JP6448214B2

JP6448214B2 - 皮膚バリア機能改善剤

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Publication number: JP6448214B2
Application number: JP2014089906A
Authority: JP
Inventors: 敦男谷本; 嘉文植田; 友加里木本; 渉天野; 健治椛島
Original assignee: Japan Tobacco Inc; Kyoto University
Current assignee: Japan Tobacco Inc; Kyoto University
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2019-01-09
Anticipated expiration: 2034-04-24
Also published as: ES2902538T3; US20140343034A1; US20170035763A1; US20190262344A1; EP2813228A1; US20240075037A1; EP2813228B1; US20210205308A1; JP2014224109A

Description

本発明は、ＪＡＫ阻害剤の新規医薬用途に関する。より詳細には、ＪＡＫ阻害剤を含有する皮膚バリア機能改善剤、ＪＡＫ阻害剤を含有する老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹、接触皮膚炎等といった皮膚疾患の治療剤又は予防剤に関する。

ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２を含む、細胞質タンパク質チロシンキナーゼ族である。

ＪＡＫ阻害剤は、特許文献１、特許文献２及び特許文献３等に報告されている。

皮膚は、物理的な衝撃、温度、紫外線又は化学物質の暴露や感染などの外部刺激からの生体保護機能及び生体内部からの水分蒸散を防ぐ保湿機能といった皮膚バリア機能により、生体維持に重要な役割を果たしている。皮膚バリア機能は、表皮の最外層に位置する数層から数十層に規則正しく重なる角質層により発揮される。皮膚バリア機能の低下により、乾燥性皮膚疾患及び肌荒れ等の皮膚トラブルが生じることが知られている。

皮膚バリア機能関連タンパク質としては、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン、ベータ‐デフェンシン３等が知られている（非特許文献１）。

フィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する角化細胞において前駆体であるプロフィラグリンとして産生される。顆粒細胞の最終分化の過程で、プロフィラグリンは分解されてモノマーであるフィラグリンになる。フィラグリンは、角化細胞内でケラチン繊維を凝集させることにより、角化細胞を角質層の角質細胞に特徴的な平坦な形へ変化させる。さらに、フィラグリンは角質層内でアミノ酸に分解、放出される。これらのアミノ酸は水溶性及び吸湿性が高く、天然保湿因子（ＮａｔｕｒａｌＭｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇＦａｃｔｏｒｓ：以下、ＮＭＦと略す）を構成する主な成分であると報告されている（非特許文献１）。

角化細胞におけるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現の促進によるフィラグリンタンパク質の産生促進により、ＮＭＦの成分である角質層内のアミノ酸量が増大し、角質層の保湿機能を本質的に改善させることが期待される。

ロリクリン及びインボルクリンは、角質細胞の細胞膜を裏打ちするコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）を構成する重要なタンパク質である。ロリクリン及びインボルクリンは、角化細胞の分化過程において、有棘層から顆粒層にかけて産生され、酵素トランスグルタミナーゼによって角化細胞の細胞膜に架橋され、不溶性の細胞膜様構造体であるＣＥを形成し、角質細胞の細胞骨格及び構造の安定性に寄与する（非特許文献１）。しかし、様々な要因でロリクリンやインボルクリンの産生量が減少すると、コーニファイドエンベロープ（ＣＥ）形成が不完全な状態となり、角化が正常に行われなくなる。その結果、皮膚バリア機能が低下し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚症状を呈するようになると考えられている。

ベータ‐デフェンシン３等の抗菌ペプチドは、皮膚において、病原菌の侵入に対して物理的バリアと共に最前線の生体防御に深く関与している（非特許文献２）。

皮脂および汗の分泌が減退し、皮膚が乾燥して光沢を失い粗造になった状態を乾皮症（皮脂欠乏症）という。米糠様の鱗屑および浅い亀裂を生じ、魚鱗癬様の外観を呈して軽度の掻痒を訴えることがある。加齢による変化の一つとして見られる場合がある。皮膚バリア機能が低下しているため、外的刺激を受けやすい。（非特許文献３）

接触皮膚炎とは、外来性の刺激物質や抗原（ハプテン）が皮膚に接触することによって発症する湿疹性の炎症反応をさす。皮膚バリア機能が低下すると接触皮膚炎を引き起こしやすくなると考えられている。接触皮膚炎は大きく刺激性接触皮膚炎とアレルギー性接触皮膚炎に分類される。（非特許文献４）

尋常性魚鱗癬は、四肢伸側を中心とした落屑とドライスキンを特徴とする、有病率の高い疾患である。尋常性魚鱗癬は一遺伝子が原因で起こる遺伝性の角化障害であり、フィラグリンをコードする遺伝子の変異により発症すること、フィラグリンタンパク質の欠乏または減少の程度により角化障害の程度が変化することが報告されている（非特許文献５）。

ネザートン症候群は、先天性魚鱗癬様紅皮症ないしアトピー性皮膚炎類似の皮疹を伴う遺伝性の重度な皮膚疾患であり、ＬｙｍｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌＫａｚａｌ−ｔｙｐｅ−ｒｅｌａｔｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＬＥＫＴＩ）をコードするセリンプロテアーゼインヒビターであるＫａｚａｌ−ｔｙｐｅ５（ＳＰＩＮＫ５）遺伝子の変異により生じる。ＬＥＫＴＩの欠乏は、表皮のプロテアーゼの活性亢進に引き続く角質層の脱離を引き起こす。この皮膚バリア機能の障害がアレルゲンの吸収にとって好ましく、ネザートン症候群患者におけるアトピー性皮膚炎の根底にある原因と考えられている。（非特許文献６）

ピーリング皮膚症候群は、表皮角質層の脱離を特徴とする疾患である。ピーリング皮膚症候群には、非炎症型のＡ型と炎症型のＢ型が知られている。ｃｏｒｎｅｏｄｅｓｍｏｓｉｎの機能を完全に喪失させるＣＤＳＮのナンセンス変異がＢ型ピーリング皮膚症候群を引き起こす。（非特許文献７）

従って、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン、ベータ・デフェンシン３等の発現を増加させることは、皮膚バリア機能を改善し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚疾患、例えば、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹、接触皮膚炎、尋常性魚鱗癬、ネザートン症候群及びＢ型ピーリング皮膚症候群の治療又は予防に有効であると考えられる。

国際公開ＷＯ０２／０９６９０９号米国特許出願公開第２００７／０１３５４６１号明細書日本特開２０１１−４６７００号公報

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発明が解決しようとする課題は、ＪＡＫ阻害剤の新規医薬用途を提供することである。

本発明者らは、ＪＡＫ阻害剤の新規医薬用途を開発するために鋭意研究を重ね、ＪＡＫ阻害剤が皮膚バリア機能関連タンパク質であるフィラグリン、ロリクリン、インボルクリン及びベータ‐デフェンシン３の発現量を上昇させること、ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ処理マウスにおいて有意にＮＭＦ産生を促進すること、及びドライスキンマウスモデルにおいて経皮水分蒸散量（ＴｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌＷａｔｅｒＬｏｓｓ、以下ＴＥＷＬとする）の減少を有意に促進すること即ち皮膚バリア機能を改善することを初めて見出した。その結果、ＪＡＫ阻害剤が皮膚バリア機能の低下に起因する様々な皮膚疾患に対して有効であることを初めて見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］ＪＡＫ阻害剤を有効成分として含有する、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹及び接触皮膚炎からなる群から選択される皮膚疾患の治療剤又は予防剤。

［２］［１］において選択される皮膚疾患が老人性乾皮症である［１］に記載の治療剤又は予防剤。

［３］［１］において選択される皮膚疾患が皮脂欠乏症である［１］に記載の治療剤又は予防剤。

［４］［１］において選択される皮膚疾患が湿疹である［１］に記載の治療剤又は予防剤。

［５］［１］において選択される皮膚疾患が接触皮膚炎である［１］に記載の治療剤又は予防剤。

［６］ＪＡＫ阻害剤が、下記化学構造式：
で示される化合物又はその医薬上許容される塩である［１］乃至［５］のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。

［７］ＪＡＫ阻害剤が、下記化学構造式：
で示される化合物又はその医薬上許容される塩である［１］乃至［５］のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。

［８］ＪＡＫ阻害剤が、下記化学構造式：
で示される化合物又はその医薬上許容される塩である［１］乃至［５］のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。

［９］ＪＡＫ阻害剤を有効成分として含有する、皮膚バリア機能改善剤。

［１０］ＪＡＫ阻害剤を有効成分として含有する、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン及びベータ‐デフェンシン３からなる群から選択される遺伝子の転写促進剤。

［１１］ＪＡＫ阻害剤を有効成分として含有する、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン及びベータ‐デフェンシン３からなる群から選択されるタンパク質の産生促進剤。

［１２］ＪＡＫ阻害剤が、下記化学構造式：
で示される化合物又はその医薬上許容される塩である［９］乃至［１１］のいずれか１項に記載の剤。

［１３］ＪＡＫ阻害剤が、下記化学構造式：
で示される化合物又はその医薬上許容される塩である［９］乃至［１１］のいずれか１項に記載の剤。

［１４］ＪＡＫ阻害剤が、下記化学構造式：
で示される化合物又はその医薬上許容される塩である［９］乃至［１１］のいずれか１項に記載の剤。

本発明は、ＪＡＫ阻害剤の新規医薬用途を提供する。

新生児正常ヒト表皮角化細胞における、ＪＡＫ阻害剤によるプロフィラグリンｍＲＮＡ量の増加を示した図である。（実施例１）新生児正常ヒト表皮角化細胞における、ＪＡＫ阻害剤によるロリクリンｍＲＮＡ量の増加を示した図である。（実施例１）新生児正常ヒト表皮角化細胞における、ＪＡＫ阻害剤によるインボルクリンｍＲＮＡ量の増加を示した図である。（実施例１）新生児正常ヒト表皮角化細胞における、ＪＡＫ阻害剤によるベータ‐デフェンシン３ｍＲＮＡ量の増加を示した図である。（実施例１）ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ処置マウスにおける、化合物ＡによるＮＭＦ産生促進作用を示した図である。（実施例２）ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ処置マウスにおける、化合物Ｂの一クエン酸塩によるＮＭＦ産生促進作用を示した図である。（実施例２）接触皮膚炎モデルマウスにおける、化合物Ａによる耳介腫脹の抑制を示した図である。（実施例３）三次元培養皮膚モデルにおける、ＩＬ−４／ＩＬ−１３存在下での化合物Ａによるフィラグリン及びロリクリンタンパク質量の増加を示した図である。（実施例４）三次元培養皮膚モデルにおける、ＩＬ−４／ＩＬ−１３非存在下での化合物Ａによるフィラグリン及びロリクリンタンパク質量の増加を示した図である。（実施例４）ドライスキンモデルマウスにおける、化合物ＡによるプロフィラグリンｍＲＮＡ量の増加を示した図である。（実施例５）ドライスキンモデルマウスにおける、化合物ＡによるＮＭＦ産生促進作用を示した図である。（実施例５）ドライスキンモデルマウスにおける、化合物ＡによるＴＥＷＬの減少を促進する作用を示した図である。（実施例５）

本明細書における用語の定義は以下のとおりである。

下記化学構造式：
で示される化合物を化合物Ａと呼ぶ。

化合物Ａの化学名は、3-[(3S,4R)-3-Methyl-6-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-1,6-diazaspiro[3.4]octan-1-yl]-3-oxopropanenitrileである。

化合物Ａの化学名は、3-[(3S,4R)-3-メチル-6-(7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-1,6-ジアザスピロ[3.4]オクタン-1-イル]-3-オキソプロパンニトリルである。

下記構造式：
で示される化合物を化合物Ｂと呼ぶ。

化合物Ｂの化学名は、3-{(3R,4R)-4-Methyl-3-[methyl(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)amino]piperidin-1-yl}-3-oxopropanenitrileである。

化合物Ｂの化学名は、3-{(3R,4R)-4-メチル-3-[メチル(7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)アミノ]ピペリジン-1-イル}-3-オキソプロパンニトリルである。

下記構造式：
を化合物Ｃと呼ぶ。

化合物Ｃの化学名は、(3R)-3-Cyclopentyl-3-[4-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-1H-pyrazol-1-yl]propanenitrileである。

化合物Ｃの化学名は、(3R)-3-シクロペンチル-3-[4-(7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-1H-ピラゾール-1-イル]プロパンニトリルである。

化合物Ａは、特許文献３の製造例６に記載の方法に従い製造することができる。

化合物Ｂは、特許文献１に記載の方法に従い製造することができる。

化合物Ｃは、特許文献２に記載の方法に従い製造することができる。

化合物Ａ、Ｂ及びＣは、ＪＡＫを阻害することが知られている。

「医薬上許容される塩」とは、化合物Ａ、Ｂ又はＣと無毒の塩を形成するものであればいかなる塩でもよく、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、アミノ酸との塩等が挙げられる。

無機酸との塩として、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等との塩が挙げられる。
有機酸との塩として、例えば、シュウ酸、マレイン酸、クエン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。

無機塩基との塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
有機塩基との塩として、例えば、メチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、グアニジン、ピリジン、ピコリン、コリン、シンコニン、メグルミン等との塩が挙げられる。
アミノ酸との塩として、例えば、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。

周知の方法に従って、化合物Ａ、Ｂ又はＣと無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸又はアミノ酸とを反応させることにより、各々の塩を得ることができる。

また、化合物Ａ、Ｂ又はＣは、同位元素（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ等）で標識されていてもよい。
化合物Ａ、Ｂ又はＣ、或いはその医薬上許容される塩としては、実質的に精製された、化合物Ａ、Ｂ又はＣ、或いはその医薬上許容される塩が好ましい。さらに好ましくは、８０％以上の純度に精製された、化合物Ａ、Ｂ又はＣ、或いはその医薬上許容される塩である。

「医薬組成物」としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤、又は外用剤、坐剤、注射剤、点眼剤、経鼻剤、経肺剤等の非経口剤が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、医薬製剤の技術分野において公知の方法に従って、化合物Ａ、Ｂ又はＣ、或いはその医薬上許容される塩を、少なくとも１種以上の医薬上許容される担体等と、適宜、適量混合等することによって、製造される。該医薬組成物中の化合物Ａ、Ｂ又はＣ、或いはその医薬上許容される塩の含量は、剤形、投与量等により異なるが、例えば、組成物全体の０．１〜１００重量％である。

「医薬上許容される担体」としては、製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、滑沢剤等、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等及び半固形製剤における基剤、乳化剤、湿潤剤、安定剤、安定化剤、分散剤、可塑剤、ｐＨ調節剤、吸収促進剤、ゲル化剤、防腐剤、充填剤、溶解剤、溶解補助剤、懸濁化剤等が挙げられる。更に必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物が用いられる。

「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、トウモロコシデンプン、デキストリン、微結晶セルロース、結晶セルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム等が挙げられる。
「崩壊剤」としては、例えば、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース等が挙げられる。
「結合剤」としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、結晶セルロース、白糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、カルメロースナトリウム、アラビアゴム等が挙げられる。
「流動化剤」としては、例えば、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。

「溶剤」としては、例えば、精製水、エタノール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
「溶解補助剤」としては、例えば、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
「懸濁化剤」としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポビドン、メチルセルロース、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。
「等張化剤」としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
「緩衝剤」としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。

「基剤」としては、水、動植物油（例えばオリーブ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ゴマ油、ヒマシ油等）、低級アルコール類（例えばエタノール、プロパノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、フェノール等）、高級脂肪酸およびそのエステル、ロウ類、高級アルコール、多価アルコール、炭化水素類（白色ワセリン、流動パラフィン、パラフィン等）、親水ワセリン、精製ラノリン、吸水軟膏、加水ラノリン、親水軟膏、デンプン、プルラン、アラビアガム、トラガカントガム、ゼラチン、デキストラン、セルロース誘導体（例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等）、合成高分子（例えばカルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等）、プロピレングリコール、マクロゴール（例えばマクロゴール２００〜６００等）、およびそれらの２種以上の組合せが挙げられる。

「保存剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。
「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸等が挙げられる。
「着色剤」としては、例えば、食用色素（例えば食用赤色２号又は３号、食用黄色４号又は５号等）、β−カロテン等が挙げられる。
「甘味剤」としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム等が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、ヒト以外の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）及びヒトに対しても、経口的又は非経口的（例えば局所、直腸、静脈投与等）に投与することができる。投与量は、投与対象、疾患、症状、剤形、投与ルート等により異なるが、例えば、化合物Ａ、Ｂ又はＣを有効成分として１日あたり、通常約０．０１ｍｇ〜１ｇの範囲である。これらの量を１回乃至数回に分けて投与することができる。

外用剤は、剤形などに応じて、例えば、塗布、塗擦又は散布などにより適用できる。外用剤の患部への適用量は、活性成分の含有量などに応じて選択でき、例えば１日１回乃至数回適用できる。

「ＪＡＫ」とは、ＪＡＫファミリーに属するＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２のうち一つ又は二つ以上の酵素である。

「ＪＡＫを阻害する」とは、ＪＡＫの機能を阻害してその活性を消失又は減弱することを意味し、ＪＡＫファミリーに属する一つ又は二つ以上の酵素を阻害することを意味する。

「ＪＡＫを阻害する」は、好ましくは「ヒトＪＡＫを阻害する」である。機能の阻害ないし活性の消失又は減弱は、好ましくはヒトの臨床的適用の場面で行われる。

「ＪＡＫ阻害剤」とは、ＪＡＫを阻害する物質であれば何でもよく、例えば、低分子化合物、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ワクチン等であってよい。「ＪＡＫ阻害剤」は、好ましくは「ヒトＪＡＫ阻害剤」である。

皮膚疾患として好ましくは、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹又は接触皮膚炎である。

ＪＡＫ阻害剤として好ましくは、化合物Ａ、Ｂ又はＣ、或いはその医薬上許容される塩である。さらに好ましくは、化合物Ａ、化合物Ｂの一クエン酸塩又は化合物Ｃの一リン酸塩である。

本明細書において治療とは、症状の改善、重症化の防止、寛解の維持、再燃の防止、さらには再発の防止も含む。本明細書において予防とは、症状の発症を抑制することを意味する。

本発明の実施の一態様として、医薬上有効量のＪＡＫ阻害剤を哺乳動物に投与することを特徴とする、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹及び接触皮膚炎からなる群から選択される皮膚疾患の治療方法又は予防方法が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、ＪＡＫ阻害剤及び医薬上許容される担体を含む、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹及び接触皮膚炎からなる群から選択される皮膚疾患の治療又は予防のための医薬組成物が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、医薬上有効量のＪＡＫ阻害剤を哺乳動物に投与することを特徴とする、皮膚バリア機能改善方法が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、医薬上有効量のＪＡＫ阻害剤を哺乳動物に投与することを特徴とする、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン及びベータ‐デフェンシン３からなる群から選択される遺伝子の転写促進方法が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、医薬上有効量のＪＡＫ阻害剤を哺乳動物に投与することを特徴とする、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン及びベータ‐デフェンシン３からなる群から選択されるタンパク質の産生促進方法が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、医薬上有効量のＪＡＫ阻害剤を哺乳動物に投与することを特徴とする、ＮＭＦの産生促進方法が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、医薬上有効量のＪＡＫ阻害剤を哺乳動物に投与することを特徴とする、ＴＥＷＬを減少させる方法が挙げられる。

哺乳動物とは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等であり、好ましくはヒトである。

ヒトとは、より好ましくは、有病者であり、医学的手当てを必要とするヒトである。

本発明の実施の一態様として、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹及び接触皮膚炎からなる群から選択される皮膚疾患の治療又は予防のためのＪＡＫ阻害剤の使用が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、皮膚バリア機能改善のためのＪＡＫ阻害剤の使用が挙げられる。

本発明の実施の一態様として、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン及びベータ‐デフェンシン３からなる群から選択される遺伝子の転写促進又はタンパク質産生促進のためのＪＡＫ阻害剤の使用が挙げられる。

本発明として好ましくは、化合物Ａ、化合物Ｂの一クエン酸塩又は化合物Ｃの一リン酸塩を含有する、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、湿疹又は接触皮膚炎の治療剤又は予防剤である。

本発明として好ましくは、化合物Ａ、化合物Ｂの一クエン酸塩又は化合物Ｃの一リン酸塩及び医薬上許容される担体を含む、医薬組成物である。

実験１．新生児正常ヒト表皮角化細胞における、ＪＡＫ阻害剤による皮膚バリア関連タンパク質のｍＲＮＡ量の増加
カルシウム刺激により分化することが知られている新生児正常ヒト表皮角化細胞（Ｌｏｎｚａ社）を実験に用いた（非特許文献８）。新生児正常ヒト表皮角化細胞（Ｌｏｎｚａ社）を、ＨｕｍａｎＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を添加したＥｐｉＬｉｆｅＭｅｄｉｕｍｗｉｔｈ０．０６ｍＭＣａｌｃｉｕｍ（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ社））にて、細胞の取扱説明書に従い、培養した。新生児正常ヒト表皮角化細胞を、５×１０⁵個／ｗｅｌｌで１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２時間培養した。上記細胞から培養上清を除いた後、各最終濃度１００ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−４及びヒトＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ社）の存在下又は非存在下で、各種濃度の被験物質及び１．３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含む培養培地を添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２下で５日間培養した。化合物Ａ、化合物Ｂの一クエン酸塩又は化合物Ｃの一リン酸塩を被験物質として用いた。
ＴｏｔａｌＲＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅＭａｍｍａｌｉａｎＴｏｔａｌＲＮＡＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、取扱説明書に従い、上記培養細胞から精製した。
上記ＲＮＡをＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔｗｉｔｈＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、取扱説明書に従い、ｃＤＮＡに逆転写した。上記ｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法により、ＴａｑｍａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｉｏｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、取扱説明書に従い、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７９００ＨＴｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒで分析し、ヒトプロフィラグリン、ロリクリン、インボルクリン、ベータ‐デフェンシン３及びグリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のＣｔ値（ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ）をそれぞれ求めた。ＧＡＰＤＨは内部標準として使用した。プライマー及びプローブは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入したものを使用した（ＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ）。
ヒトプロフィラグリン、ロリクリン、インボルクリン及びベータ‐デフェンシン３の各相対ｍＲＮＡ量は比較Ｃｔ法により算出した。各被験物質を添加した細胞のｍＲＮＡ量は、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−１３及び被験物質を添加しなかった細胞における各遺伝子のｍＲＮＡ量に対する比として、示した。結果を図１〜４に示す。

実験２．ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ処置マウスにおける、ＪＡＫ阻害剤によるＮＭＦ産生促進作用
ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ処置マウス（非特許文献９）を用いて、ＪＡＫ阻害剤によるＮＭＦ産生促進作用を評価した。実験動物は、８−１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（清水実験材料株式会社）を用いた。
マウス左耳介内側にセロハンテープ（ＮＩＣＨＩＢＡＮ）を貼付し剥離すること（ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ）を５回繰り返し、角質を剥離した。ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ６日後まで１日１回、アセトン（Ｖｅｈｉｃｌｅ）または０．５％（ｗ／ｖ）の被験物質を、ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇした部位にそれぞれ０．０２ｍＬずつ塗布した。ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ１日目は、ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ１時間後にアセトン（Ｖｅｈｉｃｌｅ）または被験物質を塗布した。化合物Ａ又は化合物Ｂの一クエン酸塩を被験物質として用いた。
ＴａｐｅＳｔｒｉｐｐｉｎｇ１、５及び７日後に、左耳介内側の総ＮＭＦ量を、ｉｎｖｉｖｏ共焦点ラマン分光装置（ｍｏｄｅｌ３５１０、ＲｉｖｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）で求めた。
左耳介内側表面より８マイクロメータの深さまで１マイクロメータ間隔で、励起波長を７８５ｎｍとして４００〜１８００ｃｍ^−１領域のラマンスペクトルを測定した。総ＮＭＦ量は、ＳｋｉｎＴｏｏｌｓ２．０（ＲｉｖｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてケラチンあたりの量として定量した。各測定時には個体毎に２−５回測定を行った。測定深度毎に総ＮＭＦ量の平均値を算出し、各深度における個体値として示した。化合物Ａの結果を図５に、化合物Ｂの一クエン酸塩の結果を図６に示した。

実験３．接触皮膚炎モデルマウスにおける、ＪＡＫ阻害剤による耳介腫脹の抑制
ＤＮＦＢに対する接触皮膚炎モデルマウス（非特許文献１０）を用いて、ＪＡＫ阻害剤の耳介腫脹抑制作用を評価した。実験動物は、８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（清水実験材料株式会社）を用いた。
マウス腹部を剃毛し、ＡＯＯ（アセトンとオリーブオイルを４：１で混合した溶液）で希釈した０．５％（ｗ／ｖ）ＤＮＦＢ（２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をそれぞれ０．０２５ｍＬずつ腹部に塗布した（感作）。５日後、ＡＯＯで希釈した０．３％（ｗ／ｖ）ＤＮＦＢをマウス両耳介の表裏にそれぞれ０．０１ｍＬずつ塗布した（惹起）。感作日より１日１回５日間、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に０．５％（ｗ／ｖ）メチルセルロース（ＭＣ）を、化合物Ａ投与群に０．５％（ｗ／ｖ）ＭＣに懸濁した０．３ｍｇ／ｍＬまたは３ｍｇ／ｍＬの化合物Ａを１０ｍＬ／Ｋｇの投与用量で経口投与した。各群は３匹ずつとした。感作及び惹起日は、感作及び惹起の１時間前に０．５％（ｗ／ｖ）ＭＣまたは化合物Ａを経口投与した。
惹起前及び惹起２４時間後に両耳介の厚さをシックネスゲージ（ＴＥＣＬＯＣＫ社）で１回測定し、惹起前の各耳介の厚さからの変化量の平均を個体値とした。結果を図７に示した。

実験４．三次元培養皮膚モデルにおける、ＪＡＫ阻害剤による皮膚バリア関連タンパク質のタンパク質量の増加
三次元培養皮膚モデルとして、ＴＥＳＴＳＫＩＮＬＳＥ−ｈｉｇｈ（東洋紡社、ＴＭＬＳＥ−０１３Ａ）を用いた（非特許文献１１）。ＴＥＳＴＳＫＩＮＬＳＥ−ｈｉｇｈの取扱い説明書に従い、トランスウェル上のＬｉｖｉｎｇＳｋｉｎＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ（ＬＳＥ）組織を、キットに含まれているアッセイ培地にて、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。
ＬＳＥ組織培養系より培地を除いた後、各最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−４及びヒトＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ社）存在下又は非存在下で、最終濃度１０００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物Aを含むアッセイ培地を添加し、ＬＳＥ組織を３７℃、５％ＣＯ_２下で３日間培養した。上記と同様に培地交換を行い、LSE組織を３７℃、５％ＣＯ_２下でさらに２日間培養した。
ＬＳＥ組織の表皮層をチューブにそれぞれ回収し、９ｍｏｌ／Ｌ尿素、２％Ｔｒｉｔｏｎ X−１００、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社、Ｐ８３４０）及びホスファターゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社、０７５７５−５１）を含む５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を０．１ｍＬずつ添加し、超音波処理で溶解した。組織溶解液に１．７３ｍｍｏｌ／Ｌ２−メルカプトエタノールを含むラミニＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを０．０８ｍＬずつ添加し、９５度で５分間加熱し、タンパク質を熱変性させた。
熱変性させたタンパク質（０．０１５ｍｇ／ｌａｎｅ）を、４−１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓｇｅｌ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）上でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ウエスタンブロット法でフィラグリンタンパク質及びロリクリンタンパク質を検出した。内部標準としてＧＡＰＤＨタンパク質を検出した。常法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）へブロッティングし、ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク（ナカライテスク社）でブロッキングした。ＰＶＤＦ膜を一次抗体（マウス抗ヒトフィラグリン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ｓｃ−６６１９２、３００倍希釈）、ウサギ抗ヒトロリクリン抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ社、ＰＲＢ−１４５Ｐ、１０００倍希釈）もしくはウサギ抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ社、ＧＴＸ１００１１８、１０００倍希釈））でインキュベーションした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された二次抗体（ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＲＰＮ２１２４、１００００倍希釈）もしくはヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、７０７４、３０００倍希釈））でインキュベーションした。化学発光基質（ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ２２３２）を取扱い説明書に従って使用して、ＰＶＤＦ膜よりオートラジオグラフィー用フィルムＡｍｅｒｓｈａｍＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）へ露光し、目的とするタンパク質を検出した。結果を図８及び９に示した。

実験５．ドライスキンモデルマウスにおける、ＪＡＫ阻害剤によるプロフィラグリンｍＲＮＡ量の増加、ＮＭＦ産生促進及びＴＥＷＬの減少の促進
「ドライスキンモデルマウスの作製」
ドライスキンモデルマウス（非特許文献１２）を用いて、ＪＡＫ阻害剤の皮膚バリア機能の改善効果を評価した。実験動物は、８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｍｓＳｌｃマウス（日本エスエルシー社）を用いた。
アセトンとジエチルエーテルの混合液（１：１）に浸漬した脱脂綿をマウスの右または両耳介内側の表面に３０秒間置いた後、水に浸漬した脱脂綿を同じ領域に３０秒間置いた（以下、Ａ／Ｅ／Ｗ処理と略す）。この処理を各群とも１日２回、７日間行い、ドライスキンモデルを作製した。Ａ／Ｅ／Ｗ処理を開始した日をＤａｙ０とした。正常対照群にはＡ／Ｅ／Ｗ無処置のマウスを使用した。
１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ含有アセトンに溶解した最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）の化合物Ａを、Ｄａｙ０から、１日１回７日間、Ａ／Ｅ／Ｗ処理直後に、Ａ／Ｅ／Ｗ処理した領域に０．０２ｍＬずつ塗布した（化合物Ａ投与群）。Ｖｅｈｉｃｌｅ群には、１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ含有アセトンを、Ｄａｙ０から、１日１回７日間、Ａ／Ｅ／Ｗ処理直後に、Ａ／Ｅ／Ｗ処理した領域に０．０２ｍＬずつ塗布した。
「定量的リアルタイムＰＣＲ」
右耳介にＡ／Ｅ／Ｗ処理を行ったマウスを実験に用いた。Ｄａｙ０、３及び６のＡ／Ｅ／Ｗ処置直前に、マウス右耳介（化合物Ａ投与群及びＶｅｈｉｃｌｅ群；各ｎ＝４）からＴｏｔａｌＲＮＡをＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、取扱い説明書に従い、抽出した後、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社）で消化した。ＴｏｔａｌＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、取扱い説明書に従い、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＭａｓｔｅｒ（ロッシュ社）とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（ロッシュ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法（インターカレーター法）により分析し、マウスプロフィラグリン及びＧＡＰＤＨのＣｔ値をそれぞれ求めた。ＧＡＰＤＨは内部標準として使用した。用いたプライマーはすべてグライナージャパン社から購入した。マウスプロフィラグリンのフォワードプライマーとして、５’−ＡＴＧＴＣＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧ−３’を、リバースプライマーとして５’−ＴＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＡ−３’をマウスＧＡＰＤＨのフォワードプライマーとして、５’−ＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＡＴＴＴＧＡＴＧＴ−３’を、リバースプライマーとして５’−ＣＡＴＧＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣ−３’を用いた。サンプル毎に２回測定し、その平均値を各サンプル値とした。マウスプロフィラグリンの相対ｍＲＮＡ量は比較Ｃｔ法により算出した。各サンプルのｍＲＮＡ量は、Ｄａｙ０におけるマウスプロフィラグリンのｍＲＮＡ量に対する比として、示した。結果を図１０に示した。
「ＮＭＦの測定」
両耳介にＡ／Ｅ／Ｗ処理を行ったマウスを実験に用いた。Ｄａｙ７に、マウス両耳介角質層の総ＮＭＦ量を、ｉｎｖｉｖｏ共焦点ラマン分光装置（ｍｏｄｅｌ３５１０、ＲｉｖｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）で求めた（化合物Ａ投与群及びＶｅｈｉｃｌｅ群；各ｎ＝３）。
耳介内側表面より８マイクロメータの深さまで１マイクロメータ間隔で、励起波長を７８５ｎｍとして４００〜１８００ｃｍ^−１領域のラマンスペクトルを測定した。総ＮＭＦ量は、ＳｋｉｎＴｏｏｌｓ２．０（ＲｉｖｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてケラチンあたりの量として定量した。耳介毎にそれぞれ４回測定を行った。測定深度毎に総ＮＭＦ量の平均値を算出し、各深度における個体値とした。正常対照として、Ａ／Ｅ／Ｗ無処理マウス（ｎ＝１）の耳介角質層の総ＮＭＦ量を測定した。結果を図１１に示した。
「ＴＥＷＬの測定」
右耳介にＡ／Ｅ／Ｗ処理を行ったマウスを実験に用いた。Ａ／Ｅ／Ｗ処理した領域からのＴＥＷＬの測定は、Ｄａｙ０、１、３及び４のＡ／Ｅ／Ｗ処置直前とＤａｙ７に行なった（化合物Ａ投与群及びＶｅｈｉｃｌｅ群；各ｎ＝４）。ＴＥＷＬの測定は、室温（摂氏２３度から２６度）、湿度４０％から６０％で、水分蒸散量測定装置ＶＡＰＯＳＣＡＮＡＳ−ＶＴ１００ＲＳ（アサヒバイオメッド）を用いて測定した。個体毎に２回測定を行い、その平均値を各個体値とした。結果を図１２に示した。

本発明は、ＪＡＫ阻害剤の皮膚疾患を対象疾患とする新規医薬用途を提供する。

Claims

下記化学構造式：
で示される化合物又はその医薬上許容される塩を有効成分として含有する、老人性乾皮症、皮脂欠乏症、尋常性魚鱗癬、ネザートン症候群及びＢ型ピーリング皮膚症候群からなる群から選択される皮膚疾患の治療剤又は予防剤。
請求項１において選択される皮膚疾患が老人性乾皮症である請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
請求項１において選択される皮膚疾患が皮脂欠乏症である請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
請求項１において選択される皮膚疾患が尋常性魚鱗癬である請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
請求項１において選択される皮膚疾患がネザートン症候群である請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
請求項１において選択される皮膚疾患がＢ型ピーリング皮膚症候群である請求項１に記載の治療剤又は予防剤。