CN106414481A - 用于在丝状真菌中生产嵌合环寡缩酚酸肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于获得至少一种微生物次级代谢产物或其衍生物的方法，该方法包括在至少一种丝状真菌中异源表达所述次级代谢产物的至少一种合成酶的步骤。此外，本发明涉及表达盒、含有所述表达盒的质粒载体、表达宿主、新颖环缩酚酸肽以及嵌合环缩酚酸肽合成酶。
Description
本发明涉及根据权利要求1所述的用于获得微生物次级代谢产物的方法、根据权利要求16所述的表达盒、根据权利要求17所述的质粒载体、根据权利要求18所述的环缩酚酸肽、根据权利要求19所述的表达宿主以及根据权利要求20所述的嵌合环缩酚酸肽合成酶。
描述
最近的基因组挖掘工作已经发现，丝状真菌的基因组编码出乎意外的丰富库的具有商业相关性的低分子量化合物。这些称作次级代谢产物的天然产物包括具有药理学影响的非核糖体肽、聚酮化合物和脂肽。然而，在次级代谢途径中涉及的大部分基因并不在标准实验室或工业条件下表达，这妨碍了这些天然产物的应用。因此已经进行了基于分子因素和培养方法的不同策略。然而，克服如低生产率的问题仍存在主要障碍。
本发明因此描述了用于合成微生物次级代谢产物或其衍生物特别是环缩酚酸肽的新颖途径。
本发明方法包括在至少一种丝状真菌中异源表达所述次级代谢产物的至少一种合成酶的步骤。
丝状真菌优选地选自以下项的组：曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属以及根霉属。具体而言，优选的表达宿主是黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、里氏木霉、尖镰孢、米根霉、产黄青霉。
在本发明方法的实施例中，合成酶选自以下项的组：非核糖体肽合成酶(NRPS)、核糖体合成且翻译后修饰的肽(RiPP)、聚酮化合物合成酶(PKS)、萜烯环化酶或其杂合体。
如果合成酶是环缩酚酸肽合成酶，特别是迭代型的环缩酚酸肽合成酶，这是特别优选的。例如，合成酶是选自含有以下项的组的环缩酚酸肽合成酶：恩镰孢菌素合成酶、PF1022合成酶、白僵菌素合成酶以及类白僵菌素合成酶。
通常还可能且可想像的是在提及的真菌之一中表达另外的NRPS，如埃博霉素、放线菌素、达托霉素、缬氨霉素、真菌孢肽或博莱霉素的NRPS。
在另一种变型中，令人希望的是在真菌表达宿主中表达PKS系统，如红霉素、多西环素或格尔德霉素的PKS系统。
天然环缩酚酸肽合成酶典型地包括两个模块：用于整合D-羟基羧酸的模块1、用于整合L-氨基酸的模块2以及另外地用于决定环大小n(典型地n＝6和8)的第三PCP和C-结构域(模块3)。环缩酚酸肽合成酶的典型实例(如恩镰孢菌素合成酶)示于图1中。
恩镰孢菌素是由3个D-羟基羧酸和3个L-氨基酸组成的六环缩酚酸肽。主要产品是恩镰孢菌素A、B、和C，其中恩镰孢菌素A包含3x D-Hiv、3x L-lle，恩镰孢菌素B包含3x D-Hiv、3x L-Val，并且恩镰孢菌素C包含3x D-Hiv、3x L-Leu。N-原子在任何情况下都是甲基化的。
恩镰孢菌素是由存在于镰孢属物种、半翅轮枝孢轮枝孢(Vertcilliumhemipterigenum)、海球菌属物种(Halosarpheia sp.)中的恩镰孢菌素合成酶合成的。在恩镰孢菌素B的情况下，模块1对D-羟基戊酸酯有特异性，模块2对L-缬氨酸有特异性，并且PCP/C-结构域(模块3)决定环数n＝6。
例如存在于无孢菌类(Mycelia sterilia)中的PF1022合成酶包括对D-苯基乳酸酯和/或D-乳酸酯有特异性的模块1、对L-亮氨酸有特异性的模块2以及决定环数n＝8的PCP/C-结构域(模块3)。
例如来自球孢白僵菌菌株ATCC7159的白僵菌素合成酶包括对D-羟基戊酸酯有特异性的模块1、对L-苯丙氨酸有特异性的模块2以及决定环数n＝6的PCP/C-结构域(模块3)。
在另一个优选实施例中，使用嵌合环缩酚酸肽合成酶，其中该合成酶由至少两种不同环缩酚酸肽合成酶的模块和/或结构域构成。如果至少一个模块选自第一环缩酚酸肽合成酶并且至少第二模块选自另一种环缩酚酸肽合成酶，这是优选的。例如，可能的是该合成酶包括一种环缩酚酸肽合成酶的模块1以及另一种环缩酚酸肽合成酶的模块2和3。
此类杂合或嵌合环缩酚酸肽合成酶的优选实施例可以具有以下安排：
a)来自PF1022合成酶的对D-苯基乳酸酯/D-乳酸酯有特异性的模块1(例如来自无孢菌类)、来自恩镰孢菌素合成酶的对L-缬氨酸有特异性且n＝6的模块2及PCP/C-结构域(模块3)(例如来自尖孢镰孢；参见图14，Seq ID No1)，或
b)来自PF1022合成酶的对D-苯基乳酸酯/D-乳酸酯有特异性的模块1、来自白僵菌素合成酶的对L-苯丙氨酸有特异性且n＝6的模块2及PCP/C-结构域(模块3)(参见图18，SeqID No 2)。
通常，任何其他模块/结构域组合是可能的。例如可想像且可能的是，模块1选自恩镰孢菌素或白僵菌素合成酶，并且模块2和PCP/C-结构域(模块3)选自PF1022合成酶。
然而，包含来自白僵菌素合成酶的模块1以及来自类白僵菌素合成酶的模块2和PCP/C-结构域(模块3)作为合成酶系统的杂合环缩酚酸肽合成酶系统(其已经显示在酿酒酵母中表达)是已经已知的并且特此被排除在外(于(Yu)等人，化学通讯(ChemComm.)，2013，49:6176-6178)。然而，这种特异性嵌合环缩酚酸肽合成酶不排除在丝状真菌中进行表达。
在本发明的另外一个实施例中，使用整合到至少一种丝状真菌的染色体中的诱导型表达系统来异源表达至少一种合成酶。这样一种诱导型表达系统是独立于代谢的。通常，组成型表达也是可能的。
在变型中，该表达系统包括至少一种由至少三个模块组成的表达盒。表达盒可以包括用于组成型表达四环素依赖性反式激活因子rtTA2的第一模块、具有用于诱导型表达至少一种次级代谢产物合成酶的rtTA2依赖性启动子的第二模块(Tet-on系统)以及用于通过同源重组将盒整合到真菌基因组中的第三模块。
在最优选的实施例中，第一模块包括组成型启动子PgpdA-rtTA-终止子TcgrA，第二模块包括操纵子序列tetO7-(tetO序列的七个拷贝)-最小启动子Pmin-次级代谢产物合酶(esyn 1)-终止子trpC(具有作为rtTA2S-M2依赖性启动子的tetO7::Pmin)，并且第三模块包括用于将质粒同源整合在pyrG座位处的pyrG*。将包含所述表达盒的质粒载体转化到优选的蛋白酶阴性(prtT)且尿嘧啶营养缺陷型(pyrG-)黑曲霉菌株中之后，对尿苷原养型转化体进行选择、纯化并使其经受Southern分析。表达盒示例性地示于图2中。
其他选择系统可以基于针对丝状真菌确立的显性的(抗生素，如潮霉素或腐草霉素)、营养缺陷型或营养选择标记物。
表达盒的至少一个拷贝被整合到真菌基因组中。可能的是，多个表达盒存在于真菌基因组中。
在本发明的另一种变型中，表达盒包括编码代谢前体或代谢中间体的生物合成酶特别是脱氢酶的另外的基因。例如，使用组成型表达的用于将氨基酸转化为羟基羧酸的脱氢酶允许独立合成不同的羟基羧酸。
所述另外的基因也可以不是表达盒的一部分，并且可以通过使用至少一个组成型、诱导型或阻遏型启动子而从不同的染色体位置表达。
使经转化的真菌表达宿主在适合的培养基中生长。用于异源表达合成酶的培养基可以包括滑石、四价钛、二氧化硅或氧化铝颗粒，其中滑石颗粒是特别优选的。这些颗粒支持更小的真菌球粒的形成。
此外，培养基包括葡萄糖、痕量元素、酪蛋白氨基酸、MgSO4、酵母提取物。在本发明方法的一种变型中，葡萄糖浓度是1％-10％，优选2.5％至7.5％，最优选5％。
如果用于异源表达合成酶的培养基包括5-50mM、优选10-30mM、最优选20mM的至少一种羟基羧酸或其衍生物(例如20mM的D-羟基戊酸酯)和10-30mM、优选15-25mM、最优选20mM的至少一种氨基酸或其衍生物(例如L-缬氨酸)，这也是优选的。
通常还可能的是，用其对应的酯、用O-酰化的羟基羧酸及其对应的酯替代羟基羧酸。由此甲基酯是优选的。
通过添加适当的诱导物，例如5-200μg/ml特别是10-100μg/ml、最优选10-50μg/ml的多西环素或其他诱导物如四环素或其衍生物来诱导表达。添加10μg/ml的多西环素是特别优选的。优选地在对数期，特别是以分批或补料分批培养进行诱导。诱导物可以添加一次或重复地添加。
在本发明的再一个实施例中，用于异源表达合成酶的培养基包括具有通式(I)R1-CHOH-CO2H的至少一种D-或L-羟基羧酸(或其外消旋混合物)，其中R1可以选自下组，该组包括
-取代的和未取代的C1-C50-烷基、取代的和未取代的C2-C50-烯基、取代的和未取代的C2-C50-炔基、取代的和未取代的C3-C10-环烷基、取代的和未取代的C5-C7-环烯基，在每种情况下所述基团可以被一个或多个氧原子、硫原子、取代的或单取代的氮原子、双键打断和/或被类型-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-和/或-OC(O)O-中的一个或多个基团打断，或
-芳基、杂芳基、-CH2-芳基或-CH2-杂芳基，其中芳基和杂芳基是取代的或未取代的。
因此，可以在表达宿主的生长期间将羟基羧酸给料至培养基中。然而，也可能的是，由表达宿主本身合成至少一些羟基羧酸。
部分R1可以选自下组，该组包括取代的和未取代的C1-C12-烷基、取代的和未取代的C3-C7-环烷基和取代的和未取代的C2-C12-烯基以及取代的和未取代的C6-C12芳基特别是-C6H5。
关于烷基、烯基、炔基、环烯基的术语“取代的”涉及以下取代基中的一个或多个对一个或多个原子(通常是H-原子)的取代：卤素(特别是F、Cl、Br)、羟基、受保护的羟基、氧代、受保护的氧代、-N3、C3-C7-环烷基、苯基、萘基、氨基、受保护的氨基、伯氨基、仲氨基或叔氨基、杂环、咪唑基、吲哚基、吡咯烷基、C1-C12-烷氧基、C1-C12-酰基、C1-C12-酰氧基、硝基、羧基、氨甲酰基、甲酰胺、N-(C1-C12-烷基)甲酰胺、N,N-二(C1-C12-烷基)甲酰胺、氰基、甲基磺酰基氨基、硫醇基、C1-C10-烷硫基以及C1-C10-烷基磺酰基。经取代的基团可以被相同的或不同的取代基取代一次或两次。
以上经取代的烷基基团的实例包括2-氧代-丙-1-基、3-氧代-丁-1-基、氰基甲基、硝基甲基、氯甲基、羟基甲基、四氢吡喃基氧基甲基、三苯甲基氧基甲基(trityloxymethyl)、丙酰基氧基甲基、氨基甲基、羧基甲基、烯丙氧基羰基甲基、烯丙氧基羰基氨基甲基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、叔丁氧基甲基、乙酰氧基甲基、氯甲基、溴甲基、碘甲基、三氟甲基、6-羟基己基、2,4-二氯(正丁基)、2-氨基丙基、1-氯乙基、2-氯乙基、1-溴甲基、2-溴甲基、1-氟乙基、2-氟乙基、1-碘乙基、2-碘乙基、1-氯丙基、2-氯丙基、3-氯丙基、1-溴丙基、2-溴丙基、3-溴丙基、1-氟丙基、2-氟丙基、3-氟丙基、1-碘丙基、2-碘丙基、3-碘丙基、2-氨基乙基、1-氨基乙基、N-苯甲酰基-2-氨基乙基、N-乙酰基-2-氨基乙基、N-苯甲酰基-1-氨基乙基、N-乙酰基-1-氨基乙基等。
以上经取代的烯基基团的实例包括苯乙烯基、3-氯-丙烯-1-基、3-氯-丁烯-1-基、3-甲氧基-丙烯-2-基、3-苯基-丁烯-2-基、1-氰基-丁烯-3-基等。
如在此使用的术语“炔基”涉及具有化学式R-C≡C-的部分，具体而言涉及C2-C50-炔基。C2-C50-炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、2-庚炔基、3-庚炔基、4-庚炔基、5-庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一炔基、十二炔基、以及直链或支链烷基链的二炔和三炔。
术语“氧代”涉及经由双键与氧原子连接由此形成酮基或醛基的碳原子。术语“受保护的氧代”涉及被两个烷氧基取代或与经取代的二醇连接两次形成非环状或环状缩酮基团的碳原子。
术语“烷氧基”涉及像甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等的部分。优选的烷氧基基团是甲氧基。
术语“C3-C7-环烷基”包括像环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基的基团。术语“C5-C7-环烯基”涉及1、2或3-环戊烯基环，1、2、3或4-环己烯基环或1、2、3、4或5-环庚烯基环。
优选地，R1是甲基、乙基、-CH(CH3)2、丙基、异丙基、-CH2-CH(CH3)2、丁基、异丁基、叔丁基、-CH2-C(CH3)3、戊基、己基、-CH2-C6H5、-CH2-Cl、-CH2-Br、-CH2-F、-CH2-I、-CH2-N3、-CH2-C≡CH、-CH2CH＝CH2CH3或-CH2-环C3H5。
在本发明的另一个优选实施例中，用于异源表达合成酶的培养基包括具有通式(II)R2-CHNH2-CO2H的至少一种D-或L-氨基酸，其中R2可以选自下组，该组包括
-取代的和未取代的C1-C50-烷基、取代的和未取代的C2-C50-烯基、取代的和未取代的C2-C50-炔基、取代的和未取代的C3-C10-环烷基、取代的和未取代的C5-C7-环烯基，在每种情况下所述基团可以被一个或多个氧原子、硫原子、取代的或单取代的氮原子、双键打断和/或被类型-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-和/或-OC(O)O-中的一个或多个基团打断。具体而言，R2是-CH2-C6H5(苯基)、-CH2-CH(CH3)2、-CH2(CH3)2。
因此，可以在表达宿主的生长期间将氨基酸给料至培养基。将氨基酸给料至培养基仅具有支持特性并且改进总体表达产量。然而，也可能(且常见)的是，由表达宿主自己合成至少一些氨基酸，优选天然存在的氨基酸。
转化到表达宿主中之前，表达盒是质粒载体的一部分。
包含具有恩镰孢菌素合酶的表达盒的这样一种质粒载体的实例示于图3中。在这种具体的质粒载体中，Esyn基因(恩镰孢菌素合成酶)被克隆到Tet-On表达载体pVG2.2中。由于基因较大(9.4kb)，使用pyrG作为选择标记物通过SLIC和同源重组方法进行克隆。然而，其他适合的克隆技术也是可应用的。
将表达盒整合到真菌(如黑曲霉)染色体中的过程示例性地示于图4中。可以通过同源或异源重组整合到基因组中，因此产生携带表达盒的单拷贝或多拷贝整合的转化体。
本发明方法允许合成至少一种包括以下通式(III)的环缩酚酸肽或其衍生物
其中R1和R2具有以上含义，R3是C1-C3烷基部分特别是-CH3部分，并且m＝3或4。优选的环缩酚酸肽示于图10中。在图11中，示出了通过给料氯乳酸酯获得的氯恩镰孢菌素的分析数据。
优选的变体是
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-)([3Cl-Lac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([3Cl-Lac]2[Lac]1恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([3Cl-Lac]1[Lac]2恩镰孢菌素B)
-环(-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-)([3Cl-Lac]3恩镰孢菌素B 2)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基)([3Br-Lac]2[Lac]1恩镰孢菌素B)
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-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([3Br-Lac]1[Lac]2恩镰孢菌素B)
环(-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-)([3Br-Lac]3恩镰孢菌素B 2)
环(-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-2-羟基异戊酰基-)([3Br-Lac]2[D-Hiv]1恩镰孢菌素B)
环(-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-2-羟基-乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-2-羟基-异戊酰基-)([3Br-Lac]1[D-Hiv]2恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-叠氮基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-叠氮基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-叠氮基乳酰基-)([3N3-Lac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-叠氮基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-叠氮基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([3N3-Lac]2[Lac]1恩镰孢菌素)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氟乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氟乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氟乳酰基-)([3F-Lac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氟乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氟乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氟乳酰基-)([3F-Lac]2[Lac]1恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-碘乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-碘乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-碘乳酰基-)([3I-Lac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-碘乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-碘乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([3I-Lac]2[Lac]1恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-碘乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([3I-Lac]1[Lac]2恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-环丙基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-环丙基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-环丙基乳酰基-)([3Cp-Lac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-)([3Br-Lac]1[3Cl Lac]2恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-)([3Br-Lac]2[3Cl Lac]1恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-炔丙基乳酸-N-甲基-L-缬氨酰基-D-炔丙基乳酸-N-甲基-L-缬氨酰基-D-炔丙基乳酰基-)([3Pr-Lac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-溴乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-氯乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-3-乳酰基-)([3Br-Lac]1[3Cl Lac]1[Lac]1恩镰孢菌素B)
环(-L-缬氨酰基-d6-D-2-羟基-异戊酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-d6-D-2-羟基-异戊酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-d6-D-2-羟基-异戊酰基-)(d18恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-苯丙氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-苯丙氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-苯丙氨酰基-D-苯基乳酰基-)([Phelac]3白僵菌素)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-苯基乳酰基-)([Phelac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([Phelac]2[Lac]1恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-乳酰基-)([Lac]3恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-D-缬氨酰基-D-苯丙氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-D-乳酰基-)([Phelac]1[Lac]2恩镰孢菌素B)
-环(-N-甲基-L-苯丙氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-苯丙氨酰基-D-苯基乳酰基-N-甲基-L-苯丙氨酰基-D-乳酰基-)([Phelac]2[Lac]1白僵菌素)
下面示出了以上和另外的变体中的一些的化学结构：
进一步可能且优选的是，使用本发明方法来产生同位素标记的和/或特别是氘化的化合物，所述化合物可以用作分析应用(例如在真菌毒素分析学中)中的标准品。
参考附图通过以下实例进一步解释本发明。它示出了：
图1环己缩酚酸肽合成酶(在这里是恩镰孢菌素合成酶)的模块安排的示意图；
图2丝状真菌中的经整合的诱导型表达系统的示意性概图；
图3具有恩镰孢菌素合成酶的表达质粒的载体图；
图4 pyrG座位中的单个和多个整合事件的概图；
图5通过在黑曲霉中异源表达对应的合酶获得的恩镰孢菌素B的1H-NMR谱；
图6通过在黑曲霉中异源表达对应的合酶获得的恩镰孢菌素B的MS-谱；
图7通过在黑曲霉中异源表达对应的合酶获得的恩镰孢菌素B的MS/MS-谱；
图8通过在黑曲霉中异源表达对应的合酶获得的恩镰孢菌素B的13C-NMR谱；
图9恩镰孢菌素B的X射线晶体结构；
图10优选的恩镰孢菌素衍生物；
图11氯恩镰孢菌素的分析数据；
图11a获得自黑曲霉的白僵菌素的分析数据；
图12用于在两个真菌NRPS编码序列之间对换全部模块的策略；
图13用于在PF1022-与恩镰孢菌素/白僵菌素合成酶之间对换羟基羧酸激活模块的所选择的同源区；
图14产生杂合真菌NRPS的概图：含有来自PFSYN的模块1和来自ESYN的模块2的杂合PFSYN/ESYN的略图。羟基羧酸特异性来自PF1022(D-PheLac/D-Lac)，氨基酸特异性来自ESYN(L-Leu)，以产生新的环己缩酚酸肽；
图15嵌合[PheLac]0-3-恩镰孢菌素衍生物的HPLC-ESI-MS。溶剂A：具有0.1％HCOOH的水，溶剂B：具有有0.1％HCOOH的ACN的乙腈。流速：0.2mL/min。用ESI-轨道阱-MS，Exactive，赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)HPLC 1200系列(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))和从1至8min从5％到100％且随后100％B持续5分多钟的梯度进行测量。柱：Grace Grom-Sil 120ODS-4HE，2x 50mm，3μm。TCC＝20℃；
图16通过串联MS测量确定嵌合[PheLac]0-3-恩镰孢菌素环缩酚酸肽的身份，片段(在肽或酯键处切割)的m/z对应于如所指示的一个或若干个氨基酸或羟基酸的丢失。溶剂A：水，溶剂B：异丙醇。流速：0.4mL/min。安捷伦科技ESI-三重四极杆-MS，6460系列，UHPLC1290无限(Infinity)-系列(安捷伦科技公司)。柱：安捷伦Poroshell 120EC-C18 3.0x50mm。TCC＝45℃。
图17[PheLac]3-恩镰孢菌素的结构式和用于确定分子式的HR-ESI-轨道阱MS；
图18将来自白僵菌素的羟基羧酸(D-Hiv)规格变为PF1022(D-PheLac/D-Lac)；
图19嵌合[PheLac]2-3-白僵菌素衍生物的HPLC-ESI-MS。
溶剂A：具有0.1％HCOOH的水，溶剂B：具有有0.1％HCOOH的ACN的乙腈。流速：0.2mL/min。用ESI-轨道阱-MS，Exactive，赛默飞世尔科技HPLC 1200系列(安捷伦科技公司)和从1至8min从5％到100％且随后100％B持续5分多钟的梯度进行测量。柱：GraceGrom-Sil 120ODS-4HE，2x 50mm，3μm。TCC＝20℃；
图20通过串联MS测量确定嵌合[PheLac]2-3-白僵菌素环缩酚酸肽的身份，片段(在肽或酯键处切割)的m/z对应于如所指示的一个或若干个氨基酸或羟基酸的丢失。溶剂A：水，溶剂B：异丙醇。流速：0.4mL/min。安捷伦科技ESI-三重四极杆-MS，6460系列，UHPLC1290无限(Infinity)-系列(安捷伦科技公司)。柱：安捷伦Poroshell 120EC-C18 3.0x50mm。TCC＝45℃；
图21获得自给料依赖性黑曲霉菌株的d18恩镰孢菌素B的提取的离子色谱图。可以将这种物质用作一种用于确定在收获品中的恩镰孢菌素的内标。氘化的标准品还从未被报道过。该系统允许合成氘化的恩镰孢菌素变体以及白僵菌素变体。
图22[3-Br-Lac]1[Lac]2恩镰孢菌素B的总离子色谱图和[3-Br-Lac]1[Lac]2恩镰孢菌素B的串联MS；
图23[3-F-Lac]3恩镰孢菌素B的串联MS；
图24[3-N3-Lac]3恩镰孢菌素B的串联MS。叠氮基基团允许1,3偶极环加成，用于对恩镰孢菌素变体进行进一步化学修饰；以及
图25通过在黑曲霉中进行前体指导的生物合成获得的[3-l-Lac]3恩镰孢菌素B的串联MS。含有碘的恩镰孢菌素变体经历消去和取代反应。
A.作为表达宿主的丝状真菌
1.术语和定义：
·宿主：
o属于曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属、根霉属的丝状真菌
·依赖性宿主：
o仅当向培养基中添加前体(羟基酸)才能够合成环缩酚酸肽的宿主(实例：黑曲霉菌株DS3.1)
·独立宿主：
o在不添加前体的情况下能够合成环缩酚酸肽的宿主(实例：黑曲霉菌株OV3.4)
2.方案：PEG介导的黑曲霉的转化
将尖镰孢的esyn1基因整合在质粒pVG2.2中，以给出质粒pDS4.2(图3)，所述质粒pDS4.2包括Tet-on系统的所有三个组分：用于组成型表达反式激活因子rtTA的PgpdA::rtTA2S-M2、以Dox依赖性方式介导esynl表达的tetO7::Pmin::esyn1以及选择和将系统靶向黑曲霉的pyrG座位所必需的pyrG*盒。
所进行的黑曲霉的转化是基于由蓬特(Punt)等人描述的方法。所使用的受体菌株是蛋白酶阴性(prtT)且尿嘧啶营养缺陷型(pyrG)的。所使用的构建体携带突变的pyrG基因(pyrG*)，这允许转化体仅在摄取外源DNA之后并且在pyrG*与黑曲霉的突变的pyrG基因形式(两个突变在不同位置处)同源重组之后才在缺乏尿苷的培养基上生长。恩镰孢菌素合成酶在Tet-On表达系统的控制下进行表达。
3.材料和溶液：
SMC：1.33M山梨醇
50mM CaCI2
20mM MES缓冲液
pH 5.8
TC：50mM CaCl2
10mM Tris/HCl
pH 7.5
STC：TC中的1.33M山梨醇
PEG缓冲液：7.5g PEG-6000
TC直到30mL
ASP+N(50x)：350mM KCl
550mM KH2PO4
3.5M NaNO3
pH 5.5
Vishniac：76mM ZnSO4
178mM H3BO3
25mM MnCl2
18mM FeSO4
7.1mM CoCl2
6.4mM CuSO4
6.2mM NaMoO4
174mM EDTA
原生质体化溶液：来自哈茨木霉的250mg溶解酶(西格玛公司(Sigma))
SMC直到10mL
pH 5.6
MM：20mL ASP+N(50x)
20mL葡萄糖(50％)
2mL MgSO4
1mL Vishniac
H2O到1L
(对于固体培养基，添加2％琼脂)
CM：MM，补充有：
10mL酪蛋白氨基酸(10％)
50mL酵母提取物(10％)
H2O到1L
(对于固体培养基，添加2％琼脂)
转化板：325.19g蔗糖
20mL ASP+N
2mL MgSO4
1mL Vishniac
12g琼脂
顶层琼脂：325.19g蔗糖
20mL ASP+N
2mL MgSO4
1mL Vishniac
6g琼脂
4.实验程序：
在30℃和120rpm下将受体菌株(例如MA169.4或AB1.13)在100mL的CM(+10mM尿苷)中培养10-16h。将菌丝体收集在myracloth过滤器上并且用SMC洗涤一次。之后，将所收集的菌丝体添加到原生质体化溶液(在50mL试管中)中并且在37℃和80rpm下孵育1-1.5h。通过显微镜检查对原生质体化进行确认。然后，通过myracloth过滤器收集原生质体并且用用STC洗涤一次。将悬浮液在10℃和2000rpm下离心10min。将上清液倾析并且将球粒轻轻地重悬于1mL的STC中。将悬浮液转移到埃彭道夫(Eppendorf)管中并且在10℃和6000rpm下离心5min。再次，将上清液倾析并且将原生质体重悬于1mL的STC中。将洗涤步骤重复两次。对于每次转化，将100μL的原生质体、10μg质粒pDS4.2(在10μL H2O中)和25μL PEG缓冲液添加到50mL试管中并轻轻地混合。添加1mL的PEG缓冲液并且将试管轻轻地混合。5min之后，添加2mL STC并混合。将20-25mL的顶层琼脂(冷却至40℃)添加到混合物中并倾倒在准备好的转化板(Φ15cm)中。将板在30℃下孵育3-4天。之后，通过将孢子在MM板上划线将转化体纯化，用于菌落分离。通过PCR和Southern印迹对经纯化的菌株进行分析，以便确认质粒pDS4.2的正确摄取和插入到受体菌株的基因组中(参见图3)。
5.合成恩镰孢菌素和氯恩镰孢菌素的依赖性宿主突变体DS3.1的分析数据(图9 5至11)
培养条件：为了鉴定用于以高产量产生恩镰孢菌素的最佳条件，使用统计软件程序MODE进行实验方法的设计。以下参数在表达esyn l的菌株DS3.1的摇瓶培养中是变化的：培养基组成(基本培养基、完全培养基、镰孢属限定培养基)，氨基酸(特别是L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸)补充(0-20mM)，羟基酸(特别是D-Hiv)补充(0-50mM)，葡萄糖浓度(1％-5％)，温度，培养时间(1-92h)以及Dox浓度(0-20μg/ml)。主要影响恩镰孢菌素产量的参数是Dox和D-Hiv。所鉴定的最佳培养基含有20mM D-Hiv、20mM的氨基酸之一以及10μg/mlDox。这种培养基组成将恩镰孢菌素产量改进了200倍。通过将葡萄糖浓度增加到5％和通过添加滑石，将恩镰孢菌素产量进一步增加约4.75倍。
恩镰孢菌素生产培养基(EM)：20mL ASP+N(50x)
100mL葡萄糖(50％)
2mL MgS04
1mL Vishniac
10mL酪蛋白氨基酸(10％)
50mL酵母提取物(10％)
100mL滑石(10％，在50mM乙酸钠缓冲液中，pH 6.5)
H2O到1L
将菌株DS3.1(用5x 106个孢子/mL进行接种)在26℃和250rpm下在EM中进行培养。16h之后，添加10mM或20mM D-Hiv、20mM l-Val和10μg/mL Dox。92h之后收获生物质，冻干并且用乙酸乙酯提取恩镰孢菌素B。
分析方法(参见图5-9，11)：
在Bruker Avance 400NMR-光谱仪上记录恩镰孢菌素B的1H-NMR和13C-NMR谱。化学位移以相对于溶剂信号的δ-单位(ppm)给出。在Jasco FT-IR4100光谱仪上记录IR谱。在LTQ轨道阱XL仪器上使用ESI技术进行HRMS。将恩镰孢菌素样品直接注入质谱仪中。
在牛津衍射Xcalibur衍射仪上收集恩镰孢菌素B的单晶结构测定的数据，所述衍射仪配备有CCD面积检测器Sapphire S以及利用MoKα辐射的石墨单色器使用氟聚烷基醚油(ABCR)将适合的晶体附接到玻璃纤维上并转移到角度稳定器中，在其中将所述晶体冷却至150K，用于数据收集。所使用的软件包：用于数据收集的CrysAlis CCD，用于晶胞精修和数据归约的CrysAlis Pro。
结果：
恩镰孢菌素B：可以在菌株DS3.1中获得高达1000mg/L的恩镰孢菌素B产量并且通过MRM-分析进行验证。
可以从转化体DS3.1的生物质(27.5mg)和1-L培养液(培养基中补充有10mM d-Hiv和20mM l-Val)中分离出393mg的经纯化的恩镰孢菌素B。
通过MS、MS/MS、IR、NMR和X射线晶体学对经分离的恩镰孢菌素B进行分析(参见图5-10)：
1H-NMR(400.1MHz,CDCl3)δ＝5.11(d,3JH,H＝8.7Hz,3H),4.49(d,3JH,H＝9.7Hz,3H),3.11(s,9H),2.32-2,21(m,6H),1.05-0.86ppm(m,36H)；13C-NMR(100.6MHz,CDCl3)δ＝170.25,169.31,75.67,63.20,33.26,29.91,27.92,20.42,19.34,18.72,18.50ppm；IR(纯净的)：v＝2963.6-2873.4(C-H,CH3和CH),1736.1(C＝O,酯),1660.9(C＝O,酰胺),1183.6(C-H,异丙基)1011.0(CO,α-羟基羧酸)；ESI-HRMS：针对[C33H57N3O9+Na]+计算的m/z：662.39870；发现值：662.39859
恩镰孢菌素类似物的产生：
给料实验的方案：
在与上述相同的条件下培养菌株DS3.1。代替D-Hiv，添加对应的羟基酸氯乳酸酯(10mM终浓度)。可以在分批或补料分批培养期间进行一次给料或以不同的时间间隔重复进行给料。
等效的方法提供了白僵菌素(参见图11a)。
B)用于产生杂合合成酶的方法和分析数据
1.用于产生嵌合合成酶的克隆策略(参见图12-14，18)：
用于在大肠杆菌中进行异源表达的使用T7启动子的表达质粒购自默克密理博公司(Merck Millipore)。通过经由限制酶切位点插入到高拷贝pRSF-Duetl质粒中来克隆编码NRPS的所有杂合基因的蛋白质表达。通过λ重组介导的系统进行组合式生物合成。经由PCR(高保真Q5-聚合酶，新英格兰生物实验室(New England Biolabs))扩增所希望的结构域或模块的序列并亚克隆进pRSF-Duetl中。将重组之后所需的选择标记物(链霉素抗性的编码序列)在单个限制酶切位点处整合到经亚克隆的片段中。针对链霉素抗性对阳性克隆进行筛选，并且随后通过侧翼单个切割位点的限制和自身连接去除抗性。将电感受态大肠杆菌BW25113细胞用在30℃下培养的具有原始NRPS基因的所希望的载体进行转化，以挽救具有λ-重组酶RED(gam，bet，exo)和单DNA保护蛋白的不耐热质粒plJ790。通过添加阿拉伯糖诱导重组酶表达，之后用含有模块的质粒转化大肠杆菌BW25113细胞，多达70个碱基对被选为重叠同源区(古斯特(Gust)等人/张(Zhang)等人1998之后修改的)。
2.具有在大肠杆菌中表达的嵌合合成酶的嵌合恩镰孢菌素和白僵菌素的产生：
培养条件和提取
将大肠杆菌Bl21gold细胞在20ml的LB-培养基中在37℃下以200rpm预培养过夜。以比率1:100用预培养物接种主培养物(50ml LB-培养基)，在37℃下孵育至OD600为0.6，并且用以0.25mM终浓度的IPTG(卡尔·罗斯公司(Carl Roth))诱导，并且在18℃下以200rpm进一步孵育24-48h用于蛋白质表达和肽产生。收获细胞并且用5ml的MeOH(工业级)提取细胞球粒。将悬浮液超声波处理(sonified)5分钟并且将上清液蒸发。
用HPLC-ESI-MS、HPLC-ESI-MS和串联MS进行分析(参见图15-17，19-25)
对于复杂的分析学，将粗提物溶解于200-500μl MeOH(HPLC级)中，并且将悬浮的固体在14000x g下离心。进行HPLC-ESI-MS，用于扫描新的衍生物。对于所有测量，我们使用安捷伦科技相关柱和HPLC/MS设备(EclipsePlus C18，2.1x 50mm；UHPLC 1290无限(Infinity)-系列，ESI-三重四极杆-MS，6460系列)。通过使用流动相系统，我们添加了具有0.1％HCOOH的H2O(A)和ACN(B)，其中ACN梯度在2.5min内是从5％到100％并且随后100％B持续5.5分多钟。
序列表
<110> 柏林工业大学
<120> 通过在丝状真菌中异源表达微生物次级代谢产物的至少一种合成酶而获得
所述次级代谢产物或其衍生物的方法
<130> TU110WO
<150> EP14160821.6
<151> 2014-03-20
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 9378
<212> DNA
<213> 尖镰孢
<400> 1
atgtcaaaca tggcaccact ccctacgatg ggcgttgagc agcaagccct atcactttca 60
tgccccttac tccctcatga cgatgagaaa cactcagaca acctttacga gcaagcaact 120
cggcacttcg gcttgagccg agacaagatc gaaaatgtct taccatgtac ttcctttcaa 180
tgtgatgtca tagattgcgc cgtcgacgat cggcggcatg ctatcggtca cgtcgtctat 240
gatatcccca atacagtgga catccagcgt ttagccgcag cctggaaaga ggttgtgcgg 300
cagacaccaa tcttgaggac cggcatcttt acatcagaaa ccggcgactc ttttcagatc 360
gtcttgaaag aaggctgcct accgtggatg tacgcgacat gtctcggcat gaagggggca 420
gtgatacaag atgaagcagt cgccgctatg actggaccgc gttgcaatcg atatgtcgtc 480
ctggaggacc cgagtacgaa gcaaaggctg ctcatctgga cattcagcca tgctttagtg 540
gattatacag tccaggaacg catccttcag cgggttctca cagtatacga cggccgggac 600
gtcgagtgcc ctcgcatcaa ggatacagaa catgtctctc ggttttggca acaacacttt 660
gaaggcttag atgcctccgt atttcccctt ctaccatctc acctaactgt gtgcaatccc 720
aatgcgcgcg cagaacatca tatctcatac acgggaccag tccagaggaa gtggtcccat 780
acaagtatct gtcgggctgc actcgcagtt cttctatctc gctttacaca ctcttcggag 840
gccctcttcg gtgttgtgac agaacaatct cacaactccg aggaccaaag acggtcaatt 900
gatggccccg caaggacagt agtgcctatc cgcgtccttt gtgccccaga tcaatatgtg 960
tcggatgtca ttggggcaat caccgcacac gaacacgcca tgcgcgggtt tgagcacgct 1020
ggacttcgca atatccgccg taccggagac gacgggtctg ctgcttgtgg attccagacc 1080
gtgctactgg tgactgacgg tgatgctccc aagacccctg ggagtgtact tcatcgaagt 1140
gtagaagaat cggatagatt catgccctgc gctaatcgtg cccttctgct cgactgccag 1200
atggctggca actcggcatc cctagtcgca cgatatgatc ataatgtgat cgacccacgc 1260
cagatgtctc gcttcctgcg acagctagga tacctgatcc aacaatttca tcatcacgtc 1320
gatctgcctc tggtcaaaga actggacgtc gtgacggcgg aggattgtgc ggaaatcgag 1380
aaatggaatt cagaacgcct aacaatgcaa gacgccttaa tccacgacac catatccaag 1440
tgggctgctg gcgatcccaa caaagctgca gttttcgctt gggatgggga atggacatac 1500
gccgagctag acaacatatc ctcccgtctc gccgtgtata tccaatccct ggacttgaga 1560
ccaggacaag caatactccc actctgcttc gagaagtcaa aatgggtcgt cgccacaatt 1620
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aggatggccc aggtctgtca gcagacctcc gccacagtcg ctctcacctc caaactccac 1740
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<212> DNA
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aacggcatcg atgcaataag cccgtctgct ctcggcaagg actttacagg gtggacgtcc 6180
atgtacgatg gaagtgaaat cgacaagtcg gagatgcagg agtggctcga cgatacgata 6240
catactctac gcgacggtca tgtaccgggg catgtcctgg agattggaac cggtacaggt 6300
atgatcttgt ttaacctcgg ctctgttgag agctacgtag gtctggaacc caccaagtcc 6360
gcggtcgagt ttgtcaacaa ggccatcaag accctgccaa atctcgcagg aagggccgag 6420
gttcacactg gcaccgccac agatatcgac cagctgagcg gactgcggcc agaccttgtt 6480
atactaaact ctgtggttca gtactttccc acagtagaat atctgacacg ggttgtggac 6540
gctctggtcc ggatacgcgg cgtcaaacgt ctcttctttg gtgatgtgcg atcacaggcg 6600
ctacacagac agtttcttgc tgcctgtgcg atgcacgcac taggcaagac ggcgaccagg 6660
gacgacgtgc ggagatacat ggcagagcgg gaggagcggg aggaggagct gctcgtcgag 6720
ccagcctttt tcacagcact catgaaccgg catcccaatc tgatccagca cgtcgagatt 6780
ctgcccaaga atataagggc cacaaatgag ctgagcgcat accgttatgc agccgtcgtc 6840
catctacgtg atccggagtc tgcggcgcgg ccggtgtatc cgattgcggc agacgactgg 6900
gtcgactttc aggcctccca gatgcgcagc gacgtccttc gagaatacct gcgtctctcg 6960
gccggtgccg ataccgtggc tgtctgcaat attccgtacg aaaagaccat ctttgagaga 7020
ctgattgtcg agtcacttga tgacaacacc ggcagtgacg cgccacagag taggctgcat 7080
ggcaggtcac tagatggcgc gccctggata tccgccgtcc gctccgacgc cgagagccgg 7140
gcatccctct ccgtgccgga ccttgtgcag ctagccgccg agtctggctt ccaggtacag 7200
gtgagtgccg cacgacagtg gtcgcagagc ggcgcgctgg acgccgtctt ccaccgccgc 7260
cacgcgtcgt cctctcagcc gactatgcgc acactcttcc aattccccga cgacaatgca 7320
ctgcgagctt cggctaccct gacgaaccgg ccgctgcagc ggctgcagag acgtcgcgtc 7380
gcggcgcaga ttcgcgaacg gctgcagacg ctggtgccgt cgtacatgat tcctgccaag 7440
attgtggtgc tggaccagat gcctctcaac gccaatggca aggtcgaccg gaaggagctg 7500
gctcgtagag cccggacgac gacgatgacg aagaaaaaga agccgcagcg attggcgtcg 7560
gagccagctt gtccaatcag cgacattgag gttgcactgt gcgaggaggc cacggcaacg 7620
tttggaatgc aagtcggcat cagcgatcac tttttcaaac tcggcggtca ttctctgctt 7680
gctacaaaac tcatatcccg cgtcggcgac agactgaaag cgcgcctgac ggtcaaggat 7740
gtctttgatc acccaatctt ttccgagctt gcgattgtca tacgcgaggg gctgcaaaac 7800
gtcgtgcccg tggctttgaa tggtggtgga caagcgaagc aagggtcggc gggagtagta 7860
gcgccgcgca atgaaatgga aacgatgctg tgtgaggagt ttgccaatgt ccttggcatg 7920
gatgtcggag tcacggacaa cttttttgac ctcggtgggc attcgctcat ggcgacaaag 7980
ctggcagcgc ggattgggcg tcgattgaat actacgatat cagtgaagga ggtctttgaa 8040
cacccgattg tgtttcagct cgccaattcc ctagagctgg gtcagttgga gagcgacaga 8100
gtaaagcaca caatgttggc cgattacact gcgtttcaac tcttgtctgt tgaagatttg 8160
caaggctttc ttcaaaacga gataagccct caacttgaat gtgcacatgg cggtattcaa 8220
gatgtatatc cagccacgca tatgcaaaag gcgtttttat gcgacgcgtc aaccggacat 8280
cccaagcctc ttgtgccgtt ctacattgac tttccccccg actcagactg ttctactctg 8340
gtcgaggcgt gctcatctct ggtgaagcgt ttcgacatgt tcaggacagt ggtcgtggaa 8400
gctgcaggcg aactgtatca agtcgtttta gagcactttg atctacagat tgatgtcgtc 8460
gagacggagg aaaacgtcca cgcggcgacg aacgatttcg tggacagaat cttggaggtg 8520
cccgtccatc tcgggcaacc actgatacaa ttcaccattc tcaagcaggc gtcttcagta 8580
cgagtcttgc tttgtctttc tcacgccctc tatgatggct tgagtttgga gcacgtcgtg 8640
cgcgatctgc acatgcttta caaaggccgg tccctgctgc cagcgaatca gttctcacgg 8700
tacatgcaat acatggacca cacgcgcaaa gccggctgtg acttttggcg cgatgtcata 8760
caagatacgc caatcactgt cctcggccat gtcgatgctg gtggccgtga gctagaagtg 8820
gaagcagcgc ggacattgca cgcgacaaag attattagca ttcctctgca ggctgtccgc 8880
agcagcatca ttacgcaggc gacagtcttc aacgctgcct gtgctctcgt gctgtctcga 8940
gaaaccggcg ccaaggacgt cgtgtttggc cggatcgtgt cggggcggca aggcctgccg 9000
gtgagctggc aaaacattgt cgggccgtgc accaatgccg taccggtgcg cgcccggatc 9060
atcgacgacg acgacgacaa ccaccggcag atgctccgcg acatgcaaga ccagtacctc 9120
ctgagcctgc cgtttgagac gctcgatttt gacgaggtcc gacgcagctg cacaaactgg 9180
ccggcgacgg ccaacaacta cgcgtgctgc gtgacgtacc acgacttttc ataccaccca 9240
gagagcgaga tggagcagca gcgggtcgag atgggcgtgc tggccagaaa ggatgcgctg 9300
ctcaaggagg agcccgtgta cgacctgggc atcgcaggag aggttgagcc ggatggcgtg 9360
cacttgcaag ttaccgtggt cgcaaagacg aggctgttta gtgaagagag ggccgcatac 9420
ctgatggaag aggtgtgtag actgtttgag agtctaaact cggctttgtg a 9471
Claims (21)
1.用于获得至少一种微生物次级代谢产物或其衍生物、或者同位素标记的微生物次级代谢产物或其衍生物的方法，该方法包括在至少一种丝状真菌中异源表达所述次级代谢产物的至少一种合成酶的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该丝状真菌选自以下项的组：曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属以及根霉属。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于该合成酶选自以下项的组：非核糖体肽合成酶(NRPS)、聚酮化合物合成酶(PKS)、核糖体合成的肽和翻译后修饰的肽(RiPP)、萜烯环化酶或其杂合体。
4.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于该合成酶是环缩酚酸肽合成酶，特别是迭代型的环缩酚酸肽合成酶。
5.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于该合成酶是选自下组的环缩酚酸肽合成酶，该组含有恩镰孢菌素合成酶、PF1022合成酶、白僵菌素合成酶以及类白僵菌素合成酶。
6.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于该合成酶包括至少两种不同环缩酚酸肽合成酶的模块和/或结构域。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于该合成酶包括一种环缩酚酸肽合成酶的模块1以及另一种环缩酚酸肽合成酶的模块2或和PCP/C-结构域。
8.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于使用整合到该至少一种丝状真菌的染色体中的诱导型表达系统来异源表达该至少一种合成酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于该表达系统包括至少一种由至少三个模块组成的表达盒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于该表达盒包括用于组成型表达四环素依赖性反式激活因子rtTA2的第一模块、具有用于诱导型表达该至少一种次级代谢产物合成酶的rtTA2依赖性启动子的第二模块以及用于使用适当的选择标记物通过同源或异源重组将该盒整合到该真菌基因组中的第三模块。
11.根据权利要求9或10之一所述的方法，其特征在于该表达盒包括编码代谢前体或代谢中间体的生物合成酶特别是脱氢酶的另外的基因。
12.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于用于异源表达该合成酶的培养基包括滑石、四价钛、二氧化硅或氧化铝颗粒。
13.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于用于异源表达该合成酶的培养基包括5-20mM、优选5-15mM、最优选10mM的至少一种羟基羧酸或其衍生物以及10-30mM、优选15-25mM、最优选20mM的至少一种氨基酸或其衍生物。
14.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于用于异源表达该合成酶的培养基包括具有通式R1-CHOH-CO2H的至少一种D-或L-羟基羧酸，其中R1可以选自下组，该组包括
-取代的和未取代的C1-C50-烷基、取代的和未取代的C2-C50-烯基、取代的和未取代的C2-C50-炔基、取代的和未取代的C3-C10-环烷基、取代的和未取代的C5-C7-环烯基，在每种情况下所述基团可以被一个或多个氧原子、硫原子、取代的或单取代的氮原子、双键打断和/或被类型-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-和/或-OC(O)O-中的一个或多个基团打断
-芳基、杂芳基、-CH2-芳基或-CH2-杂芳基，其中芳基和杂芳基是取代的或未取代的。
15.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于用于异源表达该合成酶的培养基包括具有通式R2-CHNH2-CO2H的至少一种D-或L-氨基酸，其中R2可以选自下组，该组包括
-取代的和未取代的C1-C50-烷基、取代的和未取代的C2-C50-烯基、取代的和未取代的C2-C50-炔基、取代的和未取代的C3-C10-环烷基、取代的和未取代的C5-C7-环烯基，在每种情况下所述基团可以被一个或多个氧原子、硫原子、取代的或单取代的氮原子、双键打断和/或被类型-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-和/或-OC(O)O-中的一个或多个基团打断。
16.根据权利要求9至11之一所述的表达盒。
17.包含根据权利要求16所述的至少一种表达盒的质粒载体。
18.可通过根据所述权利要求之一所述的方法获得的环缩酚酸肽或其衍生物，包括以下通式(III)
其中R1和R2具有以上含义，R3是C1-C3烷基部分特别是-CH3部分，并且m＝3或4。
19.处于丝状真菌形式的表达宿主，包含根据权利要求9至11和16之一所述的至少一种表达盒。
20.嵌合环缩酚酸肽合成酶，其中该合成酶由至少两种不同环缩酚酸肽合成酶的模块/结构域构成。
21.根据权利要求20所述的嵌合环缩酚酸肽合成酶，其特征在于至少一个模块和/或结构域选自第一环缩酚酸肽合成酶并且至少第二模块选自另一种环缩酚酸肽合成酶。
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