAACGATGCTGTGTGAGGAGT TTGCCAATGTCCTTGGCATGGATGTCGGAGTCACGGACAACTTTTTTGAC CTCGGTGGGCATTCGCTCATGGCGACAAAGCTGGCAGCGCGGATTGGGCG TCGATTGAATACTACGATATCAGTGAAGGAGGTCTTTGAACACCCGATTG TGTTTCAGCTCGCCAATTCCCTAGAGCTGGGTCAGTTGGAGAGCGACAGA GTAAAGCACACAAT GTTGGCC GATTACACT GCGT TT CAACTCTT GT CT GT TGAAGATTTGCAAGGCTTTCTTCAAAACGAGATAAGCCCTCAACTTGAAT GTGCACATGGCGGTATTCAAGATGTATATCCAGCCACGCATATGCAAAAG GCGTTTTTATGCGACGCGTCAACCGGACATCCCAAGCCTCTTGTGCCGTT CTACATTGACTTTCCCCCCGACTCAGACTGTTCTACTCTGGTCGAGGCGT GCTCATCTCTGGTGAAGCGTTTCGACATGTTCAGGACAGTGGTCGTGGAA GCT G CAGG CGAACT GTAT CAAGT CGTTTTAGAGCAC TT TGATCT ACAGAT TGATGTCGTCGAGACGGAGGAAAACGTCCACGCGGCGACGAACGATTTCG TGGACAGAATCTTGGAGGTGCCCGTCCATCTCGGGCAACCACTGATACAA TTCACCATTCTCAAGCAGGCGTCTTCAGTACGAGTCTTGCTTTGTCTTTC TCACGCCCTCTATGATGGCTTGAGTTTGGAGCACGTCGTGCGCGATCTGC ACATGCTT TACAAAGGCCGGTCCCTGCTGC CAGCGAATCAGTTC TCACGG TACATGCAATACATGGACCACACGCGCAAAGCCGGCTGTGACTTTTGGCG CGAT GTCATACAAGATACGCCAATCACT GT CCTCGGCCATGTCGAT GCTG GTGGCCGT GAGC TAGAAG T G G AAGC AGC GC GG AC AT T G C AC GC G AC AAAG ATTATTAGCATTCCTCTGCAGGCTGTCCGCAGCAGCATCATTACGCAGGC GACAGTCTTCAACGCTGCCTGTGCTCTCGTGCTGTCTCGAGAAACCGGCG CCAAGGACGTCGTGTTTGGCCGGATCGTGTCGGGGCGGCAAGGCCTGCCG GrGAGCTGGCAAAACATTGTCGGGCCGTGCACCAATGCCGTACCGGTGCG CGCC CGGATCAT CGACGACGAC GACGACAACCACCGGCAGATGC T C CGCG ACAT GCAA GACCAGTACC T C C T GAGC CTGC CGTT TGAGAC GCT C GA TTTT GACGAGGTCCGACGCAGCTGCACAAACTGGCCGGCGACGGCCAACAACTA C GC G TGC T GC GT GAC GTAC C AC GAC T TT TC AT AC CAC C C AGAGAGC GAGA T GGA GCAG CAGC GG G TCGAGAT GGGCGTGCTGGC CAGAAAG GAT G C GC T GCTCAAGGAGGAGCCCGTGTACGACCTGGGCATCGCAGGAGAGGTTGAGCCGGATGGCGTGCACTTGCAAGTTACCGTGGTCGCAAAGACGAGGCTGTTTAGTGAAGAGAGGGCCGCATACCTGATGGAAGAGGTGTGTAGACTGTTTGAGAGTCTAAACTCGGCTTTGTGA
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14160821 | 2014-03-20 | ||
| EP14160821 | 2014-03-20 | ||
| PCT/EP2015/055978 WO2015140315A2 (en) | 2014-03-20 | 2015-03-20 | Method for obtaining microbial secondary metabolites or derivatives thereof by heterologous expression of at least one synthetase of said secondary metabolites in filamentous fungi |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2682743T3 true ES2682743T3 (es) | 2018-09-21 |
Family
ID=50342210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15716435.1T Active ES2682743T3 (es) | 2014-03-20 | 2015-03-20 | Procedimiento de obtención de péptidos no ribosómicos mediante expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico en Aspergillus niger |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10738316B2 (es) |
| EP (1) | EP3119900B1 (es) |
| JP (1) | JP6524600B2 (es) |
| CN (1) | CN106414481A (es) |
| CA (1) | CA2943240C (es) |
| DK (1) | DK3119900T3 (es) |
| ES (1) | ES2682743T3 (es) |
| IL (1) | IL247880B (es) |
| WO (1) | WO2015140315A2 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112176004B (zh) * | 2019-07-05 | 2022-08-09 | 中粮生物科技股份有限公司 | 柠檬酸的生产方法 |
| CN114657155B (zh) * | 2021-12-23 | 2024-01-19 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种新型的非核糖体多肽合成酶拆分表达方法 |
| CN117384924B (zh) * | 2023-12-11 | 2024-06-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种基于酶结构域拆分的多肽生物合成方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0685469A4 (en) | 1993-02-19 | 1996-04-03 | Meiji Seika Kaisha | DERIVATIVE OF PF 1022 USED AS A CYCLIC DEPSIPEPTIDE. |
| ES2296606T3 (es) * | 1999-01-13 | 2008-05-01 | Novozymes, Inc. | Metodos de produccion de polipeptidos en celulas deficientes en ciclohexadepsipeptido. |
| CA2384122C (en) * | 1999-09-07 | 2010-05-04 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Cyclic depsipeptide synthetase and gene thereof, and mass production system for cyclic depsipeptide |
| DE102009034359A1 (de) | 2009-07-17 | 2011-02-17 | Forschungsverbund Berlin E.V. | P-Kontakt und Leuchtdiode für den ultravioletten Spektralbereich |
-
2015
- 2015-03-20 CA CA2943240A patent/CA2943240C/en active Active
- 2015-03-20 JP JP2017500432A patent/JP6524600B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-03-20 EP EP15716435.1A patent/EP3119900B1/en not_active Not-in-force
- 2015-03-20 ES ES15716435.1T patent/ES2682743T3/es active Active
- 2015-03-20 WO PCT/EP2015/055978 patent/WO2015140315A2/en active Application Filing
- 2015-03-20 CN CN201580022033.9A patent/CN106414481A/zh active Pending
- 2015-03-20 DK DK15716435.1T patent/DK3119900T3/en active
- 2015-03-20 US US15/127,645 patent/US10738316B2/en active Active
-
2016
- 2016-09-18 IL IL247880A patent/IL247880B/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL247880A0 (en) | 2016-11-30 |
| CA2943240A1 (en) | 2015-09-24 |
| DK3119900T3 (en) | 2018-08-13 |
| CN106414481A (zh) | 2017-02-15 |
| JP6524600B2 (ja) | 2019-06-12 |
| WO2015140315A2 (en) | 2015-09-24 |
| IL247880B (en) | 2021-04-29 |
| JP2017508481A (ja) | 2017-03-30 |
| CA2943240C (en) | 2021-06-29 |
| EP3119900B1 (en) | 2018-05-09 |
| US10738316B2 (en) | 2020-08-11 |
| US20170137832A1 (en) | 2017-05-18 |
| EP3119900A2 (en) | 2017-01-25 |
| WO2015140315A3 (en) | 2015-12-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2365668C (en) | In vitro macromolecule biosynthesis methods using exogenous amino acids and a novel atp regeneration system | |
| ES2682743T3 (es) | Procedimiento de obtención de péptidos no ribosómicos mediante expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico en Aspergillus niger | |
| Kim et al. | Prolonging cell‐free protein synthesis with a novel ATP regeneration system | |
| US6994986B2 (en) | In vitro synthesis of polypeptides by optimizing amino acid metabolism | |
| Blumhoff et al. | Targeting enzymes to the right compartment: metabolic engineering for itaconic acid production by Aspergillus niger | |
| US6168931B1 (en) | Enhanced in vitro synthesis of biological macromolecules using a novel ATP regeneration system | |
| AU2006259543B2 (en) | Total amino acid stabilization during cell-free protein synthesis | |
| CN103270155B (zh) | 2,4-二羟基丁酸的生产方法 | |
| Vogl et al. | Orthologous promoters from related methylotrophic yeasts surpass expression of endogenous promoters of Pichia pastoris | |
| Schöler et al. | Structure and regulation of the isocitrate lyase gene ICL1 from the yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| CN111778169A (zh) | 一种提高体外蛋白合成效率的方法 | |
| Zhang et al. | Improving methanol assimilation in Yarrowia lipolytica via systematic metabolic engineering combined with compartmentalization | |
| Weber et al. | Production of the Carboxylate Reductase from Nocardia otitidiscaviarum in a Soluble, Active Form for in vitro Applications | |
| KR20020090161A (ko) | 아그마틴의 제조방법 및 아르기닌 데카복실라제의 제조방법 | |
| CN107109446A (zh) | 顺式‑5‑羟基‑l‑哌可酸的制造方法 | |
| US20220340628A1 (en) | Tag protein for increasing water solubility and heat stability of target protein, and fusion protein comprising same | |
| Weber et al. | Multi-enzyme catalysed processes using purified and whole-cell biocatalysts towards a 1, 3, 4-substituted tetrahydroisoquinoline | |
| EP1231266B1 (en) | Arabidopsis-origin gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene | |
| Kreuzman et al. | Enzymatic synthesis of diastereospecific carbacephem intermediates using serine hydroxymethyltransferase | |
| JP2011167107A (ja) | 光学活性アミノ酸及びアミノ酸誘導体の製造方法 | |
| KR20190008805A (ko) | 젖산 생산능 향상에 관여하는 재조합 sur1 유전자 및 이를 포함하는 형질전환 미생물 | |
| US10947523B2 (en) | Biotechnological production of L-tryptophan | |
| JP2011223896A (ja) | ペプチドの製造方法 | |
| KR20230041779A (ko) | 아세틸-coa 유래 산물의 생산을 위한 방법 및 조성물 | |
| JP2000189159A (ja) | Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造方法 |