CN118421678A - 一种酿酒酵母核糖体生物发生监测体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种酿酒酵母核糖体生物发生监测体系及其应用。所述监测体系包括响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因启动子、报告基因、终止子。所述的响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因的启动子序列至少包含以下基序RAAYCCRTRCATYY、RCAYCCRTRCATYY和GAAAATTTTC中的一种；所述的R为C或A；Y为G或T。该体系可用于监测在不同环境压力下或不同菌株背景下酿酒酵母细胞内部的核糖体蛋白基因表达发生的变化以及筛选高核酸或高耐受性酿酒酵母菌株，该监测体系通过与核酸合成监测体系的配合使用，对于后续菌株改造以及研究细胞内部核糖体生物发生有指导作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种酿酒酵母核糖体生物发生监测体系及其应用。
背景技术
核糖体生物发生是细胞中最复杂和保守的基本生命过程，包括核糖体RNA(rRNA)和核糖体蛋白(RPs)的表达、rRNA前体的加工和核糖体亚基组装等步骤，是细胞中最耗能的过程之一。核糖体生物发生的过程与其它细胞活动(如生长和分裂)密切相关，是细胞生长和增殖的基本限速步骤，决定了细胞内蛋白质合成的速率，其变化对细胞命运的决定至关重要，人类的多种遗传疾病、肿瘤、癌症、COVID-19病毒感染、细菌耐药性等都与核糖体生物发生有关。因此，对该过程的监测、研究对理解生命发展规律、揭示疾病机制、开发治疗方案等都十分重要。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛。在基础研究方面，酿酒酵母与同为真核生物的动物细胞和植物细胞有很多类似的结构，酿酒酵母的许多蛋白质序列和功能与在其它生物中发现的相似，是重要的真核模式生物，在酿酒酵母的基因组中发现了大量人类基因的同源物，也是研究人类疾病发生的理想模型。在工业应用方面，首先，酿酒酵母核糖体生物发生过程中产生的rRNA是主要RNA，占80％以上，RNA的降解物和衍生物具有促进人与动物生长、维护肠道健康、提升免疫力等功效，同时还是多种药物的有效成分，在癌症及慢性病治疗方面发挥重要作用。酿酒酵母经酶解转化制备的富含呈味核苷酸二钠(包括5’-鸟苷酸二钠和5’-肌苷酸二钠，简称I+G)的酵母抽提物，已成为新一代的强化营养保健型核苷酸类食品增味剂，具有很高的经济价值，选育高rRNA合成的高核酸酵母可以提升生产效率，降低生产成本。其次，应用于食品(如酒类、食用酒精、面包、酱醋等调味品)及生物燃料生产等领域的酿酒酵母工业菌株需要耐受多种胁迫条件(高糖、高温、高盐、高乙醇、及含有弱酸类、呋喃醛类及酚类抑制物等的条件)。酿酒酵母对多种胁迫调节耐受与核糖体生物发生现象有关，保障菌株在这些胁迫条件下的核糖体生物发生是保障这些酿酒酵母在这些胁迫条件存活并进行生产工作的前提。综上，在酿酒酵母中建立便捷的核糖体生物发生活跃程度监测体系，对促进理论研究和上述工业应用菌株的选育都有重要意义。
由于核糖体生物发生过程较为复杂，人们对核糖体生物发生的调控机制的研究和应用还比较有限，需要通过逐个测定菌株的rRNA以及RPs的转录水平确定核糖体生物发生情况，尚没有量化酿酒酵母胞内核糖体生物发生活跃程度的简便方法。
发明内容
针对目前缺乏量化核糖体生物发生活跃程度的方法，本发明提供一种酿酒酵母核糖体生物发生监测体系，该体系利用响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因启动子控制报告基因表达，可反映在不同环境压力下或不同遗传背景酿酒酵母胞内的核糖体生物发生情况，该荧光检测体系用于量化胁迫条件对酿酒酵母的影响程度，为高通量筛选核糖体生物发生提升的菌株(如高核酸酵母、高耐性酵母等)提供便利，也为酿酒酵母核糖体生物发生机制的研究提供技术支持。
本发明的技术方案如下：
一种酿酒酵母核糖体生物发生监测体系，所述监测体系包括响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因启动子、报告基因、终止子。
优选地，所述的响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因的启动子序列至少包含以下基序RAAYCCRTRCATYY、RCAYCCRTRCATYY和GAAAATTTTC中的一种；所述的R为C或A；Y为G或T。
优选地，所述的响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因的启动子序列选自RPL6B、RPS0B、RPS19A或RPS28A基因启动子中的一种以上；
启动子RPL6B序列如SEQ ID No:1所示；
启动子RPS0B序列如SEQ ID No:2所示；
启动子RPS19A序列如SEQ ID No:3所示；
启动子RPS28A序列如SEQ ID No:4所示。
优选地，所述的报告基因为红色荧光蛋白基因(mCherry)、绿色荧光蛋白基因(GFP)、β-葡萄糖苷酶基因(lacZ)、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)中的至少一种。
本发明的另一个目的是保护上述酿酒酵母核糖体生物发生监测体系在量化胁迫条件对酿酒酵母的影响程度中的应用。
优选地，所述的胁迫条件包括高糖、高温、高盐、高乙醇以及含有弱酸类、呋喃醛类及酚类等抑制物的条件。
本发明的另一个目的是保护上述酿酒酵母核糖体生物发生监测体系在高核酸酿酒酵母筛选中的应用，相关高核酸酵母菌株可以应用于核糖核酸、核苷酸、核苷酸衍生物及酵母抽提物的生产。
本发明的最后一个目的是保护上述酿酒酵母核糖体生物发生监测体系在具有耐受高糖、高温、高盐、高乙醇、及含有弱酸类、呋喃醛类及酚类抑制物等胁迫调节的高耐性酿酒酵母筛选中的应用，相关高耐性酵母菌株可以应用于食品(如酒类、食用酒精、面包、酱醋等调味品)及生物燃料等领域的生产。
本发明通过荧光信号的强弱反映与rRNA合成相关联的RPs基因的转录效率，从而体现出核糖体生物发生活跃程度。本发明还提供了使用该方法监测在不同环境压力下或不同遗传背景酿酒酵母胞内的核糖体生物发生情况的范例。该方法的建立，为高通量筛选核糖体生物发生提升的菌株(如高核酸酵母、高耐性酵母等)提供便利，也为酿酒酵母核糖体生物发生机制的研究提供技术支持。
本发明的有益的技术效果在于：
1.本发明提供的荧光监测体系利用响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因启动子控制报告基因表达，所产生的荧光可以被流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光光度计、荧光显微镜等仪器快速检测，为高通量筛选核糖体生物发生提升的突变体提供了技术支持。
2.本发明提供的荧光监测体系，其表达水平能够响应不同胁迫条件，可以用于量化胁迫条件对酿酒酵母的影响程度。
3.本发明提供的荧光监测体系，其表达水平能够反映不同遗传背景菌株的核糖体生物发生情况，对高核酸酵母、高耐性酵母菌种选育以及核糖体生物发生机制的研究都具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中中生菌素抗性基因表达框成功构建到质粒pIYC04上的PCR验证图M：1kb DNAmaker；1：利用引物NrsR-F和TEF1t-R进行菌落PCR扩增到的Nat-TEF1终止子基因片段。
图2为实施例2中红色荧光蛋白基因表达框成功构建到质粒pIYC04-Nat上的PCR验证图M：1kb DNAmaker；1：利用引物mCherry-F和PGK1-R进行菌落PCR扩增到的mCherry-PGK1终止子基因片段。
图3为实施例2中核糖体蛋白基因RPL6B启动子成功构建到质粒pNRPGK上的PCR验证图M：1kb DNAmaker；1：利用引物RPL6Bp-F和mCherry-F进行菌落PCR扩增到的RPL6Bp-mCherry基因片段。
图4为实施例3中核糖体蛋白基因监测体系(BY4741-RL6)在荧光显微镜图像下与阴性对照(BY4741-ep)和阳性对照(BY4741-RPGK)的成像测试。
图5为实施例3中核糖体蛋白基因监测体系(BY4741-RL6)在荧光酶标仪下与阴性对照(BY4741-ep)和阳性对照(BY4741-RPGK)的每OD的相对荧光强度单位。
图6为实施例3中核糖体蛋白基因监测体系(BY4741-RL6)在不同香草醛浓度下其每OD的相对荧光强度单位。
图7为实施例3中核糖体蛋白基因监测体系(NAN-27-RL6与EMV-8-RL6)的每OD的相对荧光强度单位。
图8为实施例1中EMV-8和NAN-27每克菌体干重所含的RNA含量。
图9为实施例3中核糖体蛋白基因监测体系(Y03-RL6与YM83-RL6)的每OD的相对荧光强度单位。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，在不离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均视为落入本发明的范围。
实施例1：核糖体生物发生监测体系的构建
本发明利用以能够响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因RPL6B的启动子(RPL6Bp)控制表达红色荧光蛋白基因mCherry表达为例，构建反映胞内核糖体生物发生活跃程度的荧光监测体系，具体构建过程如下：
1.重组质粒pNRL6的构建
为了构建适于酿酒酵母实验室菌株(单倍体)和工业菌株(二倍体或多倍体)表达质粒，我们首先将中生菌素抗性标记基因(Nat)的表达框连接至酿酒酵母附加体质粒pIYC04上，然后将pIYC04上的PGK1启动子替换为酿酒酵母核糖体蛋白基因RPL6B的启动子，并将红色荧光蛋白mCherry连接至RPL6B基因的启动子和CYC1终止子之间。
(1)中生菌素抗性基因Nat的扩增及连接
以质粒H-pJFE1-nat-pcut1为模板，利用引物NrsR-TEF1-F，序列如SEQ ID No:5所示(5’-AATCTAAGTTTTAATTACAAGCGGCCGCATGGGTACCACT CTTGACGACAC-3’)和NrsR-TEF1-R，序列如SEQ ID No:6所示(5’-GGCGAAGAATTGTTAATTAAGAGCTCTTAGGGGCAGGGCATGC-3’)扩增573bp左右带有同源臂的Nat基因Not I-TEF1p-NrsR-TEF1t-Sac I，PCR扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸5min。
利用限制性内切酶Not I和Sac I酶切质粒pIYC04，通过Gibson连接法将Nat基因连接至pIYC04的TEF1启动子和ADH1终止子之间，将连接液转化大肠杆菌DH5α，挑选在含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上生长的菌落，利用引物NrsR-F，序列如SEQ ID No:7所示(5’-ATGGGTACCACTCTTGACGACAC-3’)和ADH1t-R，序列如SEQ ID No:8所示(5’-GGAGACTTGACCAAACCTC-3’)进行菌落PCR验证，扩增到620bp左右的条带(如图1所示)，说明Nat基因表达框成功。将该转化子接至含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，得到带有Nat筛选标记的重组质粒pIYC04-Nat。
(2)红色荧光蛋白基因mCherry的扩增及连接
以质粒pMD-187为模板，利用引物PGK1p-mCherry-F，序列如SEQ ID No:9所示(5’-ATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAAGGATCCATGGC CATCATCAAGGAGTTC-3’)和PGK1p-mCherry-R，序列如SEQ ID No:10所示(5’-CCTATAGTGAGTCGTATTACTCACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’)扩增684bp左右带有同源臂的mCherry基因，PCR扩增条件为95℃预变性5min，95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸5min。
利用限制性内切酶BamHI酶切重组质粒pIYC04-Nat，通过Gibson连接法将红色荧光蛋白基因表达框mCherry连接至pIYC04-Nat的PGK1启动子和CYC1终止子之间，将连接液转化大肠杆菌DH5α，挑选在含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上生长的菌落，利用引物mCherry-F，序列如SEQ ID No:11所示(5’-GGCCATCATCAAGGAGTTCATG-3’)和CYC1t-R，序列如SEQ ID No:12所示(5’-CGGGCCCTATAGTGAGTCG-3’)进行菌落PCR验证，扩增到700bp左右的条带(如图2所示)，说明mCherry成功连接至pIYC04-Nat上。将该转化子接至含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，得到PGK1启动子控制mCherry表达的阳性对照质粒pNRPGK。
(3)核糖体蛋白基因RPL6B启动子的扩增及连接
以酿酒酵母BY4741的基因组DNA为模板，利用引物RPL6Bp-mCherry-F，序列如SEQID No:13所示(5’-TTTGAAGCTATGGTGTGTGCGCTGAAAAT AACAATAAATAAAATACAGTAAACTTTTTTAGCGG-3’)和RPL6Bp-mCherry-R，序列如SEQ ID No:14所示(5’-AACTCCTTGATG ATGGCCATTATCCTATCAGTATCTTATCTTATCTCTTCTTG-3’)进行PCR扩增，得到824bp左右的核糖体蛋白基因RPL6B启动子(RPL6Bp)，PCR扩增条件为95℃预变性5min，95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸5min。
利用限制性内切酶BamHI和Fse I酶切重组质粒pNRPGK，通过Gibson连接法将核糖体蛋白基因启动子RPL6Bp连接至pNRPGK，以使RPL6Bp替换PGK1p，将连接液转化大肠杆菌DH5α，利用引物RPL6Bp-F，序列如SEQ ID No:15所示(5’-GGTGTGTGCGCTGAAAATAAC-3’)和RPL6Bp-mCherry，序列如SEQ IDNo:16所示(5’-CATGAACTCCTTGATGATGGCC-3’)进行菌落PCR验证，扩增到860bp左右的条带(如图3所示)，说明。将该转化子接至含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒，得到酿酒酵母RPL6B基因的启动子控制mCherry表达的重组质粒pNRL6。
2.重组质粒在酿酒酵母实验室菌株BY4741中表达
将重组质粒pIYC04-Nat、pNRPGK与pNRL6分别转化酿酒酵母实验室菌株BY4741(EUROSCARF保藏中心)，利用含有SC-His的平板筛选转化子，挑选生长较好的菌落接种至SC-His培养基中，30℃培养，从酵母中反提质粒并验证这些质粒是否成功转化到BY4741中。将成功转化的菌株活化两次后转接至SC-His培养基中，调整起始OD600至0.2，待培养至对数前期时收集菌体，然后利用荧光显微镜观察转化子的红色荧光表达情况，结果如图4所示，转化负对照质粒pIYC04-Nat(没有连接mCherry基因)的菌株(BY4741-ep)没有观察到红色荧光，转化阳性对照质粒pNRPGK(PGK1启动子控制mCherry表达)的菌株BY4741-RPGK与转化pNRL6(以RPL6B启动子控制mCherry表达)的菌株BY4741-RL6均检测到红色荧光，说明RPL6B启动子可以成功启动mCherry的表达。另外，取1mL培养至对数前期的菌液，离心收集菌体，使用PBS缓冲液(pH7.0左右)洗涤，并重悬菌体，取200μL菌悬液至96孔荧光酶标板中，利用荧光酶标仪测定红色荧光强度(λEx＝579/10nm，λEm＝616/20nm)，结果如图5所示，BY4741-ep没有监测到红色荧光，BY4741-RL6的红色荧光强度接近BY4741-RPGK，说明RPL6B启动子可以控制mCherry的表达，RPL6B启动子的活性接近PGK1启动子的活性。
实施例2：核糖体生物发生监测体系的效果评价
1.监测酿酒酵母菌株在不同胁迫条件下的核糖体生物发生变化情况
将菌株BY4741-RL6接种至SC-His中，30℃培养，活化两次，将菌液转接至含有0、3和5mM香草醛的SC-His培养基中，调整起始OD600至0.2，待培养至对数前期时，取1mL菌液，离心并收集菌体，使用PBS缓冲液(pH7.0左右)洗涤，并重悬菌体，取200μL菌悬液至96孔荧光酶标板中，利用荧光酶标仪测定红色荧光强度，结果如图6所示，BY4741-RL6的红色荧光强度随着香草醛浓度的升高而逐渐下降，与酿酒酵母在香草醛环境胁迫下rRNA合成和核糖体蛋白基因表达下调结果一致(Shen et al.,2012)，说明RPL6B启动子对不同浓度的香草醛是有响应的，该监测体系可以反映酿酒酵母在胁迫条件下核糖体生物发生的变化情况。
2.监测不同遗传背景酿酒酵母菌株的核糖体生物发生情况从而判断菌株的耐受性
将重组质粒pNRL6分别转化至具有不同香草醛抗性的酿酒酵母工业菌株EMV-8(具有较高的香草醛抗性)和NAN-27(出发菌株)中，利用含有400mg/L中生菌素的YPD平板筛选转化子，挑选生长较好的菌落接种至含有400mg/L中生菌素的YPD培养基中，30℃培养，从酵母中反提质粒并验证质粒pNRL6是否成功转化至EMV-8和NAN-27中。将成功转化的菌株活化两次后转接至含有400mg/L中生菌素的YPD培养基中，调整起始OD600至0.2，待培养至对数前期时收集菌体，使用PBS缓冲液(pH7.0左右)洗涤，并重悬菌体，取200μL菌悬液至96孔荧光酶标板中，利用荧光酶标仪测定红色荧光强度，结果如图7所示，mCherry在EMV8中的表达活性低于在NAN-27中的表达活性，这与EMV-8和NAN-27菌株的RNA合成情况(图8)和转录组数据中RPL6B基因在EMV-8和NAN-27中的表达趋势都是一致的(Shen Y,Li H,Wang X,ZhangX,Hou J,Wang L,Gao N,Bao X.High vanillin tolerance ofan evolved Saccharomycescerevisiae strain owing to its enhanced vanillin reduction and antioxidativecapacity.J Ind Microbiol Biotechnol.2014,41(11):1637–1645.)，说明该监测体系可以反映EMV-8和NAN-27的RNA合成情况和核糖体蛋白的表达情况，在胁迫条件下该监测体系表达提高较显著的为耐受性较高的菌株。
3.监测不同酵母菌株核糖体生物发生从而判断菌株的核酸含量
将重组质粒pNRL6转化具有不同核酸含量的酿酒酵母工业菌株YM83(具有较高RNA含量，保藏编号为CGMCC No.25730)和Y03(低核酸含量菌株)中，利用含有400mg/L中生菌素的YPD平板筛选转化子，挑选生长较好的菌落接种至含有400mg/L中生菌素的YPD培养基中，30℃培养，从酵母中反提质粒并验证质粒pNRL6是否成功转化至YM83和Y03中。将成功转化的菌株活化两次后转接至含有400mg/L中生菌素的YPD培养基中，调整起始OD600至0.2，待培养至对数前期时收集菌体，使用PBS缓冲液(pH7.0左右)洗涤，并重悬菌体，取200μL菌悬液至96孔荧光酶标板中，利用荧光酶标仪测定红色荧光强度，结果如图9所示，mCherry在高核酸酵母YM83中的表达活性高于在Y03中的表达活性，这与YM83和Y03菌株的RNA合成情况与RPL6B基因在这两个菌株的转录水平趋势都是一致的(Wang,Y.,Xia,T.,Li,C.,Zeng,D.,Xu,L.,Song,L.,Yu,H.,Chen,S.,Zhao,J.,Bao,X.,2023.Promoting Nucleic AcidSynthesis in Saccharomyces cerevisiae through Enhanced Expression ofRrn7p,Rrn11p,IMPDH,and Pho84p.J.Agric.Food Chem.71(41),15224-15236.)，说明该监测体系可以反映YM83和Y03的RNA合成情况和核糖体蛋白的表达情况，该监测体系表达提高较显著的为核酸含量较高的菌株。
所述的酿酒酵母工业菌株YM83为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2022年09月16日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.25730。
Claims (9)
1.一种酿酒酵母核糖体生物发生监测体系，其特征在于，所述监测体系包括响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因启动子、报告基因、终止子。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母核糖体生物发生监测体系，其特征在于，所述的响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因的启动子序列至少包含以下基序RAAYCCRTRCATYY、RCAYCCRTRCATYY和GAAAATTTTC中的一种；所述的R为C或A；Y为G或T。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母核糖体生物发生监测体系，其特征在于，所述的响应RNA合成变化的核糖体蛋白基因的启动子序列选自RPL6B、RPS0B、RPS19A或RPS28A基因启动子中的一种以上；
启动子RPL6B序列如SEQ ID No: 1所示；
启动子RPS0B序列如SEQ ID No: 2所示；
启动子RPS19A序列如SEQ ID No: 3所示；
启动子RPS28A序列如SEQ ID No: 4所示。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母核糖体生物发生监测体系，其特征在于，所述的报告基因为红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因、β-葡萄糖苷酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因中的至少一种。
5.权利要求1所述的酿酒酵母核糖体生物发生监测体系在量化胁迫条件对酿酒酵母的影响程度中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的胁迫条件包括高糖、高温、高盐、高乙醇以及含有抑制物的条件。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抑制物包括弱酸类、呋喃醛类、酚类。
8.采用权利要求1-4任一所述的酿酒酵母核糖体生物发生监测体系筛选的酿酒酵母在制备核糖核酸、核苷酸、核苷酸衍生物及酵母抽提物生产中的应用。
9.采用权利要求1-4任一所述的酿酒酵母核糖体生物发生监测体系筛选的酿酒酵母在食品及生物燃料领域生产中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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