JP6473001B2 - アスペルギルス属糸状菌の大規模欠失変異体 - Google Patents
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Description
[態様1]
アスペルギルス属に属する菌株の変異体であって、当該菌株におけるアスペルギルス・オリゼの2番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から250kbまでの領域の少なくとも一部の塩基配列が欠失しており、且つ当該塩基配列を欠失していない菌株と比較して加水分解酵素活性が増大している、変異体。
[態様2]
前記テロメア末端から250kbまでの領域において、以下のi)〜v)の領域:
i)前記テロメア末端から50kbまでの領域;
ii)前記テロメア末端から50〜100kbまでの領域;
iii)前記テロメア末端から100〜150kbまでの領域;
iv)前記テロメア末端から150〜200kbまでの領域;
v)前記テロメア末端から200〜250kbまでの領域、
のいずれか1つ以上の領域の塩基配列が欠失している、態様1に記載の変異体。
[態様3]
前記ii)及び/又はv)の領域の塩基配列が欠失している、態様2に記載の変異体。
[態様4]
前記テロメア末端から250kbまでの領域の全部の塩基配列が欠失している、態様2又は3に記載の変異体。
[態様5]
tmpB(Trans membrane protein B)遺伝子の機能が低下又は欠損している、態様1に記載の変異体。
[態様6]
tmpB遺伝子の一部又は全部が欠失している、態様5に記載の変異体。
[態様7]
前記菌株がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)又はアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)に属する、態様1〜6のいずれかに記載の変異体。
[態様8]
態様1〜7のいずれかに記載の変異体の培養物、又は培養物からの抽出物。
[態様9]
態様1〜7のいずれかに記載の変異体の製造方法であって、アスペルギルス属に属する菌株における2番染色体右腕のテロメア末端から250kbまでの領域の少なくとも一部の塩基配列を欠失させる工程を含む、方法。
[態様10]
態様8に記載の培養物、又は培養物からの抽出物の製造方法であって、態様1〜7のいずれかに記載の変異体と植物性及び/又は動物性原料とを接触させる工程を含む、方法。
[態様11]
前記原料が大豆及び小麦を含む、態様10に記載の製造方法。
[態様12]
前記培養物、又は培養物からの抽出物が麹又は諸味である、態様10又は11に記載の製造方法。
[態様13]
有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、態様1〜7のいずれかに記載の変異体又は態様8に記載の培養物、又は培養物からの抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
[態様14]
前記有機性材料がタンパク質、多糖又は脂質を含む、態様13に記載の製造方法。
本発明は、アスペルギルス属に属する菌株の変異体であって、当該菌株におけるアスペルギルス・オリゼの2番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から250kbまでの領域の少なくとも一部の塩基配列が欠失しており、且つ当該塩基配列を欠失していない菌株と比較して加水分解酵素活性が増大している、変異体を提供する。アスペルギルス属に属する菌株としては、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・リュウキュウエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)等の任意の菌株が挙げられるが、そのうちアスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する菌株や、これらの菌株のアスペルギルス・オリゼの2番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から250kbまでに存在する遺伝子群、特にtmpB遺伝子又はそのオーソログを有する菌株が好ましい。
i)前記テロメア末端から50kbまでの領域(Δ50k_Iの塩基配列に相当);
ii)前記テロメア末端から50〜100kbまでの領域(Δ50k_IIの塩基配
列に相当);
iii)前記テロメア末端から100〜150kbまでの領域(Δ50k_IIIの塩基配列に相当);
iv)前記テロメア末端から150〜200kbまでの領域(Δ100kの領域の5’末端から50kbまでの塩基配列に相当);
v)前記テロメア末端から200〜250kbまでの領域(Δ50k_IVの塩基配列に相当)、
のいずれか1つ以上の領域の塩基配列が少なくとも一部欠失していることが想定される。少なくとも「一部」の塩基配列の欠失とは、例え一塩基の欠失であっても親株と比較して加水分解酵素活性を増大させるような欠失である。
本発明は更に、上記変異体を用いて得られる培養物を提供する。本発明の変異体を含む培養物は、タンパク質を多く含む原料、例えば、植物性タンパク質を含む穀物類、野菜類など(例えば、大豆、小麦など)、そして動物性タンパク質を含む肉類、魚類などの加水分解工程で使用することができる。本明細書で使用する場合、「培養物」はアスペルギルス属菌を添加した麹や、更にはアスペルギルス属菌を利用して得られる諸味等の発酵物を意味する。
麹菌アスペルギスル・ソーヤNBRC4239株については、そのドラフトゲノム解析の結果が2011年に公開されており(DNA Research;18, 165−176、2011)、本麹菌のスッキャフォールドの塩基配列は、DDBJ/ENA/Genebankアクセッション番号DF093557からDF093585として登録・公開されている。
麹菌アスペルギルス・ソーヤ KP−del株(ΔpyrG,Δku70)(アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株誘導体。)。アスペルギルス・ソーヤKP−del株(ΔpyrG、Δku70)は、次の手順を経て得られた株である。
PD培地(ポリペプトン 1%、デキストリン 2%、リン酸水素二カリウム 0.5%、硝酸ナトリウム 0.1%、硫酸マグネシウム 0.05%、カザミノ酸 0.1%、pH 6.0)、Czapek−Dox最少培地(グルコース 3.0%、塩化カリウム 0.05%、硝酸ナトリウム 0.2%、リン酸水素二カリウム 0.1%、硫酸マグネシウム 0.05%、硫酸第二鉄 0.001%、pH 6.0)、マルツ寒天培地(麦芽エキス 8%、寒天1.5%、pH6.0)
栄養要求性株を培養する場合には、ウリジン要求性株では終濃度10mMのウリジンを培地添加し、変異体の再生には培地に1.2Mのソルビトールを添加した。
図1に麹菌アスペルギルス・ソーヤのScaffold00063の250kb欠失ベクター及び形質転換による相同組換えの概要を示す。表1に示すプライマーAs250RF_pyrとAs250RR、AsAs250LFとAs250LR_pyr、AsPyrFとAsPyrRを用いてアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株のゲノムDNAよりPCRによって相同組換えにおけるアーム領域とマーカー遺伝子をクローニングした。
500mL三角フラスコ中の10mMのウリジンを含むPD培地100mLに形質転換宿主株の分生子懸濁液を接種し、30℃で16時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体を0.7Mの塩化カリウム緩衝液で洗浄し、1.5% Lysing Enzyme(シグマ社製)及び0.3% Yatalase(大関社製)を含む0.7M塩化カリウム緩衝液で30℃、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調整した。得られたプロトプラストは1.2Mソルビトール緩衝液で洗浄した後、プロトプラストPEG法により形質転換を行った。
得られた変異体については、サザンハイブリダイゼーション法にて相同組換えの確認を行った。サザンハイブリダイゼーションに用いたプローブは表1に示すAs250RF_pyrとAs250R_nestedを用いて、また、通常のdNTPの代わりにDIG DNA Labeling Mix(Roche社製)を使用してPCRすることによって作製した。
本菌を用いた醤油原料の短期間分解試験を行い、本菌株が醤油醸造における原料の分解促進に有効であるか検討を行った。
脱脂大豆、小麦及び水を1:1:1.3の割合で混合したのち、15g秤量し、150mL容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、2.7x107個のΔ250k株又はNBRC4239 Δku70株(ネガティブコントロール)の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた(盛込み)。これを30℃で培養し盛込みから46時間を経過したところで出麹とした。なお、それぞれの実験は3反復で行った。
実施例2で示したとおり、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239におけるScaffold00063のテロメア末端250kbの欠失は醤油原料の分解を促進することが確認された。そこで、実際に小規模での試醸を実施し、圧搾性が向上するか検討を行った。
麹蓋で製麹した麹に25%食塩水を添加し、よく混合し諸味とした。これに、純粋培養した醤油乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィルス及び醤油酵母ジゴサッカロミセス・ルキシーを添加し、15℃から30℃にて90日間発酵させた。得られた醤油諸味については、目開き約1.0mmのメッシュ(サンプラテックPP24)で水洗後の残渣重量の測定と、薮田式圧搾機による圧搾後の残存粕重量の測定を行った。
以上のことから、Δ250k株を用いた場合、醤油醸造においても醤油原料の分解が促進され、残渣量を低下させることが可能であることが確認された。
その結果を図5に示した。
実施例1から4までの結果より、アスペルギルス・ソーヤでは種を問わずScaffold00063のテロメア末端側250kbを欠失させることにより醤油原料の分解効率が促進することが明らかになった。
部分欠失カセットの概要を図7、図9、図11、図13、図15に示した。それぞれテロメア末端側よりΔ50k_I〜Δ50k_IV、Δ100kとしてカセットを作製した。
Δ50k_I〜Δ50k_IV、Δ100kの位置関係を図24に示す。用いたプライマー
は、表2〜6に示した。
50RF_pyrとAs250RRの増幅産物)と同一のものを、Δ50k_IV及びΔ100kのLeft ArmはΔ250kのLeft Arm(As250LFとAs250LR_pyrの増幅産物)と同一のものを使用した。
クターを構築した。
実施例1に記載した方法と同様に形質転換を実施した。得られた変異体はサザンハイブリダイゼーションにて相同組換えの確認を行った。
した断片を、Δ50k_II及びΔ50k_IIIで用いたプローブは配列番号5と配列番号6のプライマーによって増幅されるPyrGマーカー全長の断片を、Δ50k_IV及びΔ100kで用いたプローブは実施例1で用いたものと同様に配列番号3と配列番号4のプライマーを用いて増幅される断片を用いた。
上記変異体が醤油原料の分解に有効であるか、短期間分解試験を実施し評価した。短期間分解試験は、分解条件以外は実施例4に記載した方法と同じ手順にて行った。分解終了後、諸味粘度を測定した。
さらにΔ50k_II領域中に含まれる領域を段階的に絞り込んだ結果、Trans membrane proteinであるtmpB遺伝子(配列番号47、48)の効果が期待されたため、tmpB遺伝子の破壊株を作製し、その効果を検証した。
tmpB遺伝子欠失カセットの概要を図18に示した。用いたプライマーは、表7に示した。
実施例1に記載した方法と同様に形質転換を実施した。得られた変異体は、サザンハイブリダイゼーションにて相同組換えの確認を行った。サザンハイブリダイゼーションにはPyrGマーカー領域のプローブを用い、BglIIにてゲノム断片を消化した。予想される断片は、目的の組換え産物による7.4kbの断片と、内在の不活化したpyrG遺伝子による3.0kbの二本検出される。サザンハイブリダイゼーションの結果、ΔtmpB_1とΔtmpB_2共に予想されるバンドが検出されたが、ΔtmpB_1では4.5kb付近にもシグナルが検出されたため、以降の実験にはΔtmpB_2を使用した(図19)。
上記変異体が醤油原料の分解に有効であるか評価するため、短期間分解試験を実施した。短期間分解試験は、分解条件以外は実施例4に記載した方法と同じ手順にて行った。分解終了後、諸味粘度を測定した。その結果を図20に示した。
実施例1から5までに示したデータは、いずれもアスペルギルス・ソーヤにて取得したデータであるが、アスペルギルス・オリゼのゲノム解読株である、アスペルギルス・オリゼRIB40株の系統を宿主とした場合でもScaffold00063テロメア末端250kbと相同な領域を欠失させることで同様の効果が得られるか検証を行った。
構築したベクターを用いて、アスペルギルス・オリゼRIB40を親株とする形質転換効率を向上させた栄養要求宿主であるRKuN16prt1(Δku70、ΔpyrG)株に対して形質転換を行った。なお、コントロール株の作製には、欠失したpyrG遺伝子を復帰させる相同組換えを行った。
上記欠失株を用いて小スケールで醤油麹を作製し、短期間分解を実施した。30℃で42時間分解を行った後、分解物の残渣量を測定した。
Claims (9)
- アスペルギルス属に属する菌株の変異体であって、tmpB(Trans membrane protein B)遺伝子が破壊されており、且つ当該遺伝子が破壊されていない菌株と比較して加水分解酵素活性が増大している、変異体。
- 前記破壊が、前記菌株におけるアスペルギルス・オリゼの2番染色体右腕と相同な染色体のテロメア末端から250kbまでの領域の全部の塩基配列の欠失である、請求項1に記載の変異体。
- tmpB遺伝子の一部又は全部が欠失している、請求項1に記載の変異体。
- 前記菌株がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)又はアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)に属する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異体の培養物、又は培養物からの抽出物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異体の製造方法であって、アスペルギルス属に属する菌株におけるtmpB遺伝子を破壊する工程を含む、方法。
- 請求項5に記載の培養物、又は培養物からの抽出物の製造方法であって、請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異体と植物性及び/又は動物性原料とを接触させる工程を含む、方法。
- 前記原料が大豆及び小麦を含む、請求項7に記載の製造方法。
- 前記培養物、培養物からの抽出物が麹又は諸味である、請求項7又は8に記載の製造方法。
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