ES2682743T3 - Procedimiento de obtención de péptidos no ribosómicos mediante expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico en Aspergillus niger - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de obtención de al menos un péptido no ribosómico, (NRP), o uno marcado isotópicamente, comprendiendo el procedimiento la etapa de expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico (NRPS) de dicho péptido no ribosómico en el hongo filamentoso Aspergillus niger, en el que la NRP sintetasa es una ciclodepsipéptido sintetasa seleccionada de entre el grupo que contiene Enniatin, PF1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa, en el que se utiliza un sistema de expresión inducible integrado en el genoma del hongo filamentoso Aspergillus niger para la expresión heteróloga de la al menos una sintetasa, en el que el sistema de expresión comprende al menos un casete de expresión que comprende un primer módulo para la expresión constitutiva del trans-activador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo módulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresión inducible de la al menos una sintetasa secundaria de un metabolito y un tercer módulo para la integración del casete en el genoma fúngico por recombinación homóloga o heteróloga utilizando marcadores de selección apropiados.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento de obtencion de peptidos no ribosomicos mediante expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico en Aspergillus niger
La presente invencion se refiere a un procedimiento para obtener al menos un peptido no ribosomico, o uno marcado isotopicamente, comprendiendo el procedimiento:
la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de un peptido no ribosomico (NRPS) de dicho peptido no ribosomico en el hongo filamentosos Aspergillus niger,
en el que la NRP sintetasa es una ciclodepsipeptido sintetasa seleccionada de entre el grupo que contiene Enniatin, PF1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa,
en el que se utiliza un sistema de expresion inducible integrado en el genoma del hongo filamentoso Aspergillus niger para la expresion heterologa de al menos una sintetasa,
en el que el sistema de expresion comprende al menos un casete de expresion que comprende un primer modulo para la expresion constitutiva del transactivador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de al menos una sintasa de un metabolito secundario y
un tercer modulo para la integracion del casete en el genoma fungico por recombinacion homologa o heterologa utilizando los marcadores geneticos apropiados.
Descripcion
Los recientes esfuerzos de busqueda en el genoma han descubierto que los genomas de hongos filamentosos codifican un repertorio inesperadamente rico en compuestos de bajo peso molecular de relevancia comercial. Estos productos naturales conocidos como metabolitos secundarios incluyen peptidos no ribosomicos, poliquetidos y lipopeptidos con impacto farmacologico. Sin embargo, la mayona de los genes implicados en las rutas metabolicas secundarias no se expresan en condiciones convencionales de laboratorio o industriales, lo que impide la aplicacion de estos productos naturales. se han emprendido diferentes estrategias basadas en factores moleculares y procedimientos de cultivo. Sin embargo, hay aun obstaculos grandes para superarlo tal como las bajas tasas de produccion.
El documento de patente EP 1 215 281 A1 desvela un procedimiento para obtener al menos un peptido no ribosomico que comprende:
la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico (NPRS) de dicho peptido
no ribosomico en el hongo filamentoso Mycelia sterilia,
en el que la NRPS es la ciclodepsipeptido sintetasa PF100 sintetasa,
en el que se utiliza un sistema de expresion no integrado, no inducible para la expresion heterologa de la PF1022 sintetasa.
El documento MEYER, V. Y COL.: "Fungal Gene Expression on Demand: An Inducible, Tunable, and Metabolism- Independent Expression System for Aspergillus niger' (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 77, n° 9, May 2011, paginas 2975-2983) desvela un sistema de expresion integrado e inducible para Aspergillus niger que comprende un casete de expresion que comprende un primer modulo para la expresion constitutiva del transactivador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de al menos un polipeptido y un tercer modulo para la integracion del casete en el genoma fungico por recombinacion homologa o heterologa utilizando los marcadores geneticos apropiados. Este sistema de expresion se describe como una herramienta util para la sobreproduccion proteica en Aspergillus niger.
La presente invencion describe de esta manera una nueva estrategia para la smtesis de peptidos no ribosomicos, en particular ciclodepsipeptidos.
La presente invencion comprende la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico (NRPS). El hongo filamentoso es Aspergillus niger. La ciclodepsipeptido sintetasa es en particular una ciclodepsipeptido sintetasa del tipo iterativo. La ciclodepsipeptido sintetasa se selecciona de entre el grupo de Enniatin, Pf1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa.
En general tambien es posible y concebible expresar NRPS adicionalmente en uno de los hongos mencionados, tales como una NRPS de epotilona, actinomicina, daptomicina, valinomicina, fungisporina o bleomicina.
La ciclodepsipeptido sintetasa nativa normalmente comprende dos modulos: el modulo para la integracion de un acido D-hidroxicarboxflico, el modulo 2 para la integracion de un L-aminoacido y adicionalmente un tercer PCP y dominio C (modulo 3) para la determinacion del tamano del anillo n, normalmente n = 6 y 8. Un ejemplo tfpico de una ciclodepsipeptido sintetasa, tal como la Enniatin sintetasa se muestra en la Figura 1.
La Enniatin es un hexaciclodepsipeptido que consiste en 3 acidos D-hidroxicarboxflicos y 3 L-aminoacidos. Los principales productos son la Enniatin A, B y C, comprendiendo la Enniatin A 3x D-Hiv, 3x L-Ile, comprendiendo la
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Enniatin B 3x D-Hiv, 3x L-Val y comprendiendo la Enniatin C 3x D-Hiv, 3x L-Leu. El atomo N esta metilado en cada caso.
La Enniatin se sintetiza por una Enniatin sintetasa que esta presente en Fusarium sp., Verticillium hempterigenum, Halosarpheria sp. En el caso del modulo 1 de la Enniatin B es espedfico para D-hidroxivalerato, el modulo 2 es espedfico para L-valina y PCP/dominio C (modulo 3) determinando el numero de anillo n = 6.
La PF1022 sintetasa, que es en el momento presente en Mycelia sterilia, comprende un modulo 1 espedfico para D- fenil-lactato y/o D-lactato, un modulo 2 espedfico para L-leucina y un PCP/dominio C (modulo 3) que determina un numero de anillo n = 8.
La Beauvericin sintetasa, por ejemplo, de la cepa ATCC7I59 de Beauveria bassiana, comprende un modulo 1 espedfico de D-hidroxivalerato, un modulo 2 espedfico para L-fenilalanina y un PCT/dominio C (modulo 3) que determina que el numero de anillo sea n = 6.
En otra realizacion preferida se utiliza una ciclodepsipeptido sintetasa quimerica, en la que la sintetasa esta fabricada de modulos y/o dominios de al menos dos ciclodepsipeptido sintetasas. Se prefiere que se escoja al menos un modulo de entre una primera ciclodepsipeptido sintetasa y se escoja al menos un segundo modulo de otra ciclodepsipeptido sintetasa. Por ejemplo, es posible que la sintetasa comprenda un modulo de una ciclodepsipeptido sintetasa y el modulo 2 y 3 de otra ciclodepsipeptido sintetasa.
Las realizaciones preferidas de dichas ciclodepsipeptido sintetasas hubridas o quimericas pueden tener las siguientes disposiciones:
a) un modulo 1 de la PF1022 sintetasa espedfica para el D-fenil-lactato/D-lactato (por ejemplo, de Mycelia sterilia), un modulo 2 y PCP/dominio C (modulo 3) de Enniatin sintetasa espedfica para L-valina y n = 6 (por ejemplo, de Fusarium oxysporum; vease la Figura 14, SEQ ID NO: 1), o
b) un modulo 1 de PF1022 sintetasa espedfica para D-fenil-lactato/D-lactato, un modulo 2 y PCR/dominio C (modulo 3) de Beauvericin Sintetasa espedfica para L-Fenilalanina y n = 6 (vease la Figura 16, SEQ ID NO: 2).
En general, es posible cualquier otra combinacion de modulo/dominio. Por ejemplo, se puede concebir y es posible que el modulo 1 se escoja de una Enniatin o Beauvericin sintetasa y el modulo 2 y PCP/dominio C (modulo 3)se escogen de la PF1022 sintetasa.
Sin embargo, ya se conoce un sistema de ciclodepsipeptido sintetasa hubrida comprende un modulo 1 de Beauvericin sintetasa y el modulo 2 y PCP/dominio C (modulo 3) de Bassianolide sintetasa como sistema de sintetasa, que se ha demostrado que se expresa en Saccharomyces cerevisiae, y por lo tanto esta exento (Yu y col., ChemComm., 2013, 49:6176-6178). Esta ciclodepsipeptido sintetasa quimerica espedfica no esta, sin embargo, exenta de expresion en hongos filamentosos. Se utiliza un sistema de expresion inducible integrado en el cromosoma de Aspergillus niger para la expresion heterologa de al menos una ciclodepsipeptido. Dicho sistema de expresion inducible es independiente del metabolismo. El sistema de expresion comprende al menos un casete de expresion que consiste en al menos tres modulos. El casete de expresion puede comprender un primer modulo para la expresion constitutiva del transactivador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo (sistema Tet-on) que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de al menos una metabolito sintetasa secundaria y un tercer modulo para integrar el casete en el genoma fungico por recombinacion homologa.
En una realizacion mas preferida el primer modulo comprende el promotor constitutivo PgpdA - rtTA - terminador TcgrA, el segundo modulo comprende la secuencia operadora tetO7 - (siete copias de la secuencia tetO) - el promotor mmimo Pmin - terminador trpC de la metabolito sintasa (esyn1) secundaria (con tetO7::Pmin como promotor dependiente de rtTA2S-M2) y el tercer modulo comprende pyrG* para la integracion del plasmido en el locus pyrG. Despues de la transformacion del vector plasirndico que comprende dicho casete de expresion en un negativo proteasa (prtT-) preferible y auxotrofo a uracilo (pyrG') se selecciono una cepa de A. niger de transformantes prototrofas de uridina, se purificaron y se sometieron a analisis de Southern. El casete de expresion se muestra ejemplarmente en la Figura 2.
Al menos una copia del casete de expresion se integra en el genoma fungico. Es posible que esten presentes en el genoma fungico multiples casetes de expresion.
En otra variante de la presente invencion el casete de expresion comprende enes adicionales que codifican enzimas biosinteticas de precursores metabolicos o intermediarios metabolicos, en particular deshidrogenasas. Por ejemplo, utilizando deshidrogenasas para la transformacion de aminoacidos en acidos hidroxicarboxflicos, que se expresan constitutivamente, que permite una smtesis independiente de diferentes acidos hidroxicarboxflicos.
Dichos genes adicionales puede que tampoco sean parte del casete de expresion y se pueden expresar desde diferentes localizaciones cromosomicas utilizando al menos un promotor constitutivo, inducible o represible.
El huesped de expresion Aspergillus niger transformado se cultiva en un medio de cultivo adecuado. El medio de cultivo que se utiliza para la expresion heterologa de la sintetasa puede comprender partfculas de talco, titanio, sflice
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u oxido de aluminio, entre los que se prefieren las partfculas de talco. Estas partfculas soportan la formacion de pequenos aglomerados fungicos.
El medio de cultivo comprende, ademas, glucosa, elementos traza, aminoacidos, MgSO4, extractos de levadura. En una variante del presente procedimiento la concentracion de glucosa es del 1-10%, preferentemente del 2,5 al 7,5 %, mas preferentemente del 5 %.
Tambien que el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la ciclodepsipeptido comprende 5-50 mM, preferentemente 10-30 mM, mas preferentemente 20 mM de al menos un acido hidroxicarboxflico (por ejemplo 20 mM de D-hidroxivalerato) y 10-30 mM, preferentemente 15-25 mM, mas preferentemente 20 mM de al menos un aminoacido (por ejemplo, L-valina).
Tambien es posible en general tambien es posible remplazar el acido hidroxicarboxflico por sus esteres correspondientes, por acidos hidroxicarboxflicos O-acilados y sus esteres correspondientes. Por esto, se prefieren los metil esteres.
La induccion de la expresion se produce anadiendo el inductor apropiado, por ejemplo, 5-200 pg/ml, en particular 10100 pg/ml, mas preferentemente 10-50 pg/ml de doxiciclina u otros inductores tales como la tetraciclina o derivados de la misma. Se prefiere en particular la adicion de 10 pg/ml de doxiciclina. La induccion se lleva a cabo preferentemente en la fase exponencial, en particular en cultivo discontinuo o semi-continuo. El inductor se puede anadir una vez o repetidamente.
En una realizacion adicional de la presente invencion el medio de cultiva que se utiliza para la expresion heterologa de la ciclodepsipeptido sintetasa comprende al menos un acido D- o L-hidroxicarboxflico (o una mezcla racemica de los mismos) de formula general (I) R1-CHOH-CO2H, en el que R1 se selecciona de entre un grupo que comprende
- un C-i-C50-alquilo sustituido y no sustituido, un C2-C50-alquenilo sustituido y no sustituido, un C2-C50-alquinilo sustituido o no sustituido, un C3-C10-cicloalquilo sustituido y no sustituido, un Cs-Cz-cicloalquenilo sustituido o no sustituido, que en cada caso puede estar interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o mono-sustituidos, dobles enlaces y/o por uno o mas grupos del tipo -C(O)O-, - OC(O)-, -C(O)-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-, o
- un arilo, heteroarilo, -CH2-arilo, o -CH2-heteroarilo, en los que el arilo y heteroarilo estan sustituidos o no sustituidos.
Por lo tanto, se pueden anadir los acidos hidroxicarboxflicos al medio de cultivo durante el crecimiento del huesped de expresion. Sin embargo, tambien es posible que al menos uno de los acidos hidroxicarboxflicos se sintetice por el propio huesped de expresion.
El resto R1 se puede seleccionar de entre un grupo que comprende C-i-C-^-alquilo sustituidos o no sustituido, C3-C7- cicloalquilo sustituido y no sustituido y C2-C12-alquenilo sustituido y no sustituido y un C6-C-i2-arilo sustituido y no sustituido, en particular -C6-H5.
El termino “sustituido” en conexion con alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquenilo se refiere a la sustitucion de uno o mas atomos, habitualmente atomos de H, por uno o mas de los siguientes sustituyentes: un halogeno, en particular, F, Cl, Br, hidroxilo, hidroxilo protegido, oxo, oxo protegido, -N3, C3-C7 cicloalquilo, fenilo, naftilo, amino, amino protegido, amino primario, secundario o terciario, un anillo heterodclico, imidazolilo, indolilo, pirrolidinilo, C1-C12- alcoxilo, C1-C12-acilo, C1-C12-aciloxi, nitro, carboxi, carbamoilo, carboxamido, N-(C1-C12-alquilo) carboxamido, N,N- Di(C1-C12-alquilo) carboxamido, ciano, metil-sulfonilamino, tiol, C1-C10-alquiltio y C1-C10-alquilsulfonilo. Los grupos sustituidos pueden sustituirse una vez o dos veces con el mismo o diferentes sustituyentes.
Ejemplos para los grupos alquilo sustituidos anteriores comprenden 2-oxo-prop-1-ilo, 3-oxo-but-1-ilo, cianometilo, nitrometilo, clorometilo, hidroximetilo, tetrahidropiraniloximetilo, trietiloximetilo, propioniloximetilo, aminometilo, carboximetilo, aliloxicarbonilmetilo, aliloxicarbonilaminometilo, metoximetilo, etoximetilo, t-butoximetilo, acetoximetilo, clorometilo, bromometilo, yodometilo, trifluorometilo, 6-hidroxihexilo, 2,4-dicloro(n-butilo), 2-aminopropilo, 1 -cloretilo, 2-cloretilo, 1-bromoetilo, 2-bromoetilo, 1 -fluoroetilo, 2-fluoroetilo, 1-yodoetilo, 2-yodoetilo, 1-cloropropilo, 2- cloropropilo, 3-cloropropilo, 1-bromopropilo, 2-bromopropilo, 3-bromopropilo, 1 -fluoropropilo, 2-fluoroptopilo, 3- fluoropropilo, 1-yodopropilo, 2-yodopropilo, 3-yodopropilo, 2-aminoetilo, 1-aminoetilo, N-benzoilo-2-aminoetilo, N- acetilo-2-aminoetilo, N-benzoilo-1-aminoetilo, N-acetilo-1-aminoetilo y similares.
Ejemplos de los grupos alquenilo sustituidos anteriores comprenden estirolilo, 3-cloro-propen-1-ilo, 3-cloro-buten-1- ilo, 3-metoxi-propen-2-ilo, 3-fenilo-buten-2-ilo, 1-ciano-buten-3-ilo y similares.
El termino “alquinilo” como se utiliza en el presente documento se refiere a un resto de formula R-CEC-, en particular a un “C2-C50-Alquinilo”. Ejemplos de un C2-C50-alquinilo comprenden etinilo, propinilo, 2-butinilo, 2-pentinilo, 3- pentinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo, 2-heptinilo, 3-heptinilo, 4-heptinilo, 5-heptinilo, octinilo, noninilo, decinilo, undecinilo, dodecinilo, asf como di- y tri-inas de cadenas de alquilo lineales o ramificadas.
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El termino “oxo” se refiere a un atomo de carbono, que esta conectado con un atomo de ox^geno mediante un doble enlace formando de esta manera un grupo ceto o aldehido. El termino “oxo protegido” se refiere a un atomo de carbono, que esta sustituido por dos grupos alcoxi o esta conectado dos veces con un diol sustituidos que forma un grupo cetal no ciclico o ciclico.
El termino “alcoxi” se refiere a restos como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi y similares. Un grupo alcoxi preferido es metoxi.
El termino “C3-C7-cicloalquilo” comprende grupos como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. El termino “C5-C7-cicloalquenilo” se refiere a un anillo 1,2 o 3-ciclopentenilo, un anillo 1,2, 3, o 4-ciclohexinilo, o un anillo 1, 2, 3, 4 o 5-cicloheptenilo.
Preferentemente R1 es un metilo, etilo, -CH(CH3)2, propilo, isopropilo, -CH2-CH(CH3)2, butilo, isobutilo, tert-butilo, - CH2-C(CH3)3, pentilo, hexilo, -CH2-C6H5 -CH2-Cl, -CH2-Br, -CH2-F, -CH2-I, -CH2N3, -CH2-CECH, -CH2CH=CH2CH3 o - CH2-cicloC3H5.
En otra realization preferida de la presente invention el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la ciclodepsipeptido sintetasa comprende la menos un D- o L-aminoacido de formula general (II) R2-CHNH2-CO2H, en la que R2 se selecciona de entre el grupo que comprende
- C1-C50-alquilo sustituido o no sustituido, C2-C50-alquenilo sustituido o no sustituido, C2-C50-alquinilo sustituido o no sustituido, C3-C10-cicloalquilo sustituido o no sustituido, C5-C7-cicloalquenilo sustituido o no sustituido, que en cada caso pueden interrumpirse por uno o mas atomos de oxigeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o mono-sustituidos, dobles enlaces y/o por uno o mas de los grupos del tipo -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-, -NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-. En particular R2 es -CH2-C6H5 (fenilo), - CH2-CH(CH3)2, - CH2(CH3)2.
Por lo tanto, el aminoacido se puede anadir al medio de cultivo durante el crecimiento del huesped de expresion. La alimentation de un aminoacido al medio de cultivo tiene solo un caracter de soporte y mejora el rendimiento total de expresion. Sin embargo, tambien es posible (y comun) que al menos uno de los aminoacidos, preferentemente los aminoacidos de origen natural son sintetizados por el propio huesped de expresion.
Antes de la transformation en el huesped de expresion, el casete de expresion es parte de un vector plasmidico.
Un ejemplo de dicho vector plasmidico comprende un casete de expresion con una Enniatin sintetasa se muestra en la Figura 3. En este vector plasmidico el gen Esyn (Enniatin sintetasa) estaba clonada en el vector de expresion TetOn pVG2.2. Debido que el gen es grande (9,4 kb) la donation se llevo a cabo por el procedimiento de recombination SLIC y homologo utilizando pyrG como marcador genetico. Sin embargo, tambien son aplicables otras tecnicas de clonacion adecuadas.
El proceso de integration del casete de expresion en el cromosoma de los hongos, tales como A. niger se muestra ejemplarmente en la Figura 4. La integracion en el genoma puede ser por recombinacion homologa o heterologa resultando de esta manera en transformantes que albergan integracion de una o multiples copias del casete de expresion.
El presente procedimiento permite la smtesis de al menos un ciclodepsipeptido que comprende la siguiente formula general (III)
en la que R1 y R2 tiene los siguientes significados, R3 es un resto C1-C3 alquilo, en particular un resto -CH3 y m = 3 o 4. Los ciclodepsipeptidos preferidos se muestran en la Figura 10. En la Figura 11, se muestran los datos analfticos de CloroEnniatin obtenidos por adicion de clorolactato.
Las variantes preferidas son
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-) ([3Cl-Lac]3
Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-)([3 C-Lac]2 [Lac]1 Enniatin
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B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-dorolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 Cl - Lac]i [Lac]2 Enniatin B)
- Cido(-L-valil-D-3-dorolactil-N-metil-L-valil-D-3-dorolactil-N-metil-L-valil-D-3-dorolactil-) ([3 Cl - Lac]3 Enniatin B 2)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil)([3Br-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 Br-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 Br - Lac]i [Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo(-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-) ([3 Br - Lac]3 Enniatin B 2)
- Ciclo(-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-2-hidroxiisovaleril-) ([3 Br-Lac]2 [D- Hiv]i Enniatin B)
- Ciclo(-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-2-hidroxi-lactil-N-metil-L-valil-D-2-hidroxi-isovaleril-) ([3 Br-Lac]i [D- Hiv]2 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-) ([3 N3-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-3-azidolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 N3-Lac]2 [Lac]i Enniatin)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-) ([3 F-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-N-metil-L-valil-D-3-fluorolactil-) ([3 F-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Cido(-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-) ([3 I-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 I-Lac]2 [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-yodolactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([3 I-Lac]i [Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-ciclopropillactil-N-metil-L-valil-D-3-ciclopropillactil-N-metii-L-valil-D-3-ciclo-propillactil-)
([3 Cp-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-) ([3 Br-Lac]i [3 Cl Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-) ([3 Br-Lac]2 [3 Cl Lac]i Enniatin B)
- Cido(-N-metil-L-valil-D-propagillactat-N-metil-L-valil-D-propagillactat-N-metil-L-valil-D-propagillactil-) ([3 Pr-Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo(-N-metil-L-valil-D-3-bromolactil-N-metil-L-valil-D-3-clorolactil-N-metil-L-valil-D-3-lactil-) ([3 Br-Lac]i [3 Cl Lac]i [Lac]i Enniatin B)
- Ciclo(-L-valil-d6-D-2-hidroxi-isovaleril-N-metil-L-valil-d6-D-2-hidroxi-isovaleril-N-metil-L-valil-de-D-2- hidroxiisovaleril-) (di8 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-)
([PheLac]3 Beauvericin)
- Ciclo (-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-fenillactil-) ([PheLac]3 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-fenillactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([PheLac]2 [Lac]1 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-lactil-) ([Lac]3 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-D-valil-D-fenilalanil-N-metil-L-valil-D-lactil-N-metil-L-valil-D-lactil-) ([PheLac]1 [Lac]2 Enniatin B)
- Ciclo (-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-fenillactil-N-metil-L-fenilalanil-D-lactil-) ([PheLac]2 [Lac]1 Beauvericin)
Las estructuras qmmicas de algunas de las anteriores y variantes adicionales se muestran posteriormente:
Claims (17)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Procedimiento de obtencion de al menos un peptido no ribosomico, (NRP), o uno marcado isotopicamente, comprendiendo el procedimiento la etapa de expresion heterologa de al menos una sintetasa de peptido no ribosomico (NRPS) de dicho peptido no ribosomico en el hongo filamentoso Aspergillus niger,en el que la NRP sintetasa es una ciclodepsipeptido sintetasa seleccionada de entre el grupo que contiene Enniatin, PF1022, Beauvericin y Bassianolide sintetasa,en el que se utiliza un sistema de expresion inducible integrado en el genoma del hongo filamentoso Aspergillus niger para la expresion heterologa de la al menos una sintetasa, en el que el sistema de expresion comprende al menos un casete de expresion que comprende un primer modulo para la expresion constitutiva del trans-activador rtTA2 dependiente de tetraciclina, un segundo modulo que alberga el promotor dependiente de rtTA2 para la expresion inducible de la al menos una sintetasa secundaria de un metabolito y un tercer modulo para la integracion del casete en el genoma fungico por recombinacion homologa o heterologa utilizando marcadores de seleccion apropiados.
- 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque la NRP sintetasa comprende modulos y/o dominios de al menos dos ciclodepsipeptido sintetasas diferentes.
- 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado porque la NRP sintetasa comprende el modulo 1 de una ciclodepsipeptido sintetasa y el modulo 2 y el dominio PCP/C de otra ciclodepsipeptido sintetasa.
- 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el casete de expresion comprende genes adicionales que codifican las enzimas biosinteticas de los precursores metabolicos o intermediarios metabolicos.
- 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado porque los genes adicionales codifican deshidrogenasas.
- 6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende partfculas de talco, titanio, sflice u oxido de aluminio.
- 7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende 5-20 mM de al menos un acido hidroxicarboxflico y 10-30 mM de al menos un aminoacido.
- 8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende al menos un acido D- o L-hidroxicarboxflico de formula general R1-CHOH-CO2H, en la que R1 se selecciona de entre el grupo que comprende- un C-i-C50-alquilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquenilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquinilo sustituido y no sustituido, C3-C10-cicloalquilo sustituido y no sustituido, C5-C7-cicloalquenilo sustituido y no sustituido, que en cada caso puede estar interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o no sustituidos, enlaces dobles y/o por uno o mas grupos del tipo -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)- ,-NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-- arilo, heteroarilo,-CH2-arilo o -CH2-heteroarilo, en el que el arilo y heteroarilo estan sustituidos o no sustituidos.
- 9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio de cultivo utilizado para la expresion heterologa de la sintetasa comprende al menos un D- o L-aminoacido de formula general R2-CHNH2-CO2H,en la que R2 se selecciona de entre el grupo que comprende- un C1-C50-alquilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquenilo sustituido y no sustituido, C2-C50-alquinilo sustituido y no sustituido, C3-C10-cicloalquilo sustituido y no sustituido, C5-C7-cicloalquenilo sustituido y no sustituido, que en cada caso puede estar interrumpido por uno o mas atomos de oxfgeno, atomos de azufre, atomos de nitrogeno sustituidos o no sustituidos, enlaces dobles y/o por uno o mas grupos del tipo -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)- ,-NHC(O)O-, -OC(O)NH- y/o -OC(O)O-
imagen1 metilacidnlP/rG*L-amino-acidohidroxi-carboxihcoModulo 1Modulo 2ciclacionenmatinKipactivacionCondensacionFigura 1Figura 2imagen2 PgpdA16000rtTA2S-M214000pDS 4.217244 pbTcgrAPmintetOT,isooo10000ESYNFigure 3IntegracionunicaNcoi NcolNcolNcol12,2 kb - 8.1kbIntegracionmultipleNcolNcolNcol12 2 kb17,2 kb8,1 ktFigura 4
imagen3 662,39851iOTO3COimagen4 .S sM ** Z S* zVP Bt-o ozz.«2> Hij2 SZ®"DOiw>as3S3*V:-simagen5 3imagen6 -g£*“*Simagen7 pep;su3)U|imagen8 toIT!COooCMAbundancia relativat-trwi-Kmtail-CtUWO-NCtlZ Sprite #1 KI.0,U1 AV I NLY.Zlfca T:FTM3 ♦ c ESI Fu* ms2 640,40@od12.001175,00-660,00]imagen9 Figura 7imagen10 heteroci'clicoimagen11 oyjV^(lA) soumbiv^^9Figura 10,\\acio (III)imagen12 ■65B/.eat Tiempo (min)Recuento vs Masa respecto a carga (mIt)(Chpa-N-Me-val)1001 9080ro1 ™E «irag 50I 40-•BW ;-(N-Me-Val-Chp3-N-Me-Val).(Chp*N-M»-Mal)-{N-Me-Van5452§ 30MS en tandem (Triple Quadrupol)HPLC-MS analitica (Orbitrap)[3-Cl-LacE enniatin BHPLC preparativa (fase inversa C18)Espectro de NMRFigura 11imagen13 BeauvcridnEICRecuento vs. Tiempo de adquisicion (min)jM+Na]806,4 - 2.75
- 2.251,250,75
- 772.4 [M+NH„r I H? 40,25[M+H]'Recuento vs. Masa respecto a carga m/z)x10 3(W-Me-Fhe-Hiv-fV-Me-Ptie-HIv-iV-Ms-Phe}
- 4.524*1-(Hiv-W-Me-POe-Hiv-M-Me-Phe)
- 3.5-(/V-Me-Phe-Hrv-W-Me- Phe)2 5-(Hiv-Af-Me-Phc)1.5(W-Me-Phe)133,8
- 523.10,5362,1 440,9784,3023 1100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800Recuento vs. Masa respecto a carga (m/zFigura 11a
imagen14 Estrep,EcoRi14152 pbplJ790Estrategia de intercambioRecombinacion en E. conRegion del vectorRegion ESynde protuberancia PCRprotuberancia PCRE, coliPlasmidosA-recombinasaProducto PCRModulo PF l/SmFigura 12imagen15 imagen16 Ciclodepsipeptidos - Intercambio de modulosPF1022-SintetasaEnniatin-SintetasaD-Lac/PheLacPF1022BEnniatin B[D-PheLac[3 EnniatinFigura 14CO-'J(Qamcnimagen17 Abundancia relativa (%)uAUimagen18 imagen19 COCDimagen20 PF1022Sintetasa Beauvericin-Sintetasaimagen21 Abundancia relativaimagen22 I!oH*NJAbundancia arelativa (%)imagen23 10& EIC 5,48E5 m/z 874lt= 12,87 50“12 87JLIOOt 50 ■: O'EIC 7,37E5 m/z 950t= 12,4513,451 ■2-f-rr-r-4Tttttttt-t6 8 . . 10Tiempo (min)11,85 |■ it i I'n1214n-|—i16imagen24 Figura 19[M+HrMS hj.D 4D I>*! I,= 2,815 rtf—;--------------------------------------------------------*i1 -[K,Q-D-PiM a'>L Nae-PlMMW-at-L-W-Wt -Phr] iaio^o ■[P*Phe!Laci,L’M''|i4g-Phg,&'iac4n«(V'si^g’Phe^5«[L -iV-M 0 - P h -S *0 ’Ph ft L SC.* L.»e j •-[D-PfMLsc-L-AWaft-PfteJ Iimagen25 f PheLac^Beauve ric inMSJt= 3,5 3& min-[H,0-D>^heLflC-L-iV'fiS&'Ph«-D-PheLaC'L«"Wfi-Ptse] [[M+4H]'- jny
- -JD4 PhtiLac4_^^j»h««JHi*Lac>L>W-M*.Ph6) j
- 4t,-fHMa-P!,»-Q44iaLac-LJMSK4»!is] j
- y -cn-piin! 31,-1.-!V.yi~fhe| j
xn WO «0 4» MO S» ®!) B5 TO TK *Recuento vs. Masa respecto de carga (mte)*50 m mimagen26 [PheLacJj-BeauvericinFigura 20imagen27 100658,5 - 202.1(d6 D-Hiv-N-Me-Val)-(N-Me-Val-d6 D-Hiv-N-Me-Va!)70326,1-(d6 D-Hiv-N-Me-Vat)■s SO439,25453020100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700Recuento vs. Masa respecto a carga (m/z)Abundancia relativaFigura 21Abundancia relativa
imagen28 imagen29 imagen30 _ s idTiempo (min)imagen31 imagen32 Relative Abundance -n Abundancia relativaimagen33 imagen34 Figura 24imagen35 Seq ID No 1Sintetasa quimerica PF/Enniatin>PF/ESynATGTCAAACATGGCACCACTCCCTACGATGGGCGTTGAGCAGCAAGCCCT ATCACTTTCATGCCCCTTACTCCCTCATGACGATGAGAAACACTCAGACA ACCTTTACGAGCAAGCAACTCGGCACTTCGGCTTGAGCCGAGACAAGATC GAAAATGTCTTACCATGTACTTCCTTTCAATGTGATGTCATAGATTGCGC CGTC GACGAT CGGC G G CA TG CT AT CGGTCACGTCGTCTAT GATATC CCCA ATACAGTG GACATCCAGCGTTTAGCCGCAGCCTGGAAAGAGGTTGTGCGG CAGACACCAATCTT GAGGAC CGGCAT CT TT AC AT C AGAAACCGGCGACT C TTTTCAGATCGTCTTGAAAGAAGGCTGCCTACCGTGGATGTACGCGACAT GTCTCGGCATGAAGGGGGCAGTGATACAAGATGAAGCAGTCGCCGCTATG ACTGGACCGCGTTGCAATCGATATGTCGTCCTGGAGGACCCGAGTACGAA GCAAAG GC TG CT CATC T G GA.CATT CAGC CATGCT TT AGT G GATTATACAG TCCAGGAACGCATCCTTCAGCGGGTTCTCACAGTATACGACGGCCGGGAC GTCGAGTGCCCTCGCATCAAGGATACAGAACATGTCTCTCGGTTTTGGCA ACAACACTTTGAAGGCTTAGATGCCTCCGTATTTCCCCTTCTACCATCTC ACCTAACT GT GT GCAAT C CC AATG C G CG CG CAGAAC AT CATATC T CAT AC ACGGGACCAGTCCAGAGGAAGTGGTCCCATACAAGTATCTGTCGGGCTGC ACTCGCAGTTCTTCTATCTCGCTTTACACACTCTTCGGAGGCCCTCTTCG GTGTTGTGACAGAACAATCTCACAACTCCGAGGACCAAAGACGGTCAATT GATGGCCCCGCAAGGACAGTAGTGCCTATCCGCGTCCTTTGTGCCCCAGA TCAATATGTGTCGGATGTC ATTGGGGCAA.TC ACC GC AC ACGAAC AC GCC A TGCGCGGGTTTGAGCACGCTGGACTTCGCAATATCCGCCGTACCGGAGAC GACGGGTCTGCTGCTTGTGGATTCCAGACCGTGCTACTGGTGACTGACGG TGATGCTCCCAAGACCCCTGGGAGTGTACTTCATCGAAGTGTAGAAGAAT CGGATAGATTCATGCCCTGCGCTAATCGTGCCCTTCTGCTCGACTGCCAG ATGGCTGGCAACTCGGCATCCCTAGTCGCACGATATGATCATAATGTGAT CGAC CCAC GC CAGAT G TCTCGCTTCCTGCGACAGCTAGGATACC TGATCC AACAAT TT CAT CAT CACG T C GATC T G CC TC TGGT CAAAGAACTG GACGT C GTGACGGCGGAGGATTGTGC GGAAATCGAGAAATGGAATTCAGAAC GCCT AACAATGCAAGACGCCTTAATCCACGACACCATATCCAAGTGGGCTGCTG GCGATCCCAACAAAGC TGCAGTTTTC GC TTGGGATGGGGAATGGACATAC GCCGAGCTAGACAACATATCCTCCCGTCTCGCCGTGTATATCCAATCCCT GGAC TTGAGACCAGGA CAAGCAATACTCCCACTCTGCTTCGAGAAGTCAAAATGGGTCGTCGCCACAATTCTCGCCGTCCTCAAAGCCGGTCGGGCATTC ACACTCATCGACCCGTGCGACCCCTCGGCAAGGATGGCCCAGGTCTGTCA GCAGAC CT CCGC CACAGTCGCT CTCACC TC CAAACT CCACAACACCAC CT TACGTTCCGTCGTTTCCCGCTGCATTGTGGTCGACGACGACCTCCTTCGG TCCTTACCCCGCGCCGATGGCCGCTTAAAGGCCACCGTGAAGCCACAGGA CT T GGC CTAT GT T AT T T T CACAT C TGGCAGCACAGGAGAGCCGAAAGGCA TCATGATCGAACATCGGGGGTTCGTGTCGTGTGCTATGAAATTTGGCCCC GCGCTCGGAATGGATGAGCACACGCGCGCTCTTCAATTCGCCTCATATGC GTTTGGCGCTTGTCTGGTAGAAGTTGTGACAGCTCTGATGCACGGCGGCT GCC-TCTGCATCCCTTCCGATGACGATCGCTTGAACAATGTACCGGAGTTC ATCAAAAGGGCCCAGGTGAACTGGGTGATACTCACTCCGTCGTATATCGG GACATTCCAGCCGGAAGATGTCCCTGGACTACAAACACTGGTATTGGTTG GAGAACCTATCTCAGCGTCTATTCGGGATACCTGGGCCTCCCAGGTTCGA CTCCTGAATGCCTACGGTCAGAGTGAAAGCTCAACTATGTGCAGCGTCAC GGAAGT C A GC CC GC T CT CCC TC GAAC CG AAC AAT AT CG G TCGGGC T GT AG GCC-CACGATCCTGGATCATTGATCCCGACGAGCCTGATCGTCTTGCTCCA ATTGGCTGCATTGGAGAGCTAGTGATCGAAAGTCCGGGCATTGCGCGCGA CTATATCATCGCGCCGCCGCCGGACAAGTCCCCCTTTCTCCTAGCACCCC CGGCCTGGTATCCAGCCGGGAAATTATCCAACGCCTTTAAATTTTACAAG ACTGGAGATCTCGTGCGTTATGGACCTGACGGCACCATCGTCTGCCTGGG ACC-CAAAGATTCGCAAGTGAAGATCCGAGGGCAGCGCGTAGAGATCAGCG CAC-TGGAAGCCAGTCTACGACGACAACTACCTAGTGACATCATGCCCGTG GCCGAAGCTATCAAACGCTCGGATTCGTCAGGCAGCACAGTCTTGACTGC CTTCTTGATAGGGTCATCTAAGAGTTTATCTGCGGCAGACGCCGTTATCT TGC-ATCACGGTGCTACCAACGAGATAAACGCGAAGTTGCAGCAAATCCTT CCCCAGCATTCCGTTCCATCCTATTATATCCACATGGAAAATCTTCCTCG AACTGCCACCGGCAAAGCGGACAGGAAAATGCTTCGATCTATTGCTAGCA AGCTATTGGGTGAATTGTCTCAGAACGTGACATCTCAACCGATTGAGAAG CACGATGCCCCAGCAACTGGTATAGAGGTCAAGCTGAAGGAGCTTTGGTT TCTGAGCTTGAATCTTAATCCCAACTCTCAAGATGTCGGAGCGAGTTTCT TTC-ACTTAGGCGGAAATTCCATTATCGCCATCAAAATGGTAAACATGGCG AGGTCAGCTGGGATAGCACTGAAGGTATCCGACATATTCCAGAATCCCAC GCTCGCTGGTCTCAAGGCTATTGTCATTGGTACTTCGCTGCCATACAGCC TTATTCCCAAGGTTACCCGCCAAGGCCCTGTTAGCGAGCAGTCTTATGCG CAAAACAGAATGTGGTTCCTGGATCAGTTGTCTGAGGGTGCTTCATGGTA TCTGATTCCTTTCGCTGTGCGCATGCGAGGTCCGGTGGATGTTGATGCGT TGACGCGTGCTTTGCTCGCTCTTGAACAGCGTCATGAGACACTACGAACT ACATTTGAGAACCAAGATGGTGTTGGAGTCCAGATCATCCATGATAGACTCTCCAAAGAGCTACAAGTCATCGATGCCTTGGATGGTGACGAGGGTGGTC TCAAGACACT CT AC AAAGTAGAGACCAC CACATTC GACAT CACATCCGAA GCAGGCTGGAGCTCAACCCTCATCCGCCTCGGCAAAGACGATCACATTCT GTCTATCGTCATGCACCACATCATCTCCGACGGCTGGTCCATCGACGTTC TCCGCCGCGAACTCATCCAACTCTACGCCGCCGCTCTGCAGGGCAAGGAT CCTTCCTCCGCACTAACCCCCCTACCCATCCAGTACAGCGACTTCGCCGT GTGGCAGAAGCAGGAGGCCCAAGCAGCTGAGCACGAGAGGCAGCTCCAGT AC TGGAAGAAGCAACTCGCAGATAGTTCAC C T GC CAAGATCCCTAC CGACTTCCCCCGTCCAGATCTCCTGTCCGGTGACGCAGGCGTTGTGCCCGTTGCCATCGACGGCGAGCTGTATCAGAAACTAAGGGGCTTCTGCAACAAGCACA ACAGCACTGCCTTCTCCATCCTGCTCGCTGCTTTCCGCGCGGCGCATTAC CGTC7CACAGCCGTTGACGACGCCGTGATCGGCATCCCCATTGCAAACCG TAAC CGCT GGGAGC TGGAGAACAT GATT GGTT TCT T TGTCAACACGCAGT GTAT GC GCATCG CC GTTGAC GAGACGGATACATTT GAGAGTCTG GTGC GC CAGGT C AGAT CT AC CACT AC AG CT GC GT TT GC GC AC GAGGAT GT CC C C TT CGAGCGTGTCGTTTCAGCGCTTCAGCCTGGCCATAGAGATCTCTCGCGAA CACCGCTGGCACAGATAATGTTTGCTGTTCACTCGCAGAAGGACCTTGGA CGTTTCGAGCTGGAGGGTATCCAGTCTGAGCCTATCGCCAGCAAGGCCTA CACCAGATTCGATGTCGAGTTCCATCTGTTCCAACAGGCAGACGGACTGA AGC-GCAGTTGCAACTTTGCCACAGATCTCTTCAAGCCCGAAACTATCCAG AATGTTGTCAGCGTGTTTTTCCAGATTCTACGCCATGGCCTTGACCAGCC TGAGACGTGTATCTCGGTTCTTCCACTGACTGATGGAGTCGAGGAGCTTC GCAGGT T GGATC TGCTGGAAAT CAAGAG GACTAAC TAC CC TCGC GATT CG AGCGTGGTAGATGTCTTCCGCGAACAAGCTGCCGCCAACCCAGAGGTTAT CGCT GT TACCGACT CATCTT CT CGTCTGACTTATGCAGAGCTGGACAATA AGTC TGAGCTGC TC TCACGATGGCTTCGAC GACGTAAC TT GACG CCAGAG ACGCTGGTCAGTGTTCTTGCTCCCCGGTCTTGCGAGACTATCGTTGCCTA TGTTGGTATCCTCAAGGCGAACCTGGCGTATCTTCCTCTTGACGTGAGGT CC CC GG T G AC TC GT AT GAAG GAC ATC TT GT CG AGC G TG T C TGG AAACACC ATAGTTCTTATGGGCTCTGGGGTAGAGGATCCTGGCTTTGACTTACCGCA AC TAGAGC TC GTAC GCAT CACC GACACT TT C GATGAGAC CATC GAGGAC G TGCAAGACTCTCCCCAACCGTCTGCCACAAGCCTCGCCTACGTCGTCTTC ACAT CC GGTTCAAC TGGTAAAC CCAAGG GC GT CAT GAT CGAGCACCGGGC CATTGTGCGTCTCGTCAAGAGTGACAACTTTCCTGGCTTCCCCTCCCCCG CTCGCATGTCAAATGTCTTCAACCCTGCCTTCGACGGAGCCATCTGGGAG AT CAAC T GGATG CT CCTGAACGGCGGAACAGT CGT C TGCATCGACT AC CT GACCACCCTGGACGGCAAAGAGCTCGCTGCTGTGTTCGCCAAAGAGCGCG TCAACGCCGCCTTCTTCGCACCTGCGATGCTCAAGCTTTACCTCGTTGATGCGCGCGAGGCTTTGAAGAATCTTGACTTCCTTATTGTTGGAGGTGAGAG GTTCGATACCAAGGAAGCCGTGGAGGCCATGCCGCTTGTGAGAGGCAAGA TTGCCAATATCTATGGTCCGACTGAGGCTGGAATAATCAGCACGTGCTAT AACATC CC CAAGGATGAGGCTTACACCAAT GGTGTTCC CATTGGTGGAAG TATCTACAACTCTGGTGCCTACGTCATGGATCCTAACCAGCAACTTGTCG GCCTTGGCGTCATGGGAGAGCTTGTTGTTACCGGAGACGGTGTTGGTCGA GGCTACAC TAAC CCCGAGCT CAACAAGAAC CGCTTCATCGACAT CACCAT CGAGGGCAAGAC TTTCAAGGCTTACCGTAC TGGTGACCGGATGC GTGCAC GAC-TAGGCGACGGTCTCCTTGAGTTCTTCGGCCGCATGGACAACCAGTTC AAC-ATCCGCGGCAACCGTATCGAAGCAGGGGAAGTTGAGTCTGCCATGCT CAGCCTCAAGAATGTCCTTAACGCCGCCATTGTCGTCCGCGGGGGCGGAG AAGATGAAGGGCCACTCGAGATGGTCGGATTCATCGTCGCGGACGACAAG AAIGATAC CACGGAGGAGGAAGAGACAGGCAACCAAGT TGAGGGCTGG CA GGACCATTTCGAGAGTGGTATGTACTCGGATATCAGCACCGCCGTGGACC AATCTGCCATTGGAAACGACTTTAAGGGCTGGACTTCTATGTACGATGGT AAGGAT AT C GACAAG G GC GAGAT G CAG GAG T G GT T G GAC GACG C TA T T CA CACCCTGCATAACGGCCAGATCCCTCGCGATGTCCTCGAGATCGGTACCG GTAGTGGTATGATCCTGTTCAACCTCAACCCGGGCCTCAACAGCTACGTT GGTCTTGA.TCCATCCAAGTCAGCAGTCGAGTTCGTCAACAGAGCCGTCGA GTCCTCTCCCAAGTTCGCAGGAAAAGCCAAGGTCCACGTCGGCATGGCCA CAC-ACGTCAACAAACTCGGCGAAGTACACCCCGATCTCGTGGTCTTCAAC TCCGTTGTTCAATACTTCCCCACACCCGAGTATCTCGCCGAGGTCATCGA TGGCCTCATTGCCATCCCCAGCGTCAAGCGCATCTTCCTTGGCGATATCA GATCATATGCTACCAACGGACACTTCCTCGCCGCACGCGCCATCCACACG CTCGGCACCAATAACAACGCCACCAAGGATAG'GGTGCGCCAGAAGATCCA GGAGCTGGAGGATCGAGAGGAAGAGTTTCTCGTTGAGCCTGCCTTCTTCA CCACTCTGAAGGAGCGACGTCCAGATGTTGTCAAGCATGTTGAGATCATC CCCAAGAACATGAAGGCCACCAACGAACTCAGCGCCTATCGCTACACGGC TGTTGTGCATCTGCGGGATGAAACGGACGAACCTGTGTATCATATTGAGA AGC-ATAGCTGGGTTGACTTTGAGGCGAAGCAGATGGACAAGACGGCTCTT CrTGACCACCTGCGCCTCTCCAAGGATGCTATGAGTGTGGCGGTTAGCAA CATCACCTACGCCCACACTGCCTTTGAACGTCGTATCGTTGAGTCTCTCG ArC-AGGATAGCAAGGATGACACCAAGGGTACACTCGATGGTGCAGCCTGG CTCTCAGCAGTTCGCTCCGAAGCCGAAAACCGCGCCTCACTCACCGTCCC CGACATCCTGGAGATCGCCAAAGAGGCTGGTTTCCGAGTTGAAGTCAGCG CrC-CTCGCCAGTGGTCCCAAAGTGGTGCTTTAGACGCAGTCTTCCACCAC TrTCCACCCTCCAGCACTGACCGCACTCTAATCCAGTTCCCCACGGACAA CGAGCTTCGATCATCACTCACCCTCGCCAACCGCCCTCTCCAGAAGCTGCAGCGCCGTCGTGCCGCTCTGCAAGTCCGCGAGAAGCTCCAGACGCTGGTC CCGTCTTACATGGTTCCTCCGAATATCGTGGTGCTGGACACGATGCCTCT CAAT AC T AAC GG CAAG AT C GAC AGAAAG GA GCTTACGCGT AGAG CAC G AA CACTGCCGAAGCAGCAGACTGCGGCGCCTGTGCCGGACTTCCCTATCTCT GATATCGAGATCACGCTGTGCGAGGAGGCAACTGAGGTCTTTGGAATGAA GGTTGAAATCAGCGATCACTTCTTCCAGCTCGGCGGTCACTCTCTCCTCG CTACGAAACTCATTTCTCGCATCCAGCACCGTCTCCATGTGCGGGTTACT GT GAAGGAC GTATTC GACAGC C C T GT CTTT GC CGATC T GGCAGT CAT C AT CCC-TCAAGGACTTGCTATGCAGAACCCTGTTGCTGAAGGACAGGACAAGC AAGGCTGGTCCTCGAGAGTTGCCCCTCGTACAGAAGTCGAGAAGATGCTG TGCGAGGAGTTCGCAGCTGGTCTTGGTGTCCCGGTTGGTATCACTGACAA CTTCTTCGATCTCGGTGGTCACTCGCTCATGGCTACTAAGCTAGCTGTGC GAATTGGCCGTCGCCTTGATACCGCCATCACAGTCAAGGACATCTTCGAC TACCCTGTGCTTTTCCAATTGGCGAAGAAGTTGGAGTCTTCGCATTCCAA GAGCTACGAGGAGTCTGGCGACGATATCCAGATGGCCGATTACACTGCAT TC CAGCTC CTCGAT C TGGAAGACC CCCAAGACITTGTT CAGTCC CAGATT CGGCCTCAACTGGACTCCTGCTACGGCACCATCCAGGATGTCTACCCGTC TACGCAGATGCAAAAGGCCTTCCTCTTCGATCCCACGACCGGCGAGCCCC GAGGTCTTGTGCCTTTCTATATCGACTTCCCCAGCAATGCAGATGCCGAG ACCCTCACCAAGGCTATCGGAGCTCTAGTTGACAAGCTCGATATGTTCAG AACT GTCT TCCT GGAGGCCGCAGGCGATCT GTACCAAGTT GTCGTT GAGC AC C T C AAC T T GC C T AT T G A G A.C CAT C GA GA C T GAG AAG AAC GT C AAC ACT GCAA C C GG T GAC TACCTGGATGTTCATGGAAAGGAC CCTGTCCGTC TAGG CCACCCGTGCATCCAATTCGCCATCCTGAAGACTGCCTCCTCTGTACGTG TTCTCCTGCGAATGTCCCACGCTCTGTATGATGGTTTGAGTTTTGAGTAC ATCGTCCGTGGTCTCCACGTTCTCTACAGCGGTAGAAACCTCCCCCCACC AACACAGT T T GC GCGATACATGCAGTAT GC T G CACACAG T CGTGAAGAAG GTTATCCCTTCTGGCGCGAGGTTCTGCAGAACGCGCCCATGACAGTTCTA CACGACACCAATAACGGTATGTCTGAGCAAGAGATGCCAGCCTCCAAGGC GGTACACCTGTCAGAGGTCGTCAACGTTCCAGCGCAAGCTATTCGAAACA GTACCAACACCCAAGCGACCGTCTTCAACACCGCCTGTGCCCTTGTCCTA GCCAAGGAATCCGGCTCACAGGATGTCGTCTTCGGCCGTATTGTCTCTGG TCC-ACAAGGTCTACCAGTCGTCTGGCAGGACATCATCGGCCCCTGCACAA ACC-CCGTGCCCGTCCACGCACGCGTCGACGATGGAAACCCCCAACGCATC ATCCGCGACCTACGCGACCAATACCTCCGCACTCTGCCCTTCGAATCGCT TGC-CTTCGAGGAAATCAAGCGTAACTGCACGGACTGGCCCGAAGAATTGA CCAACTTCTCTGTCTGCGTGACGTACCACAACTTCGAGTACCACCCCGAG AGCGAAGTTGACAACCAAAAGGTTGAGATGGGAGTTTTGGCAAAGTATGTTGAGTTGAGTGAAAACGAGCCGCTGTACGATCTTGCTATTGCGGGAGAGGTTGAGGCGGATGGAGTTAACCTGAAGGTCACTGTTGTTGCAAAGGCAAGGCTTTACAATGAGGCGAGGATTAGACATGTGCTTGAGGAAGTTTGCAAAACTTTCAATGGTTTGAACGAGGCTTTGTAGSea ID No. 2Sintetasa quimerica PF/Beauvericin>PF/BeauvATGTCAAACATGGCACCACTCCCTACGATGGGCGTTGAGCAGCAAGCCCT AT CAC T TT CAT GC C CC T T AC T C C C TCAT GAC GAT GAGAAACACT C AGACA ACCTTTACGAGCAAGCAACTCGGCACTTCGGCTTGAGCCGAGACAAGATC GAAAATGrCTTACCATGTACTTCCTTTCAATGTGATGTCATAGATTGCGC CGTCGACGATCGGCGGCATGCTATCGGTCACGTCGTCTATGATATCCCCA ATACAGTGGACATCCAGCGTTTAGCCGCAGCCTGGAAAGAGGTTGTGCGG CAGACACCAATCTTGAGGACCGGCATCTTTACATCAGAAACCGGCGACTC TTTTCAGATCGTCTTGAAAGAAGGCTGCCTACCGTGGATGTACGCGACAT GTCTCGGCATGAAGGGGGCAGTGATACAAGATGAAGCAGTCGCCGCTATG ACTGGACCGCGTTGCAATCGATATGTCGTCCTGGAGGACCCGAGTACGAA GCAAAGGCTGCTCATCTGGACATTCAGCCATGCTTTAGTGGATTATACAG TCCAGGAACGCATCCTTCAGCGGGTTCTCACAGTATACGACGGCCGGGAC GTCGAGTGCCCTCGCATCAAGGATACAGAACATGTCTCTCGGTTTTGGCA ACAACACTTTGAAGGCTrAGATGCCTCCGTATTTCCCCTTCTACCATCTC ACCTAACTGTGTGCAATCCCAATGCGCGCGCAGAACATCATATCTCATAC ACGGGACCAGTCCAGAGGAAGTGGTCCCA.TACAAGTATCTGTCGGGCTGC ACTCGCAGTTCTTCTATCTCGCTTTACACACTCTTCGGAGGCCCTCTTCG GTGTTGTGACAGAACAArCTCACAACTCCGAGGACCAAAGACGGTCAATT GATGGCCCCGCAAGGACAGTAGTGCCTATCCGCGTCCTTTGTGCCCCAGA TCAATATGTGTCGGATGTCATTGGGGCAATCACCGCACACGAACACGCCA TGCGCGGGTTTGAGCACGCTGGACTTCGCAATATCCGCCGTACCGGAGAC GACGGGTCTGCTGCTTGTGGATTCCAGACCGTGCTACTGGTGACTGACGG TGATGCTCCCAAGACCCCTGGGAGTGTACTTCATCGAAGTGTAGAAGAAT CGGATAGATTCATGCCCrGCGCTAATCGTGCCCTTCTGCTCGACTGCCAG ATGGCTGGCAACTCGGCATCCCTAGTCGCACGATATGATCATAATGTGAT CGACCCACGCCAGATGTCTCGCTTCCTGCGACAGCTAGGATACCTGATCC AACAATTTCATCATCACGTCGATCTGCCTCTGGTCAAAGAACTGGACGTC GT GAC GGC GGAG GATT GT GC GGAAATCGAGAAATGGAATTCAGAAC GC CT AACAATGCAAGACGCCTTAATCCACGACACCATATCCAAGTGGGCTGCTG 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