JP6516956B2

JP6516956B2 - ステロイドホルモン膜受容体の精製方法

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Publication number: JP6516956B2
Application number: JP2013136980A
Authority: JP
Inventors: 俊伸徳元; 卓之大島
Original assignee: Shizuoka University NUC
Current assignee: Shizuoka University NUC
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2019-05-22
Anticipated expiration: 2033-06-28
Also published as: JP2015010064A

Description

本発明は、ステロイドホルモン膜受容体の精製方法、特に遺伝子組み換え細胞において発現されたステロイドホルモン膜受容体の精製方法に関する。

ステロイドホルモンの一種である１７α，２０β−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｒｏｇｎｅｎ−３−ｏｎｅ（１７，２０β−ＤＨＰ）は、魚類の卵成熟誘起ホルモンとして知られている。膜受容体を介した魚類の卵成熟誘導機構に関する研究において、ステロイド膜受容体の候補であるプロゲスチン膜受容体（ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｇｅｓｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｍＰＲ）が発見され、脳や腎臓等様々な組織で発現していることが明らかになった（非特許文献１及び２）。

ｍＰＲは、７回膜貫通型受容体であり、脊髄動物細胞に保存されている、ＡｄｉｐｏＱ受容体と相同性を示す１１遺伝子からなる新規Ｇタンパク質共役受容体ファミリーを形成し、ｐｒｏｇｅｓｔｉｎａｎｄａｄｉｐｏＱｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＰＡＱＲ）ファミリーと命名されている。ｍＰＲ分子はα、β、γ、δ、及びεの５種類を有し、それぞれＰＡＱＲ７、８、５、６及び９に対応する（非特許文献３及び４）。

化学物質とステロイド膜受容体との相互作用の検討は、創薬研究において重要なアプローチとなっている。現状このような創薬研究は、膜受容体遺伝子を導入した培養細胞又はその細胞膜画分を用いた技術によって評価されている。ステロイド膜受容体に作用する薬物候補のスクリーニングは、生細胞を用いるためホルモン刺激による生体反応を検定できるとのメリットがある。同時に、培養細胞におけるステロイド膜受容体の発現量が低いことや、ラジオアイソトープの使用、細胞膜画分の都度調製の必要があることなどのデメリットがある。また、細胞培養のコストが高いため、多検体をスクリーニングするための実用化は困難と考えられる。

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 2231‐2236 (2003) Gen. Comp. Endo., 145, 101‐108 (2006) Steroids.73, 1160-1173（2008） Endocrinology,154, 283-295 (2013)

本発明は、ステロイド膜受容体を標的とする物質のスクリーニングのための、より簡便な手法を提供すること、より具体的には、ステロイドホルモン結合活性を有するステロイド膜受容体を精製する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、意外にもステロイド膜受容体を強制発現する細胞の膜画分から、ステロイドホルモン結合活性を有するステロイド膜受容体を精製できることを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明は、ステロイド膜受容体を発現できるように、ステロイド膜受容体をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を得る工程と、遺伝子組換え細胞を培養し、ステロイド膜受容体を発現させる工程と、ステロイド膜受容体を含む膜画分を回収し、ステロイド膜受容体を精製する工程とを含む、ステロイド膜受容体の精製方法を提供する。

一実施形態では、ステロイド膜受容体がプロゲスチン受容体（ｍＰＲ）であり得る。また、他の実施形態では、ステロイド膜受容体が、プロゲスチン受容体（ｍＰＲ）α、β、γ、δ、又はεであり得る。

別の実施形態では、宿主細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）であり得る。

さらなる実施形態では、精製工程は、アフィニティークロマトグラフィーによって行われ得る。該アフィニティークロマトグラフィーが、Ｈｉｓタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ及びＶ５タグから選択されるタグを利用したものであり得る。

さらに、精製工程が、アミノ基が付加されたセルロースゲルによって行われ得る。該アミノ基が付加されたセルロースゲルが、セルファイン（登録商標）アミノであり得る。また、該セルファイン（登録商標）アミノが、リガンドが固定されることなく精製に使用され得る。

本発明は、また上記の精製方法によって精製されたステロイド膜受容体を提供する。本発明はさらに、ステロイド膜受容体を標的とする物質のスクリーニングにおける、上記ステロイド膜受容体を使用する方法を提供する。

本発明の精製方法によれば、簡便かつ大量にステロイド結合活性を有するステロイド膜受容体、特にｍＰＲを得ることができる。このステロイド膜受容体を用いれば、ステロイド膜受容体を標的とする物質、特に候補薬物のスクリーニングに利用することができる。

実施例１において構築したｍＰＲαタンパク質発現用プラスミドｍＰＲα−ｐＰＩＣＺαＣにおけるｍＰＲα遺伝子が導入された部分の設計を示す図である。実施例１において作製したｍＰＲα遺伝子が導入されたＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ−３３のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。実施例３において行われたステロイドへの特異的結合活性の測定結果を示す図である。（Ａ）はウェスタンブロットによるｍＰＲαタンパク質の発現の確認結果を示し、（Ｂ）は異なる濃度のジギトニン又はコール酸塩の存在下における膜画分の放射性リガンドへの特異的結合の測定結果を示し、（Ｃ）はジギトニン存在下におけるＴｒ−Ｘ−３３の膜画分及びＸ−３３の膜画分による放射性リガンドへの特異的結合の測定結果を示し、（Ｄ）はＴｒ−Ｘ−３３の膜画分による放射性リガンドへの特異的結合のスカッチャードプロット解析の結果を示す。実施例４におけるｍＰＲα発現細胞膜画分の可溶化条件の検討結果のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。実施例６におけるセルファイン（登録商標）アミノ精製後の結果を示す図である。（Ａ）は吸光度、（Ｂ）はｃ−Ｍｙｃタグ精製後のサンプルのウェスタンブロットの結果をそれぞれ示す。実施例６におけるｃ−Ｍｙｃタグ精製後の結果を示す図である。（Ａ）は各精製段階の銀染色、（Ｂ）はｃ−Ｍｙｃタグ精製後のサンプルのウェスタンブロットの結果をそれぞれ示す。実施例７における精製されたｍＰＲαタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を示す図である。実施例８における精製したｍＰＲαタンパク質による１７，２０β−ＤＨＰへの特異的結合の結果を示す図である。

本発明のステロイド膜受容体の精製方法は、ステロイド膜受容体を発現できるように、ステロイド膜受容体をコードする遺伝子を細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を得る工程と、遺伝子組換え細胞を培養し、ステロイド膜受容体を発現させる工程と、ステロイド膜受容体を含む膜画分を回収し、ステロイド膜受容体を精製する工程とを含む。

ステロイド膜受容体を発現できるように、ステロイド膜受容体をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を得る工程に関し、従来知られている遺伝子組換え法によって行うことができる。

ステロイド膜受容体としては、プロゲスチン受容体（ｍＰＲ）を挙げられるが、例えば、プロゲスチン受容体（ｍＰＲ）α、β、γ（γ−１及びγ−２を含む）、δ、又はεが好適に用いることができる。ステロイド膜受容体は脊髄動物細胞に保存されるものであり、ステロイド膜受容体の遺伝子として、例えばキンギョ、ゼブラフィッシュ、メダカ、アフリカツメガエル、ニワトリ、マウス、ラットウサギ、モルモット、ブタ、ウシ、サル、又はヒト由来のものが好適に用いることができ、これらの遺伝子のいくつかの配列は、特定されている。そのうち、キンギョ由来のｍＰＲα遺伝子はアクセスＮｏ．ＡＢ１２２０８７として知られている。ステロイド膜受容体は、１７，２０β−ＤＨＰ、１７−ヒドロキシプロゲステロン、プロゲステロン、テストステロン、又は１７，２０β，２１−トリヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン(２０β−Ｓ)等ステロイドホルモン等のリガンドと特異的に結合する。

宿主細胞としては、細胞膜においてステロイド膜受容体を発現できるものであればよく特に限定されない。ステロイド膜受容体の発現量の観点から、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓｆ９昆虫細胞等が挙げられ、そのうち、ピキア・パストリスが特に好適に用いられる。

ベクターとしては、プロモータと宿主細胞との相性を考慮し、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の場合はｐＰＩＣＺα、ｐＰＩＣＺ、又はｐＰＩＣ３．５等を使用することができる。また、組換え細胞を容易に選択できるように、例えばゼオシン等の抗生物質耐性遺伝子が組み込まれることが好ましい。ステロイド膜受容体遺伝子は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製しやすくするために、その上流又は下流に位置する、Ｈｉｓタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等との融合タンパク質が産生するように挿入されるのが好ましい。

遺伝子導入方法としては、特に限定されないが、宿主細胞及びベクターによって当業者が適宜に選択し得る。例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、又はリン酸カルシウム法等の方法を用いることができる。

遺伝子組換え細胞を培養し、ステロイド膜受容体を発現させる工程に関し、従来知られている細胞の培養法によって行うことができる。

細胞の培養培地は宿主細胞によって当業者が適宜に選択することができ、ピキア・パストリスの場合は、ＢＭＧＹ培地、又はＢＭＭＹ培地が好適に使用される。また、遺伝子組換え細胞が抗生物質耐性を有する場合、適切な濃度の抗生物質を添加することが好ましい。遺伝子組換え細胞において、プロモータ、ステロイド膜受容体遺伝子及びタグ遺伝子が細胞のゲノム遺伝子に組み込まれることが好ましい。

遺伝子組換え細胞の膜におけるステロイド膜受容体の発現は、１７，２０β−ＤＨＰとの特異的な結合活性によって確認することができる。このような手法として、例えばステロイド膜受容体遺伝子導入細胞の膜画分を用いたステロイド結合実験が挙げられる。このような実験では、例えば放射標識した１７，２０β−ＤＨＰと非標識の１７，２０β−ＤＨＰとの競合阻害実験により１７，２０β−ＤＨＰの特異的な結合量を測定することができる。

ステロイド膜受容体を含む膜画分を回収し、ステロイド膜受容体を精製する工程において、膜画分の回収方法としては、当膜画分の回収は従来知られている方法によって行われればよく、例えば遺伝子組換え細胞を細胞破砕機によって破砕して、１０００×ｇ、７分、４℃で遠心して得た上清を２００００×ｇ、２０分、４℃で遠心して沈殿として回収することが挙げられる。得られた膜画分は０．１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳＦを含むＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール）等のバッファーに膜画分を可溶化することが挙げられる。

ステロイド膜受容体タンパク質の精製は、アフィニティークロマトグラフィーによって行われることが好ましく、特にＨｉｓタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ、及びＶ５タグ等から選択されるタグを利用したものが好ましい。

精製工程において、特にアミノ基が付加されたセルロースゲルを用いて精製することが好ましい。該アミノ基が付加されたセルロースゲルが、セルファイン（登録商標）アミノであることが好ましく、また、該セルファイン（登録商標）アミノにリガンドが固定されることなくそのまま精製に使用されることが好ましい。

本発明のステロイド膜受容体は、上記の精製方法によって精製されたものである。本発明の精製方法によって得られたステロイド膜受容体は、ワイルドタイプのステロイド膜受容体と同様に１７，２０β−ＤＨＰ、１７−ヒドロキシプロゲステロン、プロゲステロン、テストステロン、又は１７，２０β，２１−トリヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン(２０β−Ｓ)等ステロイドホルモン等のリガンドと特異的に結合する活性を有する。したがって、該ステロイド膜受容体は、ステロイド膜受容体を標的とする物質、特に医薬品の候補物質のスクリーニングにおいて使用することができる。

上記スクリーニングにおける精製されたステロイド膜受容体の使用は、例えば、医薬品、健康補助食品のスクリーニング、化学薬品の安全性評価、及びモノクローナル抗体の作製等が挙げられる。

以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

（試薬）
１７，２０β−ＤＨＰはＳｉｇｍａより入手し、３α，２０β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ）を用いた酵素的変換によって放射性標識し、^３Ｈ−１７，２０β−ＤＨＰを得た。トリプシン、修飾化（シークエンスグレード）はＰｒｏｍｅｇａ社より、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及びペプチドキャリブレーションスタンダードはＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ社より、ジギトニンはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ社より、ＤＮＡポリメラーゼ及びライゲーションキットはタカラバイオ社より、制限酵素は和光純薬工業社、タカラバイオ社又はニュー・イングランド・バイオラボ社より、アガロースゲルからＤＮＡ断片を抽出するＤＮＡ抽出キットはＱＩＡＧＥＮ社より、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用の分子量マーカーはＢｉｏ−Ｒａｄ社より、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ抗体、及びアミノ酸を含有しないＹＮＢ酵母培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より、ＢＳＡはＳｉｇｍａＣｅｍｉｃａｌ社より、抗Ｈｉｓタグ抗体、及び抗ｃ−Ｍｙｃタグ抗体はＭｅｄｉｃａｌ＆ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より入手した。その他の試薬は、特に明記しない限り和光純薬工業社より入手した。なお、特に明記しない限り、使用する試薬等は、取扱説明書に記載の使用方法に準じて使用した。

（実施例１ｍＰＲαタンパク質発現用Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞の作製）
発明者らは、以前キンギョｍＰＲαのｃＤＮＡ（アクセスＮｏ．ＡＢ１２２０８７）をｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に組み込んだ。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、１．２％アガロースゲルで電気泳動し、約１１００ｂｐのｍＰＲαのＤＮＡ断片を回収し、常法によって精製した。

精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで処理した後、同じ制限酵素で切断した発現用ベクターｐＰＩＣＺαＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１のＡ液、Ｂ液と混合して１６℃で１６時間インキュベートすることによってライゲーションした。

ライゲーション産物をＣａＣｌ_２溶液（６０ｍＭ塩化カルシウム、１５％グリセロール、１０ｍＭＰＩＰＥＳ、ｐＨ７．０）に懸濁した大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’と混合して氷上静置２０分、４２℃、３０秒、氷上静置２分によって大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’に形質転換し、２５μｇ／ｍｌゼオシンを含むＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩静置した。得られたコロニーを２５μｇ／ｍｌゼオシンを含む４００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養し、アルカリ溶解法でプラスミドＤＮＡを抽出した。

得られたコロニーをテンプレートとし、５’−ＡＯＸ１プライマー（５’−ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ−３’；配列番号１）及び３’−ＡＯＸ１プライマー（５’−ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ−３’；配列番号２）を用い、Ｅｘ．Ｔａｑポリメラーゼを用いて９４℃５分間の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間を３０サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物のサイズ（約１６５０ｂｐ）によってｍＰＲα遺伝子発現用プラスミドが導入されたコロニーを選別し、２５μｇ／ｍＬゼオシンを含むＬＢ培地で培養した。

得られた細胞からアルカリ溶解法でプラスミドＤＮＡを抽出し、ＲＮａｓｅ処理によってＲＮＡを分解した後、ＤＮＡシークエンスでプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ内のｍＰＲα遺伝子配列を、キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ（ベックマン・コールター社）、プライマーとして５’−及び３’−ＡＯＸ１プライマーを用いて確認した。

構築したｍＰＲαタンパク質発現用プラスミドをｍＰＲα−ｐＰＩＣＺαＣと命名した。ｍＰＲα−ｐＰＩＣＺαＣは、図１に示すように、プロモータｐＡＯＸ１の下流に発現可能なように順にα因子、ｍＰＲα、ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ及びＡＯＸ１ＴＴ遺伝子を有する。

Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株Ｘ−３３を、ＯＤ_６００＝１．０〜２．０となるまで、４００ｍＬのＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％、寒天２％）を用い３７℃で一晩培養した。１５００×ｇ、５分、４℃で遠心して細胞を回収し、氷冷した再蒸留水で再懸濁し、この操作を２〜３回繰り返し、最終的に氷冷した１Ｍソルビトールで再懸濁し液量４ｍＬとし、遺伝子組換えに用いた。

一方、上記得られた発現用プラスミドｍＰＲα−ｐＰＩＣＺαＣを制限酵素ＰｍｅＩで処理し、１箇所切断し、直鎖化した。直鎖化したプラスミド（約９μｇ）を上記得られた遺伝子組換え用のＸ−３３細胞懸濁液に混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で１５００Ｖ、２５μＦ及び２００Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の細胞を、１００μｇ／ｍＬゼオシンを含むＹＰＤＳ（１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ）プレートに蒔き、２日間３０℃に静置した。得られたコロニーをＭＤプレートに植え換え、一晩３０℃に静置した後４℃に保存した。

各コロニーを１．６ｍＬＭＧＹ培地（ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ１．３４％、グリセロール１％、ビオチン４×１０^−５％が入った試験管に植菌し、インキュベータで３０℃、１７５ｒｐｍで一晩振とう培養した。細胞を回収し、滅菌超純水で２回洗浄。Ｂｒｅａｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール）に再懸濁し、等量のフェノール／クロロホルム及びグラスビーズを加えてボルテックスで破砕した。数秒の遠心でスピンダウンし、水層を新しいチューブに移した。ＤＮＡをエタノール沈殿し、ＴＥ、ｐＨ７．４で溶解し、ＴｏｔａｌＤＮＡを抽出した。抽出したＴｏｔａｌＤＮＡをテンプレートとし、５’−ＡＯＸ１プライマー及び３’−ＡＯＸ１プライマーを用いて上記と同様にＰＣＲによって増幅した。対照として、ワイルドタイプ細胞のＰＣＲ産物、ｍＰＲα−ｐＰＩＣＺαＣプラスミド及びｐＰＩＣＺαＣプラスミドをテンプレートとするＰＣＲ産物を用いた。

ＰＣＲ産物をアガロースゲルの電気泳動によって確認した（図２）。左から高分子量マーカー（Ｍ）、ワイルドタイプのＰＣＲ産物（Ｘ−３３）、組換え細胞のＰＣＲ産物（Ｔｒ−Ｘ−３３）、ｍＰＲα−ｐＰＩＣＺαＣ、ｐＰＩＣＺαＣ、及び低分子量マーカー（Ｍ）のラインであり、ＰＣＲ増幅産物のサイズから遺伝子導入が成功したことが確認された。このコロニーの細胞をｍＰＲαＸ３３と命名した。

ｍＰＲαＸ３３のシングルコロニーを３０ｍＬのＢＭＧＹ培地（酵母エキス１％、Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ２％、リン酸カリウム１００ｍＭ、ｐＨ６．０、アミノ酸不含有の酵母窒素塩基１．３４％、ビオチン４×１０^−５％、グリセロール１％）が入った２００ｍＬフラスコに植菌し、インキュベータで３０℃、２５０ｒｐｍで一晩振とう培養した。培養液５ｍＬを１００ｍＬのＢＭＧＹ培地が入った５００ｍＬフラスコに植菌し、さらにインキュベータで３０℃、２５０ｒｐｍで一晩振とう培養した。３０００×ｇ、５分、室温で遠心し、沈殿を２ＬのＢＭＭＹ培地（酵母エキス１％、Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ２％、リン酸カリウム１００ｍＭ、ｐＨ６．０、アミノ酸不含有の酵母窒素塩基１．３４％、ビオチン４×１０^−５％、メタノール０．５％）に懸濁し、ＯＤ_６００＝１．０〜５．０の範囲にあることを確認した。インキュベータで２０℃、１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。４０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心し、細胞を沈殿として回収し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存し、実施例２のタンパク質の発現に用いた。

（実施例２ｍＰＲαタンパク質発現細胞の破砕及び可溶化）
実施例１で得られたｍＰＲαＸ３３細胞を２０ｍＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（０．１％ジギトニン、１ｍＭＰＭＳＦ）を加えた。破砕用チューブ５本に５ｍＬ懸濁液及び１．５ｍＬジルコニアビーズを入れた。細胞破砕機ＭＳ−１００Ｒで４０００ｒｐｍ、３００秒で破砕した後、氷上５分間放置する操作を６回繰り返した。１０００×ｇ、７分、４℃で遠心した。上清を遠心チューブに回収した（Ｓｕｐ１）。

次に、沈殿の入った破砕用チューブ１本につき４ｍＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加え、同様に細胞破砕機ＭＳ−１００Ｒで４０００ｒｐｍ、３００秒で破砕した後、氷上５分間放置する操作を６回繰り返した。１０００×ｇ、７分、４℃で遠心し、上清を遠心チューブに回収した（Ｓｕｐ２）。

続いて、沈殿の入った破砕用チューブ１本につき４ｍＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加え、同様に細胞破砕機ＭＳ−１００Ｒで４０００ｒｐｍ、３００秒で破砕した後、氷上５分間放置する操作を６回繰り返した。１０００×ｇ、７分、４℃で遠心し、上清を遠心チューブに回収した（Ｓｕｐ３）。

最後に、沈殿の入った破砕用チューブ１本につき４ｍＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加え、同様に細胞破砕機ＭＳ−１００Ｒで４０００ｒｐｍ、３００秒で破砕し、得られた懸濁液を泳動用サンプルとして回収した（ｄｅｂｒｉｓ）。

回収した上清（Ｓｕｐ１〜３）を２００００×ｇ、２０分、４℃で遠心し、沈殿をＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒで懸濁して２００ｍＬ懸濁液（細胞膜画分）とした。プロテインアッセイ染色液（バイオラッド社）によってタンパク質濃度を測定した。

（実施例３ｍＰＲαタンパク質の発現と１７，２０β−ＤＨＰへの特異的結合活性の検証）
実施例２で得られたＸ３３細胞とｍＰＲαＸ３３細胞から調製された細胞膜画分（２００００×ｇ、２０分、４℃で遠心の沈殿画分）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロットによりｍＰＲαタンパク質の発現を確認した（図３のＡ）。抗−Ｈｉｓタグ抗体によるウェスタンブロットではもともとのＸ３３細胞画分に非特異的なタンパク質バンドが検出されたが、ｍＰＲαＸ３３細胞画分ではそれ以外の２本のタンパク質バンドが検出された。矢印で示されている二つのバンドはｍＰＲαであり、上のバンドはα因子シグナル配列が結合されたｍＰＲα、下のバンドはα因子シグナル配列が切断されたｍＰＲαであることが後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより確認された。

次に、ｍＰＲαタンパク質を発現した細胞の膜画分と放射性リガンドとの特異的結合を検出できる実験条件について検討した。ＨＥＡＤｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ、ＮａＣｌ１０ｍＭ、ジチオエリトリトール１ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ）に懸濁した膜画分サンプルについて、最終濃度０．００１％、０．０１％、０．１％のジギトニンまたはコール酸塩を加えた場合と何も加えない場合について、以下の操作を行った。２．５％ＴＷＥＥＮ８０を含むＨＥＡＷｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ、ＮａＣｌ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ７．４）にＧＦ／Ｂフィルターを３０分間浸した。試験管に１μＭＤＨＰまたはＥｔＯＨを４μＬずつ入れた。そこに４ｎＭの［^３Ｈ］−１７，２０β−ＤＨＰ（４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を２００μＬずつ入れ（１系列３本）、さらにタンパク質サンプルを２００μＬずつ入れ、軽く揺すって４℃で３０分間静置した。吸引装置にＧＦ／Ｂをセットし、ＧＦ／Ｂの中央にサンプル４００μＬを滴下した。ＨＥＡＷｂｕｆｆｅｒを用いて４℃で３回洗った。ＧＦ／Ｂをバイアルに取り出した。液体シンチレーションをバイアルに入れ、１５分間激しく振とうし、シンチレーションカウンタで測定した。測定した結果を図３のＢに示した。この結果、最終濃度０．１％ジギトニンを加えた場合に最も高い結合活性が検出されたのでこの条件により発現されたｍＰＲαタンパク質の１７，２０β−ＤＨＰへの特異的結合を測定した。その結果を図３のＣに示した。

次に、発現されたｍＰＲαタンパク質の１７，２０β−ＤＨＰへの特異的結合について２．５％ＴＷＥＥＮ８０を含むＨＥＡＷｂｕｆｆｅｒにＧＦ／Ｂフィルターを３０分間浸した。試験管に１００倍分子過剰量のＤＨＰ又はＥｔＯＨを４μＬずつ入れた。さらに、２．５〜１０ｎＭの［^３Ｈ］−１７，２０β−ＤＨＰ（４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を２００μＬずつ入れた（１系列３本）。０．２％ジギトニンを含む膜画分サンプルを２００μＬずつ入れ、軽く揺すって４℃で３０分間静置した。吸引装置にＧＦ／Ｂをセットし、ＧＦ／Ｂフィルターの中央にサンプル４００μＬ滴下した。ＨＥＡＷｂｕｆｆｅｒを用いて４℃で３回洗った。ＧＦ／Ｂフィルターをバイアルに取り出した。液体シンチレーションをバイアルに入れ、１５分間激しく振とうし、シンチレーションカウンタで測定した。測定した結果を図３のＤに示した。右上の挿入図は各放射性リガンド濃度における結合飽和量を示すデータであり、このデータをスキャッチャードプロットしたものを示した。この結果から１７，２０β−ＤＨＰの最大結合量は６７ｐｍｏｌ／ｇ、結合親和性は９．４ｎＭであると求められた。この結果は徳元ら（Endocrinology, 148, 3459-3467 (2007)）に報告されているキンギョ卵膜上の受容体、培養細胞に発現させたキンギョｍＰＲαタンパク質のデータとほぼ一致しており、正常な立体構造を持ったｍＰＲαタンパク質が発現できていることが確認された。

（実施例４ｍＰＲα発現細胞膜画分の可溶化条件の検討）
実施例２で得られたｍＰＲαＸ３３細胞から調製された細胞膜画分のタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下（通常０．８ｍｇ／ｍＬ）となるように希釈し、ｍＰＲαタンパク質の可溶化条件の検討を行った。細胞膜画分に対し各種界面活性剤（ＭＥＧＡ−１０、ＦＯＳ、ＯＴＧ、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＤＤＭ、ＤＤＡ又はＯＧ）を終濃度が０．１％あるいは０．０１％となるように加えた。４℃で３０分反応させた後、２００００×ｇ、２０分、４℃で遠心し、上清１２０μＬを別のチューブに移し、電気泳動用のサンプルとした。残りの沈殿に１２０μＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加えて、同様に電気泳動用のサンプルとした。これらの試料についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロットによりｍＰＲαタンパク質の可溶化状況を調べた（図４）。

（実施例５ｍＰＲαタンパク質の可溶化）
実施例２で得られたｍＰＲαＸ３３細胞から調製された２００ｍＬの細胞膜画分のタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下（通常０．８ｍｇ／ｍＬ）となるように希釈し、ＤＤＭ、ＰＭＳＦ及びグリセロールを終量が０．１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳＦ、１０％グリセロールとなるように加えた。ビーカーに移し、室温で２０分以上スターラーで攪拌した。２００００×ｇ、３０分、４℃で遠心し、上清を可溶化サンプルとして回収し、ｍＰＲαタンパク質の精製に用いた。

（実施例６ｍＰＲαタンパク質の精製）
＜Ｎｉ−ＮＴＡ精製＞
２５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂をＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳＦ）に置換し、カラムに充填した。吸光度が安定するまでペリスタポンプ（流速１ｍＬ／分以下）でＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒをカラムに流し、平衡化した。１０ｍＬのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳＦ）を流し、平衡後の吸光度を０とした。

実施例５で得られたｍＰＲαタンパク質の精製用の可溶化サンプルの全量を、０．５ｍＬ／分以下の流速でカラムにアプライし、スルーをビーカーに回収した。吸光度が安定するまでＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳＦ）をカラムに流し、スルーをビーカーに回収した。２５０ｍＬの１０〜２５０ｍＭイミダゾールを含むＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒと２５０ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳＦ、２５０ｍＭイミダゾール）で１ｍＬ／分の流速でグラジエント溶出を開始し、以後全ての溶出液はフラクションコレクターを用いて２０ｍＬずつ回収した。最後に６０ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒを流した。得られた各フラクションについて、ＢＩＯ−ＭＩＮＩＵＶＭＯＮＩＴＯＲＡＣ−５２００Ｌを用いて吸光度を測定した。

各フラクションについてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、ＣＢＢ染色及びウェスタンブロットで溶出パターンを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて変性条件にてＬａｅｍｍｌｉ法にしたがって行った。ＣＢＢ染色は、染色液（０．２５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含む５０％トリクロロ酢酸溶液）に３〜５分間浸し、約１０分間水洗した後、脱染色液（５％メタノール、７．５％酢酸溶液）による脱染色液を数回交換して一晩で行った。ウェスタンブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質パターンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写してから行った。５％スキムミルクを含む２０ｍＭＴｒｉｓバッファー、ｐＨ７．６、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳで、室温、１〜２時間で膜をブロックした。次に、ＴＢＳバッファーで５００倍希釈した一次抗体の抗−Ｈｉｓタグ抗体と反応させ、洗浄し、ＴＢＳバッファーで２０００倍希釈した二次抗体のＨＲＰ標識抗ウサギ抗体と反応させた。目的のｍＰＲαタンパク質の可視化は、エンハンスド化学発光（ＥＣＬ）検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた。シグナルは、ＣＣＤカメラシステム（ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＩｍａｇｅＡｎａｌｙｚｅｒＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ、富士フィルム社）を用いてデジタル化した。

濃縮及びバッファー交換
ｍＰＲαの溶出が確認できたフラクションをビーカーにまとめて混合した。限外濾過フィルターＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ３を用いて濾過し、２５００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心し、液量を１４ｍＬにし濃縮した。５０ｍＭＴｒｉｓを加えて、遠心・濃縮を３回繰り返し、ＮａＣｌ濃度が１ｍＭ以下になるように、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０に交換し、最終液量を４７．５ｍＬとした。

＜セルファイン（登録商標）アミノ精製＞
５ｍＬのセルファイン（登録商標）アミノ（ＣｅｌｌｆｉｎｅＡｍｉｎｏ）樹脂（ＪＮＣ社）をＳｔａｒｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳＦ）に置換し、カラムに充填した。吸光度が安定するまでペリスタポンプを用いて１ｍＬ／分以下の流速でＳｔａｒｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒをカラムに流し、平衡化した。１０ｍＬのＳｔａｒｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒを流し、平衡後の吸光度を０とした。

濃縮及びバッファー交換したフラクション混合物の全量を１ｍＬ／分以下の流速でセルファイン（登録商標）アミノカラムにアプライし、スルーをビーカーに回収した。吸光度が安定するまでＳｔａｒｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒをカラムに流し、スルーをビーカーに回収した。

５０ｍＬの０〜０．５ＭＮａＣｌを含むＳｔａｒｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒと５０ｍのＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ＤＤＭ、１ｍＭＰＭＳ、０．５ＭＮａＣｌ）で１ｍＬ／分の流速でグラジエント溶出を開始し、以後全ての溶出液はフラクションコレクターを用いて５ｍＬずつ回収した。最後に１５ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒを流した。

各フラクションについて、上記と同様に吸光度を測定した。その結果を図５の（Ａ）に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウェスタンブロットで溶出パターンを確認した。結果を図５の（Ｂ）に示した。矢印で示されている二つのバンドはｍＰＲαであり、上のバンドはα因子シグナル配列が結合されたｍＰＲα、下のバンドはα因子シグナル配列が切断されたｍＰＲαであることが後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより確認された。

濃縮及びバッファー交換
ｍＰＲαの溶出が確認できたフラクションをビーカーにまとめて混合した。限外濾過フィルターＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ３を用いて濾過し、２５００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心し、液量を３ｍＬとし濃縮した。ＰＢＳを加えて遠心・濃縮を３回繰り返し、ＰＢＳバッファーに交換し、最終液量を１．６ｍＬとした。液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。

＜ｃ−Ｍｙｃタグ精製＞
濃縮及びバッファー交換したサンプルを解凍し、２００００×ｇ、２０分、４℃で遠心し、上清を回収した。核酸用ミニカラムに１０μＬの抗ｃ−Ｍｙｃタグビーズ（ＰｒｏｔｅｉｎＭｉｌｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、ＭＢＬ社）を充填した。上記得られた上清を１００μＬカラムにアプライし、１０分静置後、フラッシュ遠心した。１００μＬのＰＢＳを１回流し、フラッシュ遠心した。１００μＬの１×Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒを２回流した。５０μＬのｃ−Ｍｙｃタグペプチド溶液を１回流し、溶出した。ｃ−Ｍｙｃタグ精製したタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ精製したタンパク質及びセルファイン（登録商標）アミノ精製したタンパク質と共に、上述したとおりＣＢＢ染色、又は２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩ「第一」（第一化学薬品株式会社）のマニュアルに従って銀染色を行い、さらに、上記と同様にｃ−Ｍｙｃタグ精製後のタンパク質についてウェスタンブロットにて確認した。Ｈｉｓタグについて、一次抗体としてウサギ抗Ｈｉｓタグ、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギ抗体を用い、ｃ−Ｍｙｃタグについて、一次抗体としてマウス抗ｃ−Ｍｙｃタグ、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウス抗体を用いた。

結果を図６に示す。（Ａ）から、Ｎｉ−ＮＴＡ精製、セルファイン（登録商標）アミノ精製、及びｃ−Ｍｙｃタグ精製を経たｍＰＲαタンパク質は、他のタンパク質に比べて特異的に精製・濃縮できたことが確認された。（Ｂ）における矢印で示されている二つのバンドはｍＰＲαであり、上のバンドはα因子シグナル配列が結合されたｍＰＲα、下のバンドはα因子シグナル配列が切断されたｍＰＲαであることが後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより確認された。

（実施例７精製されたｍＰＲαタンパク質のペプチドのマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）分析）
精製されたｍＰＲαタンパク質をトリプシンで処理し、ａｕｔｏｆｌｅｘ（ブルカーダルトニクス社）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＰＭＦ分析を行った。解析のためのデータベースは、Ｍａｓｃｏｔ（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ社）を用いた。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳでの検出ピークを図７に示した。ＰＭＦ分析の結果、Ｍａｓｃｏｔデータベースにおいてウェスタンブロットで検出された２本のタンパク質バンドがキンギョプロゲスチン膜受容体ａｌｐｈａ（アクセッション番号４０７１４５０７、理論的質量４１６４７、理論的等電点６．９５、マッチしたペプチド数６、配列カバー領域１８％）としてヒットし、精製されたタンパク質はｍＰＲαタンパク質であることが確認された。

（実施例８ｍＰＲαタンパク質発現細胞膜による１７，２０β−ＤＨＰへの特異的結合）
実施例１で得られたｍＰＲαＸ３３細胞を上記のように培養し、ｍＰＲαタンパク質を発現させた。対照として、ｍＰＲに形質転換されていないＸ３３細胞を使用した。発現後に回収した細胞培養液２００μＬを１．５ｍＬの０．１％ジギトニンが入ったＨＥＡＤｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ、ＮａＣｌ１０ｍＭ、ジチオエリトリトール１ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ）で懸濁した後、２ｍＬチューブに移し、２００μＬジルコニアビーズを加えた。細胞破砕機ＭＳ−１００Ｒで４０００ｒｐｍ、３００秒で破砕した後、氷上５分間放置する操作を６回繰り返した。１０００×ｇ、７分、４℃で遠心し、上清を１．５ｍＬチューブに移し、２００００×ｇ、２０分、４℃で遠心した。沈殿を１ｍＬのＨＥＡＤｂｕｆｆｅｒで再懸濁して液量４ｍＬにし、粒が見えなくなるまで懸濁する。上記と同じようにタンパク質定量し、０．２％ジギトニンが入ったＨＥＡＤｂｕｆｆｅｒで希釈して最終濃度を１ｍｇタンパク質／ｍＬとした。

実施例６と同じようにしてｍＰＲαタンパク質を精製し、精製後の濃縮サンプルをタンパク質定量した後、ＨＥＡＤｂｕｆｆｅｒに交換した。

ＨＥＡＷｂｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ、ＮａＣｌ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ７．４）にＧＦ／Ｂフィルターを３０分間浸した。試験管に１μＭＤＨＰ又はＥｔＯＨを４μＬずつ入れた。さらに、４ｎＭの^３Ｈ−１７，２０β−ＤＨＰ（４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を２００μＬずつ入れた（１系列３本）。２０ｍｇ／ｍＬＢＳＡを添加したタンパク質サンプルを２００μＬずつ入れ、軽く揺すって４℃で３０分間静置した。吸引装置にＧＦ／Ｂをセットし、ＧＦ／Ｂの中央にサンプル４００μＬ滴下した。ＨＥＡＷｂｕｆｆｅｒを用いて４℃で３回洗った。ＧＦ／Ｂをバイアルに取り出した。液体シンチレーションをバイアルに入れ、１５分間激しく振とうし、シンチレーションカウンタで測定した。ＥｔＯＨを加えたサンプルが非放射リガンド（１７，２０β−ＤＨＰ）非存在下での標準リガンド（［^３Ｈ］−１７，２０β−ＤＨＰ）の最大結合量に相当し、１μＭＤＨＰを加えたサンプルが１００倍分子過剰量の非放射リガンド存在下での標準リガンドの結合量に相当し、この２つの値の差が特異的結合量に相当する。

測定した結果を図８に示した。図８から、精製されたｍＰＲαタンパク質は、プロゲスチン受容体としてのリガンドへの結合活性を有していることが確認された。

Claims

ステロイド膜受容体を発現できるように、ステロイド膜受容体をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を得る工程と、
遺伝子組換え細胞を培養し、ステロイド膜受容体を発現させる工程と、
ステロイド膜受容体を含む膜画分を回収し、ステロイド膜受容体を精製する工程と
を含み、
前記ステロイド膜受容体が、プロゲスチン膜受容体（ｍＰＲ）であり、
前記精製工程が、タグを利用したアフィニティークロマトグラフィー、及びアミノ基が付加されたセルロースゲルによって行われ、前記アミノ基が付加されたセルロースゲルを用いる際、ｍＰＲを含むサンプルを前記アミノ基が付加されたセルロースゲルに吸着させた後に、溶出バッファーでｍＰＲを溶出し、回収することによって精製する、
ステロイド膜受容体の精製方法。
前記ステロイド膜受容体が、プロゲスチン膜受容体（ｍＰＲ）α、β、γ、δ、又はεである、請求項１に記載の精製方法。
前記宿主細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１又は２に記載の精製方法。
前記タグを利用したアフィニティークロマトグラフィーが、Ｈｉｓタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ及びＶ５タグから選択されるタグを利用したものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精製方法。
前記タグを利用したアフィニティークロマトグラフィーが、Ｈｉｓタグ及びｃ−Ｍｙｃタグを利用したものである、請求項４に記載の精製方法。
前記精製工程が、Ｈｉｓタグを利用したアフィニティークロマトグラフィー、アミノ基が付加されたセルロースゲルによる精製、及び、ｃ−Ｍｙｃタグを利用したアフィニティークロマトグラフィーの順に行われる、請求項５に記載の精製方法。
前記アミノ基が付加されたセルロースゲルが、セルファイン（登録商標）アミノである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精製方法。
前記セルファイン（登録商標）アミノが、リガンドが固定されることなく精製に使用される、請求項７に記載の精製方法。