JP6450742B2 - 脂質ナノ粒子の調製のための方法および装置 - Google Patents

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Description

本出願は、2013年3月15日付で出願された米国仮特許出願第61/791,054号の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本技術は、広くはリポソームに関し、より具体的には、医薬品有効成分を封入(encapsulate)するリポソームに関する。
背景
リポソーム技術は、臨床治療および科学研究において薬物送達のために利用されている。リポソーム調製のための現方法は、小規模研究室の研究のために主に用いられている。例示的な方法としては、脂質乾燥フィルム再水和押出法、界面活性剤透析法、ならびにエタノール蒸発および希釈法が挙げられる。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,901,708号（特許文献1）および米国特許出願公開第2007/0042021号（特許文献2）は、リポソーム調製のための2段階: (i) Tコネクタを用いて、脂質-有機溶媒溶液を水溶液と混合する段階; (ii) 混合液を水溶液で希釈する段階、の方法に言及している。
現在利用可能な方法は、拡張性、低い再現性および生成物の不均一性に関連した困難な問題を提起する。薬物送達で用いるためのリポソームを作出する改善された方法に対する必要性が存在している。
米国特許第7,901,708号 米国特許出願公開第2007/0042021号
本発明は、脂質ナノ粒子(LNP)を調製するための方法を提供する。好ましい局面において、本方法は、以下の段階を含む:
a) i) マニホルドの1つまたは複数のインレットポートの第1のセットを介して1つまたは複数の脂質溶液流を、およびii) マニホルドの1つまたは複数のインレットポートの第2のセットを介して1つまたは複数の水溶液流を、導入し、それによって、LNP溶液を生成するように脂質溶液および水溶液を混合する段階; ならびに
b) マニホルドの1つまたは複数のアウトレットポートを介してLNP溶液を回収する段階。上記方法において、少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度は、180°または実質的に類似の角度ではない。言い換えれば、少なくとも1つの脂質溶液流および少なくとも1つの水溶液流は、約180°未満の角度で衝突する。かくして、いくつかの局面において、本方法はTコネクタを含まない。
本方法はまた、上記の方法によって作出されたLNP溶液、LNP溶液を用いて調製された薬学的組成物を提供する。
本発明はさらに、以下で詳細に記述されるマニホルドシステムのような、本方法を行うために適合された装置を提供する。
本方法はまた、医薬品有効成分(active pharmaceutical ingredient, API)を含有するLNPを生成するための方法であって、そのようなAPI含有LNPが単一の混合段階で生成される該方法を提供する。
例示的な態様によれば、本発明は、混合チャンバ、チャンバに接続された少なくとも1つの脂質溶液インレットポート; およびチャンバに接続された複数の水溶液インレットポートを有しうるマニホルドを含む、APIを封入しているリポソームを調製するための装置を提供する。
本発明の別の態様は、(i) 脂質溶液のリザーバ中に、有機溶媒と脂質とを含みうる脂質溶液、および(ii) 水溶液のリザーバ中に、水と緩衝液とを含む水溶液を供給する段階; ならびに(i) 混合チャンバ; (ii) チャンバに接続された少なくとも1つの脂質溶液インレットポート; および、(iii) チャンバに接続された複数の水溶液インレットポートを含みうるマニホルドを供給する段階; 各溶液流を混合チャンバへ導入し、リポソームを生成するように、脂質溶液および水溶液を混合する段階; ならびにリポソーム内に医薬品有効成分を封入する段階を含みうる、医薬品有効成分(API)を封入しているリポソームを調製するためのプロセスを提供する。
代替的な態様において、本発明は、本発明のプロセスによって作出されたリポソームを提供する。
本発明はまた、APIを封入するリポソームであって、かつその平均直径が約10〜300 nmであるものを提供する。
[本発明1001]
(a)(i)マニホルドの1つまたは複数のインレットポートの第1のセットを介して1つまたは複数の脂質溶液流を、および(ii)該マニホルドの2つまたはそれ以上のインレットポートの第2のセットを介して1つまたは複数の水溶液流を、導入し、それによって、脂質ナノ粒子(LNP)溶液を生成するように脂質溶液および水溶液を混合する段階; ならびに
(b)該マニホルドの1つまたは複数のアウトレットポートを介してLNP溶液を回収する段階
を含む、LNPを調製するための方法であって、
少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度が180°または実質的に類似の角度ではなく、少なくとも2つの水溶液インレットポートおよび少なくとも1つの脂質溶液インレットポートが同一平面上にない、前記方法。
[本発明1002]
少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度が約120°またはそれ以下である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
段階の(ii)における水溶液が、少なくとも2つのインレットポートを介して導入される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
段階の(ii)における水溶液が、少なくとも3つであるが11以下のインレットポートを介して導入される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
少なくとも2つの水溶液インレットポートおよび少なくとも1つの脂質溶液インレットポートが同一平面上にある、本発明1003の方法。
[本発明1006]
少なくとも1つのアウトレットポートが、インレットポートの平面と実質的に垂直である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
少なくとも1つのアウトレットポートが、インレットポートの平面と実質的に垂直ではない、本発明1005の方法。
[本発明1008]
少なくとも2つの水溶液インレットポートおよび少なくとも2つの脂質溶液インレットポートが同一平面上にない、本発明1003の方法。
[本発明1009]
脂質溶液および/または水溶液が約1 ml/分〜6,000 ml/分の流量で導入される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
脂質溶液および/または水溶液が約1 ml/分〜約2,500 ml/分の流量で0.1〜5 mmのポートサイズを経由して導入される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
脂質溶液および/または水溶液の流速が約0.002 m/s〜約10 m/sである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
LNP溶液が実質的に脂質ディスクを含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
LNP溶液が実質的にリポソームを含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
LNPの平均粒径が、約10 nm〜約2,000 nmである、本発明1001の方法。
[本発明1015]
LNPが約0.0005〜約0.5の多分散性指数を有する、本発明1001の方法。
[本発明1016]
脂質溶液が、有機溶媒に溶解された脂質を含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
有機溶媒が約70%またはそれ以上の濃度のエタノールである、本発明1001の方法。
[本発明1018]
脂質溶液中の総脂質の濃度が約1 mg/ml〜約200 mg/mlの範囲内である、本発明1016の方法。
[本発明1019]
脂質溶液中の脂質の1つが陰イオン性脂質、陽イオン性脂質、または中性脂質から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1020]
少なくとも1つのインレットポートへ導入される水溶液が、別のインレットポートへ導入される第2の水溶液とは異なる、本発明1003の方法。
[本発明1021]
水溶液および/または脂質溶液が、医薬品有効成分(API)を含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
段階(a)が、(iii)マニホルドの1つまたは複数のインレットポートを介して1つまたは複数の非水溶液流を導入することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1023]
LNP溶液から回収されたLNPにAPIを負荷する段階(c)をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
APIが小分子、ペプチド、タンパク質、RNA、またはDNAである、本発明1021または本発明1023の方法。
[本発明1025]
APIが抗がん剤、抗生物質剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または鎮痛薬である、本発明1021または本発明1023の方法。
[本発明1026]
抗がん剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、イプロプラチン、酢酸ロイプロリド、およびメトトレキセートから選択される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
本発明1001の方法によって作出されたLNP溶液。
[本発明1028]
本発明1026のLNP溶液を用いて調製された薬学的組成物。
[本発明1029]
本発明1001の方法を行うために適合された装置。
本発明は、マニホルドのポートサイズ、数および配置を変化させることにより、ならびに脂質および水溶液の流量または流速を選択することによりLNPサイズ、サイズ分布、形態、および製造規模の制御を可能にする。本技術のこれらのおよびその他の利点は、添付の図面および以下の説明を参照すれば明らかになるであろう。
(パネルAおよびB) APIを封入するリポソームを調製するための例示的な5ポートマニホルドを図解する。 APIを封入するリポソームを調製するための例示的なプロセスの流れ図を示す。 不溶性APIが5連の例示的なマニホルドで作出されたリポソームにより封入される、本発明の態様の略図である。 (パネルA〜D) 1 mm (パネルAおよびB)ならびに1.6 mm (パネルCおよびD)の孔径を有する5ポートマニホルドについてのリポソーム粒子サイズに及ぼす流量およびマニホルド孔径の影響を示す。 5連の例示的なマニホルドで作出され、かつドキソルビシンで負荷されたリポソームのCryo-TEM像である。 siRNAリポソームのサイズ(パネルAおよびC)、多分散性指数(パネルBおよびD)に及ぼす流量およびマニホルド孔径の影響、ならびにリポソームのCryo-TEM像(パネルE)を示す。 Aは、40 ml/分の流量で作出された単層リポソームのCryo-TEM像を示す。Bは、5 ml/分の流量で作出された脂質ディスクのCryo-TEM像を示す。 本発明の7ポートマニホルドにおけるインレットおよびアウトレットの数および方向に対する代替の例示的態様を示す。
詳細な説明
本発明は、多くの異なる形態での態様を許容するものの、図面において示されており、本明細書において、本開示は技術の原理の例示と見なされるべきであって、本発明を、例証された態様に限定することを意図していないという理解の下で、詳細ないくつかの具体的な態様のなかで説明される。
定義
「流量」という用語は、インレットポートに供給された脂質溶液または水溶液の容量をいう。
「流速」という用語は、例えば、V = R / 6000Aとして計算される、インレットポートにおける液体流速をいい、ここでV (m/s)は流速であり、R (ml/分)は流量であり、A (cm2)はインレットポートの孔の断面積である。
「脂質ナノ粒子」またはLNPという用語は、リポソーム(例えば、単層もしくは多層)、固体脂質粒子または脂質ディスクをいう。例示的なリポソームおよび脂質ディスクは、実施例において示されている。
「陽イオン性脂質」という用語は、約pH 3〜pH 9で正味の正電荷を保有する脂質をいう。
本明細書において用いられる場合、「陰イオン性脂質」という用語は、約pH 3〜pH 9で正味の負電荷を保有する脂質またはコレステロール誘導体をいう。
「ペグ化脂質」という用語は、ポリエチレングリコール重合体を結合させた脂質をいう。
「中性脂質」という用語は、約pH 3〜pH 9で正味の電荷を保有していない脂質をいう。
「脂質アンカー分子」という用語は、脂質またはコレステロールアンカーを有し、かくしてリポソームへ取り込まれうる分子をいう。
「医薬品有効成分」またはAPIという用語は、疾患処置用にまたは疾患予防(ワクチン)用に使われる薬学的有効成分をいう。APIは、疾患診断を対象とした成分を指すこともある。
図1パネルAおよびBは、本発明の態様を例証する。1つの脂質溶液インレットポート、3つの水溶液インレットポートおよび1つのリポソームアウトレットポートを有する5ポートマニホルドが示されている。図1パネルAはマニホルドの頂部からの投影であり、図1パネルBはマニホルドの側面からの投影である。図1は、マニホルド混合チャンバ110が1つの脂質溶液インレットポート120に接続され、そのインレットポートを通じて脂質溶液が混合チャンバに入ることを示す。3つの水溶液インレットポート130も混合チャンバに接続されており、チャンバに入る水溶液の通路を提供する。この図は、脂質溶液インレットポートおよび水溶液インレットポートが、140によって示される内径を有しうることを例証する。脂質溶液150は脂質溶液インレットポートに入り、その間に水溶液160が水溶液インレットポートに移行し、LNP 180がLNPアウトレットポート170から出る。
図2は、本技術の態様を実施するのに用いられうる例示的なプロセスを例証する流れ図である。図2に示されるように、流れ図は、有機溶媒と脂質とを含む脂質溶液210、および水と緩衝液とを含む水溶液220を提供する。脂質溶液または水溶液はさらに、可溶化されたAPIを含みうる。脂質溶液および水溶液は、マニホルド230の混合チャンバに同時に入りうる。いくつかの態様において、一方、または他方もしくは両方の溶液は、ポンプ装置によって供給されうる陽圧を有する。脂質溶液および水溶液は混合チャンバ中で混合されて、LNPの溶液240を生ずる。本発明のプロセスはまた、LNP内にAPIを封入する段階を提供する。APIが脂質溶液または水溶液のいずれかに可溶化されている場合、APIを封入する段階は、混合チャンバ中でのLNPの形成中に起こりうる。他の態様において、APIはリポソーム外からの薬剤の拡散によりLNPへ取り込まれうる。いくつかの態様において、本発明の方法は、LNP溶液から回収されたLNPにAPIを負荷する段階c)を含む。
図3は、不水溶性のAPIが脂質溶液に溶解される本発明の1つの態様の略図を示す。リザーバ310中の水溶液が導管330を通じてマニホルド370に運搬されうる。同時に、リザーバ340中の可溶化されたAPIを含有する脂質溶液が導管360を通じて、マニホルド370に運搬されうる。ポンプ320および350は、各溶液の流量を調整かつモニターするために用いられうる。先に図1に示されたように、水溶液は水溶液インレットポートを通じてマニホルドに入り、脂質溶液は脂質溶液インレットポートを通じてマニホルドに入る。図1に示されるように、マニホルド中での水溶液および脂質溶液の混合によって、脂質ナノ粒子380の形成が起こり、脂質ナノ粒子は脂質ナノ粒子アウトレットポートを通じてマニホルドから出る。
図4 (パネルAおよびB)は、直径が1 mmのインレットポートおよびアウトレットポートを有する5ポートマニホルドを用いて製造されたドキソルビシンHClを含有するリポソームの結果を示す。1 ml/分の流量で、リポソームは約150 nmの平均直径を有する。流量が増えると、リポソームの直径は、流量が20〜50 ml/分である場合の約50 nmのプラトーに達するまで減少する。グラフBは、粒径分布の指標である多分散性指数(「PDI」)が20〜50 ml/分の流量で約0.2であることを示す。流量が10 ml/分未満である場合、PDIは約0.3まで増える。図4 (パネルCおよびD)は、直径が1.6 mmのポートを有する5ポートマニホルドで製造されたリポソームの結果を示す。パネルCは、5 ml/分の流量で、リポソームが約120 nmの平均直径を有することを示す。流量が最大で60 ml/分まで増える場合、直径のほぼ直線的な減少が認められる。パネルDは、0.35のPDIが流量とは比較的無関係であることを示す。
図5は、ドキソルビシンを負荷したリポソームのCryo-TEM画像化を示す。リポソームは、直径が1.0 mmのポートを有する5ポートマニホルドによって作出された。配合は、臨床的に用いられる抗がんリポソーム薬ドキソルビシンの製剤であるドキシルと実質的に同じである。図に示されるように、脂質は単層リポソームを形成し、ドキソルビシンが内部に結晶を形成する。
図6は、siRNAを含有するリポソームについて得られた結果を示す。パネルAおよびBは、直径が1 mmのポートを有する5ポートマニホルドで製造されたリポソームについての結果を例証する。5 ml/分の流量で、リポソームは約160 nmの平均直径を有する。リポソームの直径は、流量が20 ml/分の場合減少し、これ以上流量が増加しても実質的には変わらない。0.008のPDIは流量とは比較的無関係である。パネルCおよびDは、直径が1.6 mmのポートを有する5ポートマニホルドで製造されたリポソームについての結果を例証する。パネルCは、5 ml/分の流量で、リポソームが約150 nmの平均直径を有することを示す。流量が10 ml/分まで増えると、サイズは約90 nmまで減少する。流量のさらなる増加は、ナノ粒子のサイズの実質的な変化をもたらさない。パネルDは、PDIが5〜50 ml/分の流量の範囲内で約0.1〜0.2であることを示す。パネルEは、siRNAリポソームのCryo-TEM像を示す。図から分かるように、粒径は均一であるが、形態は単層または多層ではない。
図7A〜7Bは、脂質粒子の形態に及ぼす流量の影響を示す。図7Aは、40 ml/分の流量(孔径1 mm; 5ポートマニホルド)で作出された単層リポソームのCryo-TEM像を示し、81.1 nmの直径および0.021のPDIを有する粒子を生じた。リポソーム内部の結晶は、負荷されたドキソルビシンである。図7Bは、5 ml/分の流量(孔径1 mm; 5ポートマニホルド)で作出された脂質ディスクのCryo-TEM像を示し、直径約60 nmおよび脂質二重層厚さ約6 nmを有する脂質ディスクを主に生じた。
図8A〜8Dは、実施例8において用いられた、本発明の7ポートマニホルドにおけるインレットおよびアウトレットの数および方向に対する代替の例示的態様を示す。矢印はポートにおける流れの方向を示し、破線は既製マニホルドにおける封止された未使用ポートを示す。
活性薬剤を封入するリポソームを調製するための装置
本発明は、本明細書において記述されるマニホルドシステムのような、本発明の方法を行うために適合された装置を提供する。
いくつかの局面において、本技術は、混合チャンバ、チャンバに接続された少なくとも1つの脂質溶液インレットポート; およびチャンバに接続された複数の水溶液インレットポートを有しうるマニホルドを含む、APIを封入するLNPを調製するための装置を提供する。
好ましい態様において、装置は、チャンバに接続されたLNP溶液アウトレットポートを含みうる。
好ましくは、装置は、脂質溶液導管により脂質溶液インレットポートに接続された脂質溶液用のリザーバ、および水溶液導管により水溶液インレットポートに接続された水溶液用のリザーバを含みうる。
脂質溶液および水溶液用のインレットポート、ならびにリポソーム溶液用の出口ポートは、同じまたは異なるものである内径を有しうる。好ましくは、インレットポートおよびアウトレットポートは、約0.1 mm〜約10 mmの内径を有する。より好ましくは、ポートは、約0.15 mm〜約5 mmの内径を有する。
いくつかの態様において、混合チャンバは、導管の変換点に位置し、導管の形状を変化させずに、互いを貫通している、または交差している2つまたはそれ以上の導管によってそれ自体が形成されうる。例えば、混合チャンバは、変換点で全てが交差している2つまたはそれ以上の貫通チャネルを固体材料において穿設することにより形成されうる。さらに、導管を通じて流体を通過させないように、1つまたは複数の導管が封止されうる。そのような封止は、交差点の直前にまたはそこから離れて位置しうる。例えば、封止された導管は、図8A、8Cおよび8Dに例証されている。
いくつかの態様において、1つのマニホルドが2つ以上の混合チャンバを含みうる。例えば、1セットのインレットポートは1つのチャンバの位置で交差し、別グループのインレットポートは別のチャンバの位置で交差し、この2つのチャンバが、アウトレットポートに接続された第3の混合チャンバに導管によって接続される。
好ましくは、脂質溶液におよび水溶液に正流を誘導するためにポンプが用いられる。ポンプはインラインポンプまたはシリンジポンプでありうる。
典型的には、混合チャンバは2つ〜約20の水溶液インレットポートに接続されうる。好ましくは、3つ〜約11のそのようなポート、3つ〜約12のそのようなポートが存在しうる。より好ましくは、3つ〜約10、または3〜約7つの水溶液エントリインレットポートが存在する。混合チャンバはまた、1〜約5つの脂質溶液インレットポートに接続されうる。好ましくは、1〜約3つの脂質溶液インレットポートが存在する。より好ましくは、1または2つの脂質溶液インレットポートが存在する。好ましい態様において、混合チャンバは少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、または5つ)の脂質溶液ポートおよび少なくとも2つ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20)の水溶液インレットポートに接続される。
混合チャンバは、粒径制御のため、1〜約3つのリポソーム溶液用アウトレットポートにさらに接続され、好ましくは、1つ(例えば、1、2、または3つ)のアウトレットポートが存在する。
ある種の局面において、脂質溶液用のインレットポートおよび水溶液用のインレットポートとの間の角度は、約18°〜約180°である。好ましくは、角度は約24°〜約180°、より好ましくは、約30°〜約180°でありうる。いくつかの態様において、少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度は、180°または実質的に類似の角度ではない。例えば、少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度は、例えは、図8A〜8Dに示されるように、約120°またはそれ以下、約90°またはそれ以下である。ポート間の角度は、各溶液流が混合チャンバへ向けられる角度である。
脂質溶液および水溶液は、マニホルドを通じて同じ流量を有しうる。あるいは、溶液は異なる流量を有しうる。脂質溶液および水溶液の流量は、1 ml/分〜約6,000 ml/分、例えば、約1 ml/分〜約1,500 ml/分でありうる。好ましくは、流量は約5 ml/分〜約1,000 ml/分、例えば、約5 ml/分〜約400 ml/分でありうる。より好ましくは、流量は約20 ml/分〜約600 ml/分または約10 ml/分〜約300 ml/分でありうる。いくつかの態様において、流量をインレットポートのサイズに基づき調整して、所望のLNPサイズ、形態、PDI、および製造規模を得る。
LNPを調製するためのプロセス
本発明は、脂質ナノ粒子(LNP)を調製するための方法であって、
a) i) マニホルドの1つまたは複数のインレットポートの第1のセットを介して1つまたは複数の脂質溶液流を、およびii) マニホルドの1つまたは複数のインレットポートの第2のセットを介して1つまたは複数の水溶液流を、導入し、それによって、LNP溶液を生成するように脂質溶液および水溶液を混合する段階; ならびに
b) マニホルドの1つまたは複数のアウトレットポートを介してLNP溶液を回収する段階
を含み、
ここで少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度が、180°または実質的に類似の角度ではない、方法を提供する。いくつかの局面において、少なくとも1つの脂質溶液流および少なくとも1つの水溶液流は、約180°未満の角度で衝突する。かくして、いくつかの局面において、本方法はTコネクタを含まない。
いくつかの態様において、少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度は、約120°またはそれ以下、例えば、115°またはそれ以下、100°またはそれ以下、90°またはそれ以下、80°またはそれ以下、72°またはそれ以下、60°またはそれ以下、45°またはそれ以下、30°またはそれ以下、18°またはそれ以下である。
いくつかの態様において、段階のii)における水溶液は、少なくとも2つ、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のインレットポートを介して導入される。いくつかの態様において、段階のii)における水溶液は、少なくとも3つであるが11以下、例えば、少なくとも3つであるが7以下、少なくとも3つであるが5つ以下、少なくとも4つであるが11以下、少なくとも5つであるが11以下、少なくとも6つであるが11以下のインレットポートを介して導入される。
いくつかの態様において、少なくとも2つ(例えば、3、4、5、6、7つなど)の水溶液インレットポートおよび少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5つなど)の脂質溶液インレットポートは同一平面上にある。
いくつかの態様において、少なくとも1つ(例えば、2つ)のアウトレットポートは、インレットポート面と実質的に垂直である。他の態様において、少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5つなど)のアウトレットポートは、インレットポート面と実質的に垂直ではない。
いくつかの態様において、少なくとも2つ(例えば、3、4、5、6、7つなど)の水溶液インレットポートおよび少なくとも1つ(例えば、2、3、4、5つなど)の脂質溶液インレットポートは同一平面上にない。
いくつかの態様において、少なくとも1つのインレットポートへ導入される水溶液は、別のインレットポートへ導入される第2の水溶液とは異なる。
いくつかの態様において、水溶液および/または脂質溶液は、医薬品有効成分(API)を含む。
いくつかの態様において、段階a)は、iii) マニホルドの1つまたは複数のインレットポートを介して1つまたは複数の非水溶液流を導入する段階をさらに含む。
本発明の別の態様は、(i) 脂質溶液のリザーバ中に、有機溶媒と脂質とを含みうる脂質溶液、および(ii) 水溶液のリザーバ中に、水と緩衝液とを含む水溶液を供給する段階; ならびに(i) 混合チャンバ; (ii) チャンバに接続された少なくとも1つの脂質溶液インレットポート; および、(iii) チャンバに接続された複数の水溶液インレットポートを含みうるマニホルドを供給する段階; 各溶液流を混合チャンバへ導入し、LNPを生成するように、脂質溶液および水溶液を混合する段階; ならびにLNP内に医薬品有効成分を封入する段階を含みうる、医薬品有効成分(API)を封入しているLNPを調製するためのプロセスを提供する。
プロセスの1つの態様において、脂質溶液は、封入されるAPIを含みうる。別の態様において、水溶液はAPIを含みうる。
リポソーム内に薬物を封入する段階は、薬物が脂質溶液または水溶液に可溶化される場合には混合段階と同時に行われうる。理論によって束縛されるわけではないが、LNPは、水溶液および脂質溶液が接触するときに瞬時に生じるものと考えられる。脂質溶液によりまたは水溶液により運搬されるAPIは、APIと脂質との間の、親油性相互作用もしくは静電相互作用のいずれか、またはその両方を通じてLNPに封入されうる。
あるいは、APIは拡散または図2に例証される別の負荷プロセスにより空のLNPへ導入されうる。
プロセスの例示的なマニホルドは、前述されており、図1に示されている。
脂質および水溶液
本発明は、脂質および水溶液を利用する。脂質溶液は有機溶媒を含みうる。有機溶媒は水混和性溶媒でありうる。好ましくは、水混和性溶媒は、エタノール、メタノール、DMSOおよびイソプロパノールからなる群より選択される。最も好ましくは、有機溶媒はエタノールである。
脂質溶液は脂質の混合物を含みうる。脂質の混合物は好ましくは、コレステロールを含む。
脂質の混合物はまた、陽イオン性脂質を含みうる。陽イオン性脂質は、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(「DODAC」); N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(「DOTMA」); N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(「DODMA」); N,N-ジステアリル-N,N-臭化ジメチルアンモニウム (「DDAB」); N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド (「DOTAP」); N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(「DODAP」); 3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル)コレステロール(「DC-Chol」); N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-臭化アンモニウムヒドロキシエチル(「DMRIE」); 1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン(DLinDMA); 1,2-ジステアリールオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン(DSDMA); 1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン(DLenDMA); 2-{4-[(3b)-コレスト-5-エン-3-イルオキシ]ブトキシ}-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-アミン(CLinDMA)でありうるが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、脂質の混合物は陰イオン性脂質を含みうる。陰イオン性脂質は、ジアシルグリセロール ホスファチジン酸(phophatidic acid) (1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(DSPA)); 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(DPPA); 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(DMPA); 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(DLPA); 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(DOPA))、ジアシルグリセロールホスホグリセロール(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール) (DSPG); 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール) (DPPG); 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール) (DMPG); 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール) (DLPG); 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール) (DOPG))、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および他の陰イオン性修飾基が中性脂質と結合したものでありうるが、これらに限定されることはない。脂質の混合物はまた、中性脂質を含みうる。中性脂質は、ジアシルグリセロール ホスホコリン(L-α-ホスファチジルコリン, 水素化(大豆) (HSPC); 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC); 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC); 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC); 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC); 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、ジアシルグリセロール ホスホエタノールアミン(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE); 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE); 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE); 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLPE); 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、およびホスファチジルセリンでありうるが、これらに限定されることはない。
脂質の混合物はまた、ペグ化脂質を含みうる。ペグ化脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (mPEG-2000-DSPE); 1,2-ジオクタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (mPEG-2000-DOPE); 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (mPEG-2000-DPPE); 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (mPEG-2000-DMPE); 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (mPEG-2000-DLPE); 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000] (mPEG-5000-DSPE); 1,2-ジオクタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000] (mPEG-5000-DOPE); 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000] (mPEG-5000-DPPE); 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000] (mPEG-5000-DMPE); 1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000] (mPEG-5000-DLPE)でありうるが、これらに限定されることはない。
脂質の混合物はまた、脂質様分子またはリピドイド(lipidoid)を含みうる。脂質の混合物はまた、タンパク質、またはペプチド、またはオリゴヌクレオチドを含む脂質結合分子またはコレステロール結合分子を含みうる。
プロセスの水溶液は好ましくは、水と緩衝液とを含む。緩衝液は、リン酸塩、ヒスチジン、HEPES、Tris、酢酸塩、およびクエン酸のものでありうるが、これらに限定されることはない。
医薬品有効成分
好ましくは、APIは抗がん剤、抗炎症剤、および抗糖尿病剤でありうる。
APIはポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチドを含む)、タンパク質または小分子でありうる。
1つの態様において、APIはポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドはゲノムDNA断片、cDNA、mRNA、ssRNA、dsRNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、sdRNA、DsiRNA、LNA、およびアンチセンスDNAまたはRNAでありうる。
あるいは、APIは有機小分子APIでありうる。好ましくは、分子は約1500 g/モルから約50 g/モルまでの分子量を有する。
APIは、例えば、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または鎮痛薬でありうる。
例示的な抗がん剤は、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アメタントロン、アミノグルテチミド、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アゼテパ、ビサントレン、ブレオマイシン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピプロピジン、エルロチニブ、エトポシド、エトプリン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、ヒドロキシウレア、イプロプラチン、酢酸ロイプロリド、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール酢酸、メレンゲストロール酢酸、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトプリン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマイシン、マイトスペル、マイトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オキシスラン、パクリタキセル、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、セムスチン、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトゾシン、タリソマイシン、テガフール、テニポシド、テロキシロン、チアミプリン、チオグアニン、チアゾフリン、トリシリビンリン酸、トリエチレンメラミン、トリメトレキセート、ウラシルマスタード、ウレデパ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビンロシジン、ビンゾリジン、ジノスタチンおよびゾルビシンを含みうるが、これらに限定されない。
例示的な抗生物質剤は、アミノグリコシド; アミカシン; ゲンタマイシン; カナマイシン; ネオマイシン; ネチルマイシン; ストレプトマイシン; トブラマイシン; アンサマイシン; ゲルダナマイシン; ヘルビマイシン; カルバセフェム; ロラカルベフ; カルバペネム(carbacepenem); エルタペネム; ドリペネム; イミペネム/シラスタチン; メロペネム; セファロスポリン; セファドロキシル; セファゾリン; セファロチンまたはセファロシン; セファレキシン; セファクロル; セファマンドール; セフォキシチン; セフプロジル; セフロキシム; セフィキシム; セフジニル; セフジトレン; セホペラゾン; セホタキシム; セフポドキシム; セフタジジム; セフチブテン; セフチゾキシム; セフトリアキソン; セフェピム; セフトビプロール; グリコペプチド; テイコプラニン; バンコマイシン; マクロライド; アジスロマイシン; クラリスロマイシン; ジリスロマイシン; エリスロマイシン; ロキシスロマイシン; トロレアンドマイシン; テリスロマイシン; スペクチノマイシン; モノバクタム; アズトレオナム; ペニシリン; アモキシシリン; アンピシリン; アズロシリン; カルベニシリン; クロキサシリン; ジクロキサシリン; フルクロキサシリン; メズロシリン; メチシリン; ナフシリン; オキサシリン; ペニシリン; ピペラシリン; チカルシリン; バシトラシン; コリスチン; ポリミキシンB; キノロン; シプロフロキサシン; エノキサシン; ガチフロキサシン; レボフロキサシン; ロメフロキサシン; モキシフロキサシン; ノルフロキサシン; オフロキサシン; トロバフロキサシン; スルホンアミド; マフェニド; プロントシル(アルカイック(archaic)); スルファセトアミド; スルファメチゾール; スルファニリミド(sufanilimide) (アルカイック); スルファサラジン; スルフィソキサゾール; トリメトプリム; トリメトプリム-スルファメトキサゾール(コトリモキサゾール) (TMP-SMX); テトラサイクリン; デメクロサイクリン; ドキシサイクリン; ミノサイクリン; オキシテトラサイクリン; テトラサイクリン; アルスフェナミン; クロラムフェニコール; クリンダマイシン; リンコマイシン; エタムブトール; ホスホマイシン; フシジン酸; フラゾリドン; イソニアジド; リネゾリド; メトロニダゾール; ムピロシン; ニトロフラントイン(nitrofuantoin); プラテンシマイシン; ピラジナミド(purazinamide); キヌプリスチン/ダルホプリスチン; リファンピンまたはリファンピシン; およびチミダゾールを含みうるが、これらに限定されない。具体的な態様において、抗がん剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、イプロプラチン、酢酸ロイプロリド、およびメトトレキセートから選択される。
例示的な抗ウイルス剤は、チオセミカルバゾン; メチサゾン; ヌクレオシドおよび/またはヌクレオチド; アシクロビル; イドクスウリジン; ビダラビン; リバビリン; ガンシクロビル; ファムシクロビル; バラシクロビル; シドホビル; ペンシクロビル; バルガンシクロビル; ブリブジン; リバビリン、環状アミン; リマンタジン; トロマンタジン; ホスホン酸誘導体; フォスカメット; ホスホネット; プロテアーゼ阻害剤; サキナビル; インジナビル; リトナビル; ネルフィナビル; アンプレナビル; ロピナビル; ホスアンプレナビル; アタザナビル; チプラナビル; ヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素阻害剤; ジドブジン; ジダノシン; ザルシタビン; スタブジン; ラミブジン; アバカビル; テノホビルジソプロキシル; アデフォビルジピボキシル; エムトリシタビン; エンテカビル; 非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤; ネビラピン; デラビルジン; エファビレンツ; ノイラミニダーゼ阻害剤; ザナミビル; オセルタミビル; モロキシジン; イノシンプラノベクス; プレコナリル; ならびにエンフビルチドを含みうるが、これらに限定されない。
例示的な抗真菌剤は、アリルアミン; テルビナフィン; 代謝拮抗物質; フルシトシン; アゾール; フルコナゾール; イトラコナゾール; ケトコナゾール; ラブコナゾール; ポサコナゾール; ボリコナゾール; グルカン合成阻害剤; カスポファンギン; ミカファンギン; アニデュラファンギン; ポリエン; アムホテリシンB; アムホテリシンBコロイド分散液(ABCD); およびグリセオフルビンを含みうるが、これらに限定されない。
例示的な鎮痛薬は、オピエート誘導体、コデイン、メペリジン、メタドン、およびモルヒネを含みうるが、これらに限定されない。
LNP
本発明はまた、下記のプロセスによって作出された、APIを封入するLNPを包含する。
好ましくは、70%超のAPIがLNPに封入される。より好ましくは、80%超のAPIがLNPに封入され、最も好ましくは、90%超のAPIがLNPに封入される。
任意で、リポソームは単層のものであってもよい。あるいは、リポソームは多層のもの、または逆ヘキサゴナルもしくは立方体形態のものであってもよく、または脂質ディスク、中空リポソーム、もしくは固体脂質粒子としてであってもよい。
本プロセスによって作出されるLNPの平均粒径は、約10 nm〜約2,000 nmであり、好ましくは300 nm未満であり、より好ましくは、平均粒径は約10〜300 nmまたは約20〜約300 nmでありうる。より好ましくは、平均粒径は約20〜120 nmまたは約30〜約200 nm、最も好ましくは約30〜約120 nm、約10〜120 nm、は約60〜約100 nm、または20〜約80 nmである。
いくつかの態様において、LNP溶液は実質的に脂質ディスクを含む。他の態様において、LNP溶液は実質的にリポソームを含む。
いくつかの態様において、LNPは約0.005〜約0.8、例えば、0.005〜約0.5、0.01〜約0.5、0.01〜約0.4、0.01〜0.2の多分散性指数を有する。
リポソーム溶液を作出するための方法
脂質溶液
脂質溶液は、一緒に混合される個々の脂質の貯蔵液から作出されうる。脂質は好ましくは、脂質溶液を作出するために有機溶媒に溶解される。脂質溶液を作出するために使われる有機溶媒は、水と混和性でありうる。好ましくは、溶媒はエタノール、メタノール、DMSO、プロパノール、DMF、THF、アセトン、ジオキサン、エチレングリコール、ポリエチレングリコールおよびイソプロパノールでありうる。より好ましくは、溶媒はポリエチレングリコール、イソプロパノール、およびエタノールである。好ましくは、溶媒は10%未満の水を含む。場合によっては、脂質溶液は、脂質の混合物から作出されてもよく、そのうえで混合物を有機溶媒に溶解する。溶液中の総脂質の濃度は、約1 mg/ml〜約200 mg/ml、例えば、約1 mg/ml〜約100 mg/mlの範囲内でありうる。より好ましくは、溶液中の総脂質の濃度は、約5 mg/ml〜約80 mg/mlまたは約10 mg/ml〜100 mg/mlの範囲内でありうる。いくつかの態様において、有機溶媒は約70%またはそれ以上(例えば、75%またはそれ以上、80%またはそれ以上、85%またはそれ以上、90%またはそれ以上、95%またはそれ以上、100%)の濃度のエタノールである。
脂質の混合物は、最適なAPI送達のために必要とされる場合には最適化されるものと考えられ、当業者によって日常の実験により容易に最適化される。下記の実施例2において、脂質溶液の総脂質濃度は29 mg/mlである; 脂質は無水エタノールに溶解される。
ある種の態様において、不水溶性APIは脂質溶液に溶解されうる。脂質溶液中のAPIの濃度は、薬剤の効力に依るものと考えられ、当業者によって容易に判定されうる。脂質/API比は、APIに対するLNPの封入力によって判定されるものと考えられる。
APIによる水溶液(S1)の調製
水溶性APIを第1の水溶液に溶解させることができる(S1)。溶液のpHおよび塩分を最適化しAPIと脂質との間の相互作用の要件に適応させて、リポソームを形成させることができる。当業者は、これらの条件を容易に判定することができる。下記の実施例において示されるように、実施例6におけるS1は、20 mMクエン酸塩、0.5 mg/mlのsiRNA, pH 5.0を含む。酸性pHが脂質DLinDMAをプロトン化させると、プラスに帯電した脂質がマイナスに帯電したsiRNAと相互作用して、siRNAをリポソームに封入する。実施例1において、溶液1、2、および3は、250 mM (NH4)2SO4, pH 6.5の溶液である。
APIのない水溶液(S2)の調製
当業者には容易に明らかであるように、(S2)といわれる、APIを欠く水溶液は、本薬剤を有する溶液と類似していてもよい。あるいは、S1およびS2は違っていてもよい。実施例6に示されるように、S2は20 mMクエン酸塩および100 mM NaCl, pH 5.0の溶液であるが、S1は20 mMクエン酸塩, pH 5.0の溶液である。
リポソーム調製
溶液の混合
脂質溶液および水溶液は好ましくは、それぞれが約1 ml/分から約6000 ml/分の流量で、異なるポートからマニホルドに入る。好ましくは、流量は約5 ml/分から約1000 ml/分でありうる。より好ましくは、流量は約20 ml/分から約600 ml/分でありうる。いくつかの態様において、流量をインレットポートのサイズに基づき調整して、所望のLNPサイズ、形態、PDI、および製造規模を得る。
いくつかの態様において、脂質溶液および/または水溶液は、約1 ml/分〜約2,500 ml/分の流量で0.1〜0.5 mmのポートサイズを経由して導入される。
いくつかの態様において、脂質溶液および/または水溶液の流速は、約0.002 m/sから約10 m/s、例えば、0.02 m/sから8 m/s、0.2 m/sから6 m/sである。流速をインレットポートのサイズに基づき調整して、所望のLNPサイズ、形態、PDI、および製造規模を得る。
LNPへのAPIの負荷
溶液の混合による
混合チャンバ中で、脂質はリポソーム粒子に即座に集まるものと考えられる。薬物APIが脂質溶液によりまたは水溶液により運搬されると、それは、APIと脂質との間の、親油性相互作用もしくは静電相互作用、またはその両方によってリポソームに封入されうる。
拡散による
本発明はまた、APIを含まないLNP (いわゆる「空の」LNP)を生成する方法を提供する。そのような態様において、APIは、マニホルド中で混合される脂質溶液にも水溶液にもともに存在しない。APIは、拡散のプロセスまたは別のプロセスによってリポソームに負荷されうる。例えば、ドキソルビシンはpH勾配でリポソームに負荷されうる。米国特許出願第10/019,200号、PCT公開番号WO 2001/005373、米国特許第5,785,987号、同第5,380,531号、同第5,316,771号、および同第5,192,549号を参照されたく、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
好ましくは、APIをLNP溶液と混合し、拡散によってリポソームにAPIをアップロードする。1つの局面において、APIを水溶液に溶解し、この溶液を空のLNPと混合する。別の局面において、APIは空のLNPの溶液に易溶性でありうるので、APIは空のLNPの溶液と容易に混合されうる。
APIの溶液とAPIの空のリポソーム溶液との体積比は好ましくは、約1:50〜約1:5の範囲内である。溶液の体積はより低いことが好ましい。というのは、それによって、最終のリポソーム溶液へのかなりの希釈が回避されるからである。
薬物封入効率は、好ましくは70%超である。より好ましくは、効率は80%超である。最も好ましくは、効率は90%超である。
リポソーム濃度調整
接線流ろ過を用いて、リポソーム溶液を濃縮することができる。
緩衝液交換
LNP溶液中の残存有機溶媒は、緩衝液交換によって除去されうる。好ましくは、緩衝液交換は、接線流ろ過によって行われる。別の態様において、緩衝液交換は透析によって行われうる。
滅菌ろ過
リポソーム溶液は好ましくは、0.22ミクロンの除菌フィルタを通過させることによって滅菌される。
LNPの使用について記述している米国特許、特許出願、PCT公開は、米国特許第8,067,390号、PCT公開番号WO 02/100435A1、PCT公開番号WO 03/015757A1、PCT公開番号WO 04/029213A2; 米国特許第5,962,016号、米国特許第5,891,467号、米国特許第5,030,453号、および米国特許第6,680,068号; ならびに米国特許出願公開第2004/0208921号であり、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
以下の実施例は例示であって、制限するものではない。技術の多くの変形が本開示の精査によって当業者には明らかになるであろう。技術の範囲は、それゆえ、実施例に関して判定されるべきではなく、それに代えて等価物のその全範囲とともに添付の特許請求の範囲に関して判定されるべきである。
材料
本実施例において用いられたマニホルドの全ては、PEEK重合体で作られており、市販の供給源から購入された。
方法
実施例1: ドキシル(Doxil)脂質組成物によるリポソームの調製
脂質を無水エタノールに溶解させた。水溶液1、2、3は全て、250 mM硫酸アンモニウム, pH 6.5であった。脂質溶液の組成は、実施例1の表に示されている。脂質のモル比は、臨床的に用いられるドキソルビシン抗がんリポソーム製剤であるドキシルの配合と実質的に同じである。上記の4溶液の各1ミリリットルを20 mlの注射器に負荷した; 各注射器を配管によって5ポートマニホルドインレットポートに接続した。配管を通じて、注射器中の溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。マニホルドの孔径(直径)は1.0 mmまたは1.6 mmであった。混合の流量は5、10、もしくは20、または30、または40、または50 ml/分であった。リポソーム溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。
粒径および多分散性指数は、HEPES緩衝生理食塩水(10 mM HEPES, pH 7.4, 138 mM NaCl)中でMalvern Zetasizer Nano ZSにより判定された。結果を図4に提示する。
実施例1の脂質組成
Figure 0006450742
実施例2: ドキソルビシン負荷リポソームの調製
脂質を無水エタノールに溶解させた。水溶液1、2、3は全て、250 mM硫酸アンモニウム, pH 6.5であった。脂質溶液の組成は、実施例2の表に示されている。脂質のモル比は、ドキソルビシン抗がんリポソーム製剤であるドキシルの配合と実質的に同じである。上記の4溶液の各1ミリリットルを20 mlの注射器に負荷した; 各注射器を配管によって5ポートマニホルドインレットポートに接続した。配管を通じて、注射器中の溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。混合器の孔径(直径)は0.5 mmであり、流量は40 ml/分であった。リポソーム溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。緩衝液を透析によりヒスチジン/スクロース緩衝液(12.5 mMヒスチジン, 9.2%スクロース, pH 6.5)へ交換した。Z平均粒径は0.021のPDIで86.1 nmであった。
空のリポソーム2ミリリットルをヒスチジン/スクロース緩衝液中10 mg/mlの濃度でドキソルビシン溶液0.198 mlと混合し、2時間42℃でインキュベートした。脂質/ドキソルビシン比(w/w)は7.99であり、99.5%のドキソルビシンがリポソームへ負荷された。負荷されたリポソームのZ平均粒径は0.032のPDIで87.3 nmであった。この方法により作出されたドキソルビシン負荷リポソームのCryo-TEM像を図5に示した。
実施例2の脂質組成
Figure 0006450742
実施例3: 6ポートマニホルドを用いたリポソームの調製
脂質を無水エタノールに溶解させた。脂質溶液1ミリリットルを5 mlの注射器へ負荷し、硫酸アンモニウム溶液(250 mM, pH 6.5)を、注射器ごとに1 mlとして4本の5 ml注射器へ負荷した。各注射器を配管によって6ポートマニホルド(IDEX Health & Sciences, 品番P-152)インレットポートに接続した。注射器に負荷された脂質および硫酸アンモニウム溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。6ポートマニホルドの孔径は1.0 mmであり、流量は20 ml/分であった。リポソーム溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。
HEPES緩衝生理食塩水(10 mM HEPES, pH 7.4, 138 mM NaCl)中でMalvern Zetasizer Nano ZSにより判定されたZ平均粒径および多分散性指数は、それぞれ、80.2 nmおよび0.207であった。
実施例3の脂質組成
Figure 0006450742
実施例4: 7ポートマニホルドを用いたリポソームの調製
脂質を無水エタノールに溶解させた。脂質溶液1ミリリットルを5 mlの注射器へ負荷し、硫酸アンモニウム溶液(250 mM, pH 6.5)を、注射器ごとに1 mlとして5本の5 ml注射器へ負荷した。各注射器を配管によって7ポートマニホルド(IDEX Health & Sciences, 品番P-150)インレットポートに接続した。注射器に負荷された脂質および硫酸アンモニウム溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。7ポートマニホルドの孔径は1.0 mmであり、流量は20 ml/分であった。リポソーム溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。
HEPES緩衝生理食塩水(10 mM HEPES, pH 7.4, 138 mM NaCl)中でMalvern Zetasizer Nano ZSにより判定されたZ平均粒径および多分散性指数は、それぞれ、60.1 nmおよび0.120であった。
実施例4の脂質組成
Figure 0006450742
実施例5: 9ポートマニホルドを用いたリポソームの調製
脂質を無水エタノールに溶解させた。脂質溶液1ミリリットルを5 mlの注射器へ負荷し、硫酸アンモニウム溶液(250 mM, pH 6.5)を、注射器ごとに1 mlとして7本の5 ml注射器へ負荷した。各注射器を配管によって9ポートマニホルド(IDEX Health & Sciences, 品番P-191)インレットポートに接続した。注射器に負荷された脂質および硫酸アンモニウム溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。9ポートマニホルドの孔径は1.0 mmであり、流量は20 ml/分であった。リポソーム溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。
HEPES緩衝生理食塩水(10 mM HEPES, pH 7.4, 138 mM NaCl)中でMalvern Zetasizer Nano ZSにより判定されたZ平均粒径および多分散性指数は、それぞれ、63.1 nmおよび0.133であった。
実施例5の脂質組成
Figure 0006450742
実施例6: siRNAリポソームの調製
脂質溶液:
脂質溶液の成分は実施例6の表に示した。
RNAは、実施例6においては61/791,054に記述されているsiApoB-1配列であった。
水溶液1: siRNA: クエン酸塩緩衝液(20 mM, pH 5.0)中0.5 mg/ml; 水溶液2: 20 mMクエン酸塩, pH 5.0, 100 mM NaCl; 水溶液3: 水溶液2と同じ
上記の4溶液の各1ミリリットルを20 mlの注射器に負荷した; 各注射器を配管によって5ポートマニホルドインレットポートに接続した。注射器に負荷された脂質、siRNA、および水性緩衝溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。リポソーム溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。5ポートマニホルド混合器の孔径は、1 mmまたは1.6 mmであった。流量は5、または10、または30、または40、または50 ml/分であった。
siRNAリポソームの孔径およびPDIは、HEPES緩衝生理食塩水(10 mM HEPES, pH 7.4, 138 mM NaCl)中でMalvern Zetasizer Nano ZSにより判定された。粒子形態をCryo-TEMによって画像化した。結果を図6に示す。図に示されるように、脂質は単層リポソームを形成し、ここではドキソルビシンが結晶を形成する。
実施例6の無水エタノール中の脂質溶液
Figure 0006450742
実施例7: 流量の変化による同じ配合からのリポソームおよび脂質ディスクの調製
脂質を無水エタノールに溶解させた。水溶液1、2、3は全て、250 mM硫酸アンモニウム, pH 6.5であった。脂質溶液の組成は、実施例7の表に示されている。上記の4溶液の各1ミリリットルを20 mlの注射器に負荷した; 各注射器を配管によって5ポートマニホルドインレットポートに接続した。配管を通じて、注射器中の溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。マニホルドの孔径(直径)は1.0 mmであり、流量は40 ml/分、または5 ml/分であった。リポソームまたは脂質ディスク溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。緩衝液を透析によりHEPES緩衝液(10 mM HEPES, 138 mM NaCl, pH 7.5)へ交換した。リポソームにドキソルビシンを負荷した。Cryo-TEM像から、40 ml/分の流量により、86.1 nmのZ平均粒径および0.021のPDIを有する単層リポソームが作出されることが特定された(図7A)。5.0 ml/分の流量により、直径約60 nmおよび約6 nmの脂質二重層厚を有する脂質ディスク(図7B)が主に作出された。
実施例7の脂質組成
Figure 0006450742
実施例8: リポソーム粒径に及ぼす出口ポートの数および位置の影響
脂質を無水エタノールに溶解させた。水溶液1、2、3は全て、250 mM硫酸アンモニウム, pH 6.5であった。脂質溶液の組成は、実施例7の表に示されている。上記の4溶液の各1ミリリットルを20 mlの注射器に負荷した; 各注射器を配管によって7ポートマニホルドインレットポートに接続した(図8A〜8Dに示されているようにさまざまに構成された)。配管を通じて、注射器中の溶液を注射器ポンプによりマニホルドの混合チャンバへ注入した。マニホルドの孔径(直径)は0.5 mmであり、流量は35 ml/分であった。残り3つのポート(中央の1つが他のポートおよび2つの側方ポートに垂直、図8の図解を参照されたい)の1つまたは2つまたは3つを、リポソーム溶液のアウトレットポートとして用いた。リポソーム溶液はアウトレットポートから出て、ガラスバイアルに集められた。異なる数のアウトレットポートによって、異なるリポソーム粒径が得られた: 3つのアウトレットポート(図8A)の場合には91 nm (PDI 0.146)、2つのアウトレットポート(図8B)の場合には81 nm (PDI 0.089); および1つのアウトレットポート(図8Cおよび8D)の場合には74-75 nm (PDI 0.052〜0.088)。アウトレットの位置は粒径に有意な影響を及ぼさなかった(図8Cおよび8D)。それゆえ、リポソーム粒径はアウトレットポートの数によって制御することができる。
実施例8の脂質組成
Figure 0006450742

Claims (26)

  1. (a)(i)マニホルドの1つまたは複数のインレットポートの第1のセットを介して1つまたは複数の脂質溶液流を、および(ii)該マニホルドの2つまたはそれ以上のインレットポートの第2のセットを介して1つまたは複数の水溶液流を、導入し、該流れは、混合チャンバの中央で衝突するように方向付けられており、それによって、脂質ナノ粒子(LNP)溶液を生成するように脂質溶液および水溶液を瞬時に混合する段階であって、該脂質溶液が、有機溶媒に溶解された脂質を含む、段階; ならびに
    (b)該マニホルドの1つまたは複数のアウトレットポートを介してLNP溶液を回収する段階
    を含む、LNPを調製するための方法であって、
    少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度が180°または実質的に類似の角度ではなく、少なくとも2つの水溶液インレットポートおよび少なくとも1つの脂質溶液インレットポートが同一平面上にない、前記方法。
  2. 少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度が約120°またはそれ以下である、請求項1記載の方法。
  3. 段階の(ii)における水溶液が、少なくとも2つのインレットポートを介して導入される、請求項1記載の方法。
  4. 段階の(ii)における水溶液が、少なくとも：3つであるが11以下のインレットポートを介して導入される、請求項3記載の方法。
  5. 少なくとも2つの水溶液インレットポートおよび少なくとも1つの脂質溶液インレットポートが同一平面上にある、請求項3記載の方法。
  6. 少なくとも1つのアウトレットポートが、インレットポートの平面と実質的に垂直である、請求項5記載の方法。
  7. 少なくとも1つのアウトレットポートが、インレットポートの平面と実質的に垂直ではない、請求項5記載の方法。
  8. 少なくとも2つの水溶液インレットポートおよび少なくとも2つの脂質溶液インレットポートが同一平面上にない、請求項3記載の方法。
  9. 脂質溶液および/または水溶液が約1 ml/分〜6,000 ml/分の流量で導入される、請求項1記載の方法。
  10. 脂質溶液および/または水溶液が約1 ml/分〜約2,500 ml/分の流量で0.1〜5 mmのポートサイズを経由して導入される、請求項9記載の方法。
  11. 脂質溶液および/または水溶液の流速が約0.002 m/s〜約10 m/sである、請求項1記載の方法。
  12. LNP溶液が実質的に脂質ディスクを含む、請求項1記載の方法。
  13. LNP溶液が実質的にリポソームを含む、請求項1記載の方法。
  14. LNPの平均粒径が、約10 nm〜約2,000 nmである、請求項1記載の方法。
  15. LNPが約0.0005〜約0.5の多分散性指数を有する、請求項1記載の方法。
  16. 有機溶媒が約70%またはそれ以上の濃度のエタノールである、請求項1記載の方法。
  17. 脂質溶液中の総脂質の濃度が約1 mg/ml〜約200 mg/mlの範囲内である、請求項1記載の方法。
  18. 脂質溶液中の脂質の1つが陰イオン性脂質、陽イオン性脂質、または中性脂質から選択される、請求項1記載の方法。
  19. 少なくとも1つのインレットポートへ導入される水溶液が、別のインレットポートへ導入される第2の水溶液とは異なる、請求項3記載の方法。
  20. 水溶液および/または脂質溶液が、医薬品有効成分(API)を含む、請求項1記載の方法。
  21. 段階(a)が、(iii)マニホルドの1つまたは複数のインレットポートを介して1つまたは複数の非水溶液流を導入することをさらに含む、請求項1記載の方法。
  22. LNP溶液から回収されたLNPにAPIを負荷する段階(c)をさらに含む、請求項1記載の方法。
  23. APIが小分子、ペプチド、タンパク質、RNA、またはDNAである、請求項20記載の方法。
  24. APIが抗がん剤、抗生物質剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または鎮痛薬である、請求項20記載の方法。
  25. 抗がん剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、イプロプラチン、酢酸ロイプロリド、およびメトトレキセートから選択される、請求項24記載の方法。
  26. 請求項1記載の方法を行うために適合された、医薬品有効成分（API）を封入しているリポソームを調製するための装置であって、
    該装置は、
    混合チャンバ；
    該チャンバに接続された少なくとも1つの脂質溶液インレットポート；
    該チャンバに接続された複数の水溶液インレットポート；および
    該チャンバに接続されたLNP溶液アウトレットポート
    を有するマニホルドを含み、
    前記脂質溶液が、有機溶媒に溶解された脂質を含み、
    脂質溶液インレットポートおよび水溶液インレットポートを介して、脂質溶液流および水溶液流が、混合チャンバの中央で衝突するように方向付けられており、それによって、LNP溶液を生成するように脂質溶液および水溶液が瞬時に混合され、
    少なくとも1つの脂質溶液インレットポートと少なくとも1つの水溶液インレットポートとの間の角度が180°または実質的に類似の角度ではなく、少なくとも2つの水溶液インレットポートおよび少なくとも1つの脂質溶液インレットポートが同一平面上にない、装置。
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