JP6424226B2 - 分泌細胞をカプセル化するためのチャンバー - Google Patents

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Description

本発明は、移植可能なバイオ人工臓器、特に、関心対象の物質を分泌する細胞をカプセル化するためのチャンバーの形をしたバイオ人工臓器の分野に関する。このようなカプセル化チャンバーおよびバイオ人工臓器の製造を可能にする膜も本発明の対象である。
治療的関心対象の物質を身体に連続して供給することが必要な病理学的状態の治療は、患者に移植することができ効率的にかつ場合よっては長期間にわたってこれらの物質を放出することができる装置を開発することが必要な状態になっている。
この必要を満たすために、治療的関心対象の1種類または複数種の物質を産生する細胞を含むバイオ人工臓器が開発されている。バイオ人工臓器に含まれる細胞は、少なくとも1つの半透膜によって区切られた内部空間に、すなわち、カプセル化チャンバー中に閉じ込められる。このような膜は、カプセル化チャンバーから患者の体内の標的細胞への治療的関心対象の物質の拡散を可能にすると同時に、患者の免疫系の抗体および細胞に対して不浸透性であり、従って、治療的関心対象の物質を産生する細胞に患者の免疫系の抗体および細胞が直接接着するのを妨げる場合に「半透性」と呼ばれる。
バイオ人工臓器は、特に患者に移植することが意図され、少なくとも1つの半透膜からなる少なくとも1つのカプセル化チャンバーを備える、装置であると理解される。該カプセル化チャンバーは、治療的関心対象の1種類または複数種の物質を分泌する細胞を含むことが意図される。
これらの治療的関心対象の物質は、患者において有益な効果を有することが意図される任意の物質である。従って、これらは、神経伝達物質、ホルモン、増殖因子、凝固因子、またはサイトカインでもよい。特に、これらの物質は、性質を限定することなく、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン、凝固第IX因子、凝固補因子(coagulation cofactor)VIII、またはカルシトニンでもよい。
装置(バイオ人工臓器、半透膜、カプセル化チャンバー)の例は先行技術において公知である。
従って、極性部位の生成によって表面修飾されかつ少なくとも1種類の親水性ポリマーの層で覆われた多孔性ポリカーボネート生体適合性フィルムからなる膜、およびバイオ人工臓器を製造するためのその使用について説明する、WO02/060409(特許文献1)についての言及がなされうる。
WO2012/017337(特許文献2)およびFR2960783(特許文献3)は、表面エネルギーを高めるように前処理された多孔性生体適合性支持体で構成され、それぞれが親水性ポリマーと少なくとも1種類の生物活性分子とを含む少なくとも2つの層を含む、機能付与された半透膜について説明し、特にバイオ人工臓器およびカプセル化チャンバーを製造するための、その使用についても説明する。
これらの明細書に開示される膜は、本明細書において開示される2つの層(多孔性生体適合性ポリマーおよび不織ポリマー)を提示していない。これは、親水層(3)がユニークな多孔性生体適合性ポリマー層(2)の上に付着されていることを示すFR2960783(特許文献3)の図2を見れば明らかである。下記のように本願の文脈において、このような親水層が想定されることも留意すべきである。
WO2012/010767(特許文献4)は、半透膜で作製された密閉シェルを備える移植可能な腎臓臓器を形成するためのバッグ(またはパウチもしくはポケット)について説明する。このバッグは、シェルに含まれるシートも備え、このシートは、その表面に、シートとシェルとの間に細胞用の空間を維持するための突起部(突出部)を備える。
US20060067917(特許文献5)は、本明細書において開示される膜およびカプセル化チャンバーについて説明していない。D2の装置はデザインの点で本明細書において開示される装置とは異なり、D2の装置の膜は単層膜(図1の104、106、および112)であるので、本願のカプセル化チャンバーと間違えることができない。
WO2000/060051(特許文献6)は、カプセル化チャンバーの半透膜の異なる材料、およびポリマーから作製することができる、カプセル化チャンバーについて説明する(この明細書の21頁15行〜22頁23行を参照されたい)。WO2000/060051(特許文献6)は、細胞を維持するために、マクロカプセル化(macroencapsulation)装置内での様々な材料の使用を想定していることも留意しなければならない(21頁30行〜22頁11行)。
しかしながら、特に、有利な生体力学的特徴を示す、すなわち、移植後に良好な耐性を示す新規のバイオ人工臓器を、外科医が入手できることが必要である。この理由は、バイオ人工臓器が一般的に腹腔内の空洞または腹膜外腔に移植されることが意図され、レシピエント患者の運動に従って引張力または剪断力を受けやすいからである。
さらに、これらのバイオ人工臓器は、患者に移植された後に長期間の生理学的効果を有することができるように多数の細胞を含むことができなければならない。従って、これを実現するのに十分に大きい臓器を設計する必要があるが、このような臓器には、移植後に患者の運動により裂けるリスクがあるという欠点がある(この問題は、限られた数の細胞しか含まないミクロ臓器(microorgan)にはあまり重要でない)。機械的強度を改善するために膜の厚さを増やすことは、膜の厚さが増えた場合に関心対象の分子の拡散が大幅に減るので解決策になり得ない。
従って、バイオ人工臓器を製造するための機械的特性が改善された新規の半透膜を開発することが望ましい。少なくとも選択的透過性を保持しなければならない。
WO02/060409 WO2012/017337 FR2960783 WO2012/010767 US20060067917 WO2000/060051
従って、第一の態様では、本発明は、治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞を収容することができる空間を区切っている半透膜で作製された密閉シェルを備える、該治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞をカプセル化するためのチャンバーであって、該膜が、少なくとも1つの多孔性生体適合性ポリマー層と1つの不織生体適合性ポリマー層とを含むことを特徴とする、チャンバーに関する。
上記で引用された明細書は、少なくとも1つの多孔性生体適合性ポリマー層と、別の不織生体適合性ポリマー層とを含む半透膜を備えるこのような分泌細胞用カプセル化チャンバーについて説明も示唆もしていない。
さらに、実施例(特に実施例7および8)から分かるように、開示されたチャンバーは、バイオ人工臓器中で用いられた場合に、特に生体内移植後に高い機械的耐性を示す。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞を収容できる空間を区切っている半透膜で作製された密閉シェルを備える、該治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞をカプセル化するためのチャンバーであって、該膜が、少なくとも1つの多孔性生体適合性ポリマー層と1つの不織生体適合性ポリマー層とを含むことを特徴とする、チャンバー。
［２］
前記膜が、2つの多孔性生体適合性ポリマー層の間に位置している1つの生体適合性不織ポリマー層を含むことを特徴とする、［1］のカプセル化チャンバー。
［３］
前記不織ポリマーが、ポリカーボネート(PC)、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリプロピレン(PP)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(塩化ビニル)(PVC)、ポリアミド、およびポリエチレン(PE)より選択されることを特徴とする、［1］または［2］のカプセル化チャンバー。
［４］
少なくとも1つの層の前記多孔性生体適合性ポリマーが、ポリカーボネート(PC)、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリプロピレン(PP)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(塩化ビニル)(PVC)、ポリアミド、およびポリエチレン(PE)より選択されることを特徴とする、［1］〜［3］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［５］
少なくとも1つの多孔性生体適合性ポリマー層または前記2つの多孔性生体適合性ポリマー層が、表面の物理修飾または化学修飾によって親水性にされており、かつ少なくとも1種類の親水性ポリマーで覆われていることを特徴とする、［1］〜［4］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［６］
前記多孔性生体適合性ポリマー層、または、前記2つの多孔性生体適合性ポリマー層の一方が、細孔10 6 個/cm 2 〜細孔10 11 個/cm 2 の細孔密度を有することを特徴とする、［1］〜［5］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［７］
前記膜の全厚が45μm〜200μmであることを特徴とする、［1］〜［6］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［８］
前記膜が単一の多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合にこの層が5μm〜100μmの厚さを有し、かつ、該膜が2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合に一方の該生体適合性ポリマー層の厚さが5〜40μmでありかつ他方の該生体適合性ポリマー層の厚さが25〜100μmであることを特徴とする、［1］〜［7］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［９］
前記膜が単一の多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合にこの生体適合性ポリマー層上に存在する細孔の内径が5〜100nm、最も好ましくは5〜90nmであること、および、該膜が2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合に一方の該生体適合性ポリマー層上に存在する細孔の内径が5〜100nmでありかつ他方の該生体適合性ポリマー層上に存在する細孔の内径が100〜2000nm、好ましくは200〜1000nmであることを特徴とする、［1］〜［8］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［１０］
少なくとも1つの層が、少なくとも1種類の生物活性分子を含む親水性ポリマーで覆われていることを特徴とする、［5］〜［9］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［１１］
前記シェルに含まれる生体適合性シートも備え、かつ該シートがその表面に突起部を任意で含む、［1］〜［10］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［１２］
前記膜が、2つの生体適合性ポリマー層を含み、前記シェルの外側にある該層が、100〜2000nmの内径を有する細孔を有し、かつ該シェルの内側にある該層が、5〜100nmの内径を有する細孔を有することを特徴とする、［1］〜［11］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［１３］
前記シェルの外側と内側との連絡を確立することを可能にさせる少なくとも1つのコネクタを備えることを特徴とする、［1］〜［12］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［１４］
円形でありかつ3cm〜20cmの直径を有することを特徴とする、［1］〜［13］のいずれかのカプセル化チャンバー。
［１５］
［1］〜［14］のいずれかの少なくとも1つのカプセル化チャンバーを備え、治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞が該カプセル化チャンバー中に存在することを特徴とする、バイオ人工臓器。
［１６］
インシュリン分泌細胞またはランゲルハンス島を含むバイオ人工膵臓であることを特徴とする、［15］のバイオ人工臓器。
［１７］
治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞を受容することを目的とした密閉パウチを形成するように、少なくとも1つの多孔性生体適合性ポリマー層と1つの不織生体適合性ポリマー層とを含む1つまたは2つの膜を熱溶着する工程を含む、［1］〜［14］のいずれかのカプセル化チャンバーを得るための方法。
「生体適合性」という用語は、生物に十分に許容され、拒絶反応も、中毒反応も、病変も、生物の生物学的機能への有害な影響も引き起こさない材料について言われると想起される。これは、材料を生物に挿入することによる炎症反応の可能性も、外因性細胞を含む生体適合性臓器の場合では免疫反応の可能性も排除しない。従って、この免疫反応は、臓器それ自体によるものではなく、むしろ臓器の内容物(外因性細胞によるケモカイン分泌)によるものである。
上記のように、半透膜にはカットオフ閾値があり、このカットオフを超える重量をもつ分子は膜を通過できないのに対して、このカットオフ閾値未満の重量をもつ分子は膜を通過することができる。カットオフ閾値の決定は、阻止することまたは透過を可能にさせることを当業者が望んでいる分子の特徴に従って当業者によって行われる。
好ましい一態様では、インシュリン、グルカゴン、またはグルコースなどの低分子を通過させ、免疫系のエフェクター分子(例えば、サイトカイン)を止めるためには、このカットオフ閾値は100kDa〜500kDa、より好ましくは100kDa〜150kDaである。
多孔性ポリマーの細孔の内径によって、望ましいカットオフ閾値を得ることが可能になる。従って、1つの具体的な事例では、多孔性生体適合性ポリマー層上に存在する細孔の内径は5〜100nmであり、完全に好ましくは5〜50nmである。
不織ポリマー
不織ポリマー(不織布)は、その繊維がランダムに維持されているようなものであると想起される。従って、それは、特定の方向に、またはランダムに向けられ、摩擦および/または粘着および/または接着によって結合された繊維からなるシートである。従って、繊維は統計学的に配置される、すなわち、ランダムに付着される。その結果として、かつ繊維のランダム配置により、不織ポリマーは物質に対して透過性であることができ、不織ポリマー内で拡散することができる物質のサイズの制限はない。
任意のタイプのポリマー繊維を用いて不織ポリマーを生成することができる。従って、ポリエステル:PET(ポリ(エチレンテレフタレート))、PBT(ポリ(ブチレンテレフタレート))、PVC(ポリ(塩化ビニル))、PP(ポリプロピレン)、PE(ポリエチレン)、またはこれらのポリマーのブレンドについての言及がなされうる。
ポリアミドまたはポリカーボネートも不織ポリマーを生成するのに使用することができる。
好ましくは、不織ポリマーは、ポリカーボネート(PC)、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリプロピレン(PP)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(塩化ビニル)(PVC)、ポリアミド、およびポリエチレン(PE)より選択される。これらのポリマーのブレンドも不織ポリマーを生成するのに使用することができる。ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)が特に好ましい。
一般的に、この不織ポリマーはメルトブロー法によって得られる。その組成物は、「メルトブロー」されたマイクロファイバーが絡み合ったものである。
この生成方法は、溶融紡糸することができるポリマー、特にポリプロピレン、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリアミド、またはポリエチレンに特に適している。
この方法によって、さらに高い機械的強度の不織布が生成される。
特定の一態様において、前記膜は、生体適合性不織ポリマー層の両側面に2つの多孔性生体適合性ポリマー層を含む。従って、この生体適合性不織ポリマー層は、これらの2つの多孔性生体適合性ポリマー層の間に位置しているか、配置されているか、または置かれている。
このような態様によって装置の強度を最適化することが可能になる。実際には、この不織布層は、衝撃を吸収し、変形する能力を与え、従って、インサイチューでの膜の剛性を高めるが、細胞の存在下では問題となることが分かっており、この不織布の周りに凝集物を形成する傾向をもつことがある「スポンジ」のように振る舞うと考えることができる。従って、不織布層が2つの多孔性生体適合性ポリマー層の間に位置することで、細胞の凝集が阻止されると同時に、生物学的物質の分子拡散が影響を受けずに装置にさらなる保護/強度が与えられる。
多孔性バイオポリマーおよび不織バイオポリマーが同一である必要はない。
同様に、2つの多孔性バイオポリマー層の存在下では、これらの層は同じポリマーでもまたは異なるポリマーでもよい。
多孔性生体適合性ポリマー
多孔性生体適合性ポリマーは当技術分野において公知のポリマーからなる。従って、それは、ポリカーボネート(PC)、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリプロピレン(PP)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(塩化ビニル)(PVC)、ポリアミド、およびポリエチレン(PE)より選択されてもよい。
特定の一態様において、少なくとも1つの層、または2つの層が適宜、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)で作製される。
細孔の形成は当技術分野において公知の任意の方法によって行われる。特に、電子衝撃法または重イオン衝撃法(この2番目の技法は特に特許US4956219で記載されている)を使用することができる。重イオン衝撃の場合、生体適合性支持体の表面に衝撃によって送られる重イオンの密度によって細孔密度が決まるのに対して、化学的浸食処理の時間によって孔径が決まる。
このように、前記膜は、先行技術において公知であり、特に、特許US4956219、D同E19536033、または同CH701975において説明されている「トラックエッチング(track-etching)」プロセスを用いて調製される。
この技術は、エネルギーが高い重イオンをポリマーフィルムに照射し、それによって、このポリマーの局所的分解を特徴とする見えない直線が形成することにある。次いで、これらの線は、選択的な化学的攻撃によって細孔の形となって現れる。
膜には重イオンビームが照射される。重イオンはポリマーフィルムの全厚を通過する。ポリマーを通過する際に、重イオンはポリマー鎖を破壊または切断し、従って、材料を通るきれいでまっすぐな開口部を形成する。細孔の最終的な並びは、照射プロセス中のポリマーフィルムに対するビームの角度によって決まる。従って、ビームは、ポリマーフィルムに対して垂直でもよいか、または他の任意の角度でもよい。
次の工程では、フィルムは、硝酸などの強酸浴に通され、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどのアルカリ性溶液と接触した後に開口部が細孔になる。
フィルムの残りとは反対に、イオンによって生じたこれらの開口部はアルカリ性溶液が通過することができ、このアルカリ性溶液は開口部を満たし、これらの開口部の周囲にある材料(ポリマー)を除去することによって細孔がエッチングされる。
孔径は、アルカリ性溶液の濃度、接触時間、および溶液の温度によって制御される。
ポリエステルまたはポリカーボネートが用いられる場合、得られる膜は親水性であり、そのままで使用することができるか、さもなければ表面処理プロセス(プラズマ、噴霧、またはコーティング)を用いて処理することができる。
この「トラックエッチング」技術による膜の調製は特許US4956219および同CH701975においてさらに正確に説明されている。
この技術により、特に、平らな面と狭いカットオフ閾値を特徴とする多孔性ポリマー膜を作製することが可能になる。
この技術によって得られる膜を使用することの利点は、孔径、細孔の数、および細孔の形状の精度が高いことである。
細孔は優先的に円筒形であるが、この技術によって円錐形などの他の形状の細孔を得ることもできる。
優先的に、細孔は並べられ、垂線に対して10°〜45°の角度を有するが、45°超または10°未満の角度も有してもよい。膜衝撃中のイオンビームの角度に応じて、これらの角度が得られる。
この技術は、ポリカーボネート(PC)、ポリエステル(PET)、またはポリイミド(PI)などの様々な材料に適用可能である。ポリアミド、ポリ(フッ化ビニリデン)、ポリアクリレート、またはポリオレフィンも使用することができる。
この方法により、0.02μm〜15μmの制御されたサイズ、細孔103個/cm2〜細孔1010個/cm2の細孔密度を有する細孔、および5μm〜80μmの厚さを有する膜を容易に得ることが可能になる。
生体適合性ポリマー上に細孔を形成する処理がなければ、このようなポリマーは、どんな物質も通さないままであり、生体適合性臓器の内部から外部への関心対象の物質の拡散を可能にしないことに留意しなければならない。細孔は、カットオフ未満の物質(すなわち、細孔直径より小さい物質)しか拡散しない。
従って、不織生体適合性ポリマー層と多孔性生体適合性ポリマー層が、異なる材料で作製され、(特に、各層を通る物質の通過および拡散に関して)異なる特性を示す異なる層であることは明らかである。
好ましい一態様では、膜の多孔性生体適合性ポリマー層の少なくとも1つは親水性にされている。親水性は、この多孔性生体適合性ポリマー層の表面に極性部位を生成することによって実現することができる。この表面修飾は物理的手段によって(例えば、表面に、荷電している極性部位を、特に、大気圧または減圧下でのプラズマ表面処理、コロナ放電、または電磁放電で生成することによって)行われてもよく、化学的手段によって行われてもよい(アルカリ処理、特に、水酸化ナトリウムを用いたアルカリ処理を想定することができる)。
優先的に、多孔性生体適合性ポリマー層は、アルゴン、水素、酸素、または空気の高周波プラズマを用いて処理される。多孔性生体適合性ポリマー層は、1リットルのリアクタ容量あたり3〜10ワットのプラズマリアクタ放出電力で約1〜20分間にわたって処理することができる。この処理は、マイクロ波プラズマを用いて同じ電力であるが5秒〜20分間にわたって行うこともできる。好ましくは、プラズマ処理は減圧下で行われる。
特許出願WO02/060409および同WO2012/017337は、特に、極性部位を多孔性生体適合性ポリマー上に導入するためのプラズマ表面処理について説明する。
少なくとも1つの多孔性生体適合性バイオポリマー層が親水性にされた後に、少なくとも1つの親水性ポリマー層、さらには、2つの異なる親水性ポリマー層で覆うことが可能である。活性分子を少なくとも1つの親水性ポリマー層に任意で含めることができる。
WO02/060409およびWO2012/017337も、親水性になるように処理されている、特に極性部位を付加することによって親水性になるように処理されている多孔性生体適合性ポリマー表面に少なくとも1種類の親水性ポリマーを付加することについて説明する。
親水性ポリマー
本発明の目的のために、親水性ポリマーを構成するものは、多孔性生体適合性ポリマーフィルムに塗布した後、WO02/060409の実施例2に記載の「液滴」試験に従って測定した後に40°未満、好ましくは30°未満の角度値を有するポリマーまたはポリマーブレンドである。
「液滴」試験による角度値はポリマー処理に応じて変化する場合があることに留意しなければならない。従って、生体適合性バイオポリマーの場合、2回のプラズマ処理が行われた場合に20°未満(約16〜17°)の接触角を観察することができる。2回のプラズマ処理後に親水性ポリマー(特にHPMC)が付着された場合に、この角度は増加する(一般的に30°未満)。生物活性を有する分子も含有する親水性ポリマーのブレンドが用いられた場合(特に、HPMC、エチルセルロース+ヘパリン混合物)、角度は30°を超えることがあるが、40°未満のままである。
優先的に、親水性ポリマーは水溶性である。この理由は、バイオ人工臓器が宿主生物の体内に移植されるため有機溶媒の使用が除外されるからである。なぜなら、有機溶媒を完全に排除することは難しく、少量であっても有機溶媒が存在することがヒトまたは動物における治療的使用とも外科的使用とも適合しないからである。
好ましくは、親水性ポリマー材料は、以下の親水性ポリマーより選択される:
- セルロースおよびその誘導体、例えば、エチルセルロース(EC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、またはカルボキシメチルセルロース(CMC);
- ポリアクリルアミドおよびそのコポリマー;
- ポリビニルピロリドン(PVP)およびそのコポリマー;
- ポリビニルアルコール;
- 酢酸ビニルコポリマー、例えば、ポリ(酢酸ビニル)/ポリ(ビニルアルコール)コポリマー;
- ポリエチレングリコール;
- プロピレングリコール;
- 親水性ポリ(メタ)アクリレート;
- 多糖;
- キトサン。
親水性ポリマーとして、前記で定義された親水性ポリマーの1つからなるポリマー材料と、前記の親水性ポリマーのいくつかのブレンド、一般的に、前記の親水性ポリマーの2つまたは3つのブレンドがいずれも使用される。
好ましくは、親水性ポリマーは、セルロースベースの化合物、特に、HPMC、EC、TEC、もしくはCMC、ポリビニルピロリドン、ポリ(ビニルアルコール)、またはポリアクリレート、例えば、ポリ(ヒドロキシエチルアクリレート)(HEA)もしくはアクリル酸コポリマーより選択される。
親水性ポリマーはまた、前述の2種類またはそれ以上の親水性ポリマーのブレンド、特に、HPMCとCMCのブレンドまたはHPMCとECのブレンドで構成されてもよい。
セルロースおよびセルロース誘導体、特に、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)が好ましい。
膜積層
機械的安定性を高めるために、多孔性生体適合性ポリマー膜は、不織布で作製された膜を用いて強化される。
不織ポリマーと多孔性生体適合性ポリマー膜との組み合わせは、優先的に、接着剤の存在下または非存在下で、好ましくは接着剤を用いずに、当技術分野において公知の方法を用いた積層、例えば、熱積層によって行われる。
従って、膜の強化は、織られたポリマーまたは不織ポリマーの層と生体適合性多孔性ポリマー層を交互に入れ替えた多層系を介して改善することができる。しかしながら、拡散性のどんな劣化も避けなければならない。
特に、細孔密度の高い薄い機能的な膜と、細孔密度の低い薄い保護膜を組み合わせることによって、機械的安定性を高めることができる。
膜を製造するのに使用することができるポリマー層の数への制限はない。
活性分子
上記で示したように、多孔性生体適合性ポリマー層上に付着される親水性ポリマーは活性分子を任意で含有することができる。
この「活性分子」は親水性ポリマーと混合される。特に、バイオ人工臓器の移植による炎症を減らすために、および/またはバイオ人工臓器を受け取った患者の組織によるプラスの応答(特に血管新生の増加)を誘導するために、「活性分子」は半透膜を取り囲んでいる培地に放出されることが意図される。
従って、活性分子は、抗炎症剤、抗感染剤、麻酔剤、増殖因子、血管形成を刺激する、および/もしくは血管新生を誘導する薬剤、治癒を誘導する薬剤、免疫抑制剤、抗凝集剤(antiaggregant)および抗凝固剤を含む抗血栓剤、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、またはインシュリン分泌を刺激する任意の分子(IGF、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)もしくはその誘導体、インクレチンミメティック)より選択される。
抗炎症剤の中で、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、例えば、アセトアミノフェン、アミノサリチル酸、アスピリン、セレコキシブ、トリサリチル酸コリンマグネシウム、デクロフェナク(declofenac)、ジフルニサル、エトドラク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、インターロイキンIL-10、IL-6ムテイン、抗IL-6、NO合成酵素阻害剤(例えば、L-NAMEまたはL-NMDA)、インターフェロン、ケトプロフェン、ケトロラック、レフルノミド、メフェナム酸、ミコフェノール酸、ミゾリビン、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム(pyroxicam)、ロフェコキシブ、サルサラート、スリンダクおよびトルメチン、ならびにコルチコイド、例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、パクリタキセル、タクロリムス、トラニラスト、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、デソニド、デスオキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、プロピオン酸クロベタゾール、およびデキサメタゾンについての言及がなされうる。イブプロフェンが特に適しており、かつ好ましい。
好ましくは、抗血栓剤、例えば、抗凝集剤(アセチルサリチル酸、クロピドグレル、チクロピジン、ジピリダモール、アブシキシマブ、エプチフィバチド、およびチロフィバン)、抗凝固剤(ヘパリン、ビバリルジン、ダビガトラン、レピルジン、フォンダパリヌクス、リバーロキサバン、エポプロステノール、ワーファリン、フェンプロクーモン、プロテインC、ドロトレコギンアルファ、抗トロンビン、ペントサン)、ならびに血栓溶解剤(アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、テネクテプラーゼ、およびレテプラーゼ)が使用される。
ヘパリンの使用が特に好ましい。
別の態様では、イブプロフェンが用いられる。
さらに、バイオ人工臓器の周囲にある組織の血管新生の誘導を可能にさせる分子、特に、PDGF(血小板由来増殖因子)、BMP(骨形成タンパク質)、VEGF(血管内皮増殖因子)、VPF(血管透過性因子)、EGF(上皮細胞増殖因子)、TGF(トランスフォーミング成長因子)、およびFGF(線維芽細胞増殖因子)を使用することが可能である。
神経栄養因子(NGF)であるIGF-1およびIGF-2を使用することも可能である。
特定の一態様において、血管形成を誘導することによって血管新生を促進する細胞増殖因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血小板由来内皮細胞増殖因子(PDGF AもしくはB)、骨形成タンパク質(BMP2もしくは4)、または肝細胞増殖因子(HGF)が選択される。
親水性ポリマーおよび生物活性分子の層を調製するために、親水性ポリマーまたは親水性ポリマーのブレンドが水に溶解される。
多孔性生体適合性ポリマー層への活性分子を任意で含有する親水性ポリマーの添加はWO02/060409およびWO2012/017337に記載の方法に従って行われる。
別の態様では、WO2012/017337に記載のように、多孔性生体適合性ポリマーの表面には、それぞれが親水性ポリマーと少なくとも1種類の生物活性分子とを含む、2つの層を付加することが可能である。
生体適合性膜の物理的特徴
好ましい態様において、本発明による膜は、それぞれが少なくとも1種類の親水性ポリマーで覆われている、2つの多孔性生体適合性ポリマー層を含み、2つの多孔性生体適合性ポリマー層は不織布層を取り囲んでいる。
細孔の直径および密度
上記のように、細孔は、当技術分野において公知の方法を用いて、それぞれの多孔性生体適合性ポリマー層に導入される。少なくとも、この層(層が1つしかない場合)、または2つの多孔性生体適合性ポリマー層の一方が、細孔106個/cm2超、好ましくは、細孔107個/cm2超の細孔密度を有することが好ましい。この細孔密度は、一般的に細孔1011個/cm2未満、好ましくは細孔1010個/cm2未満である。従って、優先的に細孔106個/cm2超、より好ましくは細孔107個/cm2超の細孔密度を有することができる膜が使用される。この密度は、優先的に細孔1011個/cm2未満、さらには細孔1010個/cm2未満である。従って、この密度は細孔106個/cm2〜細孔1011個/cm2である。細孔109個/cm2超であり、かつ細孔1010個/cm2未満の密度が完全に適している。
上記のように、多孔性生体適合性ポリマー層の細孔は、膜の半透性が可能になるような内径を有する。
従って、2つの多孔性生体適合性ポリマー層の少なくとも一方(または、そうである場合にはただ1つの層)は、5nm超、好ましくは10nm超かつ100nm未満、好ましくは10nm超かつ50nm未満、より好ましくは40nm未満の内径を有する、細孔を有する。この多孔性生体適合性ポリマー層について、90nm未満の細孔直径も非常に好ましい。なぜなら、このような細孔の直径は、膜に求められている半透性を維持するからである。次いで、細孔密度は好都合なことに細孔2.109個/cm2超かつ細孔4.1010個/cm2未満である。
膜が、2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合、該層の一方の細孔の内径は優先的には前述の通りである。
第2の層の細孔の内径がより大きくてもよく、望ましいサイズでのカットオフ効果は第1の層の細孔の直径により与えられ得る。従って、第2の層の細孔の内径は100nm超かつ2000nm未満、好ましくは200nm超でもよい。これらの細孔の内径は好ましくは1000nm未満である。400nm超かつ600nm未満、または約500nmの細孔内径が完全に適している。次いで、細孔密度は好都合なことに細孔5.106個/cm2超かつ細孔5.107個/cm2未満である。
不織布層を取り囲んでいる2つの多孔性生体適合性ポリマー層を膜が含む場合、カプセル化チャンバーは、細孔直径が最も小さい層がチャンバー内に置かれており(治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞と接触しており)、細孔直径が最も広い層が外側に置かれている(患者の身体と接触している)ようなものであることが好ましい。
膜の厚さ
好ましい一態様において、(不織ポリマー層および多孔性ポリマー層を含む)膜の全厚は45μmより大きい。全厚は一般的にかつ好ましくは200μm未満であるが、このサイズより大きい場合がある。特に、300μmまで、さらにはこれを超える厚さを想定することができる。好ましくは、全厚は50μm超である。全厚は優先的に150μm未満でもある。従って、この膜の厚さは一般的に45〜200μmである。
膜が、2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合、これらの層は同じ厚さを有してもまたは異なる厚さを有してもよい。
不織ポリマー層は一般的に、40μm超、好ましくは60μm超、より好ましくは80μm超の厚さを有する。この層は一般的に、250μm未満、好ましくは150μm未満の厚さを有する。従って、不織ポリマー層の厚さは40μm〜150μmであることが多い。
膜が生体適合性ポリマー層を1つのみ有する場合、この層は5μm超の厚さを有する。この層は200μm未満、好ましくは100μm未満であるが、好ましくは50μm未満である。
膜が、2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有し、かつ該層が異なる厚さを有する場合に、第1の層の厚さは5μm超である。それはまた、好ましくは200μm未満であるが、好ましくは40μm未満でもある。15μm未満(好ましくは5μm超)の厚さが完全に適している。2つの層の細孔の内径が異なる場合には、この厚さは優先的に、内径が最も小さい細孔を有する層の厚さである。
第2の層の厚さは一般的に25μm超である。それは、好ましくは200μm未満、好ましくは100μm未満、より好ましくは50μm未満であり、30〜50μmの厚さが完全に適している。
1つの多孔性生体適合性ポリマー層上または2つの多孔性生体適合性ポリマー層上に任意で存在するそれぞれの親水性ポリマー層の厚さは、膜の全厚と比較してごくわずかである。この厚さは、実際には、好ましくは500nm未満、一般的に25〜250nmである。
好ましい一態様において、膜は、不織ポリマー層の両側面に2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有する。
この態様において、一方の多孔性生体適合性ポリマー層は、内径が100nm超、好ましくは200nm超、より好ましくは400nm超であり、かつ1000nm未満、より好ましくは600nm未満であり、好ましくは、密度が細孔約5.107個/cm2の細孔を有する。次いで、この層は厚さが25〜200μmの層であることが有利である(上記を参照されたい)。
他方の多孔性生体適合性ポリマー層は、好ましくは、細孔約2.109個/cm2超の密度で、内径が5nm超、好ましくは10nm超の(一般的に100nm未満、好ましくは50nm未満、好ましくは40nm未満の)細孔を有する。この密度はまた優先的に細孔7.109個/cm2未満でもある。
この層は厚さが5〜200μm(好ましくは5〜15μm)の層であることが有利である。
カプセル化チャンバー
本発明はまた、治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞をカプセル化するためのチャンバーであって、該治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞を収容できる空間を区切っている本発明による膜で作製された密閉シェルを備える、チャンバーに関する。このカプセル化チャンバーは「パウチ」とも呼ばれることがあり、これにより、患者に移植可能なバイオ人工臓器を形成することが可能になる。
特定の一態様において、このカプセル化チャンバーは、前記シェルに含まれる生体適合性シートも備え、該シートは好ましくは、その表面に突起部(突出部とも呼ばれる)を含む。これらの突起部は、シートとシェルとの間に細胞用の空間を維持するのに有利であるが、細胞を均一かつ平面で分配するのにも有利である。従って、これらの突起部により、交換面を最大にすることが可能になる。このシートは優先的にシリコーンで作製される。
このような態様は出願WO2012/010767に記載されている。従って、好ましい一態様では、シェルは、熱溶着されて一緒になった2つの膜から形成される。WO2012/010767に記載の方法または当技術分野において公知の超音波を使用する熱溶着法が使用されてもよい。シェルを形成する方法は簡単であり、この方法により、シェル中にシートを封入することが可能になる。
チャンバーの形状
好ましい一態様において、カプセル化チャンバーは円形である。このような形状は、いくつかの利点を有する:
- 移植中に細胞凝集物または炎症性凝集物をもたらすことができる「隅(corner)」または突出部分がないこと、
- カプセル化チャンバーの製造が容易なこと(熱溶着の前に2つの膜およびシートの向きを揃える必要がないこと)。
特定の一態様において、カプセル化チャンバーの直径は、3cm超、好ましくは5cm超、または8cm超である。それは一般的に、20cm未満、優先的に15cm未満、または14cm未満である。8〜14cmの直径が完全に許容される。
チャンバーが円形でない場合、その最大寸法は一般的、に3cm超、好ましくは5cm超、または8cm超である。その最大寸法は一般的に、20cm未満、優先的に15cm未満、または14cm未満である。
チャンバーの容積
上記のように、カプセル化チャンバーにより優先的に、治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞が導入された場合に「マクロ」臓器を製造することができ、すなわち、該細胞は、かなりの期間(3ヶ月超、優先的に6ヶ月超)にわたって、生理学的に関心があるレベルで、この物質を分泌することができる(すなわち、患者の要望を満たすことができる)。従って、カプセル化チャンバーは多数の細胞を受容できなければならない。
一般的に、カプセル化チャンバーの好ましい内部容積は、ヒトにおいて使用する場合には15ml超、好ましくは20ml超、より好ましくは25ml超でなければならず、50mlまで増えてもよいと見積もられる。他の動物において使用する場合には、この容積は異なるだろう(例えば、ラットでは約1ml)。
このようなカプセル化チャンバーは多数の細胞を含むことができなければならない。糖尿病治療の状況では、少なくとも500000個のランゲルハンス島の等価物、好ましくは、700000個超の島の等価物、任意で、100万個のランゲルハンス島の等価物までカプセル化することができなければならない。1個の島が平均して約1000個の細胞を含むことを知った上で、これにより、本発明によるカプセル化チャンバーが含むことができる細胞の数が見積もられる。
細胞の数は、カプセル化して患者に移植することが望まれる細胞のタイプに従って変化することは言うまでもない。
好ましい一態様において、カプセル化チャンバーを形成する膜は、不織ポリマーの両側面に2つの多孔性生体適合性ポリマー層を含む。この態様では、少なくとも、(チャンバーを形成した後にチャンバー内部に置かれる)内層が、膜の半透性の性質(カットオフ閾値)をもたらす細孔が表面にある層、すなわち、5nm超の(一般的に100nm未満の)内径を有する細孔または前述の他の寸法を有する細孔を有する層であることが好ましい。
シェルの外側にある(患者の組織および細胞と接触している)層の細孔は、これより大きい内径、特に、100nm超であるが、好ましくは2000nm未満の内径を有してもよく、前述の他の寸法を有する内径を有してもよい。
一態様では、WO2012/010767に記載のように、カプセル化チャンバーは、シェルの外側と内側との連絡を確立することを可能にさせる少なくとも1つのコネクタ(特に、シェルおよび/またはシートに取り付けられる)を備えてもよい。これらのコネクタを可撓性のあるチューブに接続すると、チャンバーに充填する、およびチャンバーを空にすることが可能になる。
バイオ人工臓器
従って、本発明は、少なくとも1つの本発明によるカプセル化チャンバーを備えるバイオ人工臓器に関する。このようなバイオ人工臓器はまた、好都合なことに、コネクタに接続されたチューブを示し、このチューブよって、バイオ人工臓器に充填する、およびバイオ人工臓器を空にすることが可能になり、バイオ人工臓器が患者に移植された場合に、外植を行うことなくバイオ人工臓器の内容物を新しくすることが可能になる。
このバイオ人工臓器は様々な細胞タイプを含有してもよい。
バイオ人工臓器中にカプセル化される細胞
バイオ人工臓器中に存在する細胞は、関心対象の少なくとも1種類の生物活性物質を産生する。カプセル化チャンバーがバイオ人工膵臓の製造に意図されている場合に、該細胞は特に、インシュリン分泌細胞、または、インシュリンを産生するランゲルハンス島でもよい。
カプセル化チャンバーがバイオ人工肝臓の製造に意図されている場合に、前記細胞は肝臓細胞でもよい。
特定の一態様において、前記細胞は、関心対象の生物活性物質の発現を可能にする少なくとも1つの核酸でトランスフェクトまたは形質転換される。関心対象の生物活性物質の中で、例示として、インシュリン、サイトカイン、ペプチドホルモン、成長ホルモン、凝固第VIII因子および凝固第IX因子、ならびにカルシトニンについての言及がなされうる。
一般的に、「生物活性物質」という用語は、これを産生する細胞によって放出または分泌され、かつ宿主生物中の標的細胞または標的分子に影響を及ぼす物質、例えば、神経伝達物質、ホルモン、増殖因子、凝固因子、またはサイトカインを意味することが意図される。
不死化細胞株、例えば、分裂細胞の初代培養物、でなければ多能性幹細胞を含めて多種多様な細胞を使用することができる。
前記細胞は、例えば、中胚葉幹細胞集団に由来する筋肉細胞の前駆体である細胞であり、関心対象の生物活性物質の発現を可能にする核酸で容易に形質転換することができる筋芽細胞でもよい。当業者は、好都合なことに、例えば、WO94/02129、WO93/03768、またはWO90/15863について言及しうる。
好ましくは、本発明によるカプセル化チャンバーに含まれる細胞は、適宜、ラミニン、エンタクチン、およびヘパラン硫酸と組み合わせて、マトリックス、例えば、コラーゲンIV型またはフィブリンのマトリックスに埋め込まれる。
本発明によるカプセル化チャンバーに含まれる細胞は、一般的に、これらの細胞を実行可能な形で固定化することができる任意の産物または産物の組み合わせで構成されるマトリックスに埋め込むことができる。
関心対象の少なくとも1種類の生物活性物質を産生する細胞はアルギン酸塩マトリックス中にもカプセル化することができる。
カプセル化チャンバーの製造
カプセル化チャンバーは当技術分野において公知の任意の方法によって製造される。
好ましくは、WO2012/010767の開示が用いられる。WO2012/010767は本願の不可欠な部分と考えなければならない。
従って、本発明は、関心対象の少なくとも1種類の生物活性物質を産生する細胞を受容することを目的としたパウチを形成するように、本発明による2つの膜を(または1つの折り畳まれた膜さえも)熱溶着する工程を含む、本発明によるカプセル化チャンバーを製造するため方法に関する。
特定の一態様において、上記のように、カプセル化チャンバーはシートを備え、1つまたは複数のコネクタも備える。このようなパウチを製造する方法はWO2012/010767に記載されている。読者は、カプセル化チャンバーを製造するための方法に関する、さらに詳細な説明についてはWO2012/010767を参照するように促される。
ヘパリン、エチルセルロース(EC)、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)で処理された、または処理されていない本発明によるポリ(エチレンテレフタレート)(PET)膜またはポリカーボネート(PC)膜の静的条件下でのグルコース(A)、インシュリン(B)、およびIgG(C)に対する透過性。 ヘパリン、EC、およびHPMCで処理された、または処理されていない本発明によるPET膜を通ったグルコースで刺激されたラット膵島によるインシュリン分泌。4時間から始まるインシュリン拡散の開始と、24時間で、表面処理によって改善されていると考えられる透過性が観察された。 ヘパリン、EC、およびHPMCで処理された、または処理されていない本発明によるポリ(エチレンテレフタレート)(PET)膜またはポリカーボネート(PC)膜を移植して30日後に調製した切片の画像。2つのタイプの膜について、表面処理によって線維症および細胞浸潤(黒色の矢印)が減り、血管新生(*)が増える。 ブタに移植して15日後のバイオ人工臓器の外観。装置の一方は、単層PC膜で構成され、他方は多層PET膜で構成される。PC膜を有する装置は広範囲の引裂きを示す。多層PET膜を有する装置は、これに関する限り巨視的損傷を全く示さない。従って、この多層PET膜を走査型電子顕微鏡によって分析し、微細な亀裂がないことが証明された。
実施例1:半透膜の製造
膜は、「トラックエッチング」プロセスによって2つの多孔性PET(ポリ(エチレンテレフタレート))層が生体適合性PETフィルムから調製され、その後に、密度が30〜60g/m2の不織PET層が積層される(2つの多孔性生体適合性PET層の間に置かれる)ように製造される。接着剤を用いずに熱積層を行う。一方の多孔性PET層は、細孔2.109〜7.109個/cm2の細孔密度を有し、細孔内径10〜30nmを有する。この膜の厚さは8〜12μmである。他方の多孔性PET層は、細孔107〜5.107個/cm2の細孔密度を有し、細孔内径400〜600nmを有する。この膜の厚さは30〜50μmである。膜の全厚は200μm未満である。
実施例2:膜の表面処理
実施例1に従って調製した膜を、WO2012/017337の実施例1のプロトコールに従って表面処理に供した。
この膜を、エチルセルロース(EC)溶液と混合したヘパリンの第1の層で機能付与し、次いで、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース(HPMC)層で覆う。
実施例3:膜透過性の特徴決定
前記で調製した膜のグルコース透過性、インシュリン透過性、および免疫グロブリン(IgG)透過性を以下のプロトコールに従って試験した。
材料
透過性を試験することが望まれる膜で隔てられた上部区画および下部区画からなる拡散チャンバー(2つの区画の間の耐漏えい性はシールによってもたらされる)、グルコース(Fischer Scientific, lllkirch, France, ref: G/0500/53)、NaCl、IgG(Sigma, Lyon, France, ref: I9640)、インシュリン(Sigma, ref: I9278)、蒸留水。
溶液の調製
・生理食塩水
1lの場合、NaCl 9gを蒸留水1lに溶解する。
・グルコース(4g/l)
1lの場合、グルコース4gを生理食塩水1lに溶解する。
・IgG(5.75μg/ml)
60mlの場合、IgG原液(10mg/ml)34.5μlを生理食塩水59.966mlで希釈する。
・インシュリン(100μg/ml)
60mlの場合、インシュリン原液(10mg/ml)60μlを生理食塩水59.960mlで希釈する。
プロトコール
生理食塩水3mlを拡散チャンバーの下部区画に導入し、空気の泡が存在しないようにしながら、透過性を試験することが望まれる膜を生理食塩水の上に置く。グルコース溶液3mlを上部区画に導入し、次いで、拡散チャンバーをパラフィルムで塞ぎ、37℃でインキュベートする。
インキュベーション時間の終了時に、拡散チャンバーの上部区画に含まれる溶液1mlを穏やかにホモジナイズした後に取り出す。次いで、膜を取り出し、下部区画の溶液1mlをホモジナイズした後に取り出す。
グルコースの酵素アッセイ法は、Glucose RTU(登録商標)キット(BioMerieux, Craponne, France ref: 61 269)を用いて行う。インシュリンおよびIgGは、ビシンコニン酸(bicinchonic acid)(BCA)法を用いてQuantipro BCA Assayキット(Sigma, ref: QPBCA-1KT)によってアッセイする。結果を、以下の通り算出したパーセント透過性で表した。
透過性(％)=(C下部区画/C上部区画+C下部区画)×100
C:グルコース、IgG、またはインシュリンの濃度。
平衡状態では、上部区画および下部区画における濃度は同一であり、これは50％の最大透過性に相当する。
結果
結果を図1に示した。ECと混合したヘパリンの層とHPMC層を有する、本発明(実施例1)による多層ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)膜と、ポリカーボネートで作製されたWO02/060409またはWO2012/017337に記載の先行技術膜も試験した。
PET膜を用いてインシュリンおよびグルコースのゆっくりとした拡散が観察された。この理論に拘束されるつもりはないが、これは、PET膜を構成している多層の存在が原因である可能性がある。
PET膜はIgGに対して完全に不透過性である。
実施例4:半透膜移植試験
WO2012/017337の実施例3に記載のプロトコールに従って、膜を健常なウィスターラットの腹膜腔に移植する。
しかしながら、試料の採取に関連するプロトコールを改良した。以下のとおり試料を採取する。
組織試料の採取
使用溶液
- 超純水で10倍に希釈した25％グルタルアルデヒド(Sigma, ref: G5882-10×10ml)からフード下で調製した2.5％グルタルアルデヒド。
- PBS(参照: Gibco-14190-094)。
- 4％パラホルムアルデヒドで予め満たしたポット(Labonord, ref: PFFOR0060AF59001)。
試験した膜は、ヘパリン、EC、およびHPMCを付着させるために任意で表面処理した、本発明によるPET膜(多層)、および先行技術のPC膜である。
結果を図3に示した。2つのタイプの膜について、ヘパリンによる表面処理によって線維症および細胞浸潤(黒色の矢印)が減り、血管新生(*)が増えることが観察された。
実施例5:膜を通過したグルコースによる島刺激の試験
(a)ラット膵島の単離
使用動物
使用した動物は、体重250〜300gの雄ウィスターラット(Janvier Laboratory, Le Genes St. Ile, France)である。温度23±1℃、湿度55±3％、明期12時間および暗期12時間のサイクルで標準的な集合ケージ(collective cage)にラットを入れる。SAFE-A04餌(Villemoisson-sur-Orge, France)と水は自由に摂取させる。この動物実験を欧州指令2010/63/EUに従って行う。
膵臓の取り出し
2.7mlのRompun(登録商標)(活性成分: 2％キシラジン, Centravet ref: ROM001)を加えたImalgene 1000(登録商標)(活性成分: ケタミン, Centravet ref: IMA004)の混合物を体重100gあたり100μlの用量で腹腔内注射することによって動物を麻酔する。
動物の反射が無くなったことが確かめられた後に、動物を仰向けにして寝かせる。次いで、開腹手術を行い、胆管を十二指腸の開口部で結紮する。次いで、肝臓の開口部にカテーテルを挿入し、動物を放血によって屠殺する。4℃の1mg/mlコラゲナーゼXI型(Sigma, ref: C7657)10mlをカテーテルによって膵臓に注射する。
次いで、膵臓を取り出し、3.75mlの滅菌「灌流溶液」が入っている50ml Falconチューブに入れる。この溶液は、500mlのHBSS(ハンクス平衡塩類溶液, Lonza, ref: BE10-527F)、2.1mlの8.4％重炭酸ナトリウム、1.175mlの1M塩化カルシウム、および12.5mlの1M HEPESで構成される。取り出しの最中に酵素の働きを制限するために、膵臓が入っているチューブを氷中で保管する。
消化
膵臓を取り出したらすぐに、チューブを37℃のウォーターバスに10分間入れる。次いで、組織を十分に解離するために数秒間、勢いよく攪拌する。次いで、これを冷たい洗浄溶液と混ぜ合わせる。洗浄溶液は、0.35g/lの重炭酸ナトリウム(Sigma, ref: S-5761)と10％のウシ胎仔血清(FCS, Lonza, ref: DE14-801F)と1％の抗真菌抗生物質(AMAB, Fisher, ref: W3473M)を加えたM199(Sigma, ref: M0393-50L)で構成される。
チューブの内容物をインサート(Corning Netwellインサート, Sigma, ref: CLS3480)で濾過し、濾液を200ml Corningチューブに移し、1200rpm、4℃で1分間、遠心分離する。次いで、上清を取り除き、ペレットを冷たい洗浄溶液で再懸濁し、次いで、50ml Falconチューブに移す。1200rpm、4℃で1分間、遠心分離した後に、最大限の量の上清を取り除いた後に、精製工程に移る。
精製
実験室で調製した密度の異なる3種類の溶液:1.108(Ficoll1):1.108、1.096(Ficoll2):1.096、および1.069(Ficoll3):1.069で構成されるFicoll(Fisher, ref: BP525-500)の非連続勾配を用いて島の精製を行う。
細胞ペレットを12mlのFicoll1、10mlのFicoll2に再懸濁し、次いで、Ficoll3を上部に注意深く添加した。最後に、Ficoll3の上に5mlのPBS(Fisher, ref: 20012-019)を置く。集まったもの全て400rpm、4℃で4分間、次いで、2000rpm、4℃で12分間、遠心分離する。勾配を乱さないように遠心機のブレーキ速度および加速速度を最低限に調整する。
Ficoll2とFicoll3との間の境界面において島を回収し、次いで、微量のFicollを除去するために冷たい洗浄溶液で3回洗浄する。
培養
10％のFCS(Lonza, ref: DE14-801F)および1％のAMAB(Fisher, ref: W3473M)を含有するM199培地(Gibco, ref: 23340-020)が入っている未処理25cm2フラスコ(Dutscher, ref: 690195)に島を入れて5％CO2の湿度が高い雰囲気中で37℃で24時間培養する。
(b)刺激試験
一方の端にPET膜が取り付けられているインサート(円柱型)中に、10個のラット島を入れる。この膜は、ナノ多孔性膜(内径が10〜50nmであり、150kDaまでの分子を選択する細孔を有する)がインサートの内側にあり、ラット島と接触するように向けられ、400〜600nmの直径を有する細孔を有する層がインサートの外側に向けられている。
インサートには、10％のFCSおよび2.5mMのグルコースを含有するクレブス液400μlが入っている。このように満たされたインサートを、10％のFCSおよび25mMのグルコースを含有するクレブス液1mlが入っている24ウェルプレートのウェル中に入れる。次いで、24ウェルプレートを37℃でインキュベートし、ウェル中に入っている培地試料を1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、および24時間で採取する。次いで、ELISA法(Mercodia, ref: 1250-01)を用いて試料中のインシュリンをアッセイする。
総タンパク質を抽出するために、島をサンプリングして、プロテアーゼインヒビター(ThermoScientific, ref: 78441)を追加した溶解緩衝液(ThermoScientific, ref: 78501)50μlにも入れる。抽出は、試料を定期的にボルテックスしながらチューブを氷上に30分間置くことによって行う。島の総タンパク質内容物をブラッドフォードアッセイによって確かめ、様々な島培養間のインシュリン分泌を基準化するのに使用する。
実施例7:ブタにおけるMAILPAN(登録商標)の移植および外植
WO2012/010767に記載の方法に従って、カプセル化チャンバー(MAcro-encapsulation d'lLots PANcreatiquesのMAILPAN(登録商標)[膵島のマクロカプセル化])を調製する。2つの半透膜を溶着して一緒にする。このカプセル化チャンバーには内部シートがあり、コネクタもある。
麻酔
あらゆる麻酔の前の前投薬は計画的であり、前投薬はブチロフェノン:2mg/kgアザペロン(Stresnil*)および10mg/kgケタミン(Imalgene*)の組み合わせの筋肉内投与からなる。
下記のプロトコールに従って全身麻酔を行う。
- 動物を前投薬した状態で手術区画(operating block)まで連れてきて、手術台の上に置いて横向きに寝かせる。
- 片耳の末梢静脈にカテーテル(G22)を挿入し、その透過性を、0.9％NaCl溶液でリンスすることによって確保する。
- 催眠剤(5mg/kgチオペンタールまたは4mg/kgプロポフォール)およびクラーレ麻酔剤(curarising agent)(0.1mg/kgパンクロニウム)を静脈内注射することによって誘導を行う。この直後に、経口気管内挿管(Portex Blue Line, 低圧バルーン, 体重が25〜35kgの対象の場合、キャリブレ(calibre)6)と、制御圧力モードで動作する人工呼吸器と接続した半閉鎖循環システムを用いた肺換気を行う。35〜45mmHgのETCO2を維持するように換気(FiO2=0.5 FiN2O=0.5)を調整する。人工呼吸器は、最新の流速制御装置、圧力制御装置、および容積制御装置が取り付けられた最新世代の人間用装置(GE Avance*、Aisys*、またはAespire*)である。
- イソフルラン(吸入割合=2vol％)を用いて吸入モードで麻酔を維持する。2l/minの新鮮ガス流速の50％/50％O2/N2O混合物がベクターガス(vector gas)として働く。
- 必要だと分かったら、これに続く用量のパンクロニウムを投与することによって、深呼吸吸入麻酔(deep inhalation anaesthesia)の適用範囲の下で最適な筋肉弛緩を行う(純粋O2中のイソフルランのMAC=1.15vol％およびN2OのMAC=110vol％。
MAILPAN(登録商標)移植
動物を麻酔した後に、(低体温を引き起こさないように注意して)眠らせた動物の腹部を70％エタノール、次いで、ベタジンを用いて無菌状態にし、メスの刃を用いて剃毛する。きれいにした区画の真ん中で、皮膚および筋膜面(muscle plane)を約10〜15センチメートル縦方向に腹膜に達するまで切開する。正中開腹後、プロトタイプに生理食塩水を満たした後にプロトタイプを腹膜腔外に移植し、糸(Vicryl 2/0)で壁に取り付ける。MAILPANの2つのカテーテル(一方は充填するために使用し、他方は、移植後の期間にMAILPANにおいて島を空にするために使用する)を、皮下に入れた2つの注射チャンバーに接続した後に、4-0縫合糸を用いて正弦波の動きで腹膜を結紮する。
外科手術の終了時に、傷にNaropeinを染み込ませ、フェンタニルをIV投与した後に、動物を起こす。手術ごとにフェンタニル顆粒を2mg/kgの割合で食物摂取と共に投与する。
MAILPAN(登録商標)外植
MAILPANの機械的強度、その無菌性、およびその生体適合性(表面における血管新生、炎症がないこと、周囲組織に線維症および炎症がないこと)を評価するために、移植して15日後および60日後に全身麻酔下でMAILPAN装置を外植する。従って、後で組織学的試験を行うために、装置を外植するたびにMAILPANを取り囲んでいる組織の試料を採取する。外植するたびにKClの静脈内注射によってブタを屠殺する。
ラットと同じ条件下で組織試料を採取する(実施例5を参照されたい:組織用および膜用の同じ溶液。同じ分析を行う)。
実施例8:走査型電子顕微鏡による膜の分析
サンプリング後、膜を超純水でリンスし、2.5％まで希釈したグルタルアルデヒド(Sigma,ref:G5882)中4℃で24〜48時間固定する。次いで、固定した膜を超純水で10分間リンスする。
次いで、試料を、連続したエタノール浴:50％エタノールで10分間の浴を2回、70％エタノールで25分間の浴を1回、次いで、95％エタノールで10分間の浴を1回、最後に、100％エタノールで10分間の浴を2回、使用して脱水する。試料にまだ存在する可能性がある微量の水を完全に除去するために、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)(Sigma, ref: 440191)中で2分間のインキュベーションを行う。
屋外で乾燥させた後、次いで、炭素導電性接着剤 (Delta Microscopies, ref: 76510)を用いて、試料をブロック(Delta Microscopies, ref: 75220)上で平らになるように接着剤で結合する。
接着剤が固まったら、金-パラジウム、次いで、炭素の薄い層を付着させることで試料を金属化する。
観察は電界効果走査型電子顕微鏡(SEM)(Hitachi S800)(Neurochemistry Centre of Strasbourgのインビトロイメージングプラットフォーム)において5KVの電圧で行う。これにより、試料を傷つけることなく良好な分解能を得ることが可能になる。
結果
PC膜を用いて作製された装置は広範囲の引裂きを示すことが観察された(図4)。
他方で、多層PET膜を用いて作製された装置は、これに関する限り巨視的損傷を全く示さない。従って、この膜を走査型電子顕微鏡によって分析し、微細な亀裂がないことが証明された(図4)。
従って、本発明による膜は、先行技術の膜に観察された拡散と同様の拡散を可能にし、はっきりと半透性を有する(IgGおよび免疫系の他のタンパク質をブロックする)と考えられる。これらの膜は、生体内移植されたバイオ人工臓器内で用いられた場合に、かなり優れた耐性を示す。
PET膜のインビトロでの引っ張り強さについてさらなるデータが得られた。この強さは、3層膜(2つの多孔性PET膜が不織PET膜を取り囲んでいる)の方が2層膜(1つの多孔性PET膜が1つの不織PET膜上に積層されている)よりわずかに大きい。2層膜の引っ張り強さは単層多孔性PET膜の引っ張り強さより大きい。

Claims (16)

  1. 治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞を収容できる空間を区切っている半透膜で作製された密閉シェルを備える、該治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞をカプセル化するためのチャンバーであって、該膜が、2つの多孔性生体適合性ポリマー層の間に位置している1つの生体適合性不織ポリマー層を含むことを特徴とする、チャンバー。
  2. 前記不織ポリマーが、ポリカーボネート(PC)、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリプロピレン(PP)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(塩化ビニル)(PVC)、ポリアミド、およびポリエチレン(PE)より選択されることを特徴とする、請求項1に記載のカプセル化チャンバー。
  3. 少なくとも1つの層の前記多孔性生体適合性ポリマーが、ポリカーボネート(PC)、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリプロピレン(PP)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(塩化ビニル)(PVC)、ポリアミド、およびポリエチレン(PE)より選択されることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  4. 少なくとも1つの多孔性生体適合性ポリマー層または前記2つの多孔性生体適合性ポリマー層が、表面の物理修飾または化学修飾によって親水性にされており、かつ少なくとも1種類の親水性ポリマーで覆われていることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  5. 前記多孔性生体適合性ポリマー層、または、前記2つの多孔性生体適合性ポリマー層の一方が、細孔106個/cm2〜細孔1011個/cm2の細孔密度を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  6. 前記膜の全厚が45μm〜200μmであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  7. 前記膜が単一の多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合にこの層が5μm〜100μmの厚さを有し、かつ、該膜が2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合に一方の該生体適合性ポリマー層の厚さが5〜40μmでありかつ他方の該生体適合性ポリマー層の厚さが25〜100μmであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  8. 前記膜が単一の多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合にこの生体適合性ポリマー層上に存在する細孔の内径が5〜100nm、最も好ましくは5〜90nmであること、および、該膜が2つの多孔性生体適合性ポリマー層を有する場合に一方の該生体適合性ポリマー層上に存在する細孔の内径が5〜100nmでありかつ他方の該生体適合性ポリマー層上に存在する細孔の内径が100〜2000nm、好ましくは200〜1000nmであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  9. 少なくとも1つの層が、少なくとも1種類の生物活性分子を含む親水性ポリマーで覆われていることを特徴とする、請求項4〜8のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  10. 前記シェルに含まれる生体適合性シートも備え、かつ該シートがその表面に突起部を任意で含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  11. 前記膜が、2つの生体適合性ポリマー層を含み、前記シェルの外側にある該層が、100〜2000nmの内径を有する細孔を有し、かつ該シェルの内側にある該層が、5〜100nmの内径を有する細孔を有することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  12. 前記シェルの外側と内側との連絡を確立することを可能にさせる少なくとも1つのコネクタを備えることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  13. 円形でありかつ3cm〜20cmの直径を有することを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバー。
  14. 請求項1〜13のいずれか一項に記載の少なくとも1つのカプセル化チャンバーを備え、治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞が該カプセル化チャンバー中に存在することを特徴とする、バイオ人工臓器。
  15. インシュリン分泌細胞またはランゲルハンス島を含むバイオ人工膵臓であることを特徴とする、請求項14に記載のバイオ人工臓器。
  16. 治療的関心対象の少なくとも1種類の物質を産生する分泌細胞を受容することを目的とした密閉パウチを形成するように、少なくとも1つの多孔性生体適合性ポリマー層と1つの不織生体適合性ポリマー層とを含む1つまたは2つの膜を熱溶着する工程を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のカプセル化チャンバーを得るための方法。
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