CN103717234A - 治疗和预防金黄色葡萄球菌感染及相关病状的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预防和治疗受试者的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的方法和组合物。本发明的治疗性组合物包含杀白细胞素E和/或D蛋白或多肽和抗杀白细胞素E和/或D抗体。本发明进一步涉及鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂和LukE/D-白细胞结合的抑制剂的方法。

Description

治疗和预防金黄色葡萄球菌感染及相关病状的方法
本申请要求2011年6月19日提交的美国临时专利申请序列号61/498,596的权益，其据此通过引用整体并入。
技术领域
本发明涉及筛选、治疗和预防金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌相关病状的方法。
发明背景
金黄色葡萄球菌(“S.aureus”)是超过25％的人口共生定植的细菌。重要的是，这种生物能够突破其初始定植部位，导致细菌传播和疾病。金黄色葡萄球菌是医院感染的主要原因，是感染性心内膜炎以及皮肤和软组织感染最常见的病原，并且是食物传染疾病的四大主要原因之一。总体来说，在美国医院金黄色葡萄球菌每年感染超过120万患者。耐抗生素菌株(即，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株)，包括耐受被视为对金黄色葡萄球菌感染的最后防线的抗生素，万古霉素(vancomycin)的菌株的出现进一步突显了金黄色葡萄球菌对人类健康的威胁。这些事实突显了研发对这种重要病原体的新型疗法的重要性。
金黄色葡萄球菌产生很多不同的毒力因子和毒素，使这种细菌能够中和并经受住不同种类的免疫细胞，特别是组成身体一级防御系统的白血细胞亚群的攻击。这些毒力因子和毒素的产生使金黄色葡萄球菌维持感染状态(见Nizet，“Understanding How Leading BacterialPathogens Subvert Innate Immunity to Reveal Novel TherapeuticTargets,”J.AllergyClin.Immunol.120(1)：13-22(2007))。在这些毒力因子中，金黄色葡萄球菌产生几种双组分白细胞毒素，其通过两种非相关蛋白或亚基的协同作用损坏宿主防御细胞和红细胞的膜(见Menestrina等人，“Mode of Action of Beta-Barrel Pore-Forming Toxinsof the Staphylococcal Alpha-Hemolysin Family，”Toxicol.39(11)：1661-1672(2001))。在这些组分白细胞毒素中，γ-溶血素(HlgAB和H1gCB)和Pantone-Valentine杀白细胞素(PVL)最有特征。
杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性涉及两个组分或亚基的作用。第一亚基命名为S类亚基(即，“慢洗脱型”)，而第二亚基命名为F类亚基(即，“快洗脱型”)。S和F亚基协同作用以在白血细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞(总称为吞噬细胞)上形成孔隙(见Menestrina等人，“Mode ofAction of Beta-Barrel Pore-FormingToxins of the Staphylococcal Alpha-Hemolysin Family，”Toxicol.39(11)：1661-1672(2001))。双组分毒素在靶细胞膜上形成孔隙的机制未完全了解。提出的这些毒素的作用机制涉及S亚基很可能通过受体与靶细胞膜的结合，接着是F亚基与S亚基的结合，从而形成寡聚体，寡聚体依次形成插入靶细胞膜内的前孔隙(pre-pore)(Jayasinghe等人，“The Leucocidin Pore：Evidencefor an Octamer With Four LukFSubunits and Four LukS Subunits Altemating Around a Central Axis，”Protein.Sci.14(10)：2550-2561(2005))。双组分白细胞毒素形成的孔隙通常为阳离子选择型。孔隙形成经由溶解导致细胞死亡，已经报道在靶白血细胞的情况下，这由归因于阳离子流入的渗透不平衡引起(Miles等人，“The Staphylococcal Leucocidin Bicomponent Toxin FormsLarge Ionic Channels，”Biochemistry40(29)：8514-8522(2001))。
除PVL(也称为杀白细胞素S/F-PV或LukSF-PV)和γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)外，已知金黄色葡萄球菌产生的双组分白细胞毒素的清单包括杀白细胞素E/D(“LukE/D”)、杀白细胞素A/B(“LukAB”)和杀白细胞素M/F(“LukMF”)。因此，这些双组分杀白细胞素的S类亚基包括HlgA、HlgC、LukE、LukS-PV、LukA和LukM，而F类亚基包括HlgB、LukD、LukF-PV、LukB和LukF’-PV。金黄色葡萄球菌S和F亚基并非杀白细胞素特异性。即，它们可互换，以致其它双组分组合可在白血细胞中产生功能性孔隙，大大增多了白细胞毒素清单(Meyer等人，“Analysis of the Specificity of Panton-ValentineLeucocidin and Gamma-Hemolysin F Component Binding，”Infect.Immun.77(1)：266-273(2009))。
设计治疗MRSA感染的有效疗法特别具有挑战性。除对甲氧西林和相关抗生素的抗性外，还已发现MRSA具有显著水平的对大环内酯(例如，红霉素(erythromycin))、β-内酰胺酶抑制剂组合(例如，Unasyn、Augmentin)和氟喹诺酮(fluoroquinolone)(例如，环丙沙星(ciprofioxacin))以及对氯洁霉素(clindamycin)、三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)/磺胺甲噁唑(sulfamethoxisol)(Bactrim)和利福平(rifampin)的抗性。在严重的金黄色葡萄球菌感染情况下，临床医师已经采取静脉注射万古霉素。然而，已经有金黄色葡萄球菌对万古霉素抗性的报道。因此，需要研发有效抗击金黄色葡萄球菌感染的新疗法。
本发明涉及克服本领域的这些和其它限制。
发明概述
本发明的第一方面涉及包含治疗有效量的分离杀白细胞素E(LukE)蛋白或其多肽、分离杀白细胞素D(LukD)蛋白或其多肽，或其组合，和药学上可接受的载体的组合物。
本发明的另一方面涉及在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫的方法。这种方法涉及按在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫有效的量施用本发明的组合物。
本发明的另一方面涉及包含治疗有效量的选自由LukE抗体、LukD抗体或其组合组成的组的抗体和药学上可接受的载体的组合物。
本发明的另一方面涉及预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方法。这种方法涉及按预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量施用包含选自由LukE抗体、LukD抗体或其组合组成的组的抗体的组合物。
本发明的再一方面涉及治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方法。这种方法涉及按治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量施用包含LukE/D介导的细胞毒性的一种或多种抑制剂的组合物。
本发明的再一方面涉及预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度的方法。这种方法涉及培养经由来自受试者的液体或组织样品从感染受试者获得的金黄色葡萄球菌并且量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达。将来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量做比较，并且基于所述比较预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度。
本发明的另一方面涉及治疗患有金黄色葡萄球菌感染的受试者的方法。这种方法涉及培养经由来自受试者的液体或组织样品从感染受试者获得的金黄色葡萄球菌并且量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达。将来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量做比较，并且基于这种比较确定对受试者的适合疗法。所述方法进一步涉及向受试者施用确定的适合疗法以治疗金黄色葡萄球菌感染。
本发明的另一方面涉及鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂的方法。这种方法涉及提供细胞群、含有LukE/D的制剂和候选LukE/D抑制剂。在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有LukE/D的所述制剂，并且在所述候选抑制剂存在和缺乏时测量LukE/D介导的细胞毒性。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时细胞毒性的测得量并且基于这种比较鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂。
本发明的另一方面涉及鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂的方法。这种方法涉及提供一群白细胞、含有LukE和LukD的制剂和候选抑制剂。在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述白细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制剂，并且在所述候选抑制剂存在和缺乏时测量白细胞群上的孔隙形成。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时孔隙形成的测得量，并且基于这种比较鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂。
本发明的另一方面涉及鉴定LukE和/或LukD白细胞结合的抑制剂的方法。这种方法涉及提供一群白细胞、含有经可检测标记的LukE和LukD的制剂和候选抑制剂。在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有经可检测标记的LukE和LukD的所述制剂，并且在所述候选抑制剂存在和缺乏时测量经标记LukE和/或LukD与白细胞群的结合。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时LukE和/或LukD白细胞结合的测得量，并且基于这种比较鉴定LukE和/或LukD白细胞结合的抑制剂。
金黄色葡萄球菌作为病原体的巨大成功部分是由于其表达大量损害宿主的因子的能力。在这些因子中有许多分泌到细胞外环境的细菌蛋白毒素，在那里它们通过杀伤宿主细胞起作用。杀白细胞素E/D(LukE/D)是金黄色葡萄球菌产生的缺乏特征性的毒素。如本文所证明，这种毒素靶向并杀伤是涉及于保护宿主免受金黄色葡萄球菌感染的关键免疫细胞的宿主白细胞。LukE/D对体内发病机制至关重要的发现突显了这种毒素在疾病过程中的重要性。如本文所述，免疫接种LukE和/或LukD对金黄色葡萄球菌产生中和抗体。因此，主动和/或被动疫苗策略提供了预防金黄色葡萄球菌感染的新型治疗策略。另外，对LukE/D介导的细胞毒性的直接抑制提供了治疗患有金黄色葡萄球菌感染的个体的新方式。
附图简述
图1A-1B显示，缺乏agr基因座(ΔagrΔrot)的金黄色葡萄球菌中rot基因的缺失使在小鼠中的毒力恢复到野生型(“WT”)水平并且导致LukE/D的过量生成。图1A为存活曲线，显示ΔagrΔrot双突变体在小鼠中表现出WT毒力特征。在静脉注射约1×107CFU的金黄色葡萄球菌WT、Δagr或ΔagrΔrot双突变体后监测小鼠的存活率。每组小鼠的总数为N=6。使用对数秩(Mantel-Cox)检验测定曲线之间的统计显著性。***，p≤0.0005。图1B中，在ΔagrΔrot双突变体中，白细胞毒素的生成恢复。示出了来自下列菌株的TCA沉淀细菌培养上清液(于RPMI+CAS中生长5h)的蛋白质样品的免疫印迹：WT、Δagr和ΔagrΔrot。阴性对照条带含有来自各自细胞毒素缺失突变体(ΔlukE/D、ΔlukA/B、Δhla、ΔhlgC)的TCA沉淀上清液。还探测了所有LukE免疫印迹中ΔlukE/DΔhlgACB双突变体胞外蛋白作为LukE抗体交叉反应性的对照。
图2A-2C说明，rot单独缺失导致动物体内的超高毒力，去阻遏引起的表现型和作为结果发生的LukE/D过量生成。图2A的存活曲线示出了与亲本WT菌株相比，Δrot突变体的超高毒力。在静脉注射约1×107CFU的金黄色葡萄球菌WT和Δrot菌株后监测小鼠的存活率。每组小鼠的总数：WT，N=17；Δrot，N=12。在转录阻遏因子Rot缺乏时LukE/D的生成增加，而其它白细胞毒素的生成很大程度上未受影响。图2B的免疫印迹中示出了来自下列菌株的TCA沉淀细菌培养上清液(于RPMI+CAS中生长5h)的蛋白质样品：WT和Δrot。阴性对照条带含有来自各毒素-rot双突变体(ΔrotΔlukE/D、ΔrotΔlukA/B、ΔrotΔhla和ΔrotΔhlgACB)的TCA沉淀上清液。还探测了所有LukE免疫印迹中ΔrotΔlukE/DΔhlgACB三突变体胞外蛋白作为LukE抗体交叉反应性的对照。如图2C的存活曲线所示，Δrot突变体的超高毒力是由于LukE/D的生成增加。静脉注射约1×107CFU的金黄色葡萄球菌WT、Δrot和ΔrotΔlukE/D后监测小鼠的存活率。使用对数秩(Mantel-Cox)检验测定存活曲线之间的统计显著性。**，p≤0.005；***，p≤0.0005。
图3A-3B显示，Rot与lukE/D启动子结合并且阻遏基因表达。如图3A所示，最佳lukE/D基因表达依赖于Rot的去阻遏。lukE/D启动子区与GFP的转录融合用于测量在下列菌株背景(WT、Δagr、Δrot和ΔagrΔrot)下的肉汤培养中启动子的活化。随时间推移测量GFP荧光并且在标准化为600nm下的细菌光密度后将值表示为相对荧光单位(RFU)。所示值为一式三份进行的3次实验的结果。图3B中，Rot与lukE/D启动子结合。图3B是与M280链霉亲和素(streptavidin)磁珠结合并用金黄色葡萄球菌全细胞溶解产物培育的生物素化基因内DNA(非特异性)或lukE/D启动子DNA的启动子拉下的免疫印迹。经由免疫印迹使用抗Rot抗体检测Rot。
图4A-4F说明，在系统感染的小鼠模型中ΔlukE/D单突变体的毒力显著减弱。图4A和4B示出了对金黄色葡萄球菌Newman中lukE/D缺失的验证。图4A中，示出了具有lukE特异性引物的金黄色葡萄球菌基因组DNA的PCR。图4B中示出了来自下列菌株的TCA沉淀细菌培养上清液(于RPMI+CAS中生长5h)的蛋白质样品的免疫印迹：WT、ΔlukE/D、ΔlukE/D：：plukE/D、ΔhlgACB和ΔhlgACB。还探测了ΔlukE/D突变体胞外蛋白作为LukE抗体交叉反应性的对照。图4C-4F显示，在小鼠中ΔlukE/D突变体的毒力严重受损。图4C和4D中，静脉注射约1×107CFU(图4C)或约1×108CFU(图4D)的金黄色葡萄球菌WT、ΔlukE/D和ΔlukE/D：：plukE/D菌株后监测小鼠的存活率。每组小鼠的总数为N=6。使用对数秩(Mantel-Cox)检验测定存活曲线之间的统计显著性。**，p≤0.005；***，p≤0.0005。图4E和4F描绘了对感染约1×107CFU对图4C和4D描述的相同菌株96h后，来自肾脏的细菌CFU(图4E)和宏观病理学(图4F)的列举。箭头指出肾脓肿的位置。使用单因素(1-Way)ANOVA与Tukey的多重比较后续检验测定统计显著性。**，p≤0.005；***，p≤0.0005。
图5A-5E显示，LukE/D对人免疫细胞有毒并且在人免疫细胞中形成孔隙。图5A为细胞活力曲线，显示纯化重组LukE/D对人单核细胞样细胞系THP-1有毒。用重组LukE、LukD或LukE+LukD(LukE/D)的混合物使THP-1细胞系中毒。在中毒1h后使用CellTiter监测细胞活力，其中经培养基处理的细胞设为100％能活。结果表示三份样品的平均数±S.D.。如图5B的细胞活力曲线所示，纯化重组LukE/D对人HL60细胞系无毒。如以上使HL60细胞系中毒并且在中毒1h后使用CellTiter监测细胞活力，其中经培养基处理的细胞设为100％能活。相反，图5C的细胞活力曲线显示，纯化重组LukE/D对原代人(左图)和原代鼠(右图)中性粒细胞(也称为多形核中性粒细胞或PMN)有毒。如以上使PMN中毒并且在中毒1h后使用CellTiter监测细胞活力，其中经培养基处理的细胞设为100％能活。如图5D所示，LukE/D通过在细胞膜上形成孔隙介导对宿主细胞THP-1细胞的细胞毒性。用纯化LukE/D培育THP-1和HL60细胞，并且用溴化乙锭并入测定测量孔隙形成。示出了对于THP-1和HL60而言，三次实验的平均荧光。图5E示出了经LukE/D处理(30μg/ml)的和对照(无毒性)THP-1细胞的溴化乙锭摄取的荧光显微镜图像。
图6A-6B说明，LukE/D细胞毒性经亲和力纯化α-LukE多克隆抗体中和。在用0.1μgα-LukE多克隆抗体或免疫前血清培育后，用1.5μg的重组LukE/D使THP-1细胞中毒。分别使用CellTiter和溴化乙锭监测细胞活力(图6A)和孔隙形成(图6B)。对于CellTiter测定而言，经培养基处理的细胞设为100％活力。结果表示两份样品的平均数±标准偏差(S.D.)。
发明详述
本发明的第一方面涉及包含治疗有效量的分离LukE蛋白或其多肽、分离LukD蛋白或其多肽或其组合，和药学上可接受的载体的组合物。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含分离LukE蛋白或多肽。在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含分离LukD蛋白或多肽。在本发明的再一实施方案中，所述组合物包含LukE和LukD蛋白或多肽。
根据本发明的这个方面，适合的分离LukE蛋白包括源自任何金黄色葡萄球菌菌株的LukE蛋白。来自适合本发明组合物的不同金黄色葡萄球菌菌株的LukE蛋白的氨基酸序列示于以下表1中(即，SEQID No：1-10)。表1的SEQ ID NO：11是不同金黄色葡萄球菌菌株的LukE蛋白上展示出高水平的序列同一性的LukE共有序列。相应地，在本发明的一个实施方案中，分离LukE蛋白包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，分离LukE蛋白包含与SEQID NO：11具有约70-80％序列相似性，更优选与SEQ ID NO：11具有约80-90％序列相似性，并且更优选与SEQ ID NO：11具有约90-95％序列相似性，并且最优选与SEQ ID NO：11具有约95-99％序列相似性的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含LukE的分离免疫原性多肽。适合的LukE多肽长度为约50至约100个氨基酸。更优选地，LukE多肽长度介于约100-200个氨基酸之间，更优选长度介于约200-250个氨基酸之间，并且最优选长度介于约250-300个氨基酸之间。全长LukE的N端氨基酸残基表示天然分泌/信号序列。因此，SEQ ID NO：1-10的每一个和SEQ ID NO：11中的氨基酸残基29-311表示LukE的“成熟”分泌形式。相应地，SEQ ID NO：1-10的每一个和SEQ ID NO：11中的氨基酸残基1-311称为LukE的“未成熟”形式。相应地，在本发明的一个实施方案中，LukE多肽包含SEQ IDNO：11的氨基酸残基29-311。可选地，本发明的LukE多肽包含SEQID NO：11的氨基酸残基48-291、氨基酸29-301或氨基酸48-301。这些LukE多肽缺乏LukE活性，但是保持了抗原性。在任何一种情况下，适合的LukE多肽还包括包含与SEQ ID NO：11的氨基酸残基29-311、SEQ ID NO：11的氨基酸残基48-291、SEQ ID NO：11的氨基酸残基29-301或SEQ ID NO：11的氨基酸残基48-301具有约70-80％序列相似性，优选80-90％序列相似性，更优选90-95％序列相似性且最优选95-99％序列相似性的氨基酸序列的那些多肽。
根据本发明的这个方面，适合的分离LukD蛋白包括源自任何金黄色葡萄球菌菌株的那些蛋白。来自适合本发明组合物的不同金黄色葡萄球菌菌株的LukD蛋白的氨基酸序列示于以下表2中(即，SEQ IDNo：12-21)。表2的SEQ ID NO：22是不同金黄色葡萄球菌菌株的LukD蛋白上展示出高水平的序列同一性的LukD共有序列。相应地，在本发明的一个实施方案中，分离LukD蛋白包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，分离LukD蛋白包含与SEQ IDNO：22具有约70-80％序列相似性，更优选与SEQ ID NO：22具有约80-90％序列相似性，并且更优选与SEQ ID NO：22具有约90-95％序列相似性，并且最优选与SEQ ID NO：22具有约95-99％序列相似性的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含LukD的分离免疫原性多肽。适合的LukD多肽长度为约50至约100个氨基酸。更优选地，LukD多肽长度介于约100-200个氨基酸之间，更优选长度介于约200-250个氨基酸之间，并且最优选长度介于约250-300个氨基酸之间。全长LukD的N端氨基酸残基表示天然分泌/信号序列。因此，SEQ ID NO：12-21的每一个和SEQ ID NO：22中的氨基酸残基27-327表示LukD的成熟分泌形式。相应地，SEQ ID NO：12-21的每一个和SEQ ID NO：22中的氨基酸残基1-327称为LukD的“未成熟”形式。相应地，在本发明的一个实施方案中，LukE多肽包含SEQ IDNO：22的氨基酸残基27-327。可选地，本发明的LukE多肽包含SEQID NO：22的氨基酸残基46-307、27-312和46-312。这些LukD多肽缺乏LukD活性，但是保持了抗原性。在任何一种情况下，适合多肽还包括包含与SEQ ID NO：22的氨基酸残基27-327、SEQ ID NO：22的氨基酸残基46-307、SEQ ID NO：22的氨基酸残基27-312或SEQ IDNO：22的氨基酸残基46-312具有约70-80％序列相似性，优选80-90％序列相似性，更优选90-95％序列相似性且最优选95-99％序列相似性的氨基酸序列的那些多肽。
表1-金黄色葡萄球菌LukE序列比对
金黄色葡萄球菌菌株
                    →
Newman
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MW2
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N315
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D30
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Mu50
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TCH_70
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LukE共有序列
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Newman
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MW2
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COL
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N315
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Mu50
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TCH_70
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MRSA131
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      **************************************************
LukE共有序列
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Newman
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COL
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LukE共有序列
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Newman
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COL
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LukE共有序列
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Newman
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N315
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D30
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LukE共有序列
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Newman
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MW2
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COL
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N315
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D30
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  **************************************************
LukE共有序列
SSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNW
Figure BDA0000465181200000191
                  ********************
LukE共有序列      KTHEIKVKGHN
→描绘了分泌型LukE蛋白的起点
表2-LukD氨基酸序列比对
                    →
Newman
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MW2
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COL
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TCH_70
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D30
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N315
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Mu50
MKMKKLVKSSVASSIALLLLSNTVDAAQHITPVSEKKVDDKITLYKTTAT50SEQ ID NO：21
      **************************************************
LukD共有序列
MKMKKLVKSSVASSIALLLLSNTVDAAQHITPVSEKKVDDKITLYKTTAT50SEQ ID NO：22
Newman
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USA_300_FPR3757
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SDNDKLNISQILTFNFIKDKSYDKDTLVLKAAGNINSGYKKPNPKDYNYS100
TCH_70
SDNDKLNISQILTFNFIKDKSYDKDTLVLKAAGNINSGYKKPNPKDYNYS100
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SDNDKLNISQILTFNFIKDKSYDKDTLVLKAAGNINSGYKKPNPKDYNYS100
N315
SDNDKLNISQILTFNFIKDKSYDKDTLVLKAAGNINSGYKKPNPKDYNYS100
Mu50
SDNDKLNISQILTFNFIKDKSYDKDTLVLKAAGNINSGYKKPNPKDYNYS100
      **************************************************
LukD共有序列
SDNDKLNISQILTFNFIKDKSYDKDTLVLKAAGNINSGYKKPNPKDYNYS
Newman
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MW2
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USA_300_FPR3757
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COL
QFYWGGKYNVSVSSESNDAVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTLGYSYGGDINI150
USA_300_TCH1516
QFYWGGKYNVSVSSESNDAVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTLGYSYGGDINI150
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QFYWGGKYNVSVSSESNDAVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTLGYSYGGDINI150
TCH_70
QFYWGGKYNVSVSSESNDAVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTLGYSYGGDINI150
D30
QFYWGGKYNVSVSSESNDAVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTLGYSYGGDINI150
N315
QFYWGGKYNVSVSSESNDAVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTLGYSYGGDINI150
Mu50
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      **************************************************
LukD共有序列
QFYWGGKYNVSVSSESNDAVNVVDYAPKNQNEEFQVQQTLGYSYGGDINI
Newman
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USA_300_FPR3757
SNGLSGGLNGSKSFSETINYKQESYRTTIDRKTNHKSIGWGVEAHKIMNN200
COL
SNGLSGGLNGSKSFSETINYKQESYRTTIDRKTNHKSIGWGVEAHKIMNN200
USA_300_TCH1516
SNGLSGGLNGSKSFSETINYKQESYRTTIDRKTNHKSIGWGVEAHKIMNN200
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TCH_70
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Mu50
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LukD共有序列
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Newman
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MW2
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COL
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D30
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N315
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Mu5
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LukD共有序列
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Newman
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LukD共有序列
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Figure BDA0000465181200000281
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LukD共有序列      TSTYEVDWQNHTVKLIGTDSKETNPGV
→描绘了分泌型LukD蛋白的起点
因此，除非指出相反，天然LukE和LukD的未成熟和成熟形式及与天然LukE和LukD具有小于100％相似性的序列(即，天然序列和相似的类似物，本文统称为“LukE”和“LukD”)可用于本发明的方法中。
本发明的LukE和LukD蛋白和多肽可能在一个或多个附加氨基酸插入、取代或缺失方面分别不同于指定为SEQ ID NO：1-11和12-22的天然多肽，例如SEQ ID NO：1-22中的一个或多个氨基酸残基可经作为功能等效物的类似极性的另一氨基酸取代，导致沉默改变。换言之，相对于天然序列的变化不会明显地减弱天然LukE或LukD的基本性质。可根据本文公开的方法(例如，细胞毒性测定和膜损伤测定)筛选LukE或LukD的任何此类类似物以确定其是否保持了天然LukE或LukD活性。这些杀白细胞素中的取代可能选自氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸。
在其它实施方案中，为了使LukE和/或LukD解毒可产生非保守性改变(例如，一个或氨基酸取代、缺失和/或添加)。解毒LukE和LukD可用于活性疫苗组合物中。分子改变可通过本领域众所周知的方法实现，包括使用单链模板(Kunkel等人，Proc.Acad.Sci.，USA82：488-492(1985)，其据此通过引用整体并入)、双链DNA模板(Papworth等人，Strategies9(3)：3-4(1996)，其据此通过引用整体并入)在质粒模板上的引物延伸，和通过PCR克隆(Braman，J.(编辑)，INVITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS，第2版，Humana Press，Totowa，N.J.(2002)，其据此通过引用整体并入)。本文描述了确定LukE和LukD中的指定分子改变是否降低了LukE/D细胞毒性的方法。
在本发明的一个优选实施方案中，利用高度纯化的LukE/LukD制剂。实例包括从表1和2中举例说明的不同菌株纯化的LukE和LukD蛋白或多肽。纯化LukE和LukD毒素的方法在本领域中已知(Gravet等人，“Characterization of a Novel Structural Member，LukE-LukD，of the Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family,”FEBS436：202-208(1998)，其据此通过引用整体并入)。如本文所使用，“分离”蛋白或多肽指已经和与之自然缔合的其它蛋白质、脂质和核酸分开的蛋白或多肽。可通过任何适当标准方法测量纯度，例如通过HPLC分析的柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明的分离蛋白或多肽可从自然来源纯化，通过重组DNA技术或通过化学技术生成。
在本发明这一方面的一个实施方案中，组合物的分离LukE或LukD蛋白或其多肽与免疫原性载体分子连接。在一些情况下，免疫原性载体分子可与免疫原性蛋白或肽共价或非共价结合。示例性免疫原性载体分子包括但不限于牛血清白蛋白、鸡蛋卵白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、甲状腺球蛋白、肺炎球菌荚膜多糖、CRM197和脑膜炎球菌外膜蛋白。
在本发明的某些实施方案中，所述组合物可进一步含有一种或多种另外的金黄色葡萄球菌抗原。适合的金黄色葡萄球菌抗原包括但不限于α溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝固酶、凝集因子A、凝集因子B、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白、MHC类似蛋白、多糖细胞内粘连蛋白、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、Panton-Valentine杀白细胞素、杀白细胞素A、杀白细胞素B、杀白细胞素M、剥脱性毒素A、剥脱性毒素B、V8蛋白酶、透明质酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1、聚-N-琥珀酰β-1→6葡萄糖胺、过氧化氢酶、β-内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素结合蛋白、趋化性抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和识别宿主蛋白的微生物表面蛋白(例如，铁表面决定簇、丝氨酸-天冬氨酸重复蛋白)。
根据本发明的这个方面，所述组合物可进一步包含一种或多种佐剂。适合佐剂在本领域中已知并且包括但不限于鞭毛蛋白、弗氏完全或不完全佐剂(Freund’s complete or incomplete Adjuvant)、氢氧化铝、溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚、iscomatrix和脂质体聚阳离子DNA颗粒。
在其中打算将治疗性组合物用作活性疫苗的实施方案中，可改变LukE和/或LukD蛋白或多肽以便表现出更低的毒性。为了降低LukE和LukD毒性的改变包括化学处理(例如，如上所述特定氨基酸残基的修饰)或与另一部分(例如，与另一细菌抗原(例如细菌多糖或细菌糖蛋白))接合。已知为了解毒(或降低毒性)对其它金黄色葡萄球菌毒素的化学改变。在本领域中已知和/或本文描述了确定指定改变是否降低了LukE或LukD毒性的方法。
通过与药学上可接受的载体和任选药学上可接受的赋形剂一起配制LukE和LukD制备本发明的治疗性组合物。如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋形剂”(例如，添加剂(例如稀释剂、免疫刺激剂、佐剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂))在采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒。药学上可接受的载体的实例包括(例如)经磷酸盐、柠檬酸盐和另一有机酸缓冲的水。在本发明中可能有用的药学上可接受的赋形剂的代表性实例包括抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；佐剂(经选择以避免佐剂诱导的毒性，例如据此通过引用整体并入的美国专利6,355,625中描述的β-葡聚糖，或粒细胞集落刺激因子(GCSF))；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如
Figure BDA0000465181200000311
聚乙二醇(PEG)和
可通过混合具有所需纯净度的活性成分与药学上可接受的载体和任选赋形剂和/或附加活性剂制备呈冻干制剂或水溶液形式的本发明的治疗性组合物用于储存。
本发明的另一方面涉及在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫的方法。这种方法涉及按在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫有效的量施用本发明的组合物。根据本发明的这个方面治疗的适合受试者是有发展金黄色葡萄球菌感染风险的受试者。
根据本发明的这个方面，施用给受试者以对金黄色葡萄球菌感染产生免疫的组合物的治疗有效量是产生体液(即，抗体介导的)免疫反应所必需的量。优选地，治疗有效量的本发明组合物的施用在受试者中诱导了对金黄色葡萄球菌的中和免疫反应。为了在受试者中实现有效免疫反应，所述组合物可进一步含有如上所述的一种或多种另外的金黄色葡萄球菌抗原或佐剂。在本发明这个方面的一个替代实施方案中，在施用本发明组合物之前、之后或同时与所述组合物分开向受试者施用佐剂。
以下描述了与本发明这个方面相关的施用方法和治疗有效剂量。
本发明的另一方面涉及包含治疗有效量的选自杀白细胞素E(LukE)抗体、杀白细胞素D(LukD)抗体或其组合的抗体和药学上可接受的载体的组合物。
在本发明这个方面的一个实施方案中，所述组合物包含LukE抗体或其抗原结合片段。适合的LukE抗体包括识别SEQ ID NO：11的氨基酸序列中的一个或多个表位的那些抗体。同样，在另一实施方案中，所述组合物包含LukD抗体或其抗原结合片段。适合的LukD抗体识别SEQ ID NO：22的氨基酸序列中的一个或多个表位。在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含LukE和LukD抗体或其抗原结合片段。优选地，所述组合物包含一种或多种中和LukE和/或LukD抗体。在再一实施方案中，抗LukE和/或抗LukD抗体组合物为多价，因为其还含有特异性结合另一细菌抗原(并且任选中和其它细菌抗原)的抗体。例如，所述组合物可包含识别一种或多种另外的金黄色葡萄球菌抗原，包括但不限于上述一种或多种金黄色葡萄球菌抗原的一种或多种抗体。
为了本发明的目的，术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、抗体的基因工程化形式及其组合。更具体地，可与术语“免疫球蛋白”交换使用的术语“抗体”包括全长(即，自然发生或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)及其同样可能在自然界中自然发生或合成的免疫活性片段(即，包括全长免疫球蛋白分子的特定结合部分)。因此，术语“抗体片段”包括抗体的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等。不管结构如何，抗体片段与全长抗体识别的相同抗原结合，并且，在本发明的情况下，特异性结合LukE、LukD或LukE/D复合物。制备和筛选抗体片段的方法在本领域中众所周知。
在本发明中，抗LukE抗体可能与其它葡萄球菌(Staphylococcus)杀白细胞素S亚基例如HlgC、LukS-PVL、HlgA、LukS-I、LukA和LukM具有一定程度的交叉反应性。同样，在一些实施方案中，本发明的抗LukD抗体与其它葡萄球菌杀白细胞素F亚基例如LukF’PV、LukF-PV、LukB、LukF-I和HlgB具有一定程度的交叉反应性。抗LukE和/或抗LukD抗体可分别抑制或降低LukE活性和LukD活性。在一些实施方案中，抗LukE和/或抗LukD抗体分别中和(例如，大体上消除)LukE和LukD活性。
自然发生的抗体通常具有两条相同重链和两条相同轻链，每条轻链通过链间二硫键与重链共价连接并且多个二硫键进一步将两条重链相互连接。单独的链可折叠成具有相似尺寸(110-125个氨基酸)和结构，但是功能不同的结构域。轻链可包含一个可变结构域(VL)和/或一个恒定结构域(CL)。重链也可包含一个可变结构域(VH)和/或，由抗体的类别或同型而定，3或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人类中，同型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，IgA和IgG进一步细分为亚类或亚型(IgA1-2和IgG1-4)。
一般地，一个抗体与另一抗体间，尤其在抗原结合位点的位置处可变结构域显示出相当大的氨基酸序列可变性。在每条VL和VH中存在3个区域，称为高变区或互补决定区(CDR)，其受称为骨架可变区的低可变区支撑。本发明抗体包括IgG单克隆抗体以及抗体片段或工程化形式。例如，这些是Fv片段或蛋白质，其中举例说明的抗体的CDR和/或可变结构域工程化为单链抗原结合蛋白。
将抗体由VL和VH结构域组成的部分指定为Fv(可变区片段)并且构成抗原结合位点。单链Fv(scFv或SCA)是在一条多肽链上含有VL结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个结构域的N端和另一个结构域的C端通过柔性连接子连接。用于产生单链抗体的肽连接子通常是经选择以确保发生VL和VH结构域的恰当三维折叠的柔性肽。连接子通常为10-50个氨基酸残基，并且在一些情况下更短，例如约10-30氨基酸残基，或12-30个氨基酸残基，或甚至15-25个氨基酸残基。此类连接子肽的实例包括后面是一个丝氨酸残基的4个甘氨酸残基的重复序列。
单链抗体缺乏它们所来源的全抗体的一些或全部恒定结构域。因此，它们可克服与使用全抗体相关的一些问题。例如，单链抗体往往没有重链恒定区和其它生物分子之间的某些非期望相互作用。另外，单链抗体比全抗体小得多并且可具有比全抗体更强的渗透性，使单链抗体更有效地定位于并结合靶抗原结合位点。此外，单链抗体相对小的尺寸使其与全抗体相比不太可能在受者中引起有害免疫反应。
Fab(抗原结合片段)指抗体由VL、CL、VH和CH1结构域组成的片段。仅在木瓜蛋白酶消化后生成的片段称为Fab并且未保留重链铰链区。胃蛋白酶消化后，生成保留了重链铰链的各种Fab。具有完整链间二硫键的那些片段称为F(ab′)2，而当未保留二硫键时产生单个Fab′。F(ab′)2片段对抗原具有比单价Fab片段更高的亲合力。
Fc(结晶片段)是抗体包含配对重链恒定结构域的部分或片段的名称。在IgG抗体中，例如，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc进一步包含CH4结构域。Fc与Fc受体结合、补体介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的活化相关。对于为多种IgG样蛋白的复合物的抗体例如IgA和IgM而言，复合物形成需要Fc恒定结构域。
最后，铰链区将抗体的Fab和Fc部分分开，提供了Fab彼此相对和相对于Fc的移动性，以及包括供两条重链共价连接的多个二硫键。
“抗体”特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或另外与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由化学活性表面类的分子，例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可为“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列呈线性出现。在构象表位中，相互作用点出现在蛋白质上相互分开的氨基酸残基，即通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸上。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常经变性溶剂处理而失去。表位通常包括呈独特空间构象的至少3个，并且更通常地，至少5个或8-10个氨基酸。在显示一种抗体阻碍另一抗体与靶抗原结合的能力的简单免疫测定中可检验识别相同表位的抗体。
本发明的单克隆抗体可为鼠、人、人源化或嵌合抗体。人源化抗体为重组蛋白，其中来自一个物种的抗体，例如啮齿动物、兔、狗、山羊、马或鸡抗体(或任何其它适合动物抗体)的CDR转移到人重链和轻链可变结构域中。抗体分子的恒定结构域源自人抗体的恒定结构域。制备人源化抗体的方法在本领域中众所周知。嵌合抗体优选具有大体上或专源自人抗体恒定区的恒定区和大体上或专源自来自于除人以外的哺乳动物的可变区的序列的可变区。也可通过用相应的人序列置换鼠(或非人类哺乳动物)除高变区或互补决定区(CDR)外的可变区使嵌合过程更加有效。除CDR外的可变区也称为可变骨架区(FR)。本发明的还有其它单克隆抗体为双特异性，因为它们对LukE和LukD均有特异性。双特异性抗体优选为人或人源化抗体。
可根据标准方法获得上述抗体。例如，可向受试者(例如，哺乳动物(例如人或小鼠))施用LukE、LukD或LukE或LukD的免疫活性片段。杀白细胞素本身可用作免疫原或它们可附着于载体蛋白或其它物品例如琼脂糖珠粒上。哺乳动物产生抗体后，分离抗体生成细胞，例如脾细胞的混合物，从中获得单克隆抗体。可通过从混合物中分离单独抗体生成细胞并且通过(例如)使其与肿瘤细胞(例如骨髓瘤细胞)融合使其永生化而生成单克隆抗体。使所得杂交瘤保持培养并且从培养基中收获单克隆抗体。
本发明的另一方面涉及预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方法。这种方法包括按预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量，施用包含选自由杀白细胞素E(LukE)抗体、杀白细胞素D(LukD)抗体或其组合组成的组的抗体的本发明组合物。
根据本发明的这个方面，金黄色葡萄球菌相关病状包括但不限于皮肤损伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血病、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征。
以下描述了与本发明这个方面相关的施用方法和治疗有效剂量。
本发明的再一方面涉及治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方法。这种方法涉及按治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量，施用包含LukE/D介导的细胞毒性的一种或多种抑制剂的组合物。
根据本发明的这个方面，LukE/D介导的细胞毒性的适合抑制剂包括蛋白或肽抑制剂、核酸抑制剂或小分子抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂为LukE抑制剂。适合的LukE抑制剂包括识别SEQ ID NO：11的氨基酸序列中的表位的抗体或抗体片段。在本发明的另一实施方案中，LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂为LukD抑制剂。适合的LukD抑制剂包括识别SEQ ID NO：22的氨基酸序列中的表位的抗体或抗体片段。
在本发明这个方面的另一实施方案中，LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制LukE和LukD相互作用。根据这个实施方案适合的抑制剂包括靶向LukE或LukD的相互作用区的抗LukE和/或LukD抗体。可选地，适合抑制剂包括与LukE和/或LukD的相互作用区结合的小分子。这些相互作用区可包括SEQ ID NO：11的氨基酸3-13、SEQID NO：11的氨基酸32-47、SEQ ID NO：11的氨基酸126-139、SEQ IDNO：11的氨基酸151-156和SEQ ID NO：11的氨基酸272-283。相互作用区还可包括SEQ ID NO：22的氨基酸3-17、SEQ ID NO：22的氨基酸33-51、SEQ ID NO：22的氨基酸94-113、SEQ ID NO：22的氨基酸115-131和SEQ ID NO：22的氨基酸229-2741。
在本发明这个方面的另一实施方案中，LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制LukE/D与白细胞的质膜结合。适合抑制剂包括识别与白细胞质膜相互作用的LukE和/或LukD表位的抗体或小分子。LukE和LukD与质膜相互作用的区域包括涵盖LukE的边缘结构域的氨基酸。这些氨基酸区域包括LukE SEQ ID NO：11的氨基酸57-75、SEQ IDNO：11的氨基酸162-198和SEQ ID NO：11的氨基酸230-273及LukDSEQ ID NO：22的氨基酸59-75、SEQ ID NO：22的氨基酸170-220和SEQ ID NO：22的氨基酸253-268。相应地，识别LukE和/或LukD的这些表位的抗体特别适合本发明的这个实施方案。
在本发明这个方面的另一实施方案中，LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂是防止LukE/D寡聚体复合物形成的试剂，阻碍LukE/LukD介导的孔隙形成的试剂或阻塞LukE/LukD孔隙的试剂。根据这个实施方案，LukE/LukD介导的孔隙的适合抑制剂包括环糊精和相关化合物及任何其它孔隙抑制剂，包括蛋白或肽抑制剂、核酸抑制剂或小分子抑制剂。
在本发明这个方面的又一实施方案中，LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂是调节LukE/D表达的内源性阻遏因子或活化因子的表达和/或活性的试剂。相应地，施用诱导或模拟为lukE和lukD表达的阻遏因子的毒素阻遏因子(“Rot”)的表达和或活性的试剂，由于阻碍毒素生成而抑制LukE/D介导的细胞毒性。在McNamara的美国专利申请公开第2003/0171563号中公开了模拟Rot表达和活性并且适合用于本发明方法中的适合试剂，其据此通过引用整体并入。同样，施用抑制为lukE和lukD表达的活化因子的SaeRS的表达或活性的试剂，由于阻碍毒素生成而抑制LukE/D介导的细胞毒性。
为了本发明这个和其它方面的目的，目标“受试者”涵盖任何动物，优选哺乳动物，更优选人。在为了预防受试者金黄色葡萄球菌感染施用本发明组合物的情况下，目标受试者涵盖有受金黄色葡萄球菌感染风险的任何受试者。特别易感的受试者包括婴儿和青少年，以及免疫力低下的青少年、成人和老人。然而可根据本发明的方法治疗有金黄色葡萄球菌感染风险的任何婴儿、青少年、成人或老人或免疫力低下的个人。在为了治疗受试者金黄色葡萄球菌感染施用本发明组合物的情况下，目标受试者群体涵盖受金黄色葡萄球菌感染的任何受试者。特别适合的受试者包括有感染风险的受试者或经耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)感染的受试者。
在经由主动或被动疫苗接种，使用本发明的治疗性组合物预防金黄色葡萄球菌感染的情况下，组合物中LukE和LukD蛋白或多肽或抗LukE和抗LukD抗体的浓度足以达到对金黄色葡萄球菌感染的预防，特别是对易感人群金黄色葡萄球菌的预防。在使用治疗性组合物治疗金黄色葡萄球菌感染的情况下，抗LukE和抗LukD抗体或抑制LukE/D介导的细胞毒性的试剂的量能够达到许多症状的减轻、至少一种症状的严重程度降低或至少一种症状的进一步进展延迟或甚至感染总体减轻。
LukE、LukD、抗LukE和抗LukD抗体及抑制LukE/D介导的细胞毒性的试剂的治疗有效量可根据标准程序测定，这考虑到许多因素，包括(例如)组合物中这些活性剂的浓度、施用模式和频率、待治疗(或预防)的金黄色葡萄球菌感染的严重程度和受试者详情，例如年龄、体重及总体健康和免疫状况。例如，在国际协调会议(InternationalConference on Harmonization)的出版物和REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Publishing Company1990)中可找到通用指南，其据此通过引用整体并入。临床医师可施用LukE和LukD或抗LukE和抗LukD抗体，直至剂量达到提供预期或所需预防或治疗效果的剂量。可通过常规测定容易地监测这种疗法的进展。
供免疫接种的LukE和LukD的治疗有效量将取决于是否与佐剂缺乏时所需的更高剂量一起，联合施用佐剂。供施用的LukE和LukD的量有时在每位患者1μg-500μg间变化并且更通常地，对于人类施用而言在每次注射5-500μg间变化。偶尔，使用每次注射1-2mg的更高剂量。通常对于每次人类注射而言使用约10、20、50或100gg。优选地，LukE和LukD的量大体上相同。注射时间可明显不同，从每天一次到一年一次、十年一次。通常，可通过从受试者获得液体样品，通常为血清样品，并且测定使用本领域众所周知的方法针对LukE和LukD蛋白或多肽研发并且易于适应待测特定抗原的抗体的滴度监测有效剂量。理想地，在初始剂量之前取样并且在每次免疫接种后取后续样品并滴定。一般地，在血清稀释1：100时提供比对照或“本底”水平高至少4倍的可检滴度的剂量或给药方案满足需要，而在ELISA测定中相对于对照血清或相对于板体本底定义本底。
LukE和LukD抗体组合物的治疗有效量通常为至少50mg组合物/kg体重(mg/kg)，包括每次剂量或按每天计至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少250mg/kg、至少500mg/kg、至少750mg/kg和至少1000mg/kg。单克隆抗体组合物的剂量可能往往更低，例如为非单克隆抗体组合物的约十分之一，例如至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约15mg/kg、至少约20mg/kg或至少约25mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下施用的每种抗体的剂量落在指定范围内。通常多次施用抗体。单次剂量间的间隔可为每周一次、每月一次或每年一次。如通过测量受试者的血液抗体水平所表明，间隔也可无规律。可选地，抗体作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率施用。剂量和频率根据受试者体内抗体的半衰期变化。一般而言，人抗体显示出最长的半衰期，接着是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间内以相对稀少的间隔施用相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要相对短的间隔的相对高剂量，直至减少或终止疾病的进展，并且优选直至受试者显示出疾病症状的部分或完全改善。
根据治疗的金黄色葡萄球菌感染的性质，本发明的治疗性组合物可作为联合治疗的一部分，连同另一活性剂一起施用。此类附加活性剂包括抗感染剂、抗生素试剂和抗菌剂。在本发明中可能有用的代表性抗感染剂包括万古霉素和溶葡萄球菌(lysostaphin)。在本发明中可能有用的代表性抗生素试剂和抗菌剂包括耐青霉素酶的青霉素(penicillin)、头孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯(carbapenem)，包括万古霉素、溶葡萄球菌、青霉素G、氨苄青霉素(ampicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢拉定(cephradine)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、庆大霉素(gentamycin)、替考拉宁(teicoplanin)、林可霉素(lincomycin)和氯洁霉素(clindamycin)。这些抗生素的剂量在本领域中众所周知。见，例如，MERCK MANUAL OF DIAGNOSIS AND THERAPY，第100版，第157章，第13节(Beers&Berkow编辑，2004)，其据此通过引用整体并入。抗炎、抗感染抗生素和/或抗菌剂可在施用之前组合，或与本发明的发明治疗性组合物同时(作为同一组合物的一部分或经由不同组合物)或依次施用。在某些实施方案中，重复所述施用。受试者可为婴儿、青少年、成人或老人。受试者也可为免疫力低下的青少年、成人或老人。
本发明的治疗性组合物可以单剂量或根据多剂量方法施用。例如，施用相对少剂量的治疗性组合物，例如一个或两个剂量。在包括通常涉及几天或几周内多剂量的常规抗生素疗法的实施方案中，可在一段时间，例如至少5天、10天或甚至14天或更多天，每天服用抗生素1、2或3次或更多次，而抗体组合物一般仅施用一次或两次。然而，可由本领域的普通技术人员选择和调节治疗性组合物和抗生素的不同剂量、剂量定时和相对量。
可通过肠胃外、局部、静脉、口服、皮下、腹膜内、鼻内或肌肉内的方式施用本发明的组合物进行预防性和/或治疗性治疗。虽然其它途径可同样有效，但是最典型的施用方法是皮下。次常见的是肌肉内注射。这种注射类型最常在臂部或腿部肌肉进行。静脉注射以及腹膜内注射、动脉内、颅内或皮内注射在产生免疫反应中也有效。
可配制本发明的药剂用于肠胃外施用。可于适当混有表面活性剂例如羟丙基纤维素的水中制备所述试剂的溶液或悬浮液。也可于甘油、液体聚乙二醇及其于油中的混合物中制备分散体。示例性油为石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。一般地，水、盐水、含水右旋糖和相关糖溶液及二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是对于可注射液而言。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合注射使用的药物制剂包括无菌水溶液或分散体和临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须无菌并且流动性必须达到易于注射的程度。在生产和储存条件下必须稳定并且必须保护其免受微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适合混合物和植物油的溶剂或分散介质。
当期望全身递送本发明的药剂时，可将其配制用于通过注射，例如通过大剂量注射或连续注射进行肠胃外施用。供注射的制剂可呈单位剂量形式，与添加的防腐剂一起存在(例如)于安瓿或多剂量容器中。所述组合物可于油或含水媒介物中呈诸如悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配方剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
也可使用输液泵设备，例如Medtronic，Northridge，CA描述的输液泵设备实现本发明试剂的覆膜内或鞘内施用。此类设备允许连续输注所需化合物，避免多次注射和多次操作。
除前述制剂外，也可将所述试剂配制成贮库制剂。也可用适合的聚合或疏水性材料(例如于可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或如微溶性衍生物，例如微溶性盐配制此类长效制剂。
本发明的又一方面涉及预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度的方法。这种方法涉及培养经由来自受试者的液体或组织样品从感染受试者获得的金黄色葡萄球菌并且量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达。比较来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量并且基于所述比较预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度。
本发明的另一方面涉及治疗患有金黄色葡萄球菌感染的受试者的方法。这种方法涉及培养经由来自受试者的液体或组织样品从感染受试者获得的金黄色葡萄球菌并且量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达。比较来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量，并且基于这种比较确定对所述受试者的适合疗法。这种方法进一步涉及向所述受试者施用确定的适合疗法以治疗金黄色葡萄球菌感染。
根据本发明的这些方面，量化来自受试者的样品中的LukE和LukD表达涉及测量LukE和/或LukD mRNA表达或蛋白质生成的水平。量化样品中的mRNA和蛋白质表达水平的方法在本领域众所周知。与对照样品相比，来自受试者的样品中LukE和/或LukD mRNA表达或蛋白质生成的水平升高表明或预示受试者患有或将患有更严重的金黄色葡萄球菌感染。同样，来自受试者的样品中LukE和/或LukD mRNA表达或蛋白质生成的水平升高表明，患有感染的受试者的适合疗法涉及抑制LukE/D介导的细胞毒性的一种或多种试剂。以上公开了抑制LukE/D细胞毒性的适合试剂。
本发明的另一方面涉及鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂的方法。这种方法涉及提供细胞群、含有LukE和LukD的制剂和候选LukE/D抑制剂。在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制剂，并且在所述候选抑制剂存在和缺乏时测量LukE/D介导的细胞毒性。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时细胞毒性的测得量并且基于这种比较鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂。
根据本发明的这个方面，可筛选抗LukE和抗LukD抗体及其片段以及其它潜在治疗部分(例如，有机小分子)以评估其抑制LukE/D介导的细胞毒性的能力。如下所述，已经设计了各种方法以鉴定抑制导致LukE/D介导的细胞毒性和人白细胞溶解的一连串事件的某一方面的试剂。还设计方法以鉴定相对于其天然对应物，毒性降低的LukE和LukD改变形式。是一连串中的一部分的目标事件包括(例如)LukE和/或LukD与白细胞质膜的结合、LukE和LukD之间的相互作用(LukE/D寡聚)和LukE/D寡聚体形成的膜孔隙的阻塞。测定形式通常需要人白细胞(或其LukE或LukD膜结合部分)、适合培养基和纯化LukE和LukD。
技术人员将认识到下列方法仅为示例性并且如认为适当，可改变各种操作参数例如反应条件、可检测标记的选择和装置(例如，检测和量化的仪器)。
下列方法通常涉及鉴定抑制LukE/D细胞毒性的试剂，但不见得显示了一连串中受影响的确切事件。
为鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂，可按5×103个细胞/孔将人白细胞(例如，THP-1)接种在384孔底部透明的黑色组织培养处理板(Coming)上，最终体积为50μl的补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI(Gibco)中。然后可使细胞与试验化合物/分子(约5μl/不同浓度)接触/混合/反应/用其处理，然后用LukE和LukD使其中毒，在优选实施方案中LukE和LukD在培养条件下经大体上纯化(5μl的约0.01-5μM溶液)，优选一起添加以允许在37℃、5％C02下用LukE和LukD使白细胞中毒(例如)1h。作为对照，用培养基(100％能活)和0.1％v/v Triton X100(100％死亡)处理细胞。
在这些实施方案中，然后可用染料培育如上所述处理的细胞以监测细胞活力，例如CellTiter(Promega)(其使得能够通过量化细胞的代谢活性测量培养物中活细胞的数量，经由吸光度测定细胞活力)并且再培育一段时间(例如，在37℃、5％C02下2h)。然后可(例如)通过使用酶标仪，例如Envision2103多标记阅读器(Perkin-Elmer)在492nm下测量比色反应测定细胞活力。例如可通过使用以下方程式：活力％=100×[(Ab492样品-Ab492TritonX)/(Ab492组织培养基)计算活细胞百分比。100％活力的增长表明对LukE/D介导的细胞毒性的抑制。
这种测定的变型称为膜损伤测定。在这些实施方案中，然后可用不能透过细胞的荧光染料例如SYTOX green(0.1μM；Invitrogen)(根据生产商的说明)培育如上所述处理的细胞(例如，包括用试验化合物/分子处理细胞，然后用纯化LukE和LukD使细胞中毒)并且在室温下于黑暗中再培养(例如)15min。然后可使用酶标仪例如Envision2103多标记阅读器(Perkin-Elmer)在485nm激发波长、535nm发射波长下测量作为膜损伤指标的荧光。荧光减少表明对LukE/D细胞活性的抑制。
在这种测定的另一变型中，然后可用细胞溶解标志物培育如上所述处理的细胞(例如，包括用试验化合物处理细胞，然后用纯化LukE和LukD使细胞中毒)并且在室温下于黑暗中再培养一段时间。测量细胞溶解标志物，并且在所述化合物的存在下细胞溶解水平的降低表明对LukE/D细胞活性的抑制。
总之，这些测定将利于鉴定抑制或降低对白细胞的LukE/D细胞毒作用的化合物。
可单独或连同上述方法一起使用另外的方法，特别是如果以上方法显示了将使本领域的技术人员能够更精确地确定生化级联中的什么事件受所述试剂影响或靶向的抑制活性。这些事件包括LukE和/或LukD与白细胞膜的结合、LukE与LukD的结合(LukE/D寡聚)和LukE/D寡聚体形成的膜孔隙的阻塞。
本发明的另一方面涉及鉴定LukE、LukD和/或LukE/D与白细胞结合的抑制剂的方法。这种方法涉及提供一群白细胞或其它靶细胞、含有经可检测标记的LukE、LukD或LukE/D的制剂和候选抑制剂。在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有经可检测标记的LukE、LukD或LukE/D的所述制剂，并且在所述候选抑制剂存在和缺乏时测量经标记的LukE、LukD或LukE/D与白细胞群的结合。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时LukE、LukD或LukE/D结合的测得量，并且基于这种比较鉴定LukE、LukD或LukE/D-白细胞结合的抑制剂。
为筛选阻碍或减少为中毒过程第一步的LukE、LukD或LukE/D与靶细胞结合的抑制剂，可按2.5×103个细胞/孔将人白细胞(例如，THP-1)接种在384孔平底组织培养处理板(Corning)上，最终体积为50μl的补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI(Gibco)中。然后可用试验化合物/分子(约5μl/不同浓度)处理细胞并且在4℃、5％C02下用纯化、荧光标记LukE、LukD和/或LukE/D(例如，FITC、Cy3、Cy5、APC、PE)(5μl的约0.01-5μM溶液)培育1h。为评估试验化合物/分子的功效，例如可使用设计用于高内涵筛选和高内涵分析的自动荧光显微成像系统(例如，Cellomics ArrayScan HCS阅读器(ThermoScientific)(激发波长485nm、发射波长535nm))测量细胞相关荧光作为LukE、LukD或LukE/D与细胞结合的指标。根据本发明的这个方面，在候选抑制剂存在下与其缺乏时相比，LukE、LukD或LukE/D-白细胞结合的减少鉴定了结合抑制剂。
为筛选阻碍或减少为中毒过程第二步的LukE/LukD相互作用的抑制剂，可按2.5×103个细胞/孔将人白细胞(例如，THP-1)接种在384孔平底组织培养处理板(Corning)上，最终体积为50μl的补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI(Gibco)中。然后可用试验化合物/分子处理细胞，然后用纯化LukE和纯化LukD的混合物使其中毒，其中LukD经荧光分子例如FITC、Cy3、Cy5、APC和PE荧光标记，并且使其静置以完成中毒过程(例如，在37℃、5％C02下1h)。为评估试验化合物/分子的功效，例如可使用设计用于高内涵筛选和高内涵分析的自动荧光显微成像系统(例如，Cellomics ArrayScan HCS阅读器(Thermo Scientific)(激发波长485nm、发射波长535nm))测量细胞相关的LukD-FITC荧光作为LukE/LukD-FITC相互作用的指标。可使用经荧光标记的LukE代替LukD进行类似实验。
本发明的另一方面涉及鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂的方法。这种方法涉及提供一群白细胞、含有LukE和LukD的制剂和候选抑制剂。在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述白细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制剂，并且测量在所述候选抑制剂存在和缺乏时所述白细胞群上的孔隙形成。比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时孔隙形成的测得量，并且基于该比较鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂。
为筛选阻碍或抑制LukE/D孔隙形成的抑制剂，导致细胞溶解的效应分子，可按2.5×103个细胞/孔将人白细胞(例如，THP-1细胞)接种在384孔底部透明的黑色组织培养处理板(Corning)上，最终体积为50μl的补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI(Gibco)中。然后可用试验化合物/分子(约5μl含有不同浓度)处理细胞，然后在37℃、5％C02下用纯化LukE和LukD或LukE/D(约0.01-5μM)使其中毒15min。作为对照，可用培养基(阴性对照)和0.1％V/v TritonX100(阳性对照)处理细胞。
为直接评估宿主细胞表面的LukE/D孔隙，可使用溴化乙锭(EB)流量测定。EB是不能渗透健康宿主细胞的小阳离子染料。LukE/D一旦形成阳离子孔隙，EB就进入细胞并与DNA结合，产生荧光。然后可在室温下于黑暗中用EB(5μM)再培育以这种方式处理的细胞5min。为评估试验化合物/分子在抑制LukE/D孔隙形成中的功效，可使用酶标仪例如Envision2103多标记阅读器(Perkin-Elmer)在530nm激发波长、590nm发射波长下测量荧光作为孔隙形成的指标。这种测定将利于鉴定可阻碍或抑制LukE/D孔隙，将减轻LukE/D介导的毒性的分子。
为直接评估宿主细胞表面的LukE/D孔隙，可使用溴化乙锭(EB)流量测定。EB是不能渗透至健康宿主细胞的小阳离子染料。LukE/D一旦形成阳离子孔隙，EB就进入细胞并与DNA结合，产生荧光(例如见，图5E)。然后可在室温下于黑暗中用EB(5μM)再培育用引起LukE/D孔隙形成的试剂处理的细胞5min。为评估试验化合物/分子在抑制LukE/D孔隙形成中的功效，可使用酶标仪例如Envision2103多标记阅读器(Perkin-Elmer)在530nm激发波长、590nm发射波长下测量荧光作为孔隙形成的指标。这种测定将利于鉴定可阻碍或抑制LukE/D孔隙，将减轻LukE/D介导的毒性的分子。
本文所述测定中利用的候选化合物可基本上为怀疑能够影响生物功能或相互作用的任何化合物或组合物。所述化合物或组合物可为化合物或组合物库的一部分。可选地，可特别地将所述化合物或组合物设计为干扰本发明的LukE、LukD或LukE/D的生物活性。
实施例
提供下列实施例以说明本发明的实施方案，但是决非旨在限制其范围。
实施例1-rot的失活增强了缺乏agr的金黄色葡萄球菌菌株的毒力
在最近的研究中已经发现缺乏称为附属基因调节子(“Agr”)的主调节因子和毒素转录因子阻遏因子(“Rot”)的金黄色葡萄球菌突变菌株(即，ΔagΔrrot)在鼠全身感染模型中比高度减毒Δagr突变体表现出更强的毒力。虽然通过感染后随时间推移的存活率测量，Δagr单缺失突变体的毒力高度减弱，但是ΔagrΔrot双突变体展现出与亲本菌株(WT Newman)相似的毒力特征(图1A)。据推测，在ΔagrΔrot双突变体中观察到的毒力升高可能是由于金黄色葡萄球菌白细胞毒素的表达增强，因为认为这些毒素中的许多以Agr-Rot依赖性方式调节。实际上，对金黄色葡萄球菌野生型、Δagr和ΔagrΔrot突变菌株生成的毒素的免疫印迹分析确认所述假设，因为在ΔagrΔrot双突变体中许多毒素恢复到WT水平(图1B)。显著地，观察到与其它毒素相比，ΔagrΔrot菌株高度过量生成LukE/D(图1B)。该数据证明，Rot对关键毒力因子的阻遏对金黄色葡萄球菌中的最佳毒力潜能至关重要并且以更甚于其它白细胞毒素的Rot依赖方式严重地阻遏白细胞毒素LukE/D。
实施例2-LukE/D有助于缺乏rot的金黄色葡萄球菌菌株表现出的更强毒力
图1A-1B中描述的结果表明，agr+菌株中rot的失活也可能以LukE/D依赖方式导致毒力增强。如同ΔagrΔrot双突变体一样(图1A)，如感染Δrot的动物与感染野生型(WT)的动物相比存活率百分比下降所证实，观察到Δrot单缺失突变体还导致鼠全身感染模型中的毒力增强(图2A)。早期观察证明，Rot很可能是白细胞毒素LukE/D的主要阻遏因子。为在Δrot单缺失突变体的情况下确认这些发现，进行免疫印迹。这些实验显示，实际上LukE/D在rot缺乏时高度生成，与LukAB、γ-溶血素(HlgC)或α-毒素(Hla；图2B)相反。这些发现进一步巩固了LukE/D是造成Δrot突变体毒力增强的原因的主要Rot阻遏因子和LukE/D可在金黄色葡萄球菌体内发病机制中起重要作用的假定。为确定LukE/D过量生成是否是造成Δrot病原性表现型增强的原因，构造ΔrotΔlukE/D双突变体并且估计其在小鼠感染模型中的毒力。与WT以及Δrot突变体相比死亡率显著降低证明，ΔrotΔlukE/D双突变体的毒力大大受损(图2C)。这些结果证明，LukE/D是对Δrot突变体相关的超高毒力至关重要的主要Rot阻遏因子并且LukE/D可能是一般疾病的主要因素。这些数据进一步表明，增强Rot介导的靶基因阻遏的药物将减少金黄色葡萄球菌发病机制。
实施例3-通过与LukE/D启动子直接结合阻遏LukE/D表达
为进一步检查Rot对lukE/D基因表达的影响，构造lukE/D启动子区与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因的转录融合并且随时间推移使用WT、Δagr、Δrot和ΔagrΔrot菌株测量肉汤培养中的荧光。正如所怀疑的，lukE/D的基因表达增强超过缺乏Rot的菌株中WT的基因表达，而表达大量Rot的菌株(Δagr突变体展现出更高的Rot水平)在表达上降低。为估计Rot是否直接阻遏lukE/D，使用启动子拉下策略检查Rot与lukE/D启动子结合的能力。用与磁珠结合的lukE/D启动子DNA或非特异性基因间DNA培育细菌全细胞溶解产物。结合蛋白的免疫印迹证明，Rot实际上以特异性方式与lukE/D启动子结合(图3B)。这些结果暗示Rot为lukE/D基因表达的直接阻遏因子。因此Rot水平的变化可大体上增加或减少LukE/D的生成并因此调节金黄色葡萄球菌的毒力潜能。
实施例4-LukE/D明显有助于金黄色葡萄球菌发病机制
ΔrotΔlukE/D双缺失突变体不仅消除了与rot缺失相关的超高毒力，还大体上降低了整体毒力(比较WT存活率与ΔrotΔlukE/D存活率，图3B)。为测试LukE/D是否在金黄色葡萄球菌败血病感染的发病机制中起主要作用，构造菌株Newman中的ΔlukE/D突变体(图4A和4B)并且检查单独的lukE/D缺失对毒力的影响。对于经107或108CFU的ΔlukE/D突变体感染的小鼠而言，与野生型相比，存活率随时间推移明显升高。在107量下(图4C)到250h和在108剂量下(图4D)到100h所有野生型小鼠死于感染。然而在两种情况下，几乎100％受ΔlukE/D突变体感染的小鼠至少存活至感染后300h，表现型与ΔlukE/D：：plukE/D菌株完全互补(图4B和4C)。另外，与野生型或互补菌株相比，肾脏的细菌负担减少10倍(图4E)并且脓肿形成显著减少(图4F)。这些结果显示，LukE/D实际上是金黄色葡萄球菌全身感染的关键毒力因子。因此LukE/D是研发对抗金黄色葡萄球菌感染的新疗法的有吸引力的新目标。
实施例5-LukE/D靶向并杀伤白细胞
为确定LukE/D作用的潜在机制，表达并纯化来自大肠杆菌(E.coli)的重组LukE和LukD蛋白。为测试这些蛋白质的潜在毒性，用不同浓度的单独亚基(即，LukE或LukD)或LukE+LukD的混合物(LukE/D)培育人单核细胞样细胞(THP-1)和人前髓细胞性白血病细胞(HL60)。以单独的LukE、单独的LukD或LukE/D的剂量反应使细胞中毒并且在中毒1h后添加CellTiter以测量中毒后的活细胞百分比。人单核细胞样细胞系THP-1唯一对毒素的两个亚基一起，而非单独亚基的中毒敏感。毒素对细胞的效力为剂量依赖性并且严格需要两个亚基的存在(图5A)。相反，HL60不受单独亚基的影响或一起培育(图5B)。除细胞系外，还检查了LukE/D对原代人和鼠PMN的活性。以单独的LukE、单独的LukD或LukE/D的剂量反应使细胞中毒并且在中毒1h后添加CellTiter以测量中毒后的活细胞百分比。LukE/D而非LukE或LukD对来自人和鼠的PMN有显著毒性(图5C)。
为检查LukE/D对THP-1产生毒性的机制，在一般不能渗透宿主细胞膜，但是可经毒素孔隙进入细胞的小阳离子染料溴化乙锭的存在下使细胞中毒。添加两种毒素亚基后，如与未中毒对照和中毒PMN-HL60相比相对荧光增加所反映，溴化乙锭被迅速吸收至细胞中(图5D和5E)。这些实验证明一起时，LukE和LukD对特定人免疫细胞类型，而非其它细胞类型表现出细胞毒性，突显了这种毒素的特异性。
实施例6-抗LukE的抗体有效中和LukE/D细胞毒性
为确定对LukE产生的多克隆抗体是否能够中和LukE/D细胞毒性，进行了中和测定。通过CellTiter测量，用纯化抗LukE抗体培育LukE/D有效抑制了LukE/D介导的对THP-1细胞的细胞毒性(图6A)。如图5A-5E所示，LukE/D似乎通过在靶细胞质膜上形成可渗透孔隙发挥其毒活性。为了解抗LukE中和LukE/D细胞毒性的机制，监测在纯化抗LukE抗体的存在下用LukE/D使其中毒的细胞中LukE/D孔隙的形成。观察到，LukE/D孔隙形成受抗LukE抗体有效抑制(图6B)。这些数据证明，免疫接种LukE产生抗LukE中和抗体，表明LukE特异性抗体可为抗击金黄色葡萄球菌感染的新疗法。
虽然为了说明已经详细描述了本发明，但是应理解此细节仅仅是为了所述目的，并且本领域的技术人员可在不背离下列权利要求书所定义的本发明精神和范围的前提下对其做变动。
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Claims (71)

1.一种组合物，包含
治疗有效量的分离LukE蛋白或其多肽、分离LukD蛋白或其多肽，或其组合，和
药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukE蛋白包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukE多肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸残基48-291。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukD蛋白包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离LukD多肽包含SEQ ID NO：22的氨基酸残基46-307。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的分离蛋白或其多肽与免疫原性载体分子连接。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述免疫原性载体分子与免疫原性蛋白或肽共价或非共价结合。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述免疫原性载体分子选自由牛血清白蛋白、鸡蛋卵白蛋白、钥孔隙戚血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、甲状腺球蛋白、肺炎球菌荚膜多糖、CRM197和脑膜炎球菌外膜蛋白组成的组。
9.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含一种或多种另外的选自由以下组成的组的金黄色葡萄球菌抗原：α溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝固酶、凝集因子A、凝集因子B、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白、MHC类似蛋白、多糖细胞内粘连蛋白、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、Panton-Valentine杀白细胞素、杀白细胞素A、杀白细胞素B、杀白细胞素M、剥脱性毒素A、剥脱性毒素B、V8蛋白酶、透明质酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1、聚-N-琥珀酰β-1→6葡萄糖胺、过氧化氢酶、β-内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素结合蛋白、趋化性抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和识别宿主分子的微生物表面组分。
10.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含佐剂。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述佐剂选自由鞭毛蛋白、弗氏完全或不完全佐剂、氢氧化铝、溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚、iscomatrix和脂质体聚阳离子DNA颗粒组成的组。
12.一种在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫的方法，包括：
按在受试者中对金黄色葡萄球菌感染产生免疫有效的量施用根据权利要求1所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种另外的选自由以下组成的组的金黄色葡萄球菌抗原：α溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝固酶、凝集因子A、凝集因子B、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白、MHC类似蛋白、多糖细胞内粘连蛋白、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、Panton-Valentine杀白细胞素、杀白细胞素A、杀白细胞素B、杀白细胞素M、剥脱性毒素A、剥脱性毒素B、V8蛋白酶、透明质酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1、聚-N-琥珀酰β-1→6葡萄糖胺、过氧化氢酶、β-内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素结合蛋白、趋化性抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和识别宿主分子的微生物表面组分。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述组合物进一步包含佐剂。
15.根据权利要求12所述的方法，进一步包括：
在施用包含分离LukE蛋白、分离免疫原性LukE片段、分离LukD蛋白、分离免疫原性LukD片段或其组合的组合物之前、之后或同时向受试者施用佐剂。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述施用在受试者中诱导对金黄色葡萄球菌的中和免疫反应。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染或甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)感染。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉注射、动脉内注射、肌肉注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到粘膜上进行。
19.根据权利要求12所述的方法，进一步包括重复所述施用。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为婴儿、青少年、成人或老人。
21.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为免疫力低下的青少年、成人或老人。
22.一种组合物，包含
杀白细胞素E(LukE)抗体、杀白细胞素D(LukD)抗体或其组合和药学上可接受的载体。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述组合物包含LukE抗体。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述LukE抗体识别SEQ ID NO：11的氨基酸序列中的表位。
25.根据权利要求22所述的组合物，其中所述组合物包含LukD抗体。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述LukD抗体识别SEQ ID NO：22的氨基酸序列中的表位。
27.根据权利要求22所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种中和抗体。
28.根据权利要求22所述的组合物，进一步包含识别选自由以下组成的组的一种或多种金黄色葡萄球菌抗原的一种或多种抗体：α溶血素抗原、蛋白A、336血清型多糖抗原、凝固酶、凝集因子A、凝集因子B、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白、MHC类似蛋白、多糖细胞内粘连蛋白、β溶血素、δ溶血素、γ溶血素、Panton-Valentine杀白细胞素、杀白细胞素A、杀白细胞素B、杀白细胞素M、剥脱性毒素A、剥脱性毒素B、V8蛋白酶、透明质酸裂解酶、脂酶、葡萄球菌激酶、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1、聚-N-琥珀酰β-1→6葡萄糖胺、过氧化氢酶、β-内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素结合蛋白、趋化性抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi、5型抗原、8型抗原、脂磷壁酸和识别宿主分子的微生物表面组分。
29.一种治疗或预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方法，包括：
按预防受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量施用根据权利要求22所述的组合物。
30.根据权利要求29所述的方法，进一步包括
施用选自由抗感染剂、抗生素试剂、抗菌剂组成的组的试剂。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染为MRSA感染或MSSA感染。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌相关病状选自由皮肤损伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血病、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征组成的组。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉注射、动脉内注射、肌肉注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到粘膜上进行。
34.根据权利要求29所述的方法，进一步包括重复所述施用。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者为婴儿、青少年、成人或老人。
36.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者为免疫力低下的青少年、成人或老人。
37.一种治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状的方法，包括：
按治疗受试者金黄色葡萄球菌感染和/或金黄色葡萄球菌相关病状有效的量施用包含LukE/D介导的细胞毒性的一种或多种抑制剂的组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述抑制剂为蛋白质或肽抑制剂、核酸抑制剂或小分子抑制剂。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂为LukE抑制剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述LukE抑制剂是识别SEQ ID NO：11的氨基酸序列中的表位的抗体。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂为LukD抑制剂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述LukD抑制剂是识别SEQ ID NO：22的氨基酸序列中的表位的抗体。
43.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂包含LukE/D受体拮抗剂。
44.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制LukE和LukD的相互作用。
45.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制LukE、LukD或LukE/D与白细胞的质膜结合。
46.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂防止LukE/D寡聚体复合物形成。
47.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂抑制LukE/D介导的细胞孔隙。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂包含环糊精化合物。
49.根据权利要求37所述的方法，其中所述LukE/D介导的细胞毒性的抑制剂是诱导毒素阻遏因子(Rot)的试剂。
50.根据权利要求37所述的方法，进一步包括
施用选自由抗感染剂、抗生素试剂、抗菌剂组成的组的试剂。
51.根据权利要求37所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染为MRSA感染或MSSA感染。
52.根据权利要求37所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌相关病状选自由皮肤损伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血病、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征组成的组。
53.根据权利要求37所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉注射、动脉内注射、肌肉注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到粘膜上进行。
54.根据权利要求37所述的方法，进一步包括重复所述施用。
55.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者为婴儿、青少年、成人或老人。
56.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者为免疫力低下的青少年、成人或老人。
57.一种预测受试者金黄色葡萄球菌感染的严重程度的方法，包括：
培养来自于从感染受试者获得的液体或组织样品的金黄色葡萄球菌；
量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达或生成；
比较来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量；并且
基于所述比较预测金黄色葡萄球菌感染的严重程度。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述量化包括：
测量培养的金黄色葡萄球菌中LukE和/或LukD蛋白生成的水平。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述量化包括：
测量培养的金黄色葡萄球菌中lukE和/或lukD mRNA表达的水平。
60.一种治疗患有金黄色葡萄球菌感染的受试者的方法：
培养来自于从感染受试者获得的液体或组织样品的金黄色葡萄球菌；
量化培养的金黄色葡萄球菌中的LukE和/或LukD表达或生成；
比较来自所述受试者的样品中LukE和/或LukD的量化量与生成少量或不可检测量的LukE和/或LukD的对照样品中LukE和/或LukD的量；
基于所述比较确定对所述受试者的适合疗法；并且
向所述受试者施用所述确定疗法以治疗金黄色葡萄球菌感染。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述量化包括：
测量培养的金黄色葡萄球菌中LukE和/或LukD蛋白生成的水平。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述量化包括：
测量培养的金黄色葡萄球菌中lukE和/或lukE mRNA表达的水平。
63.一种鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂的方法，包括：
提供细胞群；
提供含有LukE和LukD的制剂；
提供候选抑制剂；
在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制剂；
测量暴露细胞群中LukE/D介导的细胞毒性水平；
比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时LukE/D细胞毒性的测量水平；并且
基于所述比较鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂。
64.根据权利要求63所述的方法，其中在所述候选抑制剂存在下，与其缺乏时相比，LukE/D介导的细胞毒性水平降低鉴定LukE/D细胞毒性的抑制剂。
65.根据权利要求63所述的方法，进一步包括：
提供细胞毒性的经标记标志物；
在所述暴露之前、同时或之后，使所述细胞群与细胞毒性的经标记标志物接触；
检测细胞毒性的经标记标志物；并且
基于所述检测测量所述细胞群中LukE/D介导的细胞毒性水平。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述细胞毒性的经标记标志物为细胞活力染料、不能透过细胞的染料和/或细胞溶解的标志物。
67.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞群包括白细胞群。
68.一种鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂的方法，包括：
提供一群白细胞；
提供含有LukE和LukD的制剂；
提供候选抑制剂；
在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述白细胞群暴露于含有LukE和LukD的所述制剂；
测量在所述候选抑制剂存在和缺乏时所述白细胞群中的孔隙形成；
比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时孔隙形成的测得量；并且
基于所述比较鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂。
69.根据权利要求68所述的方法，其中在所述候选抑制剂存在下，与其缺乏时相比，孔隙形成减少鉴定LukE/D介导的孔隙形成的抑制剂。
70.一种鉴定LukE和/或LukD-白细胞结合的抑制剂的方法，包括：
提供一群白细胞；
提供含有经可检测标记的LukE和LukD的制剂；
提供候选抑制剂；
在所述候选抑制剂存在和缺乏时使所述细胞群暴露于含有经可检测标记的LukE和LukD的所述制剂；
测量在所述候选抑制剂存在和缺乏时经标记LukE和/或LukD与所述白细胞的结合；
比较在所述候选抑制剂存在和缺乏时LukE和/或LukD-白细胞结合的测得量；并且
基于所述比较鉴定LukE和/或LukD-白细胞结合的抑制剂。
71.根据权利要求70所述的方法，其中在所述候选抑制剂存在下，与其缺乏时相比，LukE和/或LukD-白细胞结合减少鉴定LukE和/或LukD-白细胞结合的抑制剂。
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