JP6483336B2

JP6483336B2 - Ｈａｖ検出

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Publication number: JP6483336B2
Application number: JP2013254717A
Authority: JP
Inventors: ヘルマン・ライイング; ニング・ル; ニコラス・ニュートン; アンドレアス・ヴェルフェルシュナイダー; カレン・ヤング; ディルク・ツィンマーマン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2019-03-13
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: US10100374B2; CN103866045A; CN103866045B; EP2743355A1; US20190010562A1; US20140170638A1; US10865454B2; JP2014121320A; EP2743355B1

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドを用いてＨＡＶを検出するための方法、ＨＡＶを検出するためのオリゴヌクレオチドの使用および反応混合物、ならびにＨＡＶを検出するためのオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。

ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）は、肝炎、すなわち肝臓の急性感染症を引き起こす可能性があるヘパトウイルスとして分類されるＲＮＡウイルスである。ＨＡＶは通常は糞便経路により拡散し、汚染された食品もしくは水の摂取により、または感染者との直接接触により、人から人へ伝播される。

Ａ型肝炎は約４週間の潜伏期間をもつ。そのウイルスは肝臓内で複製する。臨床症状が発症する前の潜伏期間中に比較的大量のウイルスが糞便中へ排出され、短期間のウイルス血症が起きる。疾病の重症度は無症候性のものから無黄疸性または黄疸性の肝炎までに及ぶ。そのウイルスは、細胞培養において増殖した場合には非細胞変性性である。インビボでのそれの病原性は柔細胞の壊死および組織球性門脈周囲炎を伴い、細胞性免疫応答により仲介されている可能性がある。症状の発症時点までに、糞便中へのウイルスの排出は次第に低下し、停止している場合があり、抗ＨＡＶＩｇＭの力価が上昇する。抗ＨＡＶＩｇＧが１〜２週間後に検出される場合があり、数年間持続する。ＨＡＶゲノムは約７，５００ヌクレオチド（ｎｔ）のプラスセンスＲＮＡを含み、それは３’末端でポリアデニル化されており、５’末端に結合したポリペプチド（ＶＰｇ）をもつ。単一の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がゲノムの大部分を占め、Ｍ_ｒ２５２，０００の理論的分子質量をもつポリプロテインをコードする。ＨＡＶポリプロテインは、プロセシングされて構造性（アミノ末端に位置する）および非構造性のウイルスポリペプチドを生成する。ピコルナウイルスの複製の特徴の多くは始原型であるエンテロウイルスおよびライノウイルス、特に１型ポリオウイルスの研究から推測された。

Ａ型肝炎ウイルスは摂食および腸感染により体内に侵入する。次いでウイルスはおそらく血流によって拡散して標的臓器である肝臓に達する。潜伏期間中に、既に被曝後１０〜１４日目から一般に血清アミノトランスフェラーゼのピーク上昇時まで続けて、多数のウイルス粒子を糞便中に検出できる。ウイルスは疾病急性期の初期にも糞便中に検出されるが、臨床性黄疸の発症後は頻度が比較的低くなる。興味深いことに、Ａ型肝炎ウイルスに対する持続性抗体は潜伏期間の後期にも検出され、これは肝臓損傷の生化学的証拠の発現とほぼ一致する。免疫蛍光法によれば、Ａ型肝炎抗原はチンパンジーに実験的に伝播させた後に肝細胞の細胞質に局在していた。この抗原は、静脈内接種後に肝臓以外のいかなる組織にも見いだされていない。

Ａ型肝炎については種々の血清学的検査法があり、それには免疫電子顕微鏡検査、補体結合、免疫粘着血球凝集反応、ラジオイムノアッセイ、およびエンザイムイムノアッセイが含まれる。広く用いられている免疫粘着血球凝集反応は中等度の特異性および感度である。幾つかのラジオイムノアッセイ法が記載されている；これらのうち、固相型のアッセイ法が特に簡便であり、感度がきわめて高く、かつ特異的である。感度がきわめて高いエンザイムイムノアッセイ法は広く用いられている。わずか１種類の血清型のＡ型肝炎ウイルスが、実験的にＡ型肝炎ＭＳ−１株に感染させたボランティア、種々の地域での種々の大発生からの患者、およびランダムなＡ型肝炎症例において同定された。組織培養におけるウイルスの分離には長期間の適応を必要とし、したがってそれは診断には適さない。

分子生物学的手法、たとえばウイルスＲＮＡの逆転写およびそれのＰＣＲ増幅に基づく手法により、あらゆる種類の臨床試料または環境試料からのごく少量のウイルスＲＮＡを検出できる。ＨＡＶ感染は、本発明において提供する核酸検査法により検出できる。

本発明は、生物試料中のＨＡＶを検出する方法であって、ＨＡＶの核酸配列を含む標的核酸を反応混合物中で増幅することを含む方法を提供する。その反応混合物は、標的核酸を含有する可能性のある生物試料、ならびに少なくとも第１および第２プライマーを含むことができ、その際、第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５〜８から選択され、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０〜１１から選択される。その増幅によって増幅した標的核酸が生成し、それを検出することができる。

さらに本発明は、増幅した標的核酸を増幅中または増幅後に検出する方法を提供する。この方法はまた、増幅した標的核酸を検出するためのプローブをさらに含む反応混合物を含むことができる。プローブの核酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４から選択される。

この方法はまた、第２標的核酸を、ＨＡＶと並行して、ＨＡＶを含まない別のバイアル内において同じサイクリング条件下で同じ割合の増幅試薬を含む反応混合物中で検出することを提供する。

本発明はまた、第１プライマーおよび第２プライマーを含み、その際、第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５〜８から選択され、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０〜１１から選択される、反応混合物を提供する。さらに、反応混合物はプローブを含むことができ、その際、プローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４から選択される。本発明はまた、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ならびに第１プライマーおよび第２プライマーを含み、場合によりプローブを備えた、キットを提供する。さらに、たとえば第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７であってもよく、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１であってもよく、プローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１４であってもよい。

本発明はさらに、生物試料中の第２標的核酸を反応混合物中で増幅および検出することを含む方法をさらに提供する。たとえば、第２標的核酸はパルボウイルスＢ１９であってもよく、または他のウイルスもしくは細菌もしくは微生物、または遺伝子標的もしくは対照標的を含めて関心がある他の配列であってもよい。

生物試料中のＨＡＶを検出する方法であって、ＨＡＶの配列を含む標的核酸を反応混合物中で増幅することを含む方法を開示する。その反応混合物は、標的核酸を含有する可能性のある生物試料、ならびにオリゴヌクレオチドセットまたはプライマー対を含む。第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５〜８から選択でき、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０〜１１から選択できる。増幅工程によって、増幅した標的核酸を生成させることができる。本方法はさらに、増幅した核酸を検出する工程を含む。

用語“生物試料”は、核酸を標的とする診断アッセイを施すことができる、通常は生物源に由来する材料に関する。ある態様において、そのような生物試料はヒトに由来し、体液である。本発明の１態様において、生物試料はヒトの血液、尿、喀痰、汗、スワブ、ピペット操作できる糞便、または脊髄液である。生物試料は、それから標的核酸を抽出できる組織であってもよい。

本明細書中で用いる用語“増幅する”は、一般に、標的核酸から複数の核酸分子を生成することを表わし、その際、ポリメラーゼによる延長のための開始部位を提供するために、プライマーを標的核酸分子上の特異的な部位にハイブリダイズさせる。増幅は当技術分野で一般に知られているいずれかの方法、たとえば下記により実施できるが、それらに限定されない：標準ＰＣＲ、ロングＰＣＲ(long PCR)、リアルタイムＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ(hot start PCR)、ｑＰＣＲ、ＲＴ（逆転写）ＰＣＲ、および等温増幅。他の増幅反応は、特にリガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ−ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification)（ＳＤＡ）、転写仲介増幅(Transcription Mediated Amplification)（ＴＭＡ）、およびＱβ−増幅を含む。増幅プロセスにより、たとえばアンプリコンまたは増幅核酸または増幅した標的核酸と呼ばれる増幅生成物が形成される。

たとえば、核酸増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、それは参考文献のうち特にU.S.Patent No. 4,683,202、4,683,195、4,800,159、および4,965,188に開示されている。ＰＣＲには一般に、選択した核酸鋳型（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。核酸分析に有用なプライマーには、標的核酸の核酸配列内で核酸合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは制限消化物から常法によって精製でき、あるいはそれは合成によって作製できる。プライマーは増幅において最大効率を得るために一本鎖であってもよいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーはまず変性される；すなわち、それらの鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１方法は加熱による。

“熱安定ポリメラーゼ”は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素である；すなわち、それは鋳型に対して相補的なプライマー延長生成物の形成を触媒する酵素であって、二本鎖鋳型核酸を変性させるのに必要な期間、高められた温度を付与された際に、不可逆的に変性することのない酵素である。一般に、合成は各プライマーの３’末端において開始し、鋳型鎖に沿って５’から３’方向に進行する。熱安定ポリメラーゼは、たとえばサーマス・フラブス(Thermus flavus)、サーマス・ルーバー(T. ruber)、サーマス・サーモフィラス(T. thermophilus)、サーマス・アクアティカス(T. aquaticus)、サーマス・ラクテウス(T. lacteus)、サーマス・ルーベンス(T. rubens)、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、およびメタノサーマス・フェルビダス(Methanothermus fervidus)から単離された。他の代表的ポリメラーゼはＺ０５である。ポリメラーゼは、たとえば追加の機能を行なうために、および／または改善された機能性をもつために、それらの元の状態から修飾されてもよい。たとえば、Ｚ０５はたとえばUS 2009/0148891に記載される修飾Ｚ０５ポリメラーゼである。“逆転写活性をもつポリメラーゼ”は、ＲＮＡ鋳型に基づいてＤＮＡを合成できる核酸ポリメラーゼである。それは、ＲＮＡが逆転写されて一本鎖ｃＤＮＡになると、二本鎖ＤＮＡを形成することもできる。本発明の態様において、ポリメラーゼは熱安定性である。熱安定性でないポリメラーゼも、その酵素が補充される限りＰＣＲアッセイに使用できる。多数のポリメラーゼを１反応混合物中でブレンドして、多数の機能を得ることもできる。

“標的核酸”は、当業者に既知のヌクレオチド高分子化合物である。“標的核酸”は、本明細書中で、試料中の分析すべき核酸、すなわち試料中のそれの存在、不存在および／または量を測定すべき核酸を表わすために用いられる。標的核酸はゲノム配列、たとえば特定の遺伝子の一部、またはＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。他の態様において、標的核酸はウイルスまたは微生物であってもよい。特定の態様において、標的核酸はＨＡＶまたはパルボウイルスＢ１９であってもよい。標的核酸は対照標的であってもよい。

用語“反応混合物”は、その中で増幅反応が行われる媒体に関する。その媒体は液体、粒子懸濁液、または固相と連携した液体であってもよい。媒体は、標的核酸を増幅するのに必要な塩類、試薬、たとえばｄＮＴＰ、酵素、およびオリゴヌクレオチド、ならびに標的核酸を含有する可能性がある試料を含む。

１態様において、反応混合物はさらに、増幅した標的核酸を検出するための核酸プローブを含む。特定の１態様において、たとえばプローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１４であってもよい。

用語“標的核酸を含有する可能性がある”は、標的核酸を含有するかまたは何らかの理由でその疑いがある試料を検査するだけでなく、むしろ結果的にはそれらが標的核酸を含有しないとしても標的核酸を含有する可能性がある試料を検査することを意味する。

本明細書中で用いる用語“プライマー”および“プローブ”は、オリゴヌクレオチドに関する。本発明に関して、用語“オリゴヌクレオチド”は、それらのモノマー単位としての複数のヌクレオチドから形成された成分を表わす。用語“オリゴヌクレオチド”には、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる；すなわち、プライマーおよび／またはプローブは、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物（ヌクレオチド類似体とも呼ばれる）を含む。用語“プライマー”はさらに、増幅反応に用いられて標的配列にアニールするオリゴヌクレオチドに関する。用語“プローブ”はさらに、定性または定量検出の目的で標的核酸またはアンプリコンにハイブリダイズさせるオリゴヌクレオチドに関する。プローブの場合、修飾には色素、たとえばＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、ＣＹ５、ＣＹ５．５など、および／またはクエンチャー分子を含めることができる。色素分子をリンカーにカップリングさせてもよい。しかし、そのような色素はプライマー中に存在してもよい。他の代表的な修飾には、３’末端のリン酸基が含まれる。プライマーの一般的な修飾には、非特異的増幅生成物、たとえばプライマー二量体を阻止するための３’ヌクレオチドの修飾が含まれる。そのような修飾は当技術分野で周知であり、限定ではない例としてｔ−ブチルベンジル−ｄＴまたは−ブチルベンジル−ｄＣが含まれる。そのような修飾体も、用語“プライマー”に含まれる。

プライマー対とは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを表わし、それらは一緒に、アンプリコンの生成が可能な条件下に置かれると、それらがアニールする標的核酸からアンプリコンを生成することができる。２種類より多いプライマーが反応混合物中にあってもよい。増幅のためのオリゴヌクレオチドセットは、多数のプライマーおよび１または２種類以上のプローブを含むことができる。

用語“検出する”は、増幅に際して発生する信号の測定に関する。測定は定性的または定量的であってよい。適切な核酸検出方法は当業者に既知であり、Sambrook J. et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、およびAusubel F. et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NYなどの標準的テキストブックに記載されている。さらに、核酸検出工程を実施する前に、たとえば沈殿段階などの精製段階があってもよい。検出方法には、二本鎖ＤＮＡ中へインターカレートしてその後にそれの蛍光を変化させる臭化エチジウムなどの特定の色素の結合またはインターカレーションを含めることができるが、これらに限定されない。精製した核酸を場合により制限消化後に電気泳動法により分離し、その後に視覚化することもできる。プローブに基づくアッセイ法もあり、これは特異的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびそれに続くハイブリッド検出を利用する。

分析の結果を評価するために、増幅した標的核酸を増幅反応中または反応後に検出することができる。リアルタイムでの検出のための１方法は、核酸プローブまたは多数のプローブの使用である。他のリアルタイム方法は当技術分野で周知であり、たとえばＤＮＡ結合色素、たとえばＳＹＢＲグリーンまたは臭化エチジウムの使用が含まれる。

市販のリアルタイムＰＣＲ機器（たとえば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）シテスム）の使用により、ＰＣＲ増幅と増幅生成物の検出を単一の閉鎖容器内で連結することができ、それに伴ってサイクリング時間が劇的に短縮される。検出が増幅と同時に行なわれるので、リアルタイムＰＣＲ法は増幅生成物を取り扱う必要性が除かれ、増幅生成物間の交差汚染のリスクが低減する。リアルタイムＰＣＲはターンアラウンドタイムを大幅に短縮し、臨床検査室において一般的なＰＣＲ法に代わる魅力的な方法である。ただし、当業者に既知である他の検出方法も採用できる。

本発明の方法に従って内部対照核酸を用いることにより、増幅反応および検出反応を妨害する可能性がある試料特異的な阻害作用だけでなく、試料非特異的な阻害作用（標的領域とは無関係な阻害）も均一化されて、より精確な力価が得られる。“内部”とは、別の実験においてではなく、標的核酸と同じ反応混合物内で対照核酸が増幅、検出および定量されることを意味する。たとえば、本発明は、対照オリゴヌクレオチド −フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ− を反応混合物に添加することを考慮する。

“検出限界”または“ＬＯＤ”は、前決定したヒット率で検出できる、試料中の核酸の最低濃度または最低量を意味する。低い“ＬＯＤ”は高い感度に対応し、逆のことも言える。“ＬＯＤ”は、特に核酸がウイルス核酸である場合は、通常は単位“ｃｐ／ｍｌ”により、または“ＩＵ／ｍｌ”として表わされる。“ｃｐ／ｍｌ”は、“ミリリットル当たりのコピー数”を意味し、ここで、“コピー数”はそれぞれの核酸のコピー数である。ＩＵ／ｍｌは“国際単位／ｍｌ”であり、ＷＨＯ基準を表わす。

ＬＯＤを計算するために広く用いられている方法は“プロビット解析”であり、それは刺激（用量）と計数型(quantal)（全か無）応答の関係を解析する方法である。典型的な計数型応答実験では、複数グループの動物に異なる用量の薬物を投与する。各用量レベルでの死亡率を記録する。次いでこれらのデータをプロビット解析により解析することができる。プロビットモデルにより、応答率が累積正規分布としての対数用量に関係することが確認される。すなわち、対数用量は累積正規分布から死亡率を読み取るための変数として使用できる。他の分布確率ではなく正規分布を用いると、可能性のある用量の上端と下端では推定応答率が影響を受けるが、中間付近ではほとんど影響がない。

“プロビット解析”は個別の“ヒット率”で適用できる。当技術分野で知られているように、“ヒット率”は一般にパーセント［％］で表わされ、被分析体の特定濃度における陽性結果の百分率を示す。したがって、たとえばＬＯＤを９５％のヒット率で決定することができ、これは妥当な結果の９５％が陽性である設定についてＬＯＤを計算することを意味する。

１態様において、生物試料中に存在する核酸を逆転写および増幅の前に富化する。
本明細書中で用いる用語“富化する”は、標的核酸を含有する試料を処理するいずれかの方法であって、標的核酸を試料中に存在する他の物質の少なくとも一部から分離させる方法に関する。したがって、“富化”は、他の物質より多量の標的核酸を得ることと理解される。

核酸を富化するためには幾つかの方法がある：
配列依存性または生物特異的な方法、たとえば：
・アフィニティークロマトグラフィー
・固定化したプローブへのハイブリダイゼーション
配列非依存性または物理化学的な方法、たとえば：
・たとえばフェノール−クロロホルムによる液−液抽出
・たとえば純エタノールによる沈殿
・濾紙による抽出
・セチル−トリメチル−アンモニウム−ブロミドなどのミセル形成剤による抽出
・固定化したインターカレーション色素、たとえばアクリジン誘導体への結合
・シリカゲルまたは珪藻土への吸着
・カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子（ＭＧＰ）または有機シラン粒子への吸着
標的核酸を富化するための代表的方法は、Ｑｕｉａｇｅｎから市販されているＰｕｒｅｇｅｎｅ−Ｋｉｔ（たとえば、注文番号１５８３８９）を用いる富化である。

本発明の他の観点は、前記方法であって、富化の前に、多種多様な流体試料中に存在する可能性がある細胞および／またはウイルスキャプシドのリシス（溶菌）により、核酸をそれらの細胞および／またはウイルス環境から放出させるものである。

細胞またはウイルス粒子の内容物を放出させるために、それらを酵素または化学薬品で処理して、細胞壁またはウイルス粒子を溶解、破壊または変性させることができる。このプロセスは一般にリシスと呼ばれる。そのようなリシスした物質を含有する生成溶液はライゼート（溶菌産物）と呼ばれる。

１態様において、前記方法の増幅工程および検出工程の前に下記の工程を行なう：異なるタイプの流体試料を入れた複数の容器を用意する。標的核酸を含む核酸が固体支持体材料に固定化されるのに十分な期間および条件下で、固体支持体材料を容器内の複数の異なるタイプの流体試料と混和しておく。次いで、分離ステーションで固体支持体材料を流体試料中に存在する他の物質から単離し、そして分離ステーションで流体試料を固体支持体材料から分離して固体支持体材料を洗浄用緩衝液で１回以上洗浄することにより核酸を精製する。固体支持体材料と複数の異なるタイプの流体試料を混和しておく物理的条件および期間は、複数の異なるタイプの流体試料のいずれについても等しい。

本発明の１態様において、上記プロセスにおけるリシス用緩衝液は下記の群から選択される１種類以上の成分を含む：
・カオトロピック剤
・緩衝物質
・アルコール類
・還元剤
一般に溶液中の水分子の規則的構造ならびに分子内および分子間の非共有結合力を攪乱するカオトロピック剤は、試料調製操作に幾つか寄与することができる。特に、ただしそれだけではないが、それらはヌクレアーゼの三次元構造を攪乱することによるＲＮａｓｅ阻害剤として適用できる。通常はそれ以上のＲＮａｓｅ阻害剤をリシス用緩衝液に付与する必要はない。そのほかに、カオトロピック剤は生物膜、たとえば細胞膜、または細胞内器官が存在する場合にはそれらの膜の破壊に寄与する。また、それらは核酸がガラス（前記を参照）などの表面に粘着結合する際に重要な役割を果たすことができる。本発明に関するカオトロピック剤は、グアニジニウム塩、たとえばチオシアン酸グアニジニウムもしくは塩酸グアニジニウムもしくは塩化グアニジニウムもしくはイソチオシアン酸グアニジニウム、尿素、過塩素酸塩、たとえば過塩素酸カリウム、他のチオシアン酸塩、またはヨウ化カリウムである。ただし、他のカオトロピック剤も本発明の範囲において使用できる。

ある態様において、ＨＡＶの検出をパルボウイルスＢ１９の検出と同時に同じ反応混合物中で実施できる。パルボウイルスＢ１９を検出するためのオリゴヌクレオチド配列は、たとえばUS 2007-0281294に開示されている。ある態様において、第２標的核酸の増幅および検出を、ＨＡＶの増幅および検出と一緒に同じ反応混合物中で実施できる。ある態様において、ＨＡＶとパルボウイルスＢ１９を同じ反応混合物中で増幅および検出する。ある態様において、ＨＡＶおよび第２標的を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットを含むキットが提供される。ある態様において、たとえば第２標的はパルボウイルスＢ１９である。他の態様において、キットは、さらに他の標的に対するオリゴヌクレオチドセットをさらに含む。

ある態様において、増幅した核酸の検出は、増幅中に、たとえばリアルタイムＰＣＲ法を用いて行なうことができる。他の態様において、増幅した核酸の検出は、増幅が完了した後に行なうことができる。

本発明の他の態様において、第２標的核酸をＨＡＶと並行して、ＨＡＶを含有しない別のバイアル内において同じサイクリング条件下で同じ割合の増幅試薬を含む反応混合物中で検出する。用語“並行して”は、ＨＡＶと第２標的核酸を別のバイアル内において、ただし同時に同じ条件下で、その方法により処理することを意味する。

本発明はまた、オリゴヌクレオチドセット、または第１および第２プライマーを含むプライマー対を提供し、その際、第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５〜８のうちのひとつを含み、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０〜１１のうちのひとつを含む。このプライマー対は、相補的核酸とのハイブリダイゼーション反応に使用できる。さらに、本明細書に記載するプライマー対およびプローブは、ＨＡＶを検出するために使用できる。

本発明はさらに、第１および第２プライマー（第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５〜８のうちのひとつを含み、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０〜１１のうちのひとつを含む）ならびにプローブ（プローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４のうちのひとつを含む）を含む、オリゴヌクレオチドセットを提供する。

本発明はまた、本明細書に記載するポリメラーゼ、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。１態様において、キットはさらにプローブを含み、その際、プローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４のうちのひとつを含む。キットはＨＡＶの検出のために使用できる。さらに他のキット構成要素の態様は、本明細書に記載されている。

本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：２であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１０である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：２であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：３であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１０である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：３であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：４であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１０である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。

本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：４であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：５であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１０である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：５であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：６であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１０である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：６であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。

本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：７であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１０である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：７であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：８であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１０である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。本明細書に記載する方法、プライマー対、オリゴヌクレオチドセット、およびキットについての１態様において、フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：８であり、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：１１である。１態様において、プローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１３または１４である。

以下に記載する実施例において、さらに表２に示すように、Ｒ２−ＨＡＶｒｅｆオリゴヌクレオチドセットと比較して、Ｒ２−ＨＡＶオリゴヌクレオチドセットによる感度増大がＳＥＱＩＤＮＯ：７、１１についてみられた。１態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、１１および１４を使用する。

以下の実施例は本発明を説明するために提示され、それを限定するためのものではない。
２種類のオリゴヌクレオチドセットの比較
ＨＡＶについて２種類のオリゴヌクレオチドセットを比較する並行した検出限界（ＬＯＤ）試験を実施する。

試薬ＭＭｘＲ２−ＨＡＶは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５〜８のうちのひとつ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０〜１１のうちのひとつ、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４のうちのひとつの核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。

試薬ＭＭｘＲ２−ＨＡＶｒｅｆ（参照セット）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１２の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。

試験レベルノードを作成するために用いたＨＡＶ陽性検体に、さらにウイルスバックグラウンドレベルとしてパルボウイルスＢ１９を添加する。表１に示す検体希釈パネルを調製する。

表１：検体希釈パネル

ノード１〜７の各検体について、８５０μｌの試料を手動でディープウェルプレート（処理プレート）にピペット装入する。これらの処理プレートに、半自動機能モジュール（Ｒｏｃｈｅ）で、US 2012-9945751に記載された一般的な試料調製法を用いて、核酸抽出のための試料調製処理を施す。

試料の最終調製段階（溶出液の冷却）で、増幅試薬ＭＭｘＲ１およびＭＭｘＲ２（Ｒ２−ＨＡＶまたはＲ２−ＨＡＶｒｅｆ）を含有するマスターミックス（ＭＭｘ）をマイクロウェルプレート（増幅−検出プレート）の各ウェルに手動で添加する。増幅試薬Ｒ１およびＲ２は、さらに後記に定義される。次いで溶出液（単離された核酸を含有する）を機器により処理プレートからマイクロウェルプレートへ移し、ＭＭｘと混合する。次いでマイクロウェルプレートを自動シールし、増幅および検出のための独立型分析用サイクラー内へ手動で移す。増幅および検出（リアルタイムＰＣＲ）を、適切なＰＣＲプロフィールを用いて両方のマスターミックスについて同時に同一条件下で実施する。

増幅および検出
増幅のために、下記の方法で２種類の試薬ＭＭｘＲ１およびＭＭｘＲ２（Ｒ２−ＨＡＶまたはＲ２−ＨＡＶｒｅｆ）を混和し、単離された核酸と混合して、全反応体積５０μｌにする：
１０μｌのＭＭｘＲ１試薬（３．３ｍＭのＭｎＯＡｃ，ｐＨ６．１、および０．０２％のナトリウムアジド，ｐＨ７．０）、１５μｌのＭＭｘＲ２試薬（Ｒ２−ＨＡＶまたはＲ２−ＨＡＶｒｅｆ）、および２５μｌの単離された核酸を混和して、反応溶液を得る。

ＭＭｘＲ２−ＨＡＶとＭＭｘＲ２−ＨＡＶｒｅｆの配合は、それらのＨＡＶオリゴヌクレオチド組成においてのみ異なる。この例では、ＭＭｘＲ２−ＨＡＶはオリゴヌクレオチドセット１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７、１１および１４）を含み、ＭＭｘＲ２−ＨＡＶｒｅｆはオリゴヌクレオチドセット２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、９および１２）を含む。両セットを同じプライマー／プローブ濃度で試験する。

この例について、オリゴヌクレオチドセット１を含む反応混合物は、下記のものを含む：０．０３％のナトリウムアジド，ｐＨ７．０、５．４％のＤＭＳＯ、１２０ｍＭのＫＯＡｃ，ｐＨ７．０、３％のグリセロール、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、６０ｍＭのトリシン，ｐＨ８．０、０．２２２ｕＭのアプタマー、１０ＵのＵＮＧ、０．４ｍＭのｄＧＴＰ、０．４ｍＭのｄＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＣＴＰ、０．８ｍＭのｄＵＴＰ、４５ＵのＺ０５Ｄポリメセーゼ、０．３５ｕＭのＨＡＶフォワードプライマー、０．１５ｕＭのＨＡＶセンスプローブ、０．３５ｕＭのＨＡＶリバースプライマー；０．３ｕＭの内部対照フォワードプライマー、０．３ｕＭの内部対照リバースプライマー、０．１５ｕＭの内部対照プローブ。ＨＡＶｒｅｆについての反応混合物は、ＨＡＶ反応混合物と同じ濃度のオリゴヌクレオチドを含む。

データ分析
分析サイクラーの生データファイルを、自動ソフトウェアを用いて分析する。プロビット−用量応答ツールを用いてＬＯＤを決定する。計算したプロビットデータ（９５％）を表２に挙げる。

表２：MMx R2-HAVおよびMMx R2-HAVrefのプロビットデータ(95%)

このプロビットデータは、ＭＭｘＲ２−ＨＡＶｒｅｆオリゴヌクレオチドセット（１．９７）と比較して、Ｒ２−ＨＡＶオリゴヌクレオチドセットが高い感度（１．２７）を生じることを示す。

本明細書に記載した例および態様は説明のためのものにすぎず、それからみて当業者には多様な改変および変更が示唆され、それらは本発明および特許請求の範囲の精神および範囲に含まれると理解される。本明細書中に引用したすべての刊行物、配列寄託番号、特許、および特許出願を、全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。

Claims

生物試料中のＨＡＶを検出する方法であって、
ａ）ＨＡＶの核酸配列を含む標的核酸を反応混合物中で増幅する；その反応混合物は、標的核酸を含有する可能性のある生物試料、ならびに少なくとも第１および第２プライマーを含み、その際、第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７であり、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１である；
その際、増幅によって増幅した標的核酸が生成する；そして
ｂ）増幅した標的核酸を検出する
ことを含む前記方法。
増幅した標的核酸を工程ａ）の途中または後で検出する、請求項１に記載の方法。
反応混合物がさらに、増幅した標的核酸を検出するためのプローブを含む、請求項１または２に記載の方法。
プローブの核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４から選択される、請求項３に記載の方法。
第２標的核酸を、ＨＡＶと並行して、ＨＡＶを含まない別のバイアル内において同じサイクリング条件下で同じ割合の増幅試薬を含む反応混合物中で検出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
第１プライマーおよび第２プライマーを含み、第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７であり、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１である、ＨＡＶを検出するための反応混合物。
第１および第２プライマーならびにプローブを含み、第１プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７であり、第２プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１であり、プローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４から選択される、ＨＡＶを検出するための反応混合物。
ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ならびに請求項６に記載の第１プライマーおよび第２プライマーを含む、ＨＡＶを検出するためのキット。
さらにプローブを含み、プローブの核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜１４から選択される、請求項８に記載のキット。
さらに、生物試料中の第２標的核酸を反応混合物中で増幅および検出する、請求項１に記載の方法。
第２標的核酸がパルボウイルスＢ１９である、請求項１０に記載の方法。
プローブの核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１４である、請求項３に記載の方法。