JP6452765B2 - 黄色ブドウ球菌感染および関連状態を治療および予防する方法 - Google Patents

Description

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１１年６月１９日出願の米国仮特許出願第６１／４９８，５９６号の利益を主張するものである。

発明の分野
本発明は、黄色ブドウ球菌感染および黄色ブドウ球菌関連状態をスクリーニング、治療、および予防する方法に関する。

発明の背景
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（"Ｓ．ａｕｒｅｕｓ"））は、人口の２５％超に片利共生的に定着する細菌である。重要なことに、この生物は、その初期の定着部位を破壊することができ、細菌性播種および疾患をもたらす。黄色ブドウ球菌は、院内感染の主な原因であり、感染性心内膜炎ならびに皮膚および軟組織感染の最も一般的な病原因子であり、食中毒の４つの主な原因のうちの１つである。総計で、黄色ブドウ球菌は、米国の病院内で年間１２０万人超の患者に感染している。ヒトの健康に対する黄色ブドウ球菌の脅威は、黄色ブドウ球菌感染に対する防御の最終手段とされる抗生物質、バンコマイシンに耐性のある菌株を含む、耐抗生物質菌株（すなわち、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）菌株）の出現によってさらに強調される。これらの事実は、この重要な病原体に対する新規の治療製剤の開発の重要性を強調する。

黄色ブドウ球菌は、この細菌が、異なる種類の免疫細胞、特に、身体の主要な防御システムを構成する白血球の亜種による攻撃を無力化し、かつそれに耐えることを可能にする多様な病原性因子および毒素を産生する。これらの病原性因子および毒素の産生は、黄色ブドウ球菌に感染状態を維持させる（Ｎｉｚｅｔ、"Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｈｏｗ Ｌｅａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｓｕｂｖｅｒｔ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｒｅｖｅａｌ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ，"Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０（１）：１３−２２（２００７）（非特許文献１）を参照のこと）。これらの病原性因子の中で、黄色ブドウ球菌は、２つの非関連性タンパク質またはサブユニットの相乗層状作用によって宿主防御細胞および赤血球の膜を損傷させる、いくつかの二成分性ロイコトキシンを産生する（Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａら、"Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ Ｆａｍｉｌｙ，"Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９（１１）：１６６１−１６７２（２００１）（非特許文献２）を参照のこと）。これらの二成分性ロイコトキシンの中で、γ−溶血素（ＨｌｇＡＢおよびＨｌｇＣＢ）ならびにパントンバレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）は、最も特徴的である。

哺乳類細胞に対するロイコシジンの毒性は、２つの成分またはサブユニットの作用を伴う。第１のサブユニットは、Ｓサブユニット（すなわち、「緩徐溶出」）と命名され、第２のサブユニットは、Ｆサブユニット（すなわち、「急速溶出」）と命名されている。ＳおよびＦサブユニットは、相乗的に作用して、単核細胞、大食細胞、樹状細胞、および好中球（集合的に食細胞として既知である）を含む白血球上に孔を形成する（Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａら、"Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ Ｆａｍｉｌｙ，"Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９（１１）：１６６１−１６７２（２００１）（非特許文献２）を参照のこと）。それによって二成分性毒素が標的細胞膜内に孔を形成するメカニズムは、完全には理解されていない。これらの毒素の作用の提案されたメカニズムは、多くの場合は受容体を通じてＳサブユニットが標的細胞膜に結合した後、ＦサブユニットがＳサブユニットに結合し、それによって、オリゴマーを形成し、その後、該オリゴマーは、標的細胞膜中に挿入するプレポアを形成することを含む（Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅら、"Ｔｈｅ Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ Ｐｏｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ Ｏｃｔａｍｅｒ Ｗｉｔｈ Ｆｏｕｒ ＬｕｋＦ Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｆｏｕｒ ＬｕｋＳ Ｓｕｂｕｎｉｔｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ａｒｏｕｎｄ ａ Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｘｉｓ，"Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉ．１４（１０）：２５５０−２５６１（２００５）（非特許文献３））。二成分性ロイコトキシンによって形成される孔は、典型的にはカチオン選択性である。孔形成は、溶解を介して細胞死を引き起こし、それは標的白血球の場合、カチオンの流入に起因する浸透不均衡の結果であると報告されている（Ｍｉｌｅｓら、"Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ Ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｔｏｘｉｎ Ｆｏｒｍｓ Ｌａｒｇｅ Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，"Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（２９）：８５１４−８５２２（２００１）（非特許文献４））。

ＰＶＬ（ロイコシジンＳ／Ｆ−ＰＶまたはＬｕｋＳＦ−ＰＶとしても既知である）ならびにγ溶血素（ＨｌｇＡＢおよびＨｌｇＣＢ）に加えて、黄色ブドウ球菌によって産生される二成分性ロイコトキシンのレパートリーとしては、ロイコシジンＥ／Ｄ（「ＬｕｋＥ／Ｄ」）、ロイコシジンＡ／Ｂ（「ＬｕｋＡＢ」）およびロイコシジンＭ／Ｆ（「ＬｕｋＭＦ」）が含まれることが既知である。したがって、これらの二成分性ロイコシジンのＳ型サブユニットとしては、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＣ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＳ−ＰＶ、ＬｕｋＡ、およびＬｕｋＭが挙げられ、またＦ型サブユニットとしては、ＨｌｇＢ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ−ＰＶ、ＬｕｋＢ、およびＬｕｋＦ'−ＰＶが挙げられる。黄色ブドウ球菌ＳおよびＦサブユニットは、ロイコシジン特異的ではない。すなわち、それらは互換的であり、したがって、他の二成分性の組み合わせが白血球内で機能的な孔を作製することを可能にし、ロイコトキシンのレパートリーを大いに増加させる（Ｍｅｙｅｒら、"Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ ａｎｄ Ｇａｍｍａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ Ｆ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７（１）：２６６−２７３（２００９）（非特許文献５））。

ＭＲＳＡ感染を治療するのに有効な療法を設計することは、特に困難である。メチシリンおよび関連する抗生物質に対する耐性に加えて、ＭＲＳＡは、マクロライド（例えば、エリトロマイシン）、βラクタマーゼ阻害因子の組み合わせ（例えば、ユナシン、アウグメンチン）、およびフルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン）、ならびにクリンダマイシン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘｉｓｏｌ）（Ｂａｃｔｒｉｍ）、およびリファンピンに対する著しいレベルの耐性を有することも見出されている。重篤な黄色ブドウ球菌感染の場合、臨床医は、静脈内投与バンコマイシンを最後の手段として用いてきた。しかしながら、バンコマイシンに対する黄色ブドウ球菌の耐性に関する報告も存在している。したがって、黄色ブドウ球菌感染に効果的に効く新規の治療を開発する必要がある。

本発明は、当該技術分野におけるこれらおよび他の制限の打開を対象とする。

Ｎｉｚｅｔ、"Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｈｏｗ Ｌｅａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｓｕｂｖｅｒｔ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｒｅｖｅａｌ Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ，"Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０（１）：１３−２２（２００７） Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａら、"Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｔａ−Ｂａｒｒｅｌ Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ａｌｐｈａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ Ｆａｍｉｌｙ，"Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９（１１）：１６６１−１６７２（２００１） Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅら、"Ｔｈｅ Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ Ｐｏｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ Ｏｃｔａｍｅｒ Ｗｉｔｈ Ｆｏｕｒ ＬｕｋＦ Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｆｏｕｒ ＬｕｋＳ Ｓｕｂｕｎｉｔｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ａｒｏｕｎｄ ａ Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｘｉｓ，"Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉ．１４（１０）：２５５０−２５６１（２００５） Ｍｉｌｅｓら、"Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ Ｂｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｔｏｘｉｎ Ｆｏｒｍｓ Ｌａｒｇｅ Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，"Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（２９）：８５１４−８５２２（２００１） Ｍｅｙｅｒら、"Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ Ｌｅｕｃｏｃｉｄｉｎ ａｎｄ Ｇａｍｍａ−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ Ｆ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７（１）：２６６−２７３（２００９）

本発明の第１の態様は、治療的に有効な量の単離されたロイコシジンＥ（ＬｕｋＥ）タンパク質もしくはそのポリペプチド、単離されたロイコシジンＤ（ＬｕｋＤ）タンパク質もしくはそのポリペプチド、またはそれらの組み合わせ、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。

本発明の別の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化する方法に関する。本方法は、本発明の組成物を、対象における黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化するのに有効な量で投与することを含む。

本発明の別の態様は、治療的に有効な量のＬｕｋＥ抗体、ＬｕｋＤ抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。

本発明の別の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を予防する方法に関する。本方法は、ＬｕｋＥ抗体、ＬｕｋＤ抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体を含む組成物を、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を予防するのに有効な量で投与することを含む。

本発明のさらに別の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を治療する方法に関する。本方法は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子の１つ以上を含む組成物を、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を治療するのに有効な量で投与することを含む。

本発明のさらに別の態様は、黄色ブドウ球菌感染の重症度を予測する方法に関する。本方法は、感染した対象由来の流体試料または組織試料を介して該対象から得られた黄色ブドウ球菌を培養することと、培養された黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ発現を定量化することとを含む。対象由来の試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの定量化された量は、ＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤをほとんど産生しないかまたは検出不可能な量のＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤを産生する対照試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの量と比較され、該比較に基づいて、黄色ブドウ球菌の重症度が予測される。

本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象を治療する方法に関する。本方法は、感染した対象由来の流体試料または組織試料を介して該対象から得られた黄色ブドウ球菌を培養することと、培養された黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ発現を定量化することとを含む。対象由来の試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの定量化された量は、ＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤをほとんど産生しないかまたは検出不可能な量のＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤを産生する対照試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの量と比較され、この比較に基づいて、対象にとって好適な治療が決定される。方法は、決定された好適な治療を対象に施して、黄色ブドウ球菌感染を治療することをさらに含む。

本発明の別の態様は、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子を特定する方法に関する。本方法は、細胞集団、ＬｕｋＥ／Ｄを含む調製物、および候補ＬｕｋＥ／Ｄ阻害因子を供給すること含む。細胞集団は、候補阻害因子の存在下および不在下で、ＬｕｋＥ／Ｄを含有する調製物に曝露され、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性が、候補阻害因子の存在下および不在下で測定される。候補阻害因子の存在下および不在下で測定された細胞毒性の量が比較され、この比較に基づいてＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子が特定される。

本発明の別の態様は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性孔形成の阻害因子を特定する方法に関する。本方法は、白血球の集団、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物、ならびに候補阻害因子を供給することを含む。白血球集団は、候補阻害因子の存在下および不在下で、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物に曝露され、白血球集団上の孔形成が、候補阻害因子の存在下および不在下で測定される。候補阻害因子の存在下および不在下で測定された孔形成の量が比較され、この比較に基づいてＬｕｋＥ／Ｄ媒介性孔形成の阻害因子が特定される。

本発明の別の態様は、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ白血球結合の阻害因子を特定する方法に関する。本方法は、白血球の集団、検出可能に標識されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物、ならびに候補阻害因子を供給することを含む。細胞集団は、候補阻害因子の存在下および不在下で、検出可能に標識されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物に曝露され、候補阻害因子の存在下および不在下で、白血球集団に結合している標識されたＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤが測定される。候補阻害因子の存在下および不在下で測定されたＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ白血球結合の量が比較され、その比較に基づいてＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ白血球結合の阻害因子が特定される。

黄色ブドウ球菌の病原体としての驚異的な成功は、一部には、宿主を傷つける因子の貯蔵を示すその能力に起因する。これらの因子の中には、それらが宿主細胞を死滅させることによって作用する、細胞外環境中へと分泌される多数の細菌タンパク質毒素がある。ロイコシジンＥ／Ｄ（ＬｕｋＥ／Ｄ）は、黄色ブドウ球菌によって産生される、特徴決定が十分でない毒素である。本明細書で示されるように、この毒素は、黄色ブドウ球菌感染から宿主を保護することに関与する重要な免疫細胞である宿主白血球を標的にし、かつ死滅させる。ＬｕｋＥ／Ｄが生体内での病原性に極めて重要であるという発見は、疾患過程におけるこの毒素の重要性を強調する。本明細書に説明されるように、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤによる免疫化は、黄色ブドウ球菌に対する中和抗体を発生させる。したがって、能動的および／または受動的ワクチン戦略は、黄色ブドウ球菌感染を予防する新規の治療戦略を提供する。それに加えて、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の直接的阻害は、黄色ブドウ球菌感染を有する個体を治療する新規の手段を提供する。
[本発明1001]
治療的に有効な量の単離されたＬｕｋＥタンパク質もしくはそのポリペプチド、単離されたＬｕｋＤタンパク質もしくはそのポリペプチド、またはそれらの組み合わせと、
薬学的に許容される担体と
を含む、組成物。
[本発明1002]
前記単離されたＬｕｋＥタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11のアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記単離されたＬｕｋＥポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11のアミノ酸残基48〜291を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
前記単離されたＬｕｋＤタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22のアミノ酸配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
前記単離されたＬｕｋＤポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22のアミノ酸残基46〜307を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
前記組成物の前記単離されたタンパク質またはそのポリペプチドが、免疫原性担体分子に連結されている、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
前記免疫原性担体分子が、免疫原性のタンパク質またはペプチドに共有結合または非共有結合で結合している、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
前記免疫原性担体分子が、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイログロブリン、肺炎球菌莢膜多糖、ＣＲＭ197、および髄膜炎菌性外膜タンパク質からなる群から選択される、本発明1006の組成物。
[本発明1009]
α溶血素抗原、プロテインＡ、血清型336多糖抗原、コアグラーゼ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、エラスチン結合タンパク質、ＭＨＣ類似タンパク質、多糖類細胞内接着、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、パントンバレンタインロイコシジン、ロイコシジンＡ、ロイコシジンＢ、ロイコシジンＭ、表皮剥脱毒素Ａ、表皮剥脱毒素Ｂ、Ｖ8プロテアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、リパーゼ、スタフィロキナーゼ、エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素−1、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−1→6グルコサミン、カタラーゼ、βラクタマーゼ、テイコ酸、ペプチドグリカン、ペニシリン結合タンパク質、走化性阻害タンパク質、補体阻害因子、Ｓｂｉ、5型抗原、8型抗原、リポテイコ酸、および、宿主分子を認識する微生物表面成分からなる群から選択される1つ以上のさらなる黄色ブドウ球菌抗原をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
アジュバントをさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1011]
前記アジュバントが、フラジェリン、フロイント完全または不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノール、イスコマトリックス、およびリポソームポリカチオンＤＮＡ粒子からなる群から選択される、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
対象における黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化する方法であって、
本発明1001の組成物を、該対象における黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化するのに有効な量で投与すること
を含む、方法。
[本発明1013]
前記組成物が、α溶血素抗原、プロテインＡ、血清型336多糖抗原、コアグラーゼ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、エラスチン結合タンパク質、ＭＨＣ類似タンパク質、多糖類細胞内接着、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、パントンバレンタインロイコシジン、ロイコシジンＡ、ロイコシジンＢ、ロイコシジンＭ、表皮剥脱毒素Ａ、表皮剥脱毒素Ｂ、Ｖ8プロテアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、リパーゼ、スタフィロキナーゼ、エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素−1、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−1→6グルコサミン、カタラーゼ、βラクタマーゼ、テイコ酸、ペプチドグリカン、ペニシリン結合タンパク質、走化性阻害タンパク質、補体阻害因子、Ｓｂｉ、5型抗原、8型抗原、リポテイコ酸、および、宿主分子を認識する微生物表面成分からなる群から選択される1つ以上のさらなる黄色ブドウ球菌抗原をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記組成物がアジュバントをさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記対象に、単離されたＬｕｋＥタンパク質、単離された免疫原性ＬｕｋＥフラグメント、単離されたＬｕｋＤタンパク質、単離された免疫原性ＬｕｋＤフラグメント、またはこれらの組み合わせを含む前記組成物の投与前、投与後、または投与と同時に、アジュバントを投与すること
をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1016]
前記投与が、前記対象における黄色ブドウ球菌に対する中和免疫応答を誘発する、本発明1012の方法。
[本発明1017]
前記黄色ブドウ球菌感染が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）感染である、本発明1012の方法。
[本発明1018]
前記投与が、経口で、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口で、皮下的に、静脈内注入で、動脈内注入で、筋肉内注入で、胸膜内で、腹腔内で、または粘膜への塗布によって行われる、本発明1012の方法。
[本発明1019]
前記投与を繰り返すことをさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1020]
前記対象が、幼児、若年者、成人、または高齢者である、本発明1012の方法。
[本発明1021]
前記対象が、免疫無防備状態の若年者、成人、または高齢者である、本発明1012の方法。
[本発明1022]
ロイコシジンＥ（ＬｕｋＥ）抗体、ロイコシジンＤ（ＬｕｋＤ）抗体、またはこれらの組み合わせと、
薬学的に許容される担体と
を含む、組成物。
[本発明1023]
ＬｕｋＥ抗体を含む、本発明1022の組成物。
[本発明1024]
前記ＬｕｋＥ抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11のアミノ酸配列中のエピトープを認識する、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
ＬｕｋＤ抗体を含む、本発明1022の組成物。
[本発明1026]
前記ＬｕｋＤ抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22のアミノ酸配列中のエピトープを認識する、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
1つ以上の中和抗体を含む、本発明1022の組成物。
[本発明1028]
α溶血素抗原、プロテインＡ、血清型336多糖抗原、コアグラーゼ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、エラスチン結合タンパク質、ＭＨＣ類似タンパク質、多糖類細胞内接着、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、パントンバレンタインロイコシジン、ロイコシジンＡ、ロイコシジンＢ、ロイコシジンＭ、表皮剥脱毒素Ａ、表皮剥脱毒素Ｂ、Ｖ8プロテアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、リパーゼ、スタフィロキナーゼ、エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素−1、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−1→6グルコサミン、カタラーゼ、βラクタマーゼ、テイコ酸、ペプチドグリカン、ペニシリン結合タンパク質、走化性阻害タンパク質、補体阻害因子、Ｓｂｉ、5型抗原、8型抗原、リポテイコ酸、および、宿主分子を認識する微生物表面成分からなる群から選択される1つ以上の黄色ブドウ球菌抗原を認識する1つ以上の抗体をさらに含む、本発明1022の組成物。
[本発明1029]
対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を治療または予防する方法であって、
本発明1022の組成物を、該対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を予防するのに有効な量で投与すること
を含む、方法。
[本発明1030]
抗感染剤、抗生物質、および抗菌物質からなる群から選択される作用物質を投与すること
をさらに含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記黄色ブドウ球菌感染がＭＲＳＡ感染またはＭＳＳＡ感染である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
前記黄色ブドウ球菌関連状態が、皮膚創傷および皮膚感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、敗血性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群から選択される、本発明1029の方法。
[本発明1033]
前記投与が、経口で、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口で、皮下的に、静脈内注入で、動脈内注入で、筋肉内注入で、胸膜内で、腹腔内で、または粘膜への塗布によって行われる、本発明1029の方法。
[本発明1034]
前記投与を繰り返すことをさらに含む、本発明1029の方法。
[本発明1035]
前記対象が、幼児、若年者、成人、または高齢者である、本発明1029の方法。
[本発明1036]
前記対象が、免疫無防備状態の若年者、成人、または高齢者である、本発明1029の方法。
[本発明1037]
対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を治療する方法であって、
ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子の1つ以上を含む組成物を、該対象における該黄色ブドウ球菌感染および／または該黄色ブドウ球菌関連状態を治療するのに有効な量で投与すること
を含む、方法。
[本発明1038]
前記阻害因子が、タンパク質もしくはペプチド阻害因子、核酸阻害因子、または小分子阻害因子である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子がＬｕｋＥ阻害因子である、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記ＬｕｋＥ阻害因子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11のアミノ酸配列中のエピトープを認識する抗体である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子がＬｕｋＤ阻害因子である、本発明1037の方法。
[本発明1042]
前記ＬｕｋＤ阻害因子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22のアミノ酸配列中のエピトープを認識する抗体である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子が、ＬｕｋＥ／Ｄ受容体拮抗物質を含む、本発明1037の方法。
[本発明1044]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子が、ＬｕｋＥとＬｕｋＤの相互作用を阻害する、本発明1037の方法。
[本発明1045]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子が、白血球の原形質膜へのＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄの結合を阻害する、本発明1037の方法。
[本発明1046]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子が、ＬｕｋＥ／Ｄオリゴマー複合体形成を阻止する、本発明1037の方法。
[本発明1047]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子が、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞孔を阻害する、本発明1037の方法。
[本発明1048]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子がシクロデキストリン化合物を含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子が、毒素リプレッサー（Ｒｏｔ）を誘発する作用物質である、本発明1037の方法。
[本発明1050]
抗感染剤、抗生物質、および抗菌物質からなる群から選択される作用物質を投与すること
をさらに含む、本発明1037の方法。
[本発明1051]
前記黄色ブドウ球菌感染がＭＲＳＡ感染またはＭＳＳＡ感染である、本発明1037の方法。
[本発明1052]
前記黄色ブドウ球菌関連状態が、皮膚創傷および皮膚感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、敗血性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群から選択される、本発明1037の方法。
[本発明1053]
前記投与が、経口で、吸入によって、鼻腔内滴下によって、局所的に、経皮的に、非経口で、皮下的に、静脈内注入で、動脈内注入で、筋肉内注入で、胸膜内で、腹腔内で、または粘膜への塗布によって行われる、本発明1037の方法。
[本発明1054]
前記投与を繰り返すことをさらに含む、本発明1037の方法。
[本発明1055]
前記対象が、幼児、若年者、成人、または高齢者である、本発明1037の方法。
[本発明1056]
前記対象が、免疫無防備状態の若年者、成人、または高齢者である、本発明1037の方法。
[本発明1057]
対象における黄色ブドウ球菌感染の重症度を予測する方法であって、
感染した該対象から得られた流体試料または組織試料由来の黄色ブドウ球菌を培養することと、
培養された該黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ発現または産生を定量化することと、
該対象由来の該試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの定量化された量を、ＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤをほとんど産生しないかまたは検出不可能な量のＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤを産生する対照試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの量と比較することと、
該比較に基づいて、該黄色ブドウ球菌感染の重症度を予測することと
を含む、方法。
[本発明1058]
前記定量化が、
前記培養された黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤタンパク質産生のレベルを測定すること
を含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記定量化が、
前記培養された黄色ブドウ球菌におけるｌｕｋＥおよび／またはｌｕｋＤ ｍＲＮＡ発現のレベルを測定すること
を含む、本発明1057の方法。
[本発明1060]
黄色ブドウ球菌感染を有する対象を治療する方法であって、
感染した該対象から得られた流体試料または組織試料由来の黄色ブドウ球菌を培養することと、
培養された該黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ発現または産生を定量化することと、
該対象由来の該試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの定量化された量を、ＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤをほとんど産生しないかまたは検出不可能な量のＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤを産生する対照試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの量と比較することと、
該比較に基づいて、該対象に好適な治療を決定することと、
決定された該治療を該対象に施して、該黄色ブドウ球菌感染を治療することと
を含む、方法。
[本発明1061]
前記定量化が、
前記培養された黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤタンパク質産生のレベルを測定すること
を含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記定量化が、
前記培養された黄色ブドウ球菌におけるｌｕｋＥおよび／またはｌｕｋＤ ｍＲＮＡ発現のレベルを測定すること
を含む、本発明1060の方法。
[本発明1063]
ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子を特定する方法であって、
細胞集団を供給することと、
ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物を供給することと、
候補阻害因子を供給することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で、該細胞集団を、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する該調製物に曝露することと、
曝露された該細胞の集団におけるＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性レベルを測定することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で測定されたＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性のレベルを比較することと、
該比較に基づいて、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子を特定することと
を含む、方法。
[本発明1064]
前記候補阻害因子の不在下と比較した、該候補阻害因子の存在下における前記ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性のレベルの減少により、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子が特定される、本発明1063の方法。
[本発明1065]
細胞毒性の標識マーカーを供給することと、
前記曝露の前、該曝露と同時に、または該曝露の後に、前記細胞集団を該細胞毒性の標識マーカーと接触させることと、
該細胞毒性の標識マーカーを検出することと、
該検出に基づいて、該細胞の集団におけるＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性レベルを測定することと
をさらに含む、本発明1063の方法。
[本発明1066]
前記細胞毒性の標識マーカーが、細胞生死判別色素、細胞非透過性色素、および／または、細胞溶解のマーカーである、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記細胞集団が白血球の集団を含む、本発明1063の方法。
[本発明1068]
ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性孔形成の阻害因子を特定する方法であって、
白血球の集団を供給することと、
ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物を供給することと、
候補阻害因子を供給することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で、該白血球集団を、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する該調製物に曝露することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で、該白血球集団における孔形成を測定することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で測定された孔形成の量を比較することと、
該比較に基づいて、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性孔形成の阻害因子を特定することと
を含む、方法。
[本発明1069]
前記候補阻害因子の不在下と比較した、該候補阻害因子の存在下における孔形成の減少により、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性孔形成の阻害因子が特定される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ−白血球結合の阻害因子を特定する方法であって、
白血球の集団を供給することと、
検出可能に標識されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物を供給することと、
候補阻害因子を供給することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で、細胞集団を、該検出可能に標識されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する該調製物に曝露することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で、該白血球集団に結合している標識されたＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤを測定することと、
該候補阻害因子の存在下および不在下で測定されたＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ−白血球結合の量を比較することと、
該比較に基づいて、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ−白血球結合の阻害因子を特定することと
を含む、方法。
[本発明1071]
前記候補阻害因子の不在下と比較した、該候補阻害因子の存在下におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ−白血球結合の減少により、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ−白血球結合の阻害因子が特定される、本発明1070の方法。

図１Ａおよび１Ｂは、ａｇｒ遺伝子座を欠損する黄色ブドウ球菌内のｒｏｔ遺伝子の欠失（ΔａｇｒΔｒｏｔ）が、マウスにおける病原性を野生型（「ＷＴ」）レベルに回復し、またＬｕｋＥ／Ｄの過剰産生をもたらすことを示す。図１Ａは、ΔａｇｒΔｒｏｔ二重変異体が、マウスにおいてＷＴ病原性特徴を呈することを示す生存率曲線である。マウスの生存率を、約１×１０^７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌ＷＴ、Δａｇｒ、またはΔａｇｒΔｒｏｔ二重変異体の静脈内注入後に監視した。一群あたりのマウスの総数はＮ＝６であった。曲線間の統計的有意性は、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験を用いて決定した。＊＊＊，ｐ≦０．０００５。図１Ｂでは、ロイコトキシンの産生が、ΔａｇｒΔｒｏｔ二重変異体において回復されている。次の菌株：ＷＴ、Δａｇｒ、およびΔａｇｒΔｒｏｔの、ＴＣＡ沈殿細菌培養上清（ＲＰＭＩ＋ＣＡＳ内で５時間成長させた）由来のタンパク質試料の免疫ブロットが図示される。陰性対照レーンは、それぞれのロイコトキシン欠失変異体（ΔｌｕｋＥ／Ｄ、ΔｌｕｋＡ／Ｂ、Δｈｌａ、ΔｈｌｇＣ）由来のＴＣＡ沈殿上清を含む。ΔｌｕｋＥ／ＤΔｈｌｇＡＣＢ二重変異体細胞外タンパク質も同様に、ＬｕｋＥ抗体交差反応に対する対照として、全てのＬｕｋＥ免疫ブロットにおいて調査した。 図２Ａ〜２Ｃは、ｒｏｔ単独の欠失が、動物における高い病原性、抑制解除、および、結果として生じたＬｕｋＥ／Ｄの過剰産生によって引き起こされる表現型をもたらすことを例証する。図２Ａの生存率曲線は、親ＷＴ菌株と比較したΔｒｏｔ変異体の高い病原性を示す。マウスの生存率を、約１×１０^７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌ＷＴおよびΔｒｏｔ菌株の静脈内注入後に監視した。一群あたりのマウスの総数ＷＴ、Ｎ＝１７；Δｒｏｔ、Ｎ＝１２。ＬｕｋＥ／Ｄの産生は、転写リプレッサーＲｏｔの不在下で増大され、一方、他のロイコトキシンの産生は、概して影響を受けていない。次の菌株：ＷＴおよびΔｒｏｔの、ＴＣＡ沈殿細菌培養上清（ＲＰＭＩ＋ＣＡＳ内で５時間成長させた）由来のタンパク質試料が、図２Ｂの免疫ブロットに示される。陰性対照レーンは、それぞれの毒素−ｒｏｔ二重変異体（ΔｒｏｔΔｌｕｋＥ／Ｄ、ΔｒｏｔΔｌｕｋＡ／Ｂ、ΔｒｏｔΔｈｌａ、およびΔｒｏｔΔｈｌｇＡＣＢ）由来のＴＣＡ沈殿上清を含む。ΔｒｏｔΔｌｕｋＥ／ＤΔｈｌｇＡＣＢ三重変異体細胞外タンパク質も同様に、ＬｕｋＥ抗体交差反応に対する対照として、全てのＬｕｋＥ免疫ブロットにおいて調査した。図２Ｃの生存率曲線によって示されるように、Δｒｏｔ変異体の高い病原性は、ＬｕｋＥ／Ｄの増大された産生に起因する。マウスの生存率を、約１×１０^７ＣＦＵの黄色ブドウ球菌ＷＴ、Δｒｏｔ、およびΔｒｏｔΔｌｕｋＥ／Ｄの静脈内注入後に監視した。生存率曲線間の統計的有意性を、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験を用いて決定した。＊＊，ｐ≦０．００５、＊＊＊，ｐ≦０．０００５。 図３Ａおよび３Ｂは、Ｒｏｔが、ｌｕｋＥ／Ｄプロモータに結合し、遺伝子発現を抑制することを示す。図３Ａに示されるように、最適なｌｕｋＥ／Ｄ遺伝子発現は、Ｒｏｔの抑制解除に依存する。ＧＦＰに対するｌｕｋＥ／Ｄプロモータ領域の転写融合体を使用して、次の菌株バックグランド（ＷＴ、Δａｇｒ、Δｒｏｔ、およびΔａｇｒΔｒｏｔ）におけるブロス培養中のプロモータの活性化を測定した。ＧＦＰ蛍光を、経時的に測定し、６００ｎｍにおける細菌光学密度に対する正規化後、それぞれの蛍光単位（ＲＦＵ）として値を表した。示される値は、３通りで実施された３つの実験の結果である。図３Ｂでは、Ｒｏｔは、ｌｕｋＥ／Ｄプロモータに結合する。図３Ｂは、ビオチン化遺伝子内ＤＮＡ（非特異的）か、Ｍ２８０ストレプトアビジン磁気ビーズに結合し、かつ黄色ブドウ球菌全細胞溶解物と共にインキュベートされたｌｕｋＥ／ＤプロモータＤＮＡかのいずれかの、プロモータプルダウンの免疫ブロットである。Ｒｏｔを、抗Ｒｏｔ抗体を用いて免疫ブロットを介して検出した。 図４Ａ〜４Ｆは、ΔｌｕｋＥ／Ｄ単一変異体が、全身感染のマウスモデルにおける病原性に対して著しく弱毒化されることを例証する。図４Ａおよび４Ｂは、黄色ブドウ球菌ＮｅｗｍａｎにおけるｌｕｋＥ／Ｄ欠失の根拠を示す。図４Ａでは、ｌｕｋＥ特異的プライマーを伴う黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡのＰＣＲが示される。図４Ｂには、次の菌株：ＷＴ、ΔｌｕｋＥ／Ｄ、ΔｌｕｋＥ／Ｄ：：ｐｌｕｋＥ／Ｄ、ΔｈｌｇＡＣＢ、およびΔｈｌｇＡＣＢの、ＴＣＡ沈殿細菌培養上清（ＲＰＭＩ＋ＣＡＳ内で５時間成長させた）由来のタンパク質試料の免疫ブロットが示される。ΔｌｕｋＥ／Ｄ変異体細胞外タンパク質も同様に、ＬｕｋＥ抗体交差反応に対する対照として調査した。図４Ｃ〜４Ｆは、ΔｌｕｋＥ／Ｄ変異体は、マウスにおける病原性に対して重度に損なわれることを示す。図４Ｃおよび４Ｄでは、マウスの生存率を、約１×１０^７ＣＦＵ（図４Ｃ）または約１×１０^８ＣＦＵ（図４Ｄ）の黄色ブドウ球菌ＷＴ、ΔｌｕｋＥ／Ｄ、およびΔｌｕｋＥ／Ｄ：：ｐｌｕｋＥ／Ｄ菌株の静脈内注入後に監視した。一群あたりのマウスの総数は、Ｎ＝６であった。生存率曲線間の統計的有意性を、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験を用いて決定した。＊＊，ｐ≦０．００５、＊＊＊，ｐ≦０．０００５。図４Ｅおよび４Ｆは、図４Ｃおよび４Ｄで説明される菌株と同一の菌株の約１×１０^７ＣＦＵでの感染から９６時間後の腎臓由来の細菌性ＣＦＵ（図４Ｅ）と肉眼所見（図４Ｆ）との列挙を示す。矢印は、腎臓膿瘍の場所を指す。統計的有意性を、Ｔｕｋｅｙの多重比較ポストテストによる一元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定した。＊＊，ｐ≦０．００５、＊＊＊，ｐ≦０．０００５。 図５Ａ〜５Ｅは、ＬｕｋＥ／Ｄが、ヒト免疫細胞に対して毒性であり、ヒト免疫細胞内に孔を形成することを示す。図５Ａは、精製された組み換えＬｕｋＥ／Ｄが、ヒト単核細胞様細胞株ＴＨＰ−１に対して毒性であることを示す細胞生存性曲線である。ＴＨＰ−１細胞株は、組み換えＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤ混合物（ＬｕｋＥ／Ｄ）で中毒化された。細胞生存性を、培地で処理した細胞を１００％生存率に設定したＣｅｌｌＴｉｔｅｒを用いて、中毒の１時間後に監視した。結果は、３通りの試料の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。図５Ｂの細胞生存性曲線に示されるように、精製された組み換えＬｕｋＥ／Ｄは、ヒトＨＬ６０細胞株に対して毒性ではない。ＨＬ６０細胞株を、上述のように中毒化し、細胞生存性を、培地で処理した細胞を１００％生存率に設定したＣｅｌｌＴｉｔｅｒを用いて、中毒の１時間後に監視した。対照的に、図５Ｃの細胞生存性曲線は、精製された組み換えＬｕｋＥ／Ｄは、一次ヒト（左のグラフ）と一次ネズミ（右のグラフ）好中球（多形核好中球またはＰＭＮとしても既知である）の両方に対して毒性であることを示す。ＰＭＮを、上述のように中毒化し、細胞生存性を、培地で処理した細胞を１００％生存率に設定したＣｅｌｌＴｉｔｅｒを用いて、中毒の１時間後に監視した。図５Ｄに示される通り、ＬｕｋＥ／Ｄは、細胞膜内に孔を形成することによって、宿主細胞ＴＨＰ−１細胞に対する細胞毒性を媒介する。ＴＨＰ−１およびＨＬ６０細胞を、精製されたＬｕｋＥ／Ｄと共にインキュベートし、孔形成を、臭化エチジウム取り込み分析で測定した。ＴＨＰ−１およびＨＬ６０の両方に対して、３通りの実験の平均蛍光を示す。図５Ｅは、処理されたＬｕｋＥ／Ｄ（３０μｇ／ｍｌ）と対照（毒素無し）ＴＨＰ−１細胞との臭化エチジウム摂取の蛍光顕微鏡画像を示す。 図６Ａおよび６Ｂが、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性は、アフィニティー精製されたα−ＬｕｋＥポリクローナル抗体で中和されることを例証する。ＴＨＰ−１細胞を、１．５μｇの組み換えＬｕｋＥ／Ｄで中毒化させ、次に、０．１μｇのα−ＬｕｋＥポリクローナル抗体または免疫前血清と共にインキュベートした。細胞生存性（図６Ａ）および孔形成（図６Ｂ）を、それぞれ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒおよび臭化エチジウムを用いて監視した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ分析に関して、培地で処理した細胞を、１００％生存率に設定した。結果は、２通りの試料の平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。

発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、治療的に有効な量の単離されたＬｕｋＥタンパク質もしくはそのポリペプチド、単離されたＬｕｋＤタンパク質もしくはそのポリペプチド、またはそれらの組み合わせ、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。

本発明の一実施形態では、組成物は、単離されたＬｕｋＥタンパク質またはポリペプチドを含む。本発明の別の態様では、組成物は、単離されたＬｕｋＤタンパク質またはポリペプチドを含む。本発明のまた別の実施形態では、組成物は、ＬｕｋＥタンパク質またはポリペプチドとＬｕｋＤタンパク質またはポリペプチドの両方を含む。

本発明の本態様によると、好適な単離されたＬｕｋＥタンパク質には、黄色ブドウ球菌の任意の菌株に由来するものが挙げられる。本発明の組成物に好適な黄色ブドウ球菌の様々な菌株に由来するＬｕｋＥタンパク質のアミノ酸配列は、下の表１に示される（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１０）。表１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、様々な黄色ブドウ球菌株のＬｕｋＥタンパク質にわたる高レベルの配列同一性を実証するＬｕｋＥ共通配列である。したがって、本発明の一実施形態では、単離されたＬｕｋＥタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態では、単離されたＬｕｋＥタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と約７０〜８０％の配列類似性、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と約８０〜９０％の配列類似性、またより好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と９０〜９５％の配列類似性、かつ最も好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と約９５〜９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の別の実施形態では、組成物は、ＬｕｋＥの単離された免疫原性ポリペプチドを含む。好適なＬｕｋＥポリペプチドは、約５０〜約１００アミノ酸長である。より好ましくは、ＬｕｋＥポリペプチドは、約１００〜２００アミノ酸長、より好ましくは約２００〜２５０アミノ酸長、また最も好ましくは２５０〜３００アミノ酸長である。全長ＬｕｋＥのＮ末端アミノ酸残基は、天然の分泌／シグナル配列を表す。したがって、ＬｕｋＥの「成熟」分泌型は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のそれぞれにおけるアミノ酸残基２９〜３１１によって表される。それに対応して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のそれぞれのアミノ酸残基１〜３１１は、ＬｕｋＥの「未成熟」型と称される。したがって、本発明の一実施形態では、ＬｕｋＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基２９〜３１１を含む。別の方法として、本発明のＬｕｋＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基４８〜２９１、アミノ酸２９〜３０１、またはアミノ酸４８〜３０１を含む。これらのＬｕｋＥポリペプチドは、ＬｕｋＥ活性を欠損しているが、抗原性は維持する。いずれの場合でも、好適なＬｕｋＥポリペプチドとしては同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基２９〜３１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基４８〜２９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基２９〜３０１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基４８〜３０１に対して、約７０〜８０％の配列類似性、好ましくは８０〜９０％の配列類似性、より好ましくは９０〜９５％の配列類似性、かつ最も好ましくは９５〜９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。

本発明の本態様によると、好適な単離されたＬｕｋＤタンパク質には、黄色ブドウ球菌の任意の菌株に由来するタンパク質が挙げられる。本発明の組成物に好適な黄色ブドウ球菌の様々な菌株に由来するＬｕｋＤタンパク質のアミノ酸配列は、下の表２に示される（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜２１）。表２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は、様々な黄色ブドウ球菌株のＬｕｋＤタンパク質にわたる高レベルの配列同一性を実証するＬｕｋＤ共通配列である。したがって、本発明の一実施形態では、単離されたＬｕｋＤタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態では、単離されたＬｕｋＤタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に対して約７０〜８０％の配列類似性、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に対して約８０〜９０％の配列類似性、またより好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に対して９０〜９５％の配列類似性、また最も好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に対して約９５〜９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の別の実施形態では、組成物は、ＬｕｋＤの単離された免疫原性ポリペプチドを含む。好適なＬｕｋＤポリペプチドは、約５０〜約１００アミノ酸長である。より好ましくは、ＬｕｋＤポリペプチドは、約１００〜２００アミノ酸長、より好ましくは約２００〜２５０アミノ酸長、また最も好ましくは２５０〜３００アミノ酸長である。全長ＬｕｋＤのＮ末端アミノ酸残基は、天然の分泌／シグナル配列を表す。したがって、ＬｕｋＤの成熟分泌型は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜２１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のそれぞれにおけるアミノ酸残基２７〜３２７によって表される。それに対応して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２〜２１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基１〜３２７は、ＬｕｋＤの「未成熟」型と称される。したがって、本発明の一実施形態では、ＬｕｋＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基２７〜３２７を含む。別の方法として、本発明のＬｕｋＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３０７、２７〜３１２、および４６〜３１２を含む。これらのＬｕｋＤポリペプチドは、ＬｕｋＤ活性を欠損しているが、抗原性は維持する。いずれの場合にも、好適なポリペプチドとして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基２７〜３２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３０７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基２７〜３１２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３１２に対して、約７０〜８０％の配列類似性、好ましくは８０〜９０％の配列類似性、より好ましくは９０〜９５％の配列類似性、かつ最も好ましくは９５〜９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。

（表１）黄色ブドウ球菌ＬｕｋＥ配列アラインメント

→は、分泌されたＬｕｋＥタンパク質の開始を示す

（表２）ＬｕｋＤアミノ酸配列アラインメント

→は、分泌されたＬｕｋＤタンパク質の開始を示す

したがって、別途示されない限り、天然のＬｕｋＥおよびＬｕｋＤの未成熟型と成熟型の両方、ならびに天然のＬｕｋＥおよびＬｕｋＤと１００％未満の類似性を有する配列（すなわち、天然配列および同様の類似体、本明細書で集合的に「ＬｕｋＥ」および「ＬｕｋＤ」と称される）が、本発明の方法に使用され得る。

本発明のＬｕｋＥおよびＬｕｋＤタンパク質およびポリペプチドは、１つ以上の追加のアミノ酸挿入、置換、または欠失、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２２内の１つ以上のアミノ酸残基が、機能的等価物として作用し、サイレント変化をもたらす、類似の極性の別のアミノ酸によって置換されることができるという点で、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１１および１２〜２２として称される天然ポリペプチドと異なる。すなわち、天然配列に関連する変化は、天然のＬｕｋＥまたはＬｕｋＤの基本的特性を明らかに減少はしないと考えられる。ＬｕｋＥまたはＬｕｋＤの任意のかかる類似体は、天然のＬｕｋＥまたはＬｕｋＤの活性を維持しているかを決定するために、本明細書に開示のプロトコール（例えば、細胞毒性分析および膜損傷分析）に従ってスクリーニングされることができる。これらのロイコシジン内の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから、選択されてもよい。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。中極性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。

他の実施形態では、非保存的変更（例えば、１つまたはアミノ酸置換、欠失、および／または追加）が、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤを無毒化する目的のために行われ得る。無毒化されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤは、活性ワクチン組成物に使用されてもよい。分子変更は、単一標準鋳型（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８２：４８８−４９２（１９８５）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、二重標準ＤＮＡ鋳型（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰａｐｗｏｒｔｈらのＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ９（３）：３−４（１９９６））を用いて、またＰＣＲクローニング（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．（ｅｄ．），ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，２ｎｄ ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００２））によって、プラスミド鋳型上のプライマー伸長を含む、当該技術分野において周知の方法によって達成することができる。ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤにおける所与の分子変更が、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性を低下させかを決定する方法は、本明細書に説明される。

本発明の好ましい実施形態では、高度に精製されたＬｕｋＥ／ＬｕｋＤ調製物が用いられる。例としては、表１および２に例示される様々な菌株から精製されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤタンパク質またはポリペプチドが挙げられる。ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤ 毒素を精製する方法は、当該技術分野において既知である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒａｖｅｔらの"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｅｍｂｅｒ，ＬｕｋＥ−ＬｕｋＤ，ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｌｅｕｃｏｔｏｘｉｎｓ Ｆａｍｉｌｙ，"ＦＥＢＳ４３６：２０２-２０８（１９９８））。本明細書で使用される「単離された」タンパク質またはポリペプチドは、それが天然に会合される他のタンパク質、脂質、および核酸から分離されているタンパク質またはポリペプチドを指す。純度は、任意の適切な標準方法、例えば、ＨＰＬＣ分析のカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定することが可能である。本発明の単離されたタンパク質またはポリペプチドは、組み換えＤＮＡ技術によって、または化学的方法によって生産される天然の供給源から精製され得る。

本発明の本態様の一実施形態では、組成物の単離されたＬｕｋＥまたはＬｕｋＤタンパク質またはそのポリペプチドは、免疫原性担体分子に連結されている。場合によっては、免疫原性担体分子は、免疫原性のタンパク質またはペプチドに共有結合または非共有結合で結合してもよい。例示的な免疫原性担体分子としては、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイログロブリン、肺炎球菌莢膜多糖、ＣＲＭ１９７、および髄膜炎菌性外膜タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の特定の実施形態では、組成物は、１つ以上のさらなる黄色ブドウ球菌抗原をさらに含有してもよい。好適な黄色ブドウ球菌抗原としては、α溶血素抗原、プロテインＡ、血清型３３６多糖抗原、コアグラーゼ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、エラスチン結合タンパク質、ＭＨＣ類似タンパク質、多糖類細胞内接着、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、パントンバレンタインロイコシジン、ロイコシジンＡ、ロイコシジンＢ、ロイコシジンＭ、表皮剥脱毒素Ａ、表皮剥脱毒素Ｂ、Ｖ８プロテアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、リパーゼ、スタフィロキナーゼ、エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素−１、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−１→６グルコサミン、カタラーゼ、βラクタマーゼ、テイコ酸、ペプチドグリカン、ペニシリン結合タンパク質、走化性阻害タンパク質、補体阻害因子、Ｓｂｉ、５型抗原、８型抗原、リポテイコ酸、および、宿主タンパク質を認識する微生物表面タンパク質（例えば、鉄表面決定基、セリン−アスパラギン酸リピートタンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の本態様によると、組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含んでもよい。好適なアジュバントは当該技術分野において既知であり、フラジェリン、フロイント完全または不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノール、イスコマトリックス、およびリポソームポリカチオンＤＮＡ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。

治療的組成物が活性ワクチンとしての使用のために意図される実施形態では、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤタンパク質またはポリペプチドは、低下した毒性を示すように変更されてもよい。ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤの毒性を低下させる目的のための変更としては、化学的処理（例えば、上述の特定のアミノ酸残基の改質）または別の部分（例えば、細菌多糖類または細菌糖タンパク質等の別の細菌抗原）へのコンジュゲートが挙げられる。無毒化（または毒性の低下）の目的のための他の黄色ブドウ球菌毒素への化学的変更は、既知である。所与の変更が、ＬｕｋＥまたはＬｕｋＤ毒性を低下させたかを決定する方法は、当該技術分野において既知であり、および／または本明細書に説明される。

本発明の治療的組成物は、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを、薬学的に許容される担体、および所望により薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することによって調整される。本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」および「薬学的に許容される賦形剤」（例えば、希釈剤、免疫刺激剤、アジュバント、抗酸化剤、防腐剤、および可溶化剤等の添加剤）は、用いられる用量および濃度において、それに曝露される細胞または哺乳類に非毒性である。薬学的に許容される担体の例としては、例えば、ホスフェート、シトレート、および別の有機酸で緩衝化された水が挙げられる。本発明において有用な可能性がある薬学的に許容される賦形剤の代表的な例としては、例えば、アスコルビン酸等の抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質、アジュバント（アジュバント誘発性毒性を回避するように選択される、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５５，６２５号に説明されるβ−グルカン、もしくは顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ））、例えば、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、例えば、マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール、例えば、ナトリウム等の塩形成対イオン、ならびに／または例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本発明の治療的組成物は、所望の度合いの純度を有する活性材料を、薬学的に許容される担体ならびに任意の賦形剤および／またはさらなる活性物質と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形式で保管用に調製されてもよい。

本発明の別の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化する方法に関する。本方法は、本発明の組成物を、対象における黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化するのに有効な量で投与することを含む。本発明の本態様による治療に好適な対象は、黄色ブドウ球菌感染を発症する危険性のある対象である。

本発明の本態様によると、黄色ブドウ球菌感染に対して免疫化するための対象への投与のための組成物の治療的に有効な量は、体液性（すなわち、抗体媒介性）免疫応答を発生させるのに必要な量である。好ましくは、治療的に有効な量の本発明の組成物の投与は、対象における黄色ブドウ球菌に対する中和免疫応答を誘発する。対象における有効な免疫応答を達成するため、組成物は、上述に説明される、１つ以上のさらなる黄色ブドウ球菌抗原、またはアジュバントをさらに含有してもよい。本発明の本態様の代替的実施形態では、アジュバントは、本発明の組成物の投与前、投与後、または投与と同時に、組成物と別々に対象に投与される。

本発明の本態様に関する投与および治療的に有効な投薬の様式は、以下に説明される。

本発明の別の態様は、ロイコシジンＥ（ＬｕｋＥ）抗体、ロイコシジンＤ（ＬｕｋＤ）抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される治療的に有効な量の抗体、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。

本発明の本態様の一実施形態では、組成物は、ＬｕｋＥ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。好適なＬｕｋＥ抗体としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列中の１つ以上のエピトープを認識する抗体が挙げられる。同様に、別の実施形態では、組成物は、ＬｕｋＤ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。好適なＬｕｋＤ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列中の１つ以上のエピトープを認識する。本発明の別の実施形態では、組成物は、ＬｕｋＥとＬｕｋＤ抗体の両方、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。好ましくは、組成物は、１つ以上のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ中和抗体を含む。また別の実施形態では、抗ＬｕｋＥおよび／または抗ＬｕｋＤ抗体組成物は、多価であり、すなわち、別の細菌抗原に特異的に結合する（および、所望により他の細菌抗原を中和する）抗体も含有する。例えば、組成物は、上述に説明される黄色ブドウ球菌抗原のうちの１つ以上を含むがそれに限定されない、１つ以上のさらなる黄色ブドウ球菌抗原を認識する１つ以上の抗体を含んでもよい。

本発明の目的に関して、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、抗体の遺伝子組み換え形態、およびそれらの組み合わせを含む。より具体的には、用語「抗体」は、用語「免疫グロブリン」と互換的に使用され、全長（すなわち、天然に発生するか、または正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメント組み換え過程によって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）およびその免疫学的に活性なフラグメント（すなわち、全長免疫グロブリン分子の特異的結合部分を含む）を含み、それらはまた天然に発生し得るか、または天然の合成物質であり得る。したがって、用語「抗体フラグメント」は、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等の抗体の一部分を含む。構造に関わらず、抗体フラグメントは、全長抗体によって認識される同一の抗原と結合し、本発明の文脈においては、特にＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄ複合体と結合する。抗体フラグメントを作製およびスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知である。

本発明において、抗ＬｕｋＥ抗体は、ＨｌｇＣ、ＬｕｋＳ−ＰＶＬ、ＨｌｇＡ、ＬｕｋＳ−Ｉ、ＬｕｋＡ、およびＬｕｋＭ等の他のブドウ球菌ロイコシジンＳサブユニットとのいくらかの交差反応を有することができる。同様に、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＬｕｋＤ抗体は、ＬｕｋＦ'−ＰＶ、ＬｕｋＦ−ＰＶ、ＬｕｋＢ、ＬｕｋＦ−Ｉ、およびＨｌｇＢ等の他のブドウ球菌ロイコシジンＦ−サブユニットとのいくらかの交差反応を有することができる。抗ＬｕｋＥおよび／または抗ＬｕｋＤ抗体は、それぞれ、ＬｕｋＥ活性およびＬｕｋＤ活性を阻害するかまたは低下させることができる。いくつかの実施形態では、抗ＬｕｋＥおよび／または抗ＬｕｋＤ抗体は、それぞれ、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤ活性を中和する（例えば、実質的に排除する）。

天然に発生する抗体は典型的には、各軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合で連結されている、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖とを有し、かつ、複数のジスルフィド結合は、２つの重鎖を互いにさらに連結する。個々の鎖は、同様の寸法（１１０〜１２５アミノ酸）および構造を有するが異なる機能を有するドメインに、折り畳まれることができる。軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および／または１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含むことができ、重鎖もまた、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および／または、抗体のクラスまたはアイソタイプに応じて、３つもしくは４つの定常ドメイン（ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含むことができる。ヒトの場合、アイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１〜２およびＩｇＧ１〜４）に分けられる。

概して、可変ドメインは、特に、抗原結合部位において、ある抗体から次の抗体への相当なアミノ酸配列可変性を示す。高度可変性領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域が、ＶＬおよびＶＨのそれぞれに見出され、それらはフレームワーク可変領域と呼ばれる可変性の少ない領域によって支持される。本発明の抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体、および抗体フラグメントまたは改変された形態を含む。これらは、例えば、Ｆｖフラグメント、または例示の抗体のＣＤＲおよび／もしくは可変ドメインが、単鎖抗原結合タンパク質として改変されるタンパク質である。

ＶＬおよびＶＨドメインからなる抗体の部分は、Ｆｖ（可変フラグメント）と称され、抗原結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖまたはＳＣＡ）は、１つのポリペプチド鎖上にＶＬドメインとＶＨドメインとを含有する抗体フラグメントであり、１つのドメインのＮ末端と他のドメインのＣ末端とが、可撓性リンカーによって接合される。単鎖抗体を産生するために使用されるペプチドリンカーは、典型的には、ＶＬドメインおよびＶＨドメインの適切な三次元の折り畳みが発生することを確実にするように選択される、可撓性ペプチドである。リンカーは概して、１０〜５０個のアミノ酸残基であり、また例えば、約１０〜３０個のアミノ酸残基、または１２〜３０個のアミノ酸残基、またさらには１５〜２５個のアミノ酸残基等、より短い場合もある。かかるリンカーペプチドの例としては、１つのセリン残基が続く４つのグリシン残基の反復が挙げられる。

単鎖抗体は、それらが由来する全抗体の定常ドメインの、一部または全部を欠損する。したがって、単鎖抗体は、全抗体の使用に関連する問題のいくつかを打開することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生体分子との間の特定の望ましくない相互作用を含まない傾向がある。それに加えて、単鎖抗体は、全抗体よりもはるかに小さく、全抗体よりも大きい透過性を有し得、単鎖抗体が局在化し、かつ標的抗原結合部位により効率的に結合することを可能にする。さらに、相対的に小型の単鎖抗体は、全抗体よりも、受容者における不慮の免疫応答を引き起こしにくくする。

Ｆａｂ（抗原結合フラグメント）とは、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１ドメインからなる抗体のフラグメントを指す。単純にパパイン消化後に発生されるものは、Ｆａｂと称され、重鎖ヒンジ領域を保持しない。ペプシン消化後、重鎖ヒンジを保持する様々なＦａｂが発生される。完全な鎖間ジスルフィド結合を有するフラグメントは、Ｆ（ａｂ'）２と称され、一方ジスルフィド結合が保持されない場合は、単一のＦａｂ'が生じる。Ｆ（ａｂ'）_２フラグメントは、抗原に対して、一価のＦａｂフラグメントよりも高い結合活性を有する。

Ｆｃ（フラグメント結晶化）は、対になった重鎖定常ドメインを含む抗体の部分またはフラグメントを指す。ＩｇＧ抗体の場合、例えば、Ｆｃは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃは、ＣＨ４ドメインをさらに含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体媒介性細胞毒性の活性化、および抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）に関連する。複合ＩｇＧ様タンパク質の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭ等の抗体に関して、複合体形成は、Ｆｃ定常ドメインを必要とする。

最後に、ヒンジ領域は、抗体のＦａｂ部分とＦｃ部分とを分離し、Ｆａｂの互いに対する、およびＦｃに対する可動性を提供し、また２本の重鎖の共有結合のための複数のジスルフィド結合を含む。

抗体「特異性」とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合すること、ないしは他の方法で分子と相互作用することが可能な任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は概して、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖等の、分子の化学的に活性な表面群からなり、かつ概して、特異的な三次元構造特徴および特異的な荷電特徴を有する。エピトープは、「直鎖状」であってもよいか、または「立体配座」であってもよい。直鎖状エピトープでは、タンパク質と相互作用する分子（例えば、抗体等）との間の相互作用点の全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直鎖状に発生する。立体配座エピトープでは、相互作用点は、互いに分離されたタンパク質上のアミノ酸残基、すなわち、タンパク質の三次の折り畳みによって並置された非隣接アミノ酸にわたって発生する。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒への曝露に際して保持され、一方、三次の折り畳みによって形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒を伴う処理に際して失われる。エピトープは、典型的には、独特な空間立体配座にて、少なくとも３個、またより通常では少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗体は、別の抗体の標的抗原への結合を遮断するある抗体の能力を示す、単純な免疫学的分析にて検証することができる。

本発明のモノクローナル抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、またはキメラであってよい。ヒト化抗体は、１つの種由来の抗体、例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ヤギ、ウマ、またはニワトリ抗体（または、任意の他の好適な動物抗体）のＣＤＲが、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメイン内へと伝達される、組み換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメイン由来である。ヒト化抗体を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。キメラ抗体は、好ましくは、実質的にまたは排他的にヒト抗体定常領域に由来する定常領域と、実質的または排他的に、ヒト以外の哺乳類由来の可変領域の配列に由来する可変領域とを有する。キメラ化過程は、マウス（または他の非ヒト哺乳類）抗体の高度可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変領域を、対応するヒト配列で置換することによって、より効果的になされることができる。ＣＤＲ以外の可変領域は、可変フレームワーク領域（ＦＲ）としても既知である。本発明のまた他のモノクローナル抗体は、二重特異性であり、すなわちＬｕｋＥとＬｕｋＤの両方に対する特異性を有する。二重特異性抗体は、好ましくはヒトまたはヒト化である。

上述の抗体は、標準的な技術によって得ることができる。例えば、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥもしくはＬｕｋＤの免疫学的に活性なフラグメントが、対象（例えば、ヒトまたはマウス等の哺乳類）に投与することができる。ロイコシジンは、それ自体免疫原として使用され得るか、または担体タンパク質、もしくはセファロースビーズ等の他の物体に付着され得る。哺乳類が抗体を産生した後、脾細胞等の抗体産生細胞の混合物が単離され、それからポリクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は、個々の抗体産生細胞を混合物から単離し、それらを、例えば、骨髄腫細胞等の腫瘍細胞と共に溶解することによって等、不死化することによって産生することができる。得られたハイブリドーマは、培養液中に保存され、モノクローナル抗体は、培養培地から採取される。

本発明の別の態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を予防する方法に関する。この方法は、ロイコシジンＥ（ＬｕｋＥ）抗体、ロイコシジンＤ（ＬｕｋＤ）抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体を含む本発明の組成物を、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を予防するのに有効な量で投与することを含む。

本発明の本態様によると、黄色ブドウ球菌関連状態としては、皮膚創傷および皮膚感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、敗血性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の本態様に関する投与および治療的に有効な投薬の様式は、以下に説明される。

本発明のさらなる態様は、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を治療する方法に関する。この方法は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子の１つ以上を含む組成物を、対象における黄色ブドウ球菌感染および／または黄色ブドウ球菌関連状態を治療するのに有効な量で投与することを含む。

本発明の本態様によると、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の好適な阻害因子としては、タンパク質もしくはペプチド阻害因子、核酸阻害因子、または小分子阻害因子が挙げられる。

本発明の一実施形態では、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子は、ＬｕｋＥ阻害因子である。好適なＬｕｋＥ阻害因子としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列中のエピトープを認識する抗体または抗体フラグメントが挙げられる。本発明の別の実施形態では、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子は、ＬｕｋＤ阻害因子である。好適なＬｕｋＤ阻害因子としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列中のエピトープを認識する抗体または抗体フラグメントが挙げられる。

本発明の本態様の別の実施形態では、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子は、ＬｕｋＥとＬｕｋＤの相互作用を阻害する。本実施形態による好適な阻害因子としては、ＬｕｋＥまたはＬｕｋＤの相互作用領域を標的にする抗ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ抗体が挙げられる。または、好適な阻害因子としては、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの相互作用領域に結合する小分子が挙げられる。これらの相互作用領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸３〜１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸３２〜４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸１２６〜１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸１５１〜１５６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸２７２〜２８３を含んでもよい。相互作用領域はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸３〜１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸３３〜５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸９４〜１１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸１１５〜１３１、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸２２９〜２７４１を含んでもよい。

本発明の本態様の別の実施形態では、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子は、白血球の原形質膜へのＬｕｋＥ／Ｄの結合を阻害する。好適な阻害因子としては、白血球の原形質膜と相互作用するＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤのエピトープを認識する抗体または小分子が挙げられる。原形質膜と相互作用するＬｕｋＥおよびＬｕｋＤの領域には、ＬｕｋＥのリムドメインを包含するアミノ酸が含まれる。これらのアミノ酸領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のＬｕｋＥアミノ酸５７〜７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸１６２〜１９８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸２３０〜２７３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のＬｕｋＤアミノ酸５９〜７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸１７０〜２２０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸２５３〜２６８を含む。したがって、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤのこれらのエピトープを認識する抗体は、本発明の本実施形態に特に好適である。

本発明の本態様の別の実施形態では、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子は、ＬｕｋＥ／Ｄオリゴマー複合体形成を阻止する作用物質、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＤ媒介性孔形成を遮断する作用物質、またはＬｕｋＥ／ＬｕｋＤ孔を遮断する作用物質である。本実施形態によると、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＤ媒介性孔の好適な阻害因子としては、シクロデキストリンおよび関連の化合物、ならびにタンパク質もしくはペプチド阻害因子、核酸阻害因子、または小分子阻害因子を含む任意の他の孔阻害因子が挙げられる。

本発明の本態様のまた別の実施形態では、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害因子は、ＬｕｋＥ／Ｄ発現の内因性リプレッサーまたはアクチベーターの発現および／または活性を調節する作用物質である。したがって、ｌｕｋＥおよびｌｕｋＤ発現のリプレッサーである、毒素リプレッサー（「Ｒｏｔ」）の発現およびまたは活性を誘発または模倣する作用物質の投与は、毒素産生を遮断するという理由で、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性を阻害する。Ｒｏｔ発現および活性を模倣し、かつ本発明の方法における使用に適した、好適な作用物質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＭｃＮａｍａｒａの米国特許出願公開第２００３／０１７１５６３号に開示される。同様に、ｌｕｋＥおよびｌｕｋＤ発現のアクチベーターである、ＳａｅＲＳの発現または活性を阻害する作用物質の投与は、毒素産生を遮断するという理由で、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性を阻害する。

本発明の本態様および他の態様の目的のため、標的「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを包含する。対象における黄色ブドウ球菌感染を予防する目的のための本発明の組成物の投与の文脈において、標的対象は、黄色ブドウ球菌に感染している危険性のある任意の対象を包含する。特に感染しやすい対象としては、幼児および若年者、ならびに免疫障害を有する若年者、成人、および高齢者が挙げられる。しかしながら、黄色ブドウ球菌感染への危険性のある任意の幼児、若年者、成人、もしくは高齢者、または免疫障害を有する個人が、本発明の方法にしたがって治療されることができる。対象における黄色ブドウ球菌感染を治療する目的のための本発明の組成物の投与の文脈において、標的対象集団は、黄色ブドウ球菌に感染している任意の対象を包含する。特に好適な対象としては、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）に感染する危険性のある対象、またはそれらに感染している対照が挙げられる。

能動または受動ワクチン接種のいずれかを介して、黄色ブドウ球菌感染を予防するために本発明の治療的組成物を使用する文脈において、組成物中のＬｕｋＥおよびＬｕｋＤタンパク質もしくはポリペプチドまたは抗ＬｕｋＥおよび抗ＬｕｋＤ抗体の濃度は、黄色ブドウ球菌感染の予防、特に感染しやすい集団における黄色ブドウ球菌感染の予防を達成するのに適する。黄色ブドウ球菌感染を治療するために治療的組成物を使用する文脈において、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性を阻害する抗ＬｕｋＥおよび抗ＬｕｋＤ抗体または作用物質の量は、多数の症状における軽減、少なくとも１つの症状の重症度の減少、または少なくとも１つの症状のさらなる進行の遅延、またはさらには感染の全体的緩和を達成することができる。

治療的に有効な量のＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、抗ＬｕｋＥおよび抗ＬｕｋＤ抗体、ならびにＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性を阻害する作用物質は、例えば、組成物中のこれらの活性物質の濃度、投与の様式および頻度、治療される（または予防される）黄色ブドウ球菌感染の重症度、ならびに、年齢、体重、および健康全般および免疫状態等を含む対象の詳細を含む、多数の因子を考慮する標準的手順に従って決定することができる。一般的な手引きは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＨａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎおよびＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ１９９０）の出版物において見出すことができる。臨床医は、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤまたは抗ＬｕｋＥおよび抗ＬｕｋＤ抗体を、投薬量が所望のまたは必要とされる予防または治療効果に到達するまで、投与してよい。この療法の進捗は、従来の分析法によって容易に監視することができる。

免疫化のためのＬｕｋＥおよびＬｕｋＤの治療的に有効な量は、アジュバントの不在下ではより多量の投薬が必要とされるため、アジュバントが同時投与されるかどうかに依存すると考えられる。投与のためのＬｕｋＥおよびＬｕｋＤの量は、患者１人あたり１μｇ〜５００μｇ、より通常ではヒト投与の１回の注入あたり５〜５００μｇにわたることがある。時として、１回の注入あたり１〜２ｍｇのより高い用量が使用される。典型的には、約１０、２０、５０、または１００μｇが、ヒトの各注入に使用される。好ましくは、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤの量は、実質的に同一である。注入のタイミングは、１日１回から、１年に１回、１０年に１回まで著しく異なり得る。概して、有効な投薬量は、流体試料、概して、血清試料を対象から得ることと、当該技術分野において周知であり、測定される特定の抗原に容易に適合可能な方法を用いて、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤタンパク質またはポリペプチドに対して成長した抗体の力価を決定することとによって監視することができる。理想的には、試料は、初回投薬の前に採取され、その後の試料は各免疫化の後に採取および力価測定される。概して、１：１００の血清希釈において、対照または、「バックグラウンド」より少なくとも４倍大きい検出可能な力価を提供する投薬または投薬計画が望ましく、バックグランドは、対照血清と比較して、またはＥＬＩＳＡ分析におけるプレートバックグラウンドと比較して定義される。

治療的に有効な量のＬｕｋＥおよびＬｕｋＤ抗体組成物は典型的には、投薬１回あたり、または毎日、体重１キログラムあたり少なくとも５０ｍｇの組成物（ｍｇ／ｋｇ）であり、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７５０ｍｇ／ｋｇ、および少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇを含む。モノクローナル抗体組成物に関する投薬量は、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ等、非モノクローナル抗体組成物の約１０分の１等、より低い傾向がある。いくつかの方法では、異なる結合特性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が、同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投薬量は、指示される範囲内である。抗体は通常、複数回投与される。単一の投薬間の間隔は、毎週、毎月、または毎年であってよい。間隔はまた、対象における抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則であってもよい。別の方法としては、抗体は、持続放出剤として投与されることもでき、この場合、より少ない頻度の投薬が必要とされる。投薬量および頻度は、対象における抗体の半減期に応じて変動する。概して、ヒト抗体が最長の半減期を示し、続いてヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投薬量および投与の頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかに応じて変動することができる。予防的用途では、長期間にわたって、相対的に低頻度の間隔で相対的に低用量が投与される。治療的用途では、疾患の進行が軽減または終了するまで、また好ましくは対象が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、相対的に短い間隔で相対的に高用量が必要とされる場合がある。

本発明の治療的組成物は、治療される黄色ブドウ球菌感染の本質に応じて、別の活性物質と共に併用療法の一部として投与されることもできる。かかるさらなる活性物質としては、抗感染剤、抗生物質、および抗菌物質が挙げられる。本発明において有用な可能性のある代表的な抗感染剤としては、バンコマイシンおよびリソスタフィンが挙げられる。本発明において有用な可能性のある代表的な抗生物質および抗菌物質としては、バンコマイシン、リソスタフィン、ペニシリンＧ、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、セファロチン、セファゾリン、セファレキシン、セフラジン、セファマンドール、セフォキシチン、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、テイコプラニン、リンコマイシン、およびクリンダマイシンを含む、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、セファロスポリン、およびカルバペネムが挙げられる。これらの抗生物質の投薬量は、当該技術分野において周知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＭＥＲＣＫ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １３，Ｃｈ．１５７，１００^ｔｈＥｄ．（Ｂｅｅｒｓ＆Ｂｅｒｋｏｗ，ｅｄｓ．，２００４）を参照されたい。抗炎症剤、抗感染剤、抗生物質、および／または抗菌物質は、投与の前に組み合わされてもよく、または（同一の組成物の一部として、もしくは異なる組成物として）同時に投与されてもよく、または本発明の発明的治療的組成物と連続してもよい。特定の実施形態では、投与は繰り返される。対象は、幼児、若年者、成人、または高齢者であってよい。対象はまた、免疫無防備状態の若年者、成人、または高齢者であってもよい。

本発明の治療的組成物は、単回投与で投与されてもよく、または複数回投薬プロトコールに従って投与されてもよい。例えば、１回または２回といった、相対的に少ない治療的組成物の投薬が施される。概して数日または数週にわたる複数回投薬に関与する従来の抗生物質療法を含む実施形態では、抗生物質は、例えば、少なくとも５日、１０日、またさらには１４日以上等の期間、１日に１回、２回、もしくは３回またはそれ以上、摂取されることができ、一方、抗体組成物は通常、１回または２回しか投与されない。しかしながら、異なる投薬量、投薬タイミング、および治療的組成物と抗生物質との相対量は、当業者によって選択および調整されることができる。

本発明のための組成物は、予防的および／または治療的療法のために、非経口、局所的、静脈内、経口、皮下的、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内手段によって投与されることができる。その他も同等に有効であるが、最も典型的な投与経路は皮下である。次に最も一般的なものは、筋肉内注入である。この種類の注入は、最も典型的には、腕または脚の筋肉に行われる。静脈内注入、および腹腔内注入、動脈内注入、頭蓋内注入、または皮内注入もまた、免疫応答を発生させるのに有効である。

本発明の薬剤は、非経口投与のために製剤化されてもよい。薬剤の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合される水中で調製することができる。分散体もまた、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で調製することができる。例証的な油は、石油、動物油、植物油、または例えば、ピーナツ油、大豆油、もしくは鉱油等の合成有機油である。概して、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に注入可能溶液のために、好ましい液体担体である。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するための防腐剤を含有する。

注入可能な使用に好適な薬学的製剤としては、無菌注入可能な溶液または分散体のその場での調製のための、無菌水溶液または分散体および無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は無菌でなくてはならず、注射器によって容易に採取できる範囲まで流動性を有していなくてはならない。それは、製造および保管の条件下にて安定性でなくてはならず、また細菌および菌類等の微生物の汚染作用に対して保存されていなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散体媒質であることができる。

本発明の薬剤を全身に送達することが望ましい場合は、それらは、注入による、例えば、ボーラス注入または持続注入による非経口投与のために製剤化されてもよい。注入用の製剤は、単位投与形態で、例えば、アンプルまたは複数の投薬容器内に、追加の防腐剤とともに提供されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳剤の形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤等の調合剤を含有してもよい。

本発明の該剤の腹腔内または髄腔内投与もまた、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ，ＣＡによって説明されるもの等の点滴ポンプデバイスを用いて、達成されることができる。かかるデバイスは、所望の化合物の連続的点滴を可能にし、複数の注入および複数の取り扱いを回避する。

先に説明された製剤に加えて、該剤は、デポー製剤として製剤化されることもできる。このような長時間作用する製剤は、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳剤）またはイオン交換樹脂と共に、または、例えば、難溶性の塩等、難溶性の誘導体として製剤化されてもよい。

本発明のさらなる態様は、黄色ブドウ球菌感染の重症度を予測する方法に関する。この方法は、感染した対象由来の流体試料または組織試料を介して該対象から得られた黄色ブドウ球菌を培養することと、培養された黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ発現を定量化することとを含む。対象由来の試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの定量化された量は、ＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤをほとんど産生しないかまたは検出不可能な量のＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤを産生する対照試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの量と比較され、該比較に基づいて、黄色ブドウ球菌感染の重症度が予測される。

本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、感染した対象由来の流体試料または組織試料を介して該対象から得られた黄色ブドウ球菌を培養することと、培養された黄色ブドウ球菌におけるＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ発現を定量化することとを含む。対象由来の試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの定量化された量は、ＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤをほとんど産生しないかまたは検出不可能な量のＬｕｋＥおよび／もしくはＬｕｋＤを産生する対照試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの量と比較され、この比較に基づいて、対象にとって好適な治療が決定される。方法は、決定された好適な治療を対象に施して、黄色ブドウ球菌感染を治療することをさらに含む。

本発明のこれらの態様によると、対象由来の試料中のＬｕｋＥおよびＬｕｋＤ発現の定量化は、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ ｍＲＮＡ発現またはタンパク質産生のレベルを測定することを含む。試料中のｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを定量化する方法は、当該技術分野において周知である。対照試料と比較して、対象由来の試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ ｍＲＮＡ発現またはタンパク質産生の増大されたレベルは、より深刻な黄色ブドウ球菌感染を有する対象を示すか、または予測する。同様に、対象由来の試料中のＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤ ｍＲＮＡ発現またはタンパク質産生の増大されたレベルは、感染を有する対象に好適な治療は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性を阻害する１つ以上の作用物質に関与することを示す。ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性を阻害するのに好適な作用物質は、上述に開示される。

本発明の別の態様は、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子を特定する方法に関する。この方法は、細胞集団、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物、ならびに候補ＬｕｋＥ／Ｄ阻害因子を供給することを含む。細胞集団は、候補阻害因子の存在下および不在下で、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物に曝露され、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性が、候補阻害因子の存在下および不在下で測定される。候補阻害因子の存在下および不在下で測定された細胞毒性の量が比較され、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子が、この比較に基づいて特定される。

本発明の本態様によると、抗ＬｕｋＥおよび抗ＬｕｋＤ抗体、ならびにそのフラグメント、ならびに可能性のある他の治療的部分（例えば、小有機分子）は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性を阻害するそれらの能力を評価するためにスクリーニングされてもよい。後述されるように、様々な方法が、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性およびヒト白血球の溶解につながるカスケード内の事象のいくつかの側面を阻害する作用物質を特定するように設計されている。方法はまた、その生来の対応物と比較して低下した毒性を有するＬｕｋＥおよびＬｕｋＤの変更された形態を特定するように設計される。カスケードの一部である標的化される事象としては、例えば、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの白血球原形質膜への結合、ＬｕｋＥとＬｕｋＤとの間の相互作用（ＬｕｋＥ／Ｄオリゴマー化）、ならびにＬｕｋＥ／Ｄオリゴマーによって形成される膜孔の遮断が挙げられる。分析フォーマットは概して、ヒト白血球（または、そのＬｕｋＥもしくはＬｕｋＤ膜結合部分）、好適な培養培地、および精製されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを必要とする。

当業者は、以下のプロトコールは単に例証的であり、反応条件、検出可能な標識の選択、装置（例えば、検出および定量化のための計器類）等の様々な操作パラメータは、適切と見なされるように変化されてもよいことを理解するであろう。

以下の方法は概して、影響されるカスケード内の正確な事象を必ずしも明らかにしなくても、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性を阻害する作用物質を特定することに関する。

ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害因子を特定するために、ヒト白血球（例えば、ＴＨＰ−１）が、３８４ウェルの透明底黒色組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、５×１０^３細胞／ウェルにて、１０％の加熱不活性化されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補完された５０μＬの最終体積のＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で定置されてもよい。細胞は次に、試験化合物／分子（約５μＬ／異なる濃度）と接触／混合／反応／処理されてもよく、次に、好ましい実施形態では実質的に精製され（５μＬの約０．０１〜５μＭ溶液）、より好ましくは、一緒に添加される、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤで、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤによる白血球の中毒を可能にする培養条件下で、例えば、５％ＣＯ_２、３７℃で１時間、中毒化されてもよい。対照として、細胞を、培養培地（１００％生存率）で、および０．１体積／体積％のトリトンＸ１００（１００％死亡）で処理してもよい。

これらの実施形態では、上述に説明されるように処理された細胞は、次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（細胞の代謝活性の定量化によって培養液中の生存可能細胞の数を測定することによって、吸収度を介して細胞生存性を決定することができる）等の細胞生存性を監視するために、色素と共にインキュベートされてもよく、かつさらなる期間（例えば、３７℃で約２時間、５％ＣＯ_２）インキュベートされてもよい。細胞生存性は次に、プレートリーダー、例えば、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０３Ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、例えば、４９２ｎｍにおける比色反応を測定することによって、決定されてもよい。生存可能細胞率（％）は、例えば、次の等式を用いて、算出されることができる。生存率％＝１００×［（Ａｂ_４９２試料−Ａｂ_４９２ＴｒｉｔｏｎＸ）／（Ａｂ_４９２組織培養培地）。１００％生存率における増大は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性の阻害を示唆する。

この分析の変形は、膜損傷分析と称される。これらの実施形態では、上述に説明されるように（例えば、試験化合物／分子で細胞を処理すること、および次に細胞を精製されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤで中毒化することまで、ならびにそれらを含む）処理された細胞は次に、ＳＹＴＯＸグリーン（０．１μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（製造者の指示に従う）等の細胞非透過性蛍光色素と共にインキュベートされてもよく、また例えば、暗所で室温にてさらに１５分間インキュベートされてもよい。蛍光は次に、膜損傷の指標として、励起４８５ｎｍ、放出５３５ｎｍのＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）等のプレートリーダーを用いて測定されてもよい。蛍光における減少は、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害を示唆する。

この分析の別の変形では、上述に説明されるように（例えば、試験化合物で細胞を処理すること、および次に細胞を精製されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤで中毒化することまで、ならびにそれらを含む）処理された細胞は次に、細胞溶解のマーカーと共にインキュベートされてもよく、また暗所で室温にてさらなる期間インキュベートされてもよい。細胞溶解のマーカーは測定され、化合物の存在下での細胞溶解レベルの減少は、ＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性の阻害を示唆する。

これらの分析は共に、白血球細胞に対するＬｕｋＥ／Ｄの細胞毒性効果を阻害するかまたは低下させる化合物の特定を促進すると考えられる。

追加の方法が、独立して、または、特に上述の方法が阻害活性を示す場合に、上述に説明される方法と共に、使用されてもよく、それは当業者が、生化学的カスケード中のどの事象が作用物質によって影響を受けているまたは標的化されているのかをより正確に決定することを可能にするであろう。これらの事象としては、ＬｕｋＥおよび／またはＬｕｋＤの白血球膜への結合、ＬｕｋＥのＬｕｋＤへの結合（ＬｕｋＥ／Ｄオリゴマー化）、ならびにＬｕｋＥ／Ｄオリゴマーによって形成される膜孔の遮断が挙げられる。

本発明の別の態様は、標的細胞へのＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、および／またはＬｕｋＥ／Ｄ結合の阻害因子を特定する方法を含む。この方法は、白血球または他の標的細胞の集団、検出可能に標識されたＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄを含有する調製物、および候補阻害因子を供給することを含む。細胞集団は、候補阻害因子の存在下および不在下で、検出可能に標識されたＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄを含有する調製物に曝露され、白血球集団への標識されたＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄの結合が、候補阻害因子の存在下および不在下で測定される。候補阻害因子の存在下および不在下で測定されたＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄ結合の量が比較され、この比較に基づいて、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄ−白血球結合の阻害因子が特定される。

中毒過程の第１の工程である標的細胞へのＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄ結合を遮断するかまたは低下させる阻害因子に関してスクリーニングするため、ヒト白血球（例えば、ＴＨＰ−１細胞）が、３８４ウェルの平底組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、２．５×１０^３細胞／ウェルにて、１０％の加熱不活性化されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補完された５０μＬの最終体積のＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で定置されてもよい。細胞は次に、試験化合物／分子（約５μＬ／異なる濃度）で処理されてもよく、かつ精製され蛍光標識されたＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、および／またはＬｕｋＥ／Ｄ（例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＡＰＣ、ＰＥ）の５μＬの約０．０１〜５μＭ溶液と共に、４℃、５％ＣＯ_２にて１時間インキュベートされてもよい。試験化合物／分子の有効性を評価するため、細胞関連性の蛍光が、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄの細胞への結合の指標として、例えば、高含有スクリーニングおよび高含有分析用に設計された自動蛍光顕微鏡画像化システム（例えば、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（励起４８５ｎｍ、放出５３５ｎｍ））を用いて、測定されてもよい。本発明の本態様によると、候補阻害因子の不在下と比較した、候補阻害因子の存在下でのＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄ−白血球結合における減少により、結合阻害因子が特定される。

中毒過程の第２の工程である、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＤ相互作用を遮断するかまたは低下させる阻害因子に関してスクリーニングするため、ヒト白血球（例えば、ＴＨＰ−１細胞）が、３８４ウェルの平底組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、２．５×１０^３細胞／ウェルにて、１０％の加熱不活性化されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補完された５０μＬの最終体積のＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で定置されてもよい。細胞は次に、試験化合物／分子で処理されてもよく、次に、ＬｕｋＤがＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＡＰＣ、およびＰＥ等の蛍光分子で蛍光標識された、精製されたＬｕｋＥと精製されたＬｕｋＤとの混合物と共に中毒化されてもよく、また中毒過程を完了するまで（例えば、３７℃、５％ＣＯ_２にて１時間）放置されてもよい。試験化合物／分子の有効性を評価するため、細胞関連性のＬｕｋＤ−ＦＩＴＣ蛍光が、ＬｕｋＥ／ＬｕｋＤ−ＦＩＴＣ相互作用の指標として、例えば、高含有スクリーニングおよび高含有分析用に設計された自動蛍光顕微鏡画像化システム（例えば、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（励起４８５ｎｍ、放出５３５ｎｍ）を用いて、測定されてもよい。同様の実験が、ＬｕｋＤの代わりに蛍光標識されたＬｕｋＥを用いて実施されてもよい。

本発明の別の態様は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性孔形成の阻害因子を特定する方法に関する。この方法は、白血球の集団、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物、ならびに候補阻害因子を供給することを含む。白血球集団は、候補阻害因子の存在下および不在下で、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含有する調製物に曝露され、白血球集団上の孔形成が、候補阻害因子の存在下および不在下で測定される。候補阻害因子の存在下および不在下で測定された孔形成の量が比較され、この比較に基づいて、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性孔形成の阻害因子が特定される。

ＬｕｋＥ／Ｄ孔、細胞溶解につながるエフェクター分子の形成を遮断または阻害する阻害因子に関してスクリーニングするため、ヒト白血球（例えば、ＴＨＰ−１細胞）が、３８４ウェルの透明底黒色組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、２．５×１０^３細胞／ウェルにて、１０％の加熱不活性化されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補完された５０μＬの最終体積のＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で定置されてもよい。細胞は次に、試験化合物／分子（約５μＬ、異なる濃度を含む）で処理されてもよく、また次に、精製されたＬｕｋＥおよびＬｕｋＤまたはＬｕｋＥ／Ｄ（約０．０１〜５μＭ）で、３７℃、５％ＣＯ_２にて１５分間、中毒化されてもよい。対照として、細胞は、培養培地（陰性対照）で、および０．１体積／体積％のＴｒｉｔｏｎＸ１００（陽性対照）で処理されてもよい。

宿主細胞の表面上のＬｕｋＥ／Ｄ孔を直接評価するために、臭化エチジウム（ＥＢ）流入分析を使用することができる。ＥＢは、健康な宿主細胞内へは非透過性の小型のカチオン性色素である。ＬｕｋＥ／Ｄによるカチオン性孔の形成に際して、ＥＢは、細胞内に入り、ＤＮＡに結合して、蛍光をもたらす。この様式で処理された細胞を、次に、暗所で室温にてさらに５分間、ＥＢ（５μＭ）でインキュベートすることができる。ＬｕｋＥ／Ｄ孔形成の阻害における試験化合物／分子の有効性を評価するために、蛍光を、励起５３０ｎｍ、放出５９０ｎｍにおいて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）等のプレートリーダーを用いて、孔形成の指標として測定することができる。この分析は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性毒性を緩和すると考えられる、ＬｕｋＥ／Ｄ孔を遮断または阻害することができる分子の特定を促進すると考えられる。

宿主細胞の表面上のＬｕｋＥ／Ｄ孔を直接評価するために、臭化エチジウム（ＥＢ）流入分析を使用することができる。ＥＢは、健康な宿主細胞内へは非透過性の小型のカチオン性色素である。ＬｕｋＥ／Ｄによるカチオン性孔の形成に際して、ＥＢは、細胞内に入り、ＤＮＡに結合して、蛍光をもたらす（例えば、図５Ｅを参照のこと）。ＬｕｋＥ／Ｄ孔形成を引き起こす作用物質で処理された細胞は、次に暗所で室温にてさらに５分間、ＥＢ（５μＭ）でインキュベートすることができる。ＬｕｋＥ／Ｄ孔形成の阻害における試験化合物／分子の有効性を評価するために、蛍光を、励起５３０ｎｍ、放出５９０ｎｍにおいて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）等のプレートリーダーを用いて、孔形成の指標として測定することができる。この分析は、ＬｕｋＥ／Ｄ媒介性毒性を緩和すると考えられる、ＬｕｋＥ／Ｄ孔を遮断または阻害することができる分子の特定を促進すると考えられる。

本明細書に説明される分析に用いられる候補化合物は、本質的に、生物学的機能または相互作用に影響を与えることが可能とされる任意の化合物または組成物であってよい。化合物または組成物は、化合物または組成物のライブラリの一部であってもよい。別の方法としては、化合物または組成物は、本発明のＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、またはＬｕｋＥ／Ｄの生物学的活量と相互作用または干渉するように特異的に設計されてもよい。

以下の実施例は、本発明の実施例を例証するために提供されるが、その範囲を制限することを決して意図されない。

実施例１-ｒｏｔの不活性化はａｇｒ欠損黄色ブドウ球菌株の病原性を強化する
近年の研究において、補助遺伝子調節因子（「Ａｇｒ」）および転写因子毒素リプレッサー（「Ｒｏｔ」）として既知である両方の主要調節因子を欠損する黄色ブドウ球菌変異体菌株（すなわち、ΔａｇΔｒｒｏｔ）は、高度に弱毒化されたΔａｇｒ変異体と比較して、全身感染のマウスモデルにおける強化された病原性を示すことが見出されている。Δａｇｒ単一欠失変異体は、感染後の期間にわたる生存率によって測定した際に、病原性に対して高度に弱体化されるのに対し、ΔａｇｒΔｒｏｔ二重変異体は、親菌株（ＷＴ Ｎｅｗｍａｎ）のものと同様の病原性特徴を示す（図１Ａ）。ΔａｇｒΔｒｏｔ二重変異体において観察された増大された病原性は、これらの毒素の多くはＡｇｒ−Ｒｏｔ依存性の様式において調節されると考えられるため、黄色ブドウ球菌ロイコトキシンの強化された発現に起因する可能性があると考えられた。実際、黄色ブドウ球菌野生型、Δａｇｒ、およびΔａｇｒΔｒｏｔ変異体菌株によって産生された毒素の免疫ブロット分析は、ΔａｇｒΔｒｏｔ二重変異体では多くの毒素がＷＴレベルに回復されるという仮説を確証した（図１Ｂ）。際立ったことに、ＬｕｋＥ／Ｄは、他の毒素と比較して、ΔａｇｒΔｒｏｔ菌株によって大幅に過剰産生されることが観察された（図１Ｂ）。このデータは、Ｒｏｔによる重要な病原性因子の抑制が、黄色ブドウ球菌における最適な病毒力にとって決定的であるということ、またロイコトキシンＬｕｋＥ／Ｄが、他のロイコトキシンと比較して、Ｒｏｔ依存性様式において大きく抑制されるということを実証する。

実施例２-ＬｕｋＥ／Ｄはｒｏｔ欠損黄色ブドウ球菌株によって示される強化された病原性の一因となる
図１Ａおよび１Ｂに示される結果は、ａｇｒ^＋菌株におけるｒｏｔの不活性化もまた、恐らくＬｕｋＥ／Ｄ依存性様式において、増大された病原性をもたらす可能性があることを示した。ΔａｇｒΔｒｏｔ二重変異体（図１Ａ）と同様に、Δｒｏｔ単一欠失変異体も、ＷＴに感染したものと比較した、Δｒｏｔに感染した動物の生存率（％）における減少によって立証される通り、全身感染のマウスモデルにおける強化された病原性をもたらすことが観察された（図２Ａ）。初期の観察は、Ｒｏｔが、ロイコトキシンＬｕｋＥ／Ｄの主要リプレッサーである可能性が高いことを実証した。単一Δｒｏｔ欠失変異体の文脈におけるこれらの発見を確証するため、免疫ブロットを実施した。これらの実験は、実際にＬｕｋＥ／Ｄが、ＬｕｋＡＢ、γ−溶血素（ＨｌｇＣ）、またはα−毒素と対照的に、ｒｏｔの不在下でより高度に産生されることを明らかにした（Ｈｌａ、図２Ｂ）。これらの発見は、ＬｕｋＥ／Ｄは、Δｒｏｔ変異体の病原性における増大の原因である主要なＲｏｔ抑制された因子であるという仮定、およびＬｕｋＥ／Ｄは、黄色ブドウ球菌の生体内病原性において重要な役割を担う可能性があるという仮定を、さらに強めた。ＬｕｋＥ／Ｄ過剰産生が、Δｒｏｔの強化された病原性表現型の原因であったかを決定するため、ΔｒｏｔΔｌｕｋＥ／Ｄ二重変異体が構築され、感染のマウスモデルにおけるその病原性が分析された。ΔｒｏｔΔｌｕｋＥ／Ｄ二重変異体は、ＷＴおよびΔｒｏｔ変異体の両方と比較した死亡率における際立った低下によって立証される通り、病原性に関して著しく損なわれた（図２Ｃ）。これらの結果は、ＬｕｋＥ／Ｄは、Δｒｏｔ変異体に関連した高い病原性に決定的である主要なＲｏｔ抑制された因子であるということ、またＬｕｋＥ／Ｄは、一般的な疾患に対する主要な寄与因子であるということを実証する。これらの結果はさらに、標的遺伝子のＲｏｔ媒介性抑制を強化する薬物は、黄色ブドウ球菌病原性を低下させるであろうことを示す。

実施例３−ＲｏｔはＬｕｋＥ／Ｄプロモータに直接結合することによってＬｕｋＥ／Ｄ発現を抑制する
ｌｕｋＥ／Ｄ遺伝子発現へのＲｏｔの影響をさらに検証するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に関してコードする遺伝子に対するｌｕｋＥ／Ｄプロモータ領域の転写融合体が構築され、蛍光が、ＷＴ、Δａｇｒ、Δｒｏｔ、およびΔａｇｒΔｒｏｔ菌株を用いたブロス培養において経時的に測定された。疑われた通り、ｌｕｋＥ／Ｄの遺伝子発現は、Ｒｏｔを欠損する菌株においてＷＴを上回って増大され、一方多量のＲｏｔを発現する菌株（Δａｇｒ変異体は、増大されたＲｏｔレベルを示す）は、発現において減少された。ＲｏｔによるｌｕｋＥ／Ｄの抑制が直接的かどうかを分析するために、ｌｕｋＥ／Ｄプロモータに結合するＲｏｔの能力を、プロモータプルダウン戦略を用いて調査した。細菌性全細胞溶解物が、ｌｕｋＥ／ＤプロモータＤＮＡまたは磁気ビーズに結合された非特異性遺伝子間ＤＮＡと共にインキュベートされた。結合されたタンパク質の免疫ブロットは、Ｒｏｔが実際に、特異的様式においてｌｕｋＥ／Ｄプロモータに結合することを実証した（図３Ｂ）。これらの結果は、ｌｕｋＥ／Ｄ遺伝子発現の直接的なリプレッサーとしてのＲｏｔを暗示する。したがって、Ｒｏｔレベルにおける変更は、ＬｕｋＥ／Ｄの産生を実質的に増大または減少させることができ、結果によって、黄色ブドウ球菌の病毒力を調節する。

実施例４−ＬｕｋＥ／Ｄは黄色ブドウ球菌病原性に著しく寄与する
ΔｒｏｔΔｌｕｋＥ／Ｄ二重欠失変異体は、ｒｏｔ欠失に関連した高い病原性を排除するだけでなく、また同様に病原性全体を実質的に低下させる（図３ＢのＷＴ生存率をΔｒｏｔΔｌｕｋＥ／Ｄ生存率と比較されたい）。ＬｕｋＥ／Ｄが黄色ブドウ球菌敗血症感染の発病に主要な役割を果たすかどうかを試験するために、菌株Ｎｅｗｍａｎ中にΔｌｕｋＥ／Ｄ変異体が構築され（図４Ａおよび４Ｂ）、病原性へのｌｕｋＥ／Ｄ欠失単独の影響が検査された。経時的生存率は、１０^７ＣＦＵか１０^８ＣＦＵかのいずれかのΔｌｕｋＥ／Ｄ 変異体に感染したマウスに関して、野生型と比較して飛躍的に増大した。全ての野生型マウスは、１０^７投薬量において２５０時間までに（図４Ｃ）、また１０^８投薬量において１００時間までに（図４Ｄ）感染によって死亡した。しかしながら、どちらの場合においても、ΔｌｕｋＥ／Ｄ変異体に感染したマウスの１００％近くが、感染後少なくとも３００時間まで生存し、表現型は完全にΔｌｕｋＥ／Ｄ：：ｐｌｕｋＥ／Ｄ菌株と相補する（図４Ｂおよび４Ｃ）。それに加えて、腎臓への細菌の負担は、野生型または相補性菌株と比較して、１０倍まで低下され（図４Ｅ）、また膿瘍形成は著しく低下される（図４Ｆ）。これらの結果は、ＬｕｋＥ／Ｄが実際に、黄色ブドウ球菌感染に対して決定的な病原性因子であることを示す。したがって、ＬｕｋＥ／Ｄは、黄色ブドウ球菌感染に対抗するための新規の治療法の開発のための、魅力的な新規の標的である。

実施例５−ＬｕｋＥ／Ｄは白血球を標的にして死滅させる
ＬｕｋＥ／Ｄの作用の潜在的メカニズムを決定するために、大腸菌由来の組み換えＬｕｋＥおよびＬｕｋＤタンパク質が発現され、精製された。これらのタンパク質の潜在的毒性を試験するために、ヒト単核細胞様細胞（ＴＨＰ−１）およびヒト前骨髄球性白血病細胞（ＨＬ６０）が、異なる濃度の個々のサブユニット（すなわち、ＬｕｋＥまたはＬｕｋＤ）かＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤの混合物（ＬｕｋＥ／Ｄ）かのいずれかと共にインキュベートされた。細胞は、ＬｕｋＥ単独か、ＬｕｋＤ単独か、またはＬｕｋＥ／Ｄかのいずれかの用量応答を伴って中毒化され、中毒化の１時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒが添加され、中毒後の生存可能細胞パーセントが測定された。ヒト単核細胞様細胞株、ＴＨＰ−１は、毒素の両方のサブユニットが一緒にされた状態で中毒に対して唯一感受性があったが、個々のサブユニットに対してはそうではなかった。細胞に対する毒素の強度は、投薬量依存性であり、また両方のサブユニットの存在を強く必要とした（図５Ａ）。対照的に、ＨＬ６０は、サブユニット単独でも、共にインキュベートされた場合も影響を受けなかった（図５Ｂ）。細胞株に加えて、主要ヒトおよびマウスＰＭＮに対するＬｕｋＥ／Ｄの活量も同様に調査された。細胞は、ＬｕｋＥ単独か、ＬｕｋＤ単独か、またはＬｕｋＥ／Ｄかのいずれかの用量応答を伴って中毒化され、中毒の１時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒが添加され、中毒後の生存可能細胞パーセントが測定された。ＬｕｋＥ／Ｄは、ヒト由来およびマウス由来の両方のＰＭＮに対して極めて細胞毒性であったが、ＬｕｋＥまたはＬｕｋＤはそうではなかった（図５Ｃ）。

ＬｕｋＥ／ＤがＴＨＰ−１に対して毒性であるメカニズムを調査するために、細胞が、正常では宿主細胞膜に対して非透過性であるが、毒素孔を介して細胞への接近することができる小型のカチオン性色素である臭化エチジウムの存在下で中毒化された。両方の毒素サブユニットの添加後、臭化エチジウムは、中毒化されていない対照および中毒化されたＰＭＮ−ＨＬ６０と比較した相対的蛍光における増大によって反映されるように、細胞内へ迅速に取り込まれた（図５Ｄおよび５Ｅ）。これらの実験は、合わせて考えると、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤは、特定のヒト免疫細胞型に対して細胞毒性を表すが他のものには表さないことを実証し、この毒素の特異性を強調している。

実施例６−ＬｕｋＥに対する抗体はＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性を強力に中和した
ＬｕｋＥに対して成長させたポリクローナル抗体が、ＬｕｋＥ／Ｄの細胞毒性を中和することができるかを決定するために、中和分析を実施した。精製した抗ＬｕｋＥ抗体とのＬｕｋＥ／Ｄのインキュベーションは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒで測定した際に、ＴＨＰ−１細胞に対するＬｕｋＥ／Ｄ媒介性細胞毒性を強力に阻害した（図６Ａ）。図５Ａ〜５Ｅに示される通り、ＬｕｋＥ／Ｄは、標的細胞の原形質膜内に透過性孔を形成することによって、その毒性作用を発揮するようである。抗ＬｕｋＥがＬｕｋＥ／Ｄ細胞毒性を中和するメカニズムについての洞察を得るために、精製した抗ＬｕｋＥ抗体の存在下で、ＬｕｋＥ／Ｄ中毒化させた細胞におけるＬｕｋＥ／Ｄ孔の形成を監視した。ＬｕｋＥ／Ｄ孔形成は、抗ＬｕｋＥ抗体によって強力に阻害されることが観察された（図６Ｂ）。これらのデータは、ＬｕｋＥによる免疫化が、抗ＬｕｋＥ中和抗体を発生させることを実証し、ＬｕｋＥ特異的抗体が、黄色ブドウ球菌感染に効く新規の治療となり得ることを示している。

本発明を、例証の目的のために詳細に説明してきたが、かかる詳細は、単にその目的のためであり、変更が、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなくそのなかでなされ得ることが、当業者によって理解される。

Claims (16)

1. 治療的に有効な量の、長さが３００アミノ酸残基以下であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基４８〜２９１のアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基４８〜２９１に対して90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＬｕｋＥポリペプチドと、
   薬学的に許容される担体と
   を含む、組成物。
2. 前記単離されたＬｕｋＥポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基２９〜３１１、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基２９〜３１１に対して90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記単離されたＬｕｋＥポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基４８〜３０１、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸残基４８〜３０１に対して90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記単離されたＬｕｋＥポリペプチドが２００〜２５０アミノ酸長である、請求項１に記載の組成物。
5. 前記単離されたＬｕｋＥポリペプチドが２５０〜３００アミノ酸長である、請求項１に記載の組成物。
6. ３００以下のアミノ酸長であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３０７のアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３０７に対して90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＬｕｋＤポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
7. 治療的に有効な量の、３００以下のアミノ酸長であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３０７のアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３０７に対して90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＬｕｋＤポリペプチドと、
   薬学的に許容される担体と
   を含む、組成物。
8. 前記単離されたＬｕｋＤポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基２７〜３１２、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基２７〜３１２に対して90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の組成物。
9. 前記単離されたＬｕｋＤポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３１２、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸残基４６〜３１２に対して90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の組成物。
10. 前記単離されたＬｕｋＤポリペプチドが２５０〜３００アミノ酸長である、請求項7に記載の組成物。
11. 前記組成物の前記単離されたポリペプチドが、免疫原性担体分子に連結されている、請求項１または7に記載の組成物。
12. 前記免疫原性担体分子が、前記単離されたポリペプチドに共有結合または非共有結合で結合している、請求項11に記載の組成物。
13. 前記免疫原性担体分子が、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイログロブリン、肺炎球菌莢膜多糖、ＣＲＭ１９７、および髄膜炎菌性外膜タンパク質からなる群から選択される、請求項11に記載の組成物。
14. α溶血素抗原、プロテインＡ、血清型３３６多糖抗原、コアグラーゼ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、エラスチン結合タンパク質、ＭＨＣ類似タンパク質、多糖類細胞内接着、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、パントンバレンタインロイコシジン、ロイコシジンＡ、ロイコシジンＢ、ロイコシジンＭ、表皮剥脱毒素Ａ、表皮剥脱毒素Ｂ、Ｖ８プロテアーゼ、ヒアルロン酸リアーゼ、リパーゼ、スタフィロキナーゼ、エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素−１、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−１→６グルコサミン、カタラーゼ、βラクタマーゼ、テイコ酸、ペプチドグリカン、ペニシリン結合タンパク質、走化性阻害タンパク質、補体阻害因子、Ｓｂｉ、５型抗原、８型抗原、リポテイコ酸、および、宿主分子を認識する微生物表面成分からなる群から選択される１つ以上のさらなる黄色ブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項１または7に記載の組成物。
15. アジュバントをさらに含む、請求項１または7に記載の組成物。
16. 前記アジュバントが、フラジェリン、フロイント完全または不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノール、イスコマトリックス、およびリポソームポリカチオンＤＮＡ粒子からなる群から選択される、請求項15に記載の組成物。

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