PT1345597E - Nanopartículas lipídicas anfifílicas para incorporação de péptidos e/ou proteínas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS ANFIFÍLICAS PARA INCORPORAÇÃO DE PÉPTIDOS E/OU PROTEÍNAS" Área da invenção

Esta invenção refere-se a nanopartículas lipídicas que consistem em lipidos enriquecidos em componentes anfifilicos, que promovem a incorporação de péptidos e/ou proteínas, e a um processo para obtê-las, bem como à sua utilização.

Contexto da invenção

Sistemas de distribuição de fármacos que foram investigados durante muitos anos incluem micropartículas, lipossomas, emulsões óleo-em-água (0/A) e nanopartículas à base de polímeros sintéticos ou macromoléculas naturais. A utilização de lipidos sólidos como material matricial para a distribuição de fármacos é bem conhecida, como grânulos lipídicos para a distribuição oral de fármacos (por exemplo, cápsulas de Mucosolvan® Retard). A produção de micropartículas lipídicas por congelação por pulverização foi descrita por Speiser no início da década de oitenta (Speiser et al., Pharm. Res. 8_ (1991) 47-54), seguidas de nanogrânulos lipídicos para administração perorai (Speiser EP 0167825 (1990)). Basicamente, os lipidos que podem ser utilizados são bem tolerados pelo corpo (por exemplo, glicéridos compostos por ácidos gordos que estão presentes nas emulsões para nutrição parentérica).

Vesículas fosfolipídicas redescobertas na forma de "lipossomas" em 1965 por Bagham apareceram no mercado 2 cosmético em 1986 (J. E. Diederichs et al., Pharm. Ind. 56> (1994) 267-275).

No que se refere a micropartículas poliméricas, o seu número no mercado é limitado, tendo havido apenas um aumento limitado do número de produtos em micropartículas. A situação é ainda pior para nanopartículas poliméricas; passados mais de 30 anos de investigação, este sistema de distribuição praticamente não existe no mercado. Esta situação deve-se a motivos muito bem conhecidos, entre os quais se devem salientar dois: a citotoxicidade de polímeros e a ausência de um método adequado de produção em larga escala. Polímeros aceites para utilização como implantes não têm necessariamente também boa tolerabilidade na forma de nanopartículas. Na gama de dimensões de nanómetros e tendo uma dimensão de alguns micrómetros, o polímero pode ser interiorizado por células (por exemplo, macrófagos), e a degradação dentro da célula pode conduzir a um efeito citotóxico, por exemplo, como relatado para polímeros de poliésteres (Int. J. Pharm. 30_ (1986) páginas 215-220, A. Smith).

Considerando as limitações dos transportadores de fármacos convencionais, como lipossomas, emulsões lipídicas, nanopartículas e microesferas, há uma necessidade óbvia de um sistema transportador para a distribuição controlada de substâncias bioactivas, como péptidos ou proteínas, para ultrapassar as desvantagens dos sistemas tradicionais, particularmente no que se refere à preparação, estabilidade e toxicidade.

Nanopartículas lipídicas são um sistema transportador alternativo a transportadores coloidais tradicionais, como emulsões, lipossomas e micro- e nanopartículas poliméricas, e têm as propriedades aqui mencionadas a seguir: • biodegradabilidade e ausência de toxicidade; 3 • capacidade para incorporar substâncias fracamente solúveis em água; • estabilidade química e física melhorada; • possibilidade de preparar uma formulação de armazenamento a seco; • libertação controlada de substâncias incorporadas.

Também é bem conhecido que nanopartículas lipídicas são caracterizadas como partículas lipídicas num estado físico sólido na gama de dimensões de nanómetros que combinam as vantagens de outros sistemas de distribuição de fármacos, como as seguintes: • o estado sólido da matriz lipídica permite libertação prolongada do fármaco e • protege o ingrediente incorporado de degradação química, • os lípidos são basicamente bem tolerados (baixa toxicidade celular e sistémica), • é possível a produção em larga escala por homogeneização a alta pressão, semelhante a emulsões e lipossomas.

Muitos fármacos diferentes foram incorporados em nanopartículas lipídicas, tendo-se estimado a sua capacidade de carga para avaliar a conveniência de um sistema transportador de fármacos. Westesen et al. estudaram a incorporação de fármacos para ubidecarenona (J. Control. Release 4_8 (1997) páginas 223-236). Foram

descritos vários tipos de fármacos como sendo aptos a ser incorporados em nanopartículas lipídicas, por exemplo, tetracaína ou etomidato (J. Microencapsulation, volume 16, n° 2 (1999) páginas 205-213), palmitato de Vitamina E (Proc. Int. Symp. Control. Release Bioact. Mater. 25_ (1998) páginas 433-434), ciclosporina (WO 99/56733 (1999)), 4 timolol (S. T. P. Pharma Sciences 6 (1992) 514-518, Gasco et al.), doxorrubicina e idarrubicina (Int. J. Pharm. 89 (1993), Gasco et al.). No entanto, foi pouco estudada a incorporação de péptidos em nanoparticulas lipídicas, tal como, por exemplo, Muller et al., com nanoparticulas lipídicas carregadas com lisozimas (Int. J. Pharm. 149 (1997) páginas 255-265).

Até à data, muitos investigadores prepararam nanoparticulas lipídicas como transportadores coloidais para a distribuição controlada de fármacos. Domb et al. (WO 91/07171) produziram lipoesferas como transportadores de fármacos e outros agentes bioactivos. Utilizando ultra-sonicação, Speiser et al. (Ger. Offen. DE 3421468 (1985)) obtiveram nanogrânulos lipidicos (80-800 nm) constituídos maioritariamente por ácidos gordos e seus ésteres com glicerol. Sjõsrtõm e Bergenstahl obtiveram nanoparticulas lipídicas por precipitação em emulsões de solvente (Int. J. Pharm. 88^ (1993) páginas 53-62) . Siekmann e Westesen (Pharm. Pharmacol. Lett. 1 (1992) páginas 123-126),

Westesen et al. (Int. J. Pharm. 93 (1993) páginas 189-199) e Muller et al. (J. Controlled Rei. 3(3 (1994) páginas 83-96) produziram nanoparticulas lipídicas por homogeneização a alta pressão de lípidos fundidos dispersos numa solução aquosa de surfactante.

Relativamente à carga de péptido e/ou proteína quando se utilizam nanoparticulas lipídicas como sistema de distribuição de fármacos, ainda há vários problemas por resolver: propriedades de fraca solubilidade relativamente ao referido fármaco carregado, fraca estabilidade do fármaco carregado, interacções fracas entre o fármaco e a matriz lipídica, 5 degradação enzimática e química, má absorção ao longo do tracto gastrointestinal. A patente DE 198 19 273 A revela partículas lipídicas sólidas que compreendem ciclosporina e, opcionalmente, um surfactante.

Descrição da invenção A presente invenção proporciona um tipo novo de nanopartículas lipídicas que compreendem lípidos anfifílicos adequados para a incorporação de péptidos e/ou proteínas, para proporcionar a sua libertação controlada depois de terem sido administradas.

Em particular, o objectivo principal da invenção consiste em proporcionar um novo tipo de nanopartículas lipídicas que compreendem um fármaco, uma matriz lipídica e um surfactante, caracterizadas por o referido fármaco ser um péptido ou uma proteína e por a referida matriz lipídica ter um teor de monoglicéridos que é pelo menos 70% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da matriz lipídica.

Para obter uma incorporação melhorada dos referidos péptidos e/ou proteínas na matriz lipídica examinaram-se vários lípidos com diferentes características hidrófilas/hidrófobas e composições químicas, tais como, por exemplo, tri-, di- e monoglicéridos, PEG- ou PPG-glicéridos, sacárido-glicéridos, ácidos gordos e misturas destes.

Surpreendentemente, observou-se que se pode obter a carga máxima de péptido e/ou proteína utilizando uma matriz lipídica que contenha um teor elevado de monoglicéridos, que confere propriedades anfifílicas às nanopartículas lipídicas. Verificou-se que o teor de monoglicéridos da referida matriz lipídica deve perfazer pelo menos 70% p/p, preferivelmente desde 75 até 99% p/p. Em consequência, de 6 acordo com a presente invenção, pode utilizar-se qualquer um dos lipidos acima mencionados ou qualquer mistura de um ou mais daqueles desde que a quantidade total de monoglicéridos perfaça pelo menos 70%, como explicado acima.

De acordo com uma especificação preferida da invenção, a matriz lipidica tem um ponto máximo de fusão de pelo menos 65°C, mais preferivelmente pelo menos 70°C. O ponto máximo de fusão da matriz lipidica pode ser facilmente determinado por qualquer método conhecido na área. Um exemplo destes métodos é Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC).

Além disso, de acordo com outra especificação preferida da invenção, a matriz lipidica tem um elevado teor cristalino. Pode determinar-se o teor cristalino por qualquer método conhecido na área. Por exemplo, experiências de DSC podem permitir determinar qualitativamente se a matriz lipidica tem um elevado teor cristalino ou é polimórfica. De facto, o gráfico de DSC de uma matriz lipidica polimórfica exibirá múltiplos pontos máximos de fusão pequenos e largos, ao passo que o gráfico de DSC de uma matriz lipidica com elevado teor cristalino exibirá um ponto máximo grande e abrupto.

As nanoparticulas lipidicas carregadas com fármaco de acordo com a invenção são estabilizadas por compostos tais como surfactantes iónicos ou não iónicos. Surfactantes adequados incluem, mas não se limitam aos seguintes exemplos: fosfolipidos sintéticos, seus derivados hidrogenados e respectivas misturas, esfingolipidos e glicoesfingolipidos, ácidos gordos saturados ou insaturados, álcoois gordos, copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno, ácidos gordos etoxilados bem como respectivos ésteres ou éteres, dimiristoilfosfatidilcolina, 7 dimiristoilfosfatidilglicerol, ou uma combinação de dois ou mais dos compostos acima mencionados. Um surfactante preferido de acordo com a invenção é dimiristoilfosfatidilglicerol .

Opcionalmente, as referidas nanoparticulas lipidicas são suplementarmente estabilizadas por pelo menos um co-surfactante seleccionado do grupo que compreende ou consiste em butanol, ácido butírico, ácido hexanóico, colato de sódio, taurocolato de sódio e glicocolato de sódio, mais particularmente colato de sódio.

Nanoparticulas lipidicas da invenção também podem incluir outros excipientes, tais como polímeros com propriedades bioadesivas ou intensificadoras da absorção, e podem ser seleccionados do grupo que compreende ou consiste em polímeros acrílicos (Carbopol®, Policarbofil, Noveon®), ácidos gordos de cadeia média e polietilenoglicóis. Excipientes preferidos são os polímeros acrílicos acima mencionados.

Pretende-se que todos os componentes de entre matriz lipídica, surfactante, co-surfactante e os outros excipientes sejam farmaceuticamente aceitáveis.

Tipicamente, qualquer péptido ou proteína terapeuticamente eficaz pode ser incorporado nas nanoparticulas lipidicas da invenção. A maior parte das proteínas terapeuticamente úteis pode ser agrupada em 3 classes: factores reguladores, incluindo hormonas, citoquinas, linfoquinas, quimioquinas, seus receptores e outros factores reguladores do crescimento celular e metabolismo compreendendo enzimas; produtos do sangue, incluindo factores sanguíneos derivados do soro e activadores enzimáticos do fibrinogénio; 8 anticorpos monoclonais.

De acordo com uma especificação da invenção, proteínas ou péptidos adequados como mencionado acima incluem, mas não se limitam aos exemplos seguintes: AAT, UK, PUK, estreptoquinase, tPA, SOD, insulina, GH, GRF, ANF, GnRH, análogos da LHRH, eritropoietina, CSF de granulócitos, CSF de granulócitos-macrófagos, Interleuquina-1, Interleuquina-2, Interleuquina-3/CSF multipotencial, Interleuquina-4, Interleuquina-5 (ou CSF de eosinófilos), Interleuquina-6, Interleuquina-7, Interleuquina-8, Interleuquina-9,

Interleuquina-10, Interleuquina-11, interferão-a, interferão-β, interferão-γ, factor inibidor de leucemia, CSF de macrófagos, TNF, Factor de células estaminais, bem como os seus receptores.

De acordo com uma especificação preferida da invenção, a referida proteína, ou péptido, é seleccionada do grupo que consiste em Interleuqina-6, Interferão-a, Interferão-β, Interferão-γ, GnRH, análogos da LHRH, GH, GRF, gonadotropinas (como FSH, LH e hCG) e receptores do TNF, ou respectivos fragmentos solúveis.

Mais preferivelmente, o péptido é seleccionado do grupo que consiste em análogos da LHRH e, mais particularmente, um decapéptido que actue como antagonista da LHRH.

Numa especificação particularmente preferida da presente invenção, uma lista não limitativa dos referidos péptidos inclui os seguintes compostos:

Abarelix (revelado em WO 9640757), actua como antagonista da LHRH e é definido pela fórmula aqui apresentada a seguir: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3- (3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-N-metil-L-Tyr-D-Asn-L-Leu-N6-(1-metiletil)-L-Lys-L-Pro. 9

Antarelix (revelado em WO 9219651), actua como antagonista da LHRH e é definido pela fórmula seguinte: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-L-Tyr-Νβ-(aminocarbonil)-D-Lys-L-Leu-N6-(1-metiletil)-L-Lys-L-Pro. - Azalina B (revelado em US 5296468), actua como antagonista da GnRH e é definido pela fórmula seguinte: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-4-[(5-amino-lH-l,2,4-triazolo-3-il)amino]-L-Phe-4-[(5-amino-lH-l,2,4-triazolo-3-il) amino]-D-Phe-L-Leu-N6-(1-metiletil)-L-Lys-L-Pro.

Ganirelix (revelado em EP 277829), actua como antagonista da LHRH e é definido pela fórmula seguinte: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser—L-Tyr-N6-[bis(etilamino) metileno]-D-Lys-L-Leu-N6-[bis(etilamino)metileno]-L-Lys-L-Pro .

Numa especificação mais preferida da presente invenção, o referido péptido que actua como antagonista da LHRH é um decapéptido especifico denominado Antide. Este decapéptido (N-Ac-D-2-Nal, D-pCIPhe, D-3-Pal, NicLys, D-NicLys, Ilys, D-Ala, NH2) tem uma actividade anti-ovulatória impressionante bem como propriedades antagonistas da LHRH, e já foi descrito (EP 377665 e US 5470947) que actua directamente no metabolismo hormonal numa mulher.

Outro péptido preferido particular que actua como antagonista da LHRH é outro decapéptido denominado Cerotide (cujo INN é Cetrorelix, revelado na EP 299402), que tem a fórmula seguinte: D-Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-Ala-4-Cl-D-Phe-3-(3-piridinil)-D-Ala-L-Ser-L-Tyr-N5-(aminocarbonil)-D-ornitil-L-Leu-L-Arg-L-Pro.

Assim, relata-se aqui que as nanopartículas lipídicas carregadas com péptido ou proteína são, de facto, adequadas 10 para serem utilizadas como medicamento, para a preparação de uma composição farmacêutica. No caso preferido, em que o péptido é um decapéptido que actua como antagonista da LHRH, a composição farmacêutica será útil para a modulação do metabolismo hormonal num mamífero ou para o tratamento ou prevenção de perturbações associadas a actividade anormal do metabolismo hormonal numa mulher. Mais especificamente, para o tratamento ou prevenção de perturbações associadas a actividade anormal da via da LHRH. Neste caso específico, nanopartículas lipídicas carregadas com péptido são úteis para o tratamento de doenças hormonais, estados patológicos ou acções contraceptivas nas quais o antagonismo da LHRH desempenha um papel importante, como um agente contraceptivo para inibir a ovulação num mamífero ou inibir o crescimento de tumores dependentes de hormonas ou a produção de testosterona num mamífero. Nanopartículas lipídicas carregadas com péptido podem ser empregues isoladamente ou em combinação com outros agentes farmacêuticos.

Quando empregues como agentes farmacêuticos, nanopartículas lipídicas carregadas com péptido ou proteína da presente invenção são tipicamente administradas como uma forma galénica farmacêutica. Assim, composições farmacêuticas que compreendam nanopartículas lipídicas carregadas com péptido ou proteína e excipientes farmacêuticos, como diluentes, agentes antioxidantes, surfactantes, co-surfactantes agentes de regulação da viscosidade, antimicrobianos, crioprotectores, também pertencem ao âmbito da presente invenção. Essa composição pode ser preparada de um modo bem conhecido na área farmacêutica. Em geral, as nanopartículas lipídicas carregadas com péptido ou proteína da presente invenção são administradas numa quantidade terapeuticamente eficaz. A 11 quantidade realmente administrada será tipicamente determinada por um médico à luz das circunstâncias relevantes, incluindo o estado a ser tratado, a via de administração escolhida, a idade, peso e resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente e afins.

As composições farmacêuticas destas invenções podem ser administradas por uma variedade de vias, incluindo as vias oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra-arterial, intraperitoneal, dérmica, sublingual, rectal, bucal, vaginal, nasal ou pulmonar. A via de administração oral é a preferida de acordo com a invenção.

Dependendo da via de distribuição pretendida, os compostos podem ser formulados em formas liquidas ou sólidas. As composições para administração oral podem tomar a forma de soluções ou suspensões liquidas em volume ou substâncias pulverulentas.

Formas liquidas adequadas para administração oral podem incluir veiculos aquosos ou não aquosos adequados juntamente com tampões, agentes de suspensão e distribuição, corantes, aromatizantes e afins.

Formas sólidas podem incluir, por exemplo, qualquer um dos ingredientes seguintes, ou compostos de natureza semelhante: um aglutinante, como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina, um excipiente, como amido ou lactose, um agente desintegrador, como ácido alginico, Primogel ou amido de milho, um lubrificante, como estearato de magnésio, um agente deslizante, como dióxido de silício coloidal, um agente adoçante, como sucrose ou sacarina, ou um agente aromatizante, como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja.

Composições injectáveis baseiam-se tipicamente em solução salina esterilizada injectável ou solução salina 12 tamponada com fosfato ou outros transportadores injectáveis conhecidos na área.

Outro objectivo da presente invenção consiste num processo para preparar as nanoparticulas lipidicas carregadas com um péptido ou uma proteína que foram apresentadas acima.

De acordo com um método de produção preferido, as nanoparticulas lipidicas carregadas com péptido ou proteína da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende os passos seguintes (ver Figura 2): 1. incorporação do fármaco na fase lipídica e dissolução do surfactante e, opcionalmente, do co-surfactante na fase aquosa, em condições de aquecimento controlado; 2. mistura da fase lipídica com a fase aquosa; 3. Homogeneização a Alta Pressão da pré-emulsão obtida; 4. arrefecimento da nano-emulsão em condições de temperatura rigorosamente controlada; 5. opcionalmente, eliminação da água.

Cada um dos passos mencionados acima é aqui pormenorizado a seguir.

Primeiro passo O referido péptido e/ou proteína é incorporado em matrizes lipidicas por uma técnica de co-fusão bem conhecida. Em particular, o lípido é primeiramente fundido num banho termostatizado, a uma temperatura apropriada, dependendo do lípido utilizado. Em seguida, o referido péptido e/ou proteína é adicionado em passos ao lípido fundido com agitação constante. 0 fármaco também pode ser incorporado na matriz lipídica utilizando a técnica de "extracçâo de solventes". 0 fármaco e o lípido são primeiramente co-solubilizados a uma temperatura adequada num solvente apropriado, que é 13 subsequentemente extraído em condições apropriadas (sob vácuo, a uma temperatura adequada).

Neste primeiro passo, a matriz pode ser modificada com excipientes adicionais, como fosfolípidos, com propriedades tensioactivas e hidrofilicidade que possa promover suplementarmente a incorporação do fármaco na matriz. Os fosfolípidos são habitualmente utilizados na indústria farmacêutica para a preparação de emulsões parentéricas e entéricas, bem como para a estabilização de suspensões, pulverizações e aerossóis e para a produção de lipossomas. Além disso, estes excipientes poderão exercer um efeito benéfico na absorção do fármaco.

No primeiro passo, surfactantes e, opcionalmente, co-surfactantes são dissolvidos na fase aquosa. 0 surfactante tem um efeito estabilizador na emulsão/suspensão ao reduzir a tensão interfacial entre as fases lipídica e aquosa. 0 co-surfactante também actua como estabilizador, pois pensa-se que se colocará na interface entre as duas fases, conferindo assim uma carga à superfície das partículas e prevenindo a coalescência das partículas.

Quando se empregar a técnica de "extracção de solventes" para a incorporação do fármaco na matriz lipídica, o solvente utilizado é seleccionado do grupo que consiste em água, etanol, propanol, álcool benzílico, isopropanol ou uma mistura destes, mais particularmente álcool benzílico.

Segundo passo

As fases aquosa e lipídica, mantidas à mesma temperatura (entre 30°C e 90°C, particularmente 50°C e 85°C, mais particularmente 65°C e 85°C) são vigorosamente misturadas para se obter uma pré-emulsão. 14

Terceiro passo

Aplica-se Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 30°C e 90°C, com uma pressão compreendida entre 50 bar e 2000 bar, particularmente entre 500 bar e 1800 bar, mais particularmente entre 1000 e 1500 bar. Durante este passo ocorre ruptura de partículas por cavitação e tensão mecânica, que conduz a uma nano-emulsão.

Quarto passo A nano-emulsão obtida é arrefecida em condições de temperatura controlada. Após cristalização do lípido aparecem nanopartículas lipídicas sólidas.

Os passos mencionados acima são realizados numa gama de pH entre 1 e 9, particularmente entre 5 e 7.

Nesta fase obtêm-se as Nanopartículas lipídicas da invenção em fase sólida, mas numa suspensão aquosa. A dimensão (diâmetro médio) das referidas nanopartículas numa formulação de nanopartículas lipídicas tem um perfil em forma de sino (gráfico logarítmico frequência versus dimensão, ver Figura 3) que abrange uma gama desde alguns nanómetros (10 nm) até cerca de 10 μπι. Em consequência, a dimensão de uma população de partículas é melhor descrita pelos parâmetros D (v, 0,1), D (v, 0,5) e D (v, 0,9), que definem a distribuição de dimensões da população do modo seguinte: D (v, 0,1) = 10% (em volume) das partículas têm uma dimensão inferior a este valor D (v, 0,5) = 50% (em volume) das partículas têm uma dimensão inferior a este valor D (v, 0,9) = 90% (em volume) das partículas têm uma dimensão inferior a este valor 15

Para as formulações de nanopartículas lipidicas mais promissoras que seleccionámos, os parâmetros da dimensão são os seguintes: D (v, 0,1) = na gama 0,15 μιη - 0,20 μιη D (v, 0,5) = na gama 0,30 μιη - 0,60 μιη D (v, 0,9) = na gama 1 μιη - 10 μιη como se pode observar dos dados apresentados na Tabela 3 e da Figura 6, onde se apresentam curvas de grãos super-finos de volume determinado por LD sobrepostas de uma formulação de nanopartículas lipidicas analisada em diferentes instantes até aos 6 meses.

Descreve-se aqui a seguir a composição das formulações aquosas de nanopartículas lipidicas obtidas de acordo com uma especificação preferida da presente invenção. Péptido ou Proteína (% p/p) Fase lipídica (% p/p) Surfactante (% p/p) Co- surfactante (% p/p) Outros excipientes (isto é, intensificadores da absorção/ bioadesivos) H20 (% p/p) 0,1 até 25 2 até 50 0,1 até 7 0 até 2 0,001 até 7 até 100

De acordo com uma composição preferida da invenção, o teor de péptido ou proteína vai desde 0,1 até 20% p/p, particularmente desde 0,1 até 0,5% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da formulação aquosa final.

Numa especificação preferida da invenção, o teor da matriz lipídica vai desde 2 até 50% p/p, particularmente desde 5 até 40% p/p, mais particularmente desde 8 até 30% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da formulação aquosa final.

De acordo com outra composição preferida da invenção, o teor do surfactante vai desde 1 até 5% p/p, particularmente desde 2 até 4% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da formulação aquosa final. 16

De acordo com uma composição particularmente preferida da invenção, o teor do co-surfactante vai desde 0 até 1% p/p, particularmente desde 0,2 até 0,8% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da formulação aquosa final.

De acordo com uma composição particularmente preferida da invenção, o teor do excipiente intensificador da absorção vai desde 0 até 5% p/p, mais particularmente desde 0,2 até 1% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da formulação aquosa final.

De acordo com uma composição particularmente preferida da invenção, o teor do excipiente bioadesivo vai desde 0 até 0,05% p/p, particularmente desde 0,005 até 0,05% p/p e mais particularmente desde 0,005 até 0,02% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da formulação aquosa final.

Bastante surpreendentemente, nanoparticulas lipidicas carregadas com péptido/proteina de acordo com a presente invenção exibiram estabilidade satisfatória (6 meses e mais) com eficiência inalterada da encapsulação (ver Fig. 6) .

Uma comparação entre Nanoparticulas Lipidicas de Compritol de acordo com a invenção carregadas com ciclosporina e Nanoparticulas Lipidicas de Imwitor 900 carregadas com ciclosporina (como representado em DE 198119273) revela melhor estabilidade da composição no que se refere à dimensão (ver Fig. 4 e Fig. 5).

Quinto passo (opcional)

Se as nanoparticulas lipidicas se destinarem a ser empregues para composições farmacêuticas em formas galénicas sólidas, é necessário eliminar a água da suspensão aquosa. Isto pode ser efectuado por qualquer técnica conhecida na área, por exemplo, por filtração ou ultra-filtração ou por liofilização. 17

Este parágrafo apresenta abreviaturas e definições dos vários termos biológicos e analíticos, bem como abreviaturas utilizadas ao longo desta candidatura de patente, pretendendo-se que sejam aplicadas uniformemente ao longo da especificação e reivindicações a menos que seja expressamente indicado o contrário. "Anfifílico" refere-se a um composto com afinidade para dois ambientes diferentes - por exemplo, uma molécula com regiões hidrófilas (polares) e lipófilas (não polares) . Os detergentes são exemplos clássicos. "AAT" refere-se a α-1-antitripsina. "ANF" refere-se a Factor Natriurético Atrial. "Antide", cujo INN proposto é Iturelix, refere-se ao seguinte decapéptido: N-Ac-D-2-Nal, D-pCIPhe, D-3-Pal, Ser, NicLys, D-NicLys, Leu, Ilys, Pro, D-Ala, NH2, em que: "2-Nal" refere-se a 3-(2-naftil)alanina, "Ilys" refere-se a N-isopropil-lisina, "NicLys" refere-se a N-nicotinoil-lisina, "3-Pal" refere-se a 3-(3-piridil)alanina. "DSC" refere-se a Calorimetria Diferencial de Varrimento. "ΔΗ" refere-se a variação da entalpia. "DMPC" refere-se a DiMiristoilFosfatidilColina. "DMPG" refere-se a DiMiristoilFosfatidilGlicerol. "FACTOR VIII" refere-se a uma glicoproteína que contém 2331 aminoácidos. "FSH" refere-se a Hormona Estimulante do Folículo. "GH" refere-se a Hormona de Crescimento.

Pretende-se que "glicéridos" signifique ésteres de glicerol de C4-C30 ácidos gordos saturados ou insaturados. "GRF" refere-se a Factor de Libertação da hormona de Crescimento. "GnRH" refere-se a Hormona de Libertação da Gonadotropina. "HPH" refere-se a Homogeneização a Alta Pressão. 18 "LD" refere-se a Difractometria Laser. "LHRH" refere-se a Hormona de Libertação da Hormona Luteinizante. "Lípido", de acordo com a presente invenção, refere-se a uma substância que é fracamente solúvel em água mas que é solúvel em solventes orgânicos. De acordo com a presente invenção, lipidos incluem ácidos gordos, mono-, di- e triglicéridos, fosfolípidos, PEG-glicéridos, sacárido-glicéridos ou ceras e qualquer mistura destes. "LN" refere-se a nanoparticulas lipidicas. "P.f." refere-se a ponto de fusão. "Monoglicéridos" refere-se a compostos obtidos aplicando esterificação por ácidos gordos de uma das funções álcool de glicerol como mostrado aqui a seguir:

CH2OH-CHOH-CH2OH---------------------> CH2OCOR1-CHOH-CH2OH

Glicerol Monoglicérido em que R1 é uma C4-C30 cadeia hidrocarbonada saturada ou insaturada; ou por hidrólise parcial de triglicéridos. "Nanoparticulas" refere-se a partículas cujo diâmetro médio está compreendido numa gama desde 1 nm até 3000 nm. "PCS" refere-se a Espectroscopia por Correlação de Fotões. "PEG" refere-se a Polietilenoglicol. "Péptido" significa uma coluna vertebral de poliamida que contém átomos de carbono tetraédricos entre grupos amida. A cadeia peptídica é obtida por condensação de aminoácidos: um grupo amino de um liga-se ao grupo carboxilo do seguinte, formando uma ligação peptídica.

Pretende-se que "farmaceuticamente aceitável" abranja qualquer substância que não interfira na eficácia da actividade biológica do ingrediente activo e que não seja tóxica para o hospedeiro ao qual é administrada. 19 "Polimorfo" refere-se a uma substância com capacidade para adoptar várias formas cristalinas no seu estado sólido. "Proteínas" refere-se a uma molécula que compreende uma sequência de aminoácidos polipeptídica. A principal distinção entre péptidos e proteínas está relacionada com a dimensão. De acordo com a presente invenção, os péptidos não têm mais de 100 aminoácidos, ao passo que as proteínas têm mais de 100 aminoácidos. "PUK" refere-se a Pró-uroquinase. "Sacárido" refere-se a um grupo aldeído ou a um grupo cetona com pelo menos dois grupos hidroxilo, cujo sacárido adopta várias formas: forma monomérica (monossacárido), forma dimérica (dissacárido), forma trimérica (trissacárido), oligómero (oligossacárido) e polímero (polissacárido). "SOD" refere-se a Superóxido Dismutase. "Surfactante" refere-se a um composto anfifílico capaz de estabilizar emulsões e suspensões de materiais não polares em solução aquosa. "Co-surfactante" refere-se a um composto anfipático capaz de completar e optimizar a acção do surfactante. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para afectar o decurso e gravidade das doenças descritas acima, conduzindo à redução ou remissão dessa patologia. A quantidade eficaz dependerá da via de administração e do estado do paciente. "TNF" refere-se a Factor de Necrose Tumoral. "tPA" refere-se a Activador do Plasminogénio em Tecidos. "UK" refere-se a uroquinase. "p/p" refere-se a peso/peso. A presente invenção será ilustrada por intermédio de alguns exemplos que fazem referência às Figuras seguintes. 20

Descrição das Figuras

Figura 1: Esta figura refere-se à tensão superficial de soluções aquosas de Antide para diferentes concentrações do fármaco.

Figura 2: O esquema da Figura 2 descreve o método de produção de nanoparticulas lipidicas carregadas com péptido de acordo com a invenção.

Figura 3: Esta figura mostra curvas de frequência de LD de uma formulação de nanoparticulas lipidicas com a composição seguinte: Antide 0,2%, Compritol E ATO 9,8%, Lutrol F68 5%, água até 100%.

Figuras 4 e 5: Estas figuras mostram curvas de frequência de LD de duas formulações de LN diferentes carregadas com ciclosporina. A primeira (Figura 4) de acordo com a invenção é composta por Ciclosporina 0,2%, Compritol E ATO 9,3%, DMPG Na 0,5%, Tagat S 2,5% e colato de Na 0,5%. A segunda (Figura 5), como descrito em DE 19819273, é composta por Ciclosporina 0,2%, Imwitor 900 9,3%, Tagat S 2,5% e colato de Na 0,5%.

Estas medições foram efectuadas para diferentes valores t: ..... t=0; - t = 24 horas; ----- t = 14 dias; - t = 1 mês.

Figura 6: Esta figura mostra curvas de grãos super-finos de volume determinado por LD sobrepostas de uma formulação de nanoparticulas lipidicas (composta por Antide 0,2%,

Compritol E ATO 9,3%, DMPG 0,5%, Tagat S 2,5%, Colato de 21 Sódio 0,5%, água até 100%), obtida por análise de LD em diferentes instantes até aos 6 meses.

Figura 7: Esta figura refere-se a análises de DSC de Compritol E ATO (teor de monoglicéridos: 80%) e Imwitor 900 (teor de monoglicéridos: 40-50%) puros.

Figura 8: Esta figura refere-se ao perfil de libertação de fármacos in vivo em água a partir de LN27 e LN28 carregados com Antide. LN27 = Antide 0,2%, Compritol E ATO 9,3%, DMPG 0,5%, Tagat S 2,5%, Colato de Sódio 0,5% LN28 = Antide 0,2%, Compritol E ATO 9,3%, DMPG 0,5%, Lutrol F68 5%

Teor de água de todas as formulações = até 100%.

Figura 9: Esta figura refere-se à avaliação da bioactividade in vitro de Antide incorporado em sistemas lipidicos. LN27 = Antide 0,2%, Compritol E ATO 9,3%, DMPG 0,5%, Tagat S 2,5%, Colato de Sódio 0,5% LN28 = Antide 0,2%, Compritol E ATO 9,3%, DMPG 0,5%, Lutrol F68 5% LN29 = Antide 0,2%, Compritol E ATO 9,8%, Lutrol F68 5%

Teor de água de todas as formulações = até 100%.

Figura 10: Esta figura mostra a cinética da libertação de três formulações diferentes de nanoparticulas lipidicas carregadas com Antide quando injectadas subcutaneamente em ratos. As curvas representam a concentração de Antide no plasma ao longo do tempo. 22

EXEMPLOS O péptido utilizado nos Exemplos aqui apresentados abaixo é Antide. Este péptido tem caracteristicas anfifílicas, como demonstrado pelos dados seguintes.

Análise da tensão superficial. Efectuaram-se medições da tensão superficial yLV utilizando um tensiómetro Kruss (sistema de análise do formato da gota) em soluções aquosas de Antide para diferentes concentrações do fármaco, nomeadamente 0,01, 0,1, 1,0, 10 mM. Os resultados estão apresentados na Figura 1.

Coeficiente de partição. Foi determinado utilizando octanol como fase orgânica e água como fase hidrófila. As duas fases foram primeiramente saturadas entre si durante 24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, dissolveu-se Antide na fase aquosa a uma concentração bem inferior à saturação. Subsequentemente, adicionou-se à fase aquosa um volume igual da fase orgânica e manteve-se a mistura com agitação durante 24 horas à temperatura ambiente. Determinou-se a concentração de Antide nas duas fases por RP-HPLC, tendo-se obtido o coeficiente de partição a partir da razão da concentração do fármaco entre a fase orgânica e a fase aquosa. O coeficiente resultante octanol/água foi 8,56 . 10’2.

Apresentam-se na Tabela 1 os resultados da avaliação semi-quantitativa da solubilidade do Antide nalguns lipidos, juntamente com o teor de monoglicéridos dos lipidos.

Preparação e caracterização de nanopartículas lipídicas carregadas com péptido

Descrevem-se abaixo alguns exemplos respeitantes à presente invenção utilizando diferentes composições. A 23

Figura 2 esquematiza a preparação de nanoparticulas lipidicas pelo método de HPH.

Materiais e equipamento Antide em volume, Bachem.

Imwitor 900 (Monoestearato de glicerilo), Condea Chemie-DE. Compritol E ATO (Monobeenato de glicerilo), Gattefossé-FR. Compritol 888 ATO (Beenato de glicerilo), Gattefossè-FR. Imwitor 312 (Monoglicérido do ácido láurico), Condea Chemie-DE.

Imwitor 928 (Mono/dicocoato de glicerilo), Condea Chemie-DE.

Geleol (Mono-palmitato/estearato de glicerilo), Gattefossè-FR.

Compritol HD 5 ATO (Beenato de glicerilo/polietileno-glicol), Gattefossè-FR.

Superpolystate (Estearato de polietilenoglicol), Gattefossè-FR.

Precirol ATO 5 (Mono-/di-/tripalmitato/estearato de glicerilo), Gattefossè-FR.

Witepsol E 85 (Triglicéridos de Cio-Cis ácidos gordos saturados), Massa Witepsol

Softisan 142 (Coco-glicéridos hidrogenados), Condea Chemie-DE.

Gelot 64 (palmitato/estearato de glicerilo/ polietilenoglicol), Gattefossè-FR.

Monosteol (Palmitato/estearato de propilenoglicol), Gattefossè-FR.

Gelucire 44/14 (Mistura definida de mono/di/triésteres de ácido láurico com glicerol e polietilenoglicol), Gattefossè-FR. 24

Gelucire 50/13 (Combinação definida de mono/di/triésteres de ácido esteárico com glicerol e polietilenoglicol), Gattefossè-FR. Álcool cetilico, Sigma.

Lutrol F68 (copolimero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno), Basf-D.

Tagat S (Estearato de glicerilo de PEG30), Goldschmidt-D. Ácido cáprico, Sigma.

Sal de sódio do ácido eólico, ICN Aurora Ohio-EUA.

Sal de sódio de 1,2-dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), Chemi-I. 1,2-Dimiristoilfosfatidileolina (DMPC), Chemi-I.

Noveon AA1 (Goodrich).

Pemulen TR-2 NF (Goodrich).

Calorimetro Diferencial de Varrimento Perkin Elmer Pyris 1. As análises de DSC foram realizadas no modo de aguecimento e arrefecimento com as seguintes condições de operação: Gama: 8°C - 100°C; Velocidade de varrimento: 5°C/minuto; Capacidade do recipiente (com orifício): 50 μΐ; fluxo de N2: 20 μΐ/minuto. Os parâmetros de DSC foram avaliados na 2a ronda de aquecimento que exibiu as principais transições térmicas.

Difractómetro Laser Malvern Mastersizer Microplus MAF 5001. Malvern Zetasizer 3000HS (Análise da dimensão e análise do potencial Zeta).

Homogeneizador a Alta Pressão MICRON LAB 40 (APV), equipado com uma camisa termostática.

Sistema de análise do formato da gota DAS 10-Kruss. 25

Sistema HPLC Waters: Módulo de Separação 2690; Coluna RP, Júpiter 5 μιη C18 (250 x 4,6 mm, 5 μηι) ; Detector de Absorvância Dual λ 2487.

Exemplo 1: Preparação de nanoparticulas lipidicas utilizando Compritol E ATO, Taqat S e Colato de sódio

Após dispersão do péptido (Antide, 0,08 g) no lipido fundido (Compritol E ATO, 3,92 g) a 85°C, adicionou-se a fase aquosa morna com surfactante (Tagat S, 1,0 g) e co-surfactante (Colato de sódio, 0,2 g) . A mistura obtida foi pré-homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em condições de temperatura controlada, tendo-se formado nanoparticulas sólidas após cristalização do lipido. A dimensão do lote foi 40 g.

Exemplo 2: Preparação de nanoparticulas lipidicas utilizando Compritol E ATO, DMPG, Taqat S e Colato de sódio (LN27)

Após dispersão do péptido (Antide, 0,08 g) no lipido fundido (Compritol E ATO, 3,72 g) que continha DMPG (0,2 g) a 85°C, adicionou-se a fase aquosa morna com surfactante (Tagat S, 1,0 g) e co-surfactante (Colato de sódio, 0,2 g). A mistura obtida foi pré-homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em condições de temperatura controlada, tendo-se 26 formado nanopartículas sólidas após cristalização do lípido. A dimensão do lote foi 40 g.

Exemplo 2A: Preparação de nanopartículas lipídicas utilizando Imwitor 900, DMPG, Tagat S e Colato de sódio

Repetiu-se o Exemplo 2 mas utilizando Imwitor 900 em vez de Compritol E ATO. No final do procedimento, as nanopartículas não se formaram porque as partículas tenderam a agregar-se. Isto deve-se a diferenças do teor de monoglicéridos, pontos máximos de fusão e teor cristalino entre os dois lípidos. Todas essas diferenças foram apresentadas na Figura 7.

Exemplo 3: Preparação de nanopartículas lipídicas utilizando Compritol E ATO, Imwitor 900, DMPG, Tagat S e Colato de sódio

Após dispersão do péptido (Antide, 0,08 g) na combinação de lípidos fundidos (Compritol E ATO e Imwitor 900, 9:1, 3,72 g) que continha DMPG (0,2 g) a 85°C, adicionou-se a fase aquosa morna com surfactante (Tagat S, 1,0 g) e co-surfactante (Colato de sódio, 0,2 g). A mistura obtida foi pré-homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em condições de temperatura controlada, tendo-se formado nanopartículas sólidas após cristalização do lípido. A dimensão do lote foi 40 g. 27

Exemplo 4: Preparação de nanopartículas lipídicas utilizando Compritol E ATO, DMPG e LUTROL F68 (LN28)

Após dispersão do péptido (Antide, 0,08 g) no lipido fundido (Compritol E ATO, 3,72 g) que continha DMPG (0,2 g) a 85°C, adicionou-se a fase aquosa morna com surfactante (Lutrol F68, 2,0 g) . A mistura obtida foi pré- homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em condições de temperatura controlada, tendo-se formado nanopartículas sólidas após cristalização do lipido. A dimensão do lote foi 40 g.

Exemplo 5: Preparação de nanopartículas lipídicas utilizando Compritol E ATO e Lutrol F68 (LN29)

Após dispersão do péptido (Antide, 0,08 g) no lipido fundido (Compritol E ATO, 3,92 g) a 85°C, adicionou-se a fase aquosa morna com surfactante (Lutrol F68, 2,0 g) . A mistura obtida foi pré-homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em condições de temperatura controlada, tendo-se formado nanopartículas sólidas após cristalização do lipido. A dimensão do lote foi 40 g. 28

Exemplo 6: Preparação de nanopartículas lipídicas utilizando Compritol E ATO, Ácido cáprico, Taqat S e Colato de sódio

Após dispersão do péptido (Antide, 0,08 g) na fase de lipido fundido (Compritol E ATO, 3,64 g, e ácido cáprico, 0,08 g) a 85°C, adicionou-se a fase aquosa morna com surfactante (Tagat S, 1,0 g) e co-surfactante (Colato de sódio, 0,2 g) . A mistura obtida foi pré-homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em condições de temperatura controlada, tendo-se formado nanopartículas sólidas após cristalização do lipido. A dimensão do lote foi 40 g.

Exemplo 7: Preparação de nanopartículas lipídicas utilizando Compritol E ATO, DMPG, Lutrol F68 e Noveon AA1 O péptido (Antide, 0,08 g) foi disperso no lipido fundido (Compritol E ATO, 3,92 g) que continha DMPG (0,4 g) a 85°C. A fase aquosa foi preparada do modo seguinte: dissolveu-se o surfactante (Lutrol F68, 2,0 g) em metade do volume da fase aquosa (cerca de 17 ml de água) , ao passo que o Noveon AA1 (4 mg) foi disperso na outra metade do volume da fase aquosa (cerca de 17 ml de água) . Adicionou-se primeiramente a fase aquosa morna com surfactante à fase lipídica fundida e, subsequentemente, a outra parte da fase aquosa que continha Noveon foi derramada na mistura, que então foi pré-homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em 29 condições de temperatura controlada, tendo-se formado nanopartículas sólidas após cristalização do lipido. A dimensão do lote foi 40 g.

Exemplo 8: Preparação de nanopartículas lipidicas

utilizando Compritol E ATO, Lutrol F68 e Pemulen TR-2 NF O péptido (Antide, 0,08 g) foi disperso no lipido fundido (Compritol E ATO, 3,92 g) que continha DMPG (0,4 g) a 85°C. A fase aquosa foi preparada do modo seguinte: dissolveu-se o surfactante (Lutrol F68, 2,0 g) em metade do volume da fase aquosa (cerca de 17 ml de água) , ao passo que o Pemulen (4 mg) foi disperso na outra metade do volume da fase aquosa (cerca de 17 ml de água) . Adicionou-se primeiramente a fase aquosa morna com surfactante à fase lipídica fundida e, subsequentemente, a outra parte da fase aquosa que continha Pemulen foi derramada na mistura, que então foi pré-homogeneizada, à mesma temperatura, utilizando um dispositivo comum de homogeneização para obter uma pré-emulsão. Essa emulsão foi submetida a Homogeneização a Alta Pressão a uma temperatura entre 80°C e 90°C. A nano-emulsão obtida desta forma foi arrefecida em condições de temperatura controlada, tendo-se formado nanopartículas sólidas após cristalização do lipido. A dimensão do lote foi 40 g.

Apresenta-se abaixo a caracterização das nanopartículas lipidicas preparadas como descrito nos Exemplos 1-5.

Exemplo 9: Avaliação da eficiência da encapsulação de Antide em nanopartículas lipidicas

Determinou-se a eficiência da encapsulação de Antide em nanopartículas lipidicas por RP-HPLC. Em primeiro lugar, a suspensão de nanopartículas lipidicas foi completamente dissolvida em acetona. Seguidamente extraiu-se o Antide 30 adicionando água à fase orgânica. A mistura das duas fases foi agitada, sonicada e centrifugada e a fase límpida foi subsequentemente removida e injectada na coluna de HPLC. Deve notar-se que o teor de fármaco determinado por este método deve ser considerado como o teor total de fármaco, sem qualquer referência a Antide incluído nas nanopartículas lipídicas ou dissolvido na fase aquosa contínua. Surpreendentemente, o Antide foi encapsulado com uma eficiência de 85-90%. Além disso, as nanopartículas lipídicas formadas eram fisicamente e quimicamente estáveis a 4°C durante pelo menos 6 meses após a preparação. De facto, não se observou degradação do ingrediente activo e as características físicas das nanopartículas lipídicas permaneceram inalteradas; não se notou qualquer agregação entre as partículas.

Exemplo 10: Libertação de Antide in vitro

Nanopartículas lipídicas com Antide foram incubadas no meio de libertação (água); recolheram-se amostras em instantes diferentes, que foram subsequentemente filtradas em filtros Acrodisc de 0,22 μπι. Analisou-se a solução límpida por RP-HPLC. Apresentam-se na Figura 8 os resultados da libertação de Antide a partir de duas formulações.

Exemplo 11: Caracterização físico-química de nanopartículas lipídicas

Avaliou-se a dimensão das partículas e a distribuição da dimensão das partículas de formulações de nanopartículas lipídicas carregadas com Antide por Difractometria Laser (LD) e Espectroscopia por Correlação de Fotões (PCS) utilizando o Difractómetro Laser da Malvern e o Zetasizer, respectivamente. Também se mediu o potencial Zeta das 31 nanopartículas lipídicas utilizando o Zetasizer. Os resultados estão apresentados na Tabela 3. Para a análise de LD, algumas gotas de nanopartículas lipídicas foram dispersas em 100 ml de água desionizada de modo a obter um valor de obscurecimento entre 5% e 30%. A amostra foi mantida em circulação na unidade de dispersão a uma velocidade da bomba de 1500 rpm. Para cada amostra fizeram-se pelo menos três medições; os dados foram processados utilizando a apresentação 5NFD (RI das partículas = [1,456, 0,01] como parte real e imaginária, respectivamente, e RI do dispersante = 1,3300). Efectuou-se a análise de dimensões por PCS utilizando água MilliQ filtrada (0,2 pm) como meio dispersante. A concentração das formulações de nanopartículas lipídicas utilizada para a análise foi cerca de 1 μΐ/ml, de modo a obter um valor da taxa de contagem inferior a 500 Kcps. Para a análise do potencial Zeta das nanopartículas lipídicas, utilizou-se como dispersante uma solução aquosa de NaCl filtrada (0,2 pm) com uma condutividade de cerca de 50 pS (medida exactamente com um aparelho de medição da condutividade). A concentração das formulações de nanopartículas lipídicas para esta análise foi cerca de 0,3 μΐ/ml, de modo a obter uma taxa de contagem de cerca de 3000-3500 Kcps. RESULTADOS BIOLÓGICOS Exemplo 12: Ensaio in vitro

Os resultados apresentados na Figura 9 confirmam que o método de preparação de nanopartículas lipídicas não causou nenhuma modificação importante da actividade do fármaco. Isto foi demonstrado no ensaio de células da pituitária de rato, realizado como aqui descrito abaixo. 32

Preparou-se uma cultura primária de células da pituitária de rato partindo da digestão enzimática de glândulas pituitárias removidas de ratos fêmeas. As células recuperadas foram plaqueadas a 2,5 x 105/cavidade em placas de 24 cavidades e foram cultivadas durante 72 horas a 37°C e 5% de C02.

As cavidades foram lavadas três vezes e depois foram tratadas durante 24 horas com 0,75, 1,5, 3, 6 e 12 ng/ml de três formulações de nanoparticulas lipidicas com Antide (LN27, LN28 e LN29) ou Antide padrão de referência interno em triplicado. As cavidades para o nivel de referência e máximo de LH segregada receberam apenas meio de cultura.

Em seguida, após a lavagem, as amostras e diluições de Antide de referência foram renovadas e adicionou-se LHRH (10~8 M) a todas as cavidades, exceptuando as cavidades de referência que receberam um volume igual de meio de cultura. Meio condicionado de cada cavidade foi recolhido após 4 horas de incubação (37°C, 5% de C02) e foi armazenado a -20°C até ser analisado quanto ao teor de LH.

Para avaliar a LH segregada utilizou-se um RIA comercial (Amersham Pharmacia Biotech). Os resultados foram expressos como percentagem de inibição da secreção de LH pelo Antide.

Exemplo 13: Ensaio in vivo

Utilizaram-se no estudo ratos machos Sprague Dawley adultos (63-70 dias e cerca de 300 g). A dieta foi disponibilizada ad libitum a todos os animais. A água potável também foi oferecida aos animais ad libitum.

As formulações de teste que continham nanoparticulas lipidicas de Antide foram administradas na forma de uma única dose subcutânea de 0,6 mg (cerca de 2 mg/kg) de Antide a cada grupo de ratos pela via subcutânea. As 33 nanopartículas lipídicas de Antide foram administradas numa solução aquosa de glucose aproximadamente 5%. 0 teor de nanopartículas do veículo foi cerca de 120 mg/ml. O volume de administração foi 400 μΐ por rato.

Seguiu-se a concepção experimental que se descreve a seguir.

Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 Artigo de teste Antide Antide LN27 Antide LN28 Antide LN29 Antide LN271 Antide LN28 Antide LN29 n- Partículas de placebo Dose de Antide (mg) 0, 6 0, 6 0, 6 0, 6 0, 6 0, 6 0, 6 0 N° ratos/grupo 3 3 3 3 30 30 30 12 Amostragem do sangue 0. 5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 horas 0. 5, 1, 2, 4, 8, 24 horas 0. 5, 1, 2, 4, 8, 24 horas 0, 5, 1, 2, 4, 8, 24 horas 0, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 dias 0, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 dias 0, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 dias 1, 4, 8, 14 dias

Os compostos foram administrados aos animais, que tinham jejuado durante a noite antes da administração.

Para os animais dos grupos 1-4, recolheram-se cerca de 0,5-1 ml de sangue de uma veia sublingual ou da cauda em cada instante de amostragem até às 8 horas. Às 24 horas (72 horas para o grupo 1), os animais foram anestesiados com éter e foram mortos por exsanguinação pela aorta abdominal.

Procedeu-se à amostragem dos animais dos grupos 5-8 por exsanguinação pela aorta abdominal nos instantes de amostragem indicados.

Recolheu-se sangue em tubos heparinizados e separou-se o plasma por centrifugação (2500 x g) a 4°C. O plasma obtido no sacrifício foi dividido em 3 alíquotas de pelo menos 1 ml. 34

Determinaram-se as concentrações de Antide no plasma por um método de HPLC com detecção por Espectrometria de Massa (HPLC/MS/MS). Esses resultados de pK estão apresentados na Figura 10. O marcador farmacodinâmico testosterona foi medido em todas as amostras de plasma recolhidas na altura do sacrifício.

Determinaram-se os níveis de testosterona utilizando um estojo de RIA da Diagnostic Product Corporation (DPC).

Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4, que mostra que a produção de testosterona foi realmente inibida durante um pequeno período após a administração, o que indica uma libertação controlada de Antide. Além disso, a concentração de testosterona no plasma de 0,0 ± 0,0 obtida um dia após a administração indica realmente uma supressão total dos níveis de testosterona. 35

Tabela 1: Carga máxima de Antide nos lípidos pré-examinados e teor de monoglicéridos dos lípidos LÍPIDOS Carga Produto Descrição química Teor de Monoglicéridos (%) Carga de Antide (%) Imwitor 312 Monoglicérido do ácido láurico 95,30 2,2 Imwitor 900* Mono/diestearato de glicerilo 40-50 2,0 Imwitor 928 Mono/dicocoato de glicerilo 43,5 8,5x1o-1 Geleol Monopalmitato/estearato de glicerilo 35 1,8 Compritol E ATO Mono/di/tribeenato de glicerilo 80,40 1,7 Compritol 888 ATO Beenato de glicerilo 12-18 4,3xl0_1 Compritol HD 5 ATO Beenato de glicerilo/polietilenoglicol 1 1,7χ10~2 Superpolystate estearato de polietilenoglicol <1 1,7x1o-1 Precirol ATO 5 Mono/di/tripalmitato/estearato de glicerilo 8-17 5, 9xl0-2 Witepsol E 85 Triglicéridos de Ci0-Ci8 ácidos gordos saturados <1 1,4xl0-2 -não solúvel Softisan 142 Coco-glicéridos hidrogenados <1% 1,7xl0-2 -não solúvel Gelot 64 Palmitato/estearato de glicerilo/polietilenoglicol <1% 5,8xl0-2 -não solúvel Monosteol Palmitato/estearato de propilenoglicol <1% 3,2xl0-2 -não solúvel Gelucire 44/14 Mistura definida de mono/di/triésteres de ácido láurico com glicerol e polietilenoglicol <1% 4,0xl0-2 -não solúvel Gelucire 50/13 Mistura definida de mono/di/triésteres de ácido esteárico com glicerol e polietilenoglicol <1% 3,0xl0-2 -não solúvel Álcool cetilico Álcool cetilico <1% 3,7xl0-2 -não solúvel Tagat S <1% 2,7xl0-2 -não solúvel 36

Tabela 2: Principais transições térmicas de combinações lipido/lípido (os números entre parênteses na segunda coluna referem-se a transições térmicas secundárias). LÍPIDOS Pontos Máximos de Fusão (°C) Compritol 888 ATO 72,0 Compritol E ATO 73,7 Imwitor 900 58, 6 Imwitor 312 (21, 6), (42,5), 56,3 Precirol ATO 5 (49,0), 57,2 Compritol 888 ATO + Imwitor 900 [75:25] 68,7 Compritol 888 ATO + Imwitor 900 [50:50] (58,7), 64,5 Compritol 888 ATO + Imwitor 900 [25:75] 61,2 Compritol 888 ATO + Imwitor 312 [75:25] (37,1), 66,8 Compritol 888 ATO + Imwitor 312 [50:50] (37,3), 51,3, 64,3 Compritol 888 ATO + Imwitor 312 [25:75] (22,2), (38,7), 53,7, (60,4) Compritol 888 ATO + Precirol ATO 5 [75:25] (56, 4), 68,5 Compritol 888 ATO + Precirol ATO 5 [50:50] 56, 6, 64,3 Compritol 888 ATO + Precirol ATO 5 [25:75] (49, 0), 58,8 Imwitor 900 + Imwitor 312 [75:25] 53, 5 Imwitor 900 + Imwitor 312 [50:50] (38), 46,4 Imwitor 900 + Imwitor 312 [25:75] (32,4), 40,0 Imwitor 900 + Precirol ATO 5 [75:25] 59,2 Imwitor 900 + Precirol ATO 5 [50:50] (49,2), 57,9 Imwitor 900 + Precirol ATO 5 [25:75] (49, 0), 57,9 Precirol ATO 5 + Imwitor 312 [75:25] 51,5 (largo) Precirol ATO 5 + Imwitor 312 [50:50] 38,2, 47,9 Precirol ATO 5 + Imwitor 312 [25:75] (32,2), 39,3 37

Tabela 3: Caracterização físico-química de lotes de nanopartículas lipídicas com diferentes composições.

Ex. N° Composição (% p/p) Condições operacionais D (v,0,l) (μπι) D (v,0,5) (μπι) D (v,0,9) (μπι) Dimensão por PCS (nm) Pot. Z (mV) 1 Antide 0,2 Compr. E ATO 9,8 Tagat S 2,5 Colato de Na 0,5 T= 85 °C P= 1000 bar 1 ciclo 0, 17 0,57 2,83 278 -14,4 2 Antide 0,2 Compr. E ATO 9,3 DMPG 0,5 Tagat S 2,5 Colato de Na 0,5 T= 85 °C P— 1000 bar 1 ciclo 0, 18 0,52 5,21 274 -38, 9 3 Antide 0,2 Compr. E ATO+ Imw 900 (9 :1) 9,3 DMPG 0,5 Tagat S 2,5 Colato de Na 0,5 T= 85 °C P= 1000 bar 1 ciclo 0, 17 0,48 3,42 233 -48, 9 4 Antide 0,2 Compr. E ATO 9,3 DMPG 0,5 Lutrol F68 5,0 T= 85°C P= 1000 bar 1 ciclo 0, 19 0,54 4,36 242 -39, 4 5 Antide 0,2 Compr. E ATO 9,8 Lutrol F68 5,0 T= 85°C P= 1000 bar 1 ciclo 0, 19 0,46 1,84 N/A N/A 6 Antide 0,2 Compr. E ATO 9,1 Ácido cáprico 0,2 DMPG 0,5 Tagat S 2,5 Colato de Na 0,5 T= 85 °C P= 1000 bar 1 ciclo 0, 15 0,38 3,07 149 -38,5 7 Antide 0,2 Compr. E ATO 9,8 DMPG 1,0 Lutrol F68 5,0 Noveon AA1 0,01 T= 85 °C P= 1000 bar 1 ciclo 0, 17 0,41 5,55 160 -48,8 8 Antide 0,2 Compr. E ATO 8,8 DMPG 1,0 Lutrol F68 5,0 Pemulen 0,01 T= 85 °C P= 1000 bar 1 ciclo 0, 18 0,46 6, 66 189 -50,5 38

Tabela 4: Níveis de testosterona no plasma a t=0, t=l dia e t=8 dias após administração s.c. em ratos (apresentam-se valores médios da concentração de testosterona no plasma e desvio padrão correspondente (DP) em ng/ml). Níveis de testosterona no plasma (ng/ml) Tempo LN27 LN28 LN2 9 Placebo (dias) Média DP Média DP Média DP Média DP 0 3,3 3,4 2,2 1,2 3,1 4,6 N/A N/A 1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,4 2,3 8 1,2 0,8 1,7 0,7 0,5 0,4 4,2 4, 9

Lisboa, 16 de Outubro de 2007

Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Nanopartículas lipídicas que compreendem um fármaco, uma matriz lipídica e um surfactante, caracterizadas por o referido fármaco ser um péptido ou uma proteína e por a referida matriz lipídica ter um teor de monoglicéridos que é pelo menos 70% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da matriz lipídica, em que as referidas nanopartículas estão situadas numa gama desde 1 nm até 3 000 nm.

2. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 1, caracterizadas por o referido teor de monoglicéridos estar compreendido entre 75 e 99% p/p, em que a percentagem se baseia no peso da matriz lipídica.

3. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizadas por as referidas nanopartículas lipídicas também compreenderem um co-surfactante.

4. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 1, caracterizadas por o referido fármaco ser uma proteína.

5. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 1, caracterizadas por o referido fármaco ser um péptido.

6. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 1, caracterizadas por o referido fármaco ser um péptido seleccionado do grupo que consiste em análogos da LHRH. 2

7. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 6, caracterizadas por o referido péptido ser um decapéptido que actua como antagonista da LHRH.

8. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 6 ou 7, caracterizadas por o referido decapéptido ser N-Ac-D-2-Nal-D-pClPhe-D-3-Pal-Ser-NicLys-D-NicLys-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH2.

9. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 6 ou 7, caracterizadas por o referido decapéptido ser Cetrorelix.

10. Nanopartículas lipídicas de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadas por o referido surfactante ser seleccionado de entre fosfolípidos sintéticos, seus derivados hidrogenados e respectivas misturas, esfingolípidos e glicoesfingolípidos, ácidos gordos saturados ou insaturados, álcoois gordos, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, ácidos gordos etoxilados bem como respectivos ésteres ou éteres, ou uma combinação de dois ou mais dos compostos acima mencionados.

11. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 10, caracterizadas por o referido surfactante ser dimiristoilfosfatidilglicerol.

12. Nanopartículas lipídicas de acordo com a Reivindicação 3, caracterizadas por o referido co-surfactante ser seleccionado do grupo que consiste em butanol, ácido 3 butírico, ácido hexanóico, colato de sódio, taurocolato de sódio ou glicocolato de sódio.

13. Nanopartículas lipidicas de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadas por as referidas nanopartículas também compreenderem outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

14. Nanopartículas lipidicas de acordo com a Reivindicação 13, caracterizadas por os referidos excipientes serem polímeros com propriedades bioadesivas ou intensificadoras da absorção seleccionados do grupo que consiste em polímeros acrílicos, ácidos gordos de cadeia média e polietilenoglicóis.

15. Nanopartículas lipidicas de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes para utilização como medicamento.

16. Composição farmacêutica que contém nanopartículas lipidicas de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes e um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

17. Processo para a produção das nanopartículas lipidicas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, que compreende ou consiste nos passos seguintes: incorporação do fármaco na fase lipídica e dissolução do surfactante e, opcionalmente, do co-surfactante na fase aquosa, em condições de aquecimento controlado; mistura da fase lipídica com a fase aquosa; 4 aplicação de Homogeneização a Alta Pressão à pré-emulsão obtida, e arrefecimento da nano-emulsão em condições de temperatura controlada.

18. Processo de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por os referidos passos serem realizados a um pH compreendido entre 1 e 9.

19. Processo de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por o referido passo de mistura da fase lipidica com a fase aquosa ser efectuado a uma temperatura compreendida entre 30°C e 90°C.

20. Processo de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por o referido passo de Homogeneização a Alta Pressão ser realizado a uma temperatura compreendida entre 30°C e 90°C.

21. Processo de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por o referido passo de Homogeneização a Alta Pressão ser realizado a uma pressão compreendida entre 50 bar e 2000 bar.

22. Nanoparticulas lipidicas obtidas por um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 17-21. Lisboa,16 de Outubro de 2007