JP6476430B2 - ウロキナーゼ阻害剤及び血管新生阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有するウロキナーゼ阻害剤及び血管新生阻害剤に関する。

特許文献１に開示されるように、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体として、例えば、イシクラゲ（Nostoc commune）、髪菜（Nostoc flagelliforme）、葛仙米（Nostoc sphaericum）が知られている。これらの藻体は、蛋白質、ビタミン類、多糖類、各種ミネラルを豊富に含有しており、古来より中国や日本等において食用に供されてきた。

一方、ウロキナーゼは、セリンプロテアーゼの一つであり、不活性な酵素前駆体であるプラスミノゲンを活性型のプラスミンに変換する酵素（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子）として知られている。また、ウロキナーゼは、プロテアーゼとしての機能以外にも血管内皮細胞の遊走促進作用及びマトリゲル上での管腔形成促進作用を有し、血管新生において重要な機能を果たしている。

特開平９−１４９７７４号公報

本発明は、本研究者らによる鋭意研究の結果、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物が、ウロキナーゼの活性を阻害する作用、及び血管新生を阻害する作用を発揮することを新たに見出したことに基づいてなされたものである。本発明の目的は、新規なウロキナーゼ阻害剤及び血管新生阻害剤を提供することにある。

上記の目的を達成するためのウロキナーゼ阻害剤は、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
上記ウロキナーゼ阻害剤において、前記藻体は、イシクラゲ、髪菜、葛仙米から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。

上記の目的を達成するための血管新生阻害剤は、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
上記血管新生阻害剤において、前記藻体は、イシクラゲ、髪菜、葛仙米から選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。

本発明によれば、新規なウロキナーゼ阻害剤及び血管新生阻害剤が提供される。

[第１実施形態]
以下、本実施形態のウロキナーゼ阻害剤について説明する。
本実施形態のウロキナーゼ阻害剤は、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有する。藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体（以下、上記藻体と記載する。）としては、例えば、イシクラゲ、髪菜、葛仙米から選ばれる少なくとも一種を用いることができる。

抽出物の原料となる上記藻体は、天然に自生する藻体であってもよいし、人工的に培養した藻体であってもよい。なお、安定供給が可能である点や品質保持が容易である点から、人工的に培養した藻体を用いることが工業的に好適である。また、上記藻体は、採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、並びに採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態のいずれの状態であってもよい。

上記藻体から抽出物を抽出するための抽出溶媒としては、例えば、有機溶媒、及び有機溶媒と水との混合溶媒を用いることができる。上記有機溶媒としては、例えば、低級アルコール、酢酸エチル、ヘキサン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、アセトン、グリセリン、及びプロピレングリコールが挙げられる。低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。

また、有機溶媒としては、単独種を用いてもよいし、複数種を混合した混合溶媒を用いてもよい。抽出溶媒として水と有機溶媒の混合溶媒を用いる場合には、混合溶媒中における有機溶媒の含有量は、好ましくは５０体積％以上、より好ましくは８０体積％以上である。また、抽出溶媒中に、添加剤、例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、及び乳化剤等が溶解されていてもよい。

上記藻体から抽出物を抽出する抽出方法としては、公知の抽出方法、例えば冷却抽出、常温抽出、及び加熱抽出のいずれの方法を用いてもよい。また、抽出温度は溶媒の種類、抽出効率、成分の劣化等に応じ適宜設定することができる。

抽出操作としては、抽出溶媒中に原料である上記藻体を所定時間浸漬させることにより行われる。その際、抽出溶媒中における上記藻体の濃度は、注出溶媒の種類、抽出効率、抽出後の濃縮処理の効率等に応じ適宜設定することができる。こうした抽出操作において、抽出効率を高めるべく、必要に応じて攪拌処理、加圧処理、及び超音波処理等の処理をさらに行ってもよい。

また、抽出操作は同一の上記藻体に対して一回のみ行ってもよいし、複数回繰り返して行ってもよい。そして、抽出操作の後に固液分離操作が行われることで、抽出液（抽出物）と上記藻体の残渣とを分離する。固液分離操作の方法としては、例えばろ過や遠心分離等の公知の分離法を用いることができる。また、得られた抽出液（抽出物）は、必要に応じて濃縮又は乾燥処理を行ってもよい。

本実施形態のウロキナーゼ阻害剤に含有される上記藻体の抽出物は、ウロキナーゼ阻害活性を有する。そして、ウロキナーゼは、血管形成、骨再形成、子宮内の胚着床、免疫細胞の炎症部位への浸潤、排卵、精子形成等の種々の生理プロセスに関与する酵素である。したがって、本実施形態のウロキナーゼ阻害剤は、ウロキナーゼに対する阻害効果を得る用途、例えば、上記の生理プロセスの異常等に起因する疾患の治療及び予防を目的とした医薬品、医薬部外品、及び飲食品用の添加剤や、上記の生理プロセスの研究を目的とした実験用・研究用試薬として適用することができる。

なお、本実施形態のウロキナーゼ阻害剤を医薬品や医薬部外品に適用して使用する場合には、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与、粘膜投与等のあらゆる投与方法、皮膚や物品等へ塗布する方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤、塗布剤等が挙げられる。

また、本実施形態のウロキナーゼ阻害剤は、そのウロキナーゼ阻害作用を損なわない範囲で上記藻体の抽出物以外の成分を含有させてもよい。上記藻体の抽出物以外の成分としては、例えば賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤、香料、甘味料等が挙げられる。

次に、本実施形態の効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態のウロキナーゼ阻害剤は、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有している。上記構成によれば、ウロキナーゼの活性を阻害することができる。

（２）本実施形態のウロキナーゼ阻害剤の有効成分は、特定の藻体に含まれる天然成分であることから、生体に対してより安全に適用することができる。
[第２実施形態]
以下、本実施形態の血管新生阻害剤について説明する。

本実施形態の血管新生阻害剤は、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有する。本実施形態の血管新生阻害剤に含有される、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物は、第１実施形態のウロキナーゼ阻害剤に含有されるものと同様であるため、ここでは具体的な記載を省略する。

本実施形態の血管新生阻害剤に含有される、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物は、血管新生に対する阻害活性を有する。したがって、本実施形態の血管新生阻害剤は、血管新生の阻害効果を得ることを目的とした医薬品、医薬部外品、及び飲食品用の添加剤や、血管新生に関する研究を目的とした実験用・研究用試薬として適用することができる。

なお、本実施形態の血管新生阻害剤を医薬品や医薬部外品に適用して使用する場合には、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与、粘膜投与等のあらゆる投与方法、皮膚や物品等へ塗布する方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤、塗布剤等が挙げられる。

また、本実施形態の血管新生阻害剤は、その血管新生阻害作用を損なわない範囲で、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物以外の成分を含有させてもよい。藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物以外の成分としては、例えば賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤、香料、甘味料等が挙げられる。

次に、本実施形態の効果について、以下に記載する。
（３）本実施形態の血管新生阻害剤は、藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有している。上記構成によれば、血管新生を阻害することができる。

（４）本実施形態の血管新生阻害剤の有効成分は、特定の藻体に含まれる天然成分であることから、生体に対してより安全に適用することができる。
なお、上記各実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。

・ 第１実施形態のウロキナーゼ阻害剤、及び第２実施形態の血管新生阻害剤を、例えば馬、牛、鳥等のヒト以外の動物に使用してもよい。

次に、試験例を挙げて上記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜藻体の抽出物の調製＞
イシクラゲの乾燥藻体（１ｇ）にｎ−ヘキサン（２０ｍｌ）を加え、室温にて、超音波を付与しながら１時間の溶媒抽出を行った後、ろ紙を用いて抽出液と残渣とに分離した。残渣を用いて再度、同様の抽出処理を行い、これを２回繰り返した（合計３回の抽出処理を行なった。）。得られた抽出液を減圧乾固することにより、イシクラゲのヘキサン抽出物を得た。

上記のヘキサン抽出後の藻体の残渣に酢酸エチル（２０ｍｌ）を加え、室温にて、超音波を付与しながら１時間の溶媒抽出を行った後、ろ紙を用いて抽出液と残渣とに分離した。残渣を用いて再度、同様の抽出処理を行い、これを２回繰り返した（合計３回の抽出処理を行なった。）。得られた抽出液を減圧乾固することにより、イシクラゲの酢酸エチル抽出物を得た。

上記の酢酸エチル抽出後の相対の残渣にメタノール（２０ｍｌ）を加え、室温にて、超音波を付与しながら１時間の溶媒抽出を行った後、ろ紙を用いて抽出液と残渣とに分離した。残渣を用いて再度、同様の抽出処理を行い、これを２回繰り返した（合計３回の抽出処理を行なった。）。得られた抽出液を減圧乾固することにより、イシクラゲのメタノール抽出物を得た。

また、髪菜の乾燥藻体に対して同様の抽出処理を行うことにより、髪菜のヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、及びメタノール抽出物を得た。また、葛仙米の乾燥藻体に対して同様の抽出処理を行うことにより、葛仙米のヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、及びメタノール抽出物を得た。

＜ウロキナーゼ阻害試験＞
イシクラゲ、髪菜、及び葛仙米の各抽出物について、ウロキナーゼ阻害試験を行った。
イシクラゲ、髪菜、及び葛仙米の各抽出物を、ジメチルスルホキシドに溶解させて、１ｍｇ／ｍｌの試験溶液をそれぞれ調整し、これを試料溶液とした。緩衝液として、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（１．５ｇ）をイオン交換水（２２０ｍｌ）に溶解させ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）とポリエチレングリコール８０００とを、それぞれ終濃度が０．０１質量％になるように加え、塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ８．８に調整したものを用意した。

ウロキナーゼ溶液として、１７８４０７Ｕ／ｍｌウロキナーゼを緩衝液で希釈して３７５０Ｕ／ｍｌに調製したものを用意した。基質溶液として、５ｍＭスペクトロザイムＵＫ溶液を緩衝液で希釈して１ｍＭに調製したものを用意した。

９６ウェルのマイクロプレートに緩衝液（２０μｌ）、試料溶液（１０μｌ）、ウロキナーゼ溶液（２０μｌ）を分注し、プレートシェーカーにて３０秒間撹拌した後、３７℃のインキュベータにて１０分間反応させた。マイクロプレートをインキュベータから取り出して１０分経過したタイミングにて、基質溶液（５０μｌ）を加え、プレートシェーカーにて３０秒間撹拌した後、３７℃のインキュベータにて１０分間反応させた。マイクロプレートをインキュベータから取り出して１５分経過したタイミングにて、マルチラベルリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。そして、下記式にしたがって各試験溶液のウロキナーゼ阻害活性（％）を求めた。その結果を表１に示す。

（算出式）
ウロキナーゼ阻害活性（％）＝[１−（Ａ―Ｃ）／Ｂ]×１００
Ａ：試料溶液＋ウロキナーゼ溶液＋基質溶液の吸光度
Ｂ：ウロキナーゼ溶液＋基質溶液の吸光度
Ｃ：試料溶液の吸光度

表１に示すように、イシクラゲ及び葛仙米については、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、及びメタノール抽出物のいずれにおいてもウロキナーゼ阻害活性を確認することができた。髪菜については、酢酸エチル抽出物及びメタノール抽出物においてウロキナーゼ阻害活性を確認することができた。

＜血管新生阻害試験＞
イシクラゲの酢酸エチル抽出物及びメタノール抽出物について、血管新生阻害試験を行った。血管新生阻害試験は、血管新生キット（倉敷紡績株式会社製、ＫＺ−２０００）を用いて、同キットに添付の取扱い説明書にしたがって行った。イシクラゲの酢酸エチル抽出物及びメタノール抽出物はそれぞれ、最終濃度が０．１０ｍｇ／ｍｌ、１．００ｍｇ／ｍｌとなるように培地中に添加した。

その結果、最終濃度０．１０ｍｇ／ｍｌで添加した試験においては、酢酸エチル抽出物については血管新生に対する阻害活性は認められなかったが、メタノール抽出物については血管新生に対する阻害活性を示すことを確認することができた。また、最終濃度１．００ｍｇ／ｍｌで添加した試験においては、酢酸エチル抽出物及びメタノール抽出物ともに、明らかに血管新生に対する阻害活性を示すことを確認することができた。

また、イシクラゲの酢酸エチル抽出物及びメタノール抽出物に対して、消化酵素による処理（３０分のペプシン処理及び２時間のパンクレアチン処理）を行った酵素処理物を用いて、同様の血管新生阻害試験を行った。酵素処理物はそれぞれ、最終濃度が１．００ｍｇ／ｍｌとなるように培地中に添加した。

その結果、酢酸エチル抽出物の酵素処理物については、血管新生の阻害活性を確認することができなかった。一方、メタノール抽出物の酵素処理物については、血管新生の阻害活性を確認することができた。

これらの結果から、イシクラゲ等の藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物の中でも、メタノール等の低級アルコールによる抽出物が、血管新生の阻害活性の高さ、及び酵素処理物に対する耐性の観点において特に優れていると考えられる。

Claims (4)

1. 藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有し、
   前記藻体は、イシクラゲ、葛仙米から選ばれる少なくとも一種であり、
   前記抽出物は、ヘキサン、酢酸エチル、低級アルコールから選ばれる少なくとも一種の有機溶媒、又は前記有機溶媒と水との混合溶媒を抽出溶媒とする抽出物であることを特徴とするウロキナーゼ阻害剤（ただし、イシクラゲのエタノール抽出物を用いる態様を除く。）。
2. 藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有し、
   前記藻体は、髪菜であり、
   前記抽出物は、酢酸エチル、低級アルコールから選ばれる少なくとも一種の有機溶媒、又は前記有機溶媒と水との混合溶媒を抽出溶媒とする抽出物であることを特徴とするウロキナーゼ阻害剤。
3. 藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有し、
   前記藻体は、イシクラゲ、葛仙米から選ばれる少なくとも一種であり、
   前記抽出物は、ヘキサン、酢酸エチル、低級アルコールから選ばれる少なくとも一種の有機溶媒、又は前記有機溶媒と水との混合溶媒を抽出溶媒とする抽出物であることを特徴とする血管新生阻害剤（ただし、イシクラゲのエタノール抽出物を用いる態様を除く。）。
4. 藍藻綱ネンジュモ目ノストック属に属する藻体の抽出物を有効成分として含有し、
   前記藻体は、髪菜であり、
   前記抽出物は、酢酸エチル、低級アルコールから選ばれる少なくとも一種の有機溶媒、又は前記有機溶媒と水との混合溶媒を抽出溶媒とする抽出物であることを特徴とする血管新生阻害剤。