JP6409190B2 - 米糠加水分解物を製造する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、限定タンパク質分解で、(好ましくは脱脂)米糠からタンパク質を穏やかに抽出する方法に関する。米糠は、限定タンパク質分解を受ける前に洗浄される。
農作物原料のタンパク質抽出は、タンパク質それ自体の溶解度、またはそれらとマトリックス中のその他の構成物との相互作用によって妨げられ得る。次に溶解度それ自体も、タンパク質収集前の加工段階によって影響を受ける。例えば、材料の脱脂は、タンパク質の溶解度を大幅に低下させる。そのため、タンパク質分解技術が適用されて、タンパク質の溶解度を増大させ、ひいてはタンパク質抽出収率を増大させる。タンパク質分解酵素の使用は、ほとんどが、高度な加水分解のために苦味のある製品をもたらし、食品中の用途が限定される。
本発明は、50重量%(乾物基準)を超える(ポリ)ペプチドを含んでなり、少なくとも10%、好ましくは10〜16%のDH(加水分解度)を有し、90%を超える、好ましくは95%を超える(ポリ)ペプチドが、500Daを超える分子量(MW)を有する、(好ましくは脱脂)米糠加水分解組成物を提供する。
−好ましくは水である水性液体を(好ましくは脱脂)米糠に添加するステップと;
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%、好ましくは12〜30重量%の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−好ましくは6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−酵素インキュベーションを30〜80℃、好ましくは45〜65℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、(好ましくは脱脂)米糠加水分解組成物を製造する方法が提供され、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
−好ましくは水である水性液体を(好ましくは脱脂)米糠に添加するステップと;
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%、好ましくは12〜30重量%の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−好ましくは6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−酵素インキュベーションを30〜80℃、好ましくは45〜65℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、50重量%(乾物基準)を超えるタンパク質含有量を有する、(好ましくは脱脂)米糠加水分解組成物を製造する方法を提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
−好ましくは水である水性液体を(好ましくは脱脂)米糠に添加するステップと;−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%、好ましくは12〜30重量%の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−好ましくは6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−酵素インキュベーションを30〜80℃、好ましくは45〜65℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる(好ましくは50重量%(乾物基準)を超えるタンパク質含有量を有する)(好ましくは脱脂)米糠加水分解組成物を製造する方法にも関し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと;
−前記米糠を前記水性液体と共に、少なくとも0.5分間、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも5分間、好ましくは少なくとも20分間、より好ましくは少なくとも60分間インキュベートするステップと;
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%、好ましくは12〜30重量%の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−好ましくは6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−酵素インキュベーションを30〜80℃、好ましくは45〜65℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物(好ましくは50重量%(乾物基準)を超えるタンパク質含有量を有する)を製造する方法を提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと;
−前記米糠を前記水性液体と共に、4〜80℃の温度、好ましくは室温で、少なくとも0.5分間、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも5分間、好ましくは少なくとも20分間、より好ましくは少なくとも60分間インキュベートするステップと;
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%、好ましくは12〜30重量%の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−好ましくは6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−酵素インキュベーションを30〜80℃、好ましくは45〜65℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物(好ましくは50重量%(乾物基準)を超えるタンパク質含有量を有する)を製造する方法を提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと;
−前記米糠を前記水性液体と共に、4〜80℃の温度、好ましくは室温で、少なくとも0.5分間、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも5分間、好ましくは少なくとも20分間、より好ましくは少なくとも60分間混合するステップと;
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%、好ましくは12〜30重量%の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−好ましくは6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−酵素インキュベーションを30〜80℃、好ましくは45〜65℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物(好ましくは50重量%(乾物基準)を超えるタンパク質含有量を有する)を製造する方法を提供し、
酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
−好ましくは水である水性液体を米糠に添加するステップと;
−前記米糠を前記水性液体と共に、4〜80℃の温度、好ましくは室温で、および4〜8のpH範囲で、少なくとも0.5分間、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも5分間、好ましくは少なくとも20分間、より好ましくは少なくとも60分間インキュベートし、好ましくは混合するステップと;
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%、好ましくは12〜30重量%の濃度を有する洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−好ましくは6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−酵素インキュベーションを30〜80℃、好ましくは45〜65℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に液体を固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物(好ましくは50重量%(乾物基準)を超えるタンパク質含有量を有する)を製造する方法をさらに提供し、酵素または酵素組成物は、エンドプロテアーゼを含んでなる。
[材料]
脱脂米糠(DRB)は市販され、最初に55〜65℃の高温で1時間以内にヘキサン抽出し、それに続いて105〜110℃で残留ヘキサンを除去する、いわゆる焙煎ステップによって、未加工米糠から得られ得る。酵素Maxazyme NNP DS(登録商標)はDSM(The Netherlands)製の市販品であり、メタロプロテアーゼである。
EDTA:分析用(>純度99.7%)、Merck KGaA Darmstadt、Germany。
クエン酸:分析用(純度99%)、Merck KGaA Darmstadt、Germany。
タンパク質含有量は、AOAC公定法991.20ミルク中(総)窒素、に記載されるケルダール法によって判定した。6.25の換算係数を使用して、タンパク質の量(%(w/w))を判定した。
総炭水化物は、NREL(National Renewable Energy Laboratory)のNREL/TP−510−42618法の修正法によって定量化した。この方法とは対照的に、加水分解後の遊離単糖類の検出は、内標準としてマレイン酸を使用する、定量NMR(QNMR)の手段によって得た。NMRスペクトルは、5mm凍結探針を装着したBruker Avancelll 600MHz NMRシステム上で記録した。探針の温度は280Kに設定した。
ペプチドパターンは、SDS−PAGEによって視覚化した。SDS−PAGEおよび染色のために使用した全ての材料は、Invitrogen(Carlsbad,CA,US)から購入された。製造会社の使用説明書に従ってSDS緩衝液を用いて、試料を調製し、製造会社の使用説明書に従ってMES−SDS緩衝系を用いて、12%Bis−Trisゲル上で分離した。Simply Blue Safe Stain(Collodial Coomassie G250を用いて、染色を実施した。
2%(w/w)のタンパク質濃度でタンパク質粉末を溶解し、タンパク質溶液を調製した。4M HClまたは4M NaOHで、pHを4、6.8または8.0に調節した(追加的な塩の添加はなかった)。
2%(w/w)のタンパク質濃度でタンパク質粉末を溶解し、タンパク質溶液を調製した。4M HClまたは4M NaOHで、pHを4、6.8または8に調節した。気泡は、100gタンパク質溶液を1分間激しく泡立てることで、生じさせた(1Lビーカー内、18,000rpmの4枚の回転羽根付きWarningブレンダー)。気泡生成後、気泡/液体内容物を250mlシリンダーに移し入れた。タンパク質の起泡能力は、気泡調製の30秒後に、気泡容積を測定することで判定した。気泡安定性は、気泡調製の30分後の気泡容積と定義された。
乾物含量は、赤外線法を用いて105℃で判定した。
加水分解度は、迅速OPA試験によって判定した(Nielsen,P.M.,Petersen,D.,Dambmann,C.,Improved method for determining food protein degree of hydrolysis,Journal of Food Science 2001,66,642−646)。使用されたケルダール係数は、6.25であった。
試料を既知量の0.1N HCL溶液に溶解した。この溶液の100μLをアミノ酸の同位体標識アナログを含有する内標準(IS)溶液と混合し、共溶出ペプチドからのイオン抑制効果について補正した。この試料/IS溶液の10μLを70μLのWatersホウ酸塩緩衝液および20μLのWaters誘導体化試薬と混合した。混合後、溶液を55℃で10分間加熱した。1μLをUPLC−MS/MSシステム上に注入した。
WatersからのaXevoTQ質量分光計と組み合わされた、超高圧液体クロマトグラフ上で、分析を実施した。カラムは、43℃で0.4ml/分の流速で作動する、Waters BEHC18カラム(150×2.1mm、1.7μ)であった。watersからの移動は、AccQ−Tag溶出剤AおよびAccQ−Tag溶出剤Bと称される。表1に記載の勾配を適用した。
ジおよびトリペプチド量は、以下の方法に従って判定した。
−既知濃度の10種の異なるジペプチドと10種の異なるトリペプチドとの混合物の質量分析法(MS)による分析
−提供された試料のMSによる分析:1mlの試料溶液(2mg/ml)を3kDスピンカラム上で遠心分離して、濾液を分析した。
−ブランク試料(MQ)の分析
ジおよびトリペプチドの混合物は、以下のペプチドを含有した:
ジペプチド:
GC、AG、FG、GP、RW、WL、VP、KK、AA、FL
トリペプチド:
WGP、GGP、YPP、LAL、LAV、EGP、LAK、LAW、VPL、NPI
(アミノ酸については1文字略号を使用した)
200mgの米糠加水分解組成物試料を10mLのメスフラスコに二連で量り入れ、MQ水で最大容積にした。磁気撹拌機によって、この懸濁液を室温で30分間、900rpmで混合した。
[実施例1]
15℃の1530グラムの飲料水(15重量%)中の270グラムのDRB(脱脂米糠)を、15℃で1時間のインキュベーション中に十分に混合した。1時間のインキュベーション後、遠心分離によって、S/L分離を実施した(スイングローター付きSorvall Evolution RC遠心分離機を5000RCFで5分間使用した)。1187グラムの上清が除去された。613グラムの固体を1140グラムの飲料水に50℃で溶解した。0.75mlのMaxazyme NNP DS(登録商標)(4ml/kgの乾燥DRB)を添加して、pH7.2、50℃で2時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、0.38mlのMaxazyme NNP DS(2ml/kgの乾燥DRB)をもう一度添加した。合計で2時間のインキュベーション後、S/L分離を再度実施した。1258グラムの上清を収集し、タンパク質含有量、乾物含量、および加水分解度について分析した。結果:
50℃の1530グラムの飲料水(15重量%)中の270グラムのDRB(脱脂米糠)を、50℃で1時間のインキュベーション中に十分に混合した。1時間のインキュベーション後、遠心分離によって、S/L分離を実施した(スイングローター付きSorvall Evolution RC遠心分離機を5000RCFで5分間使用した)。1133グラムの上清が除去された。572グラムの固体の内、523グラムを1056グラムの飲料水に50℃で溶解した。0.75mlのMaxazyme NNP DS(4ml/kgの乾燥DRB)を添加して、pH7.2、50℃で2時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、0.38mlのMaxazyme NNP DS(2ml/kgの乾燥DRB)をもう一度添加した。合計で2時間のインキュベーション後、S/L分離を再度実施した。991グラムの上清を収集し、タンパク質含有量、乾物含量、および加水分解度について分析した。結果:
10℃の1530グラムの飲料水(15重量%)中の270グラムのDRB(脱脂米糠)を、10℃で1時間のインキュベーション中に十分に混合した。1時間のインキュベーション後、遠心分離によって、S/L分離を実施した(スイングローター付きSorvall Evolution RC遠心分離機を5000RCFで5分間使用した)。1142グラムの上清が除去された。616グラムの固体の内、579グラムを772グラムの飲料水に50℃で溶解した。0.79mlのMaxazyme NNP DS(4ml/kgの乾燥DRB)を添加して、pH7.2、50℃で2時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、0.4mlのMaxazyme NNP DS(2ml/kgの乾燥DRB)をもう一度添加した。合計で2時間のインキュベーション後、S/L分離を再度実施した。797グラムの上清を収集し、タンパク質含有量、乾物含量、および加水分解度について分析した。結果:
さらなる実施例では、分析を実施して、異なる構成物に関して、洗出し材料を分析した。
本実施例では、次の水溶液による脱脂米糠の洗浄が示された。1重量%のTitriplex III.2aq(EDTA、Merck)1重量%クエン酸ナトリウム.2aq(Merck)、pH補正なし(pH6.5の懸濁液を生じた)、pH4(HCl補正)、およびpH2(HCl補正)。
Claims (5)
- −水を米糠に添加するステップと;
−固体画分から液体を分離して、洗浄固体画分を得るステップと;
−酵素または酵素組成物を5〜30重量%の濃度を有する前記洗浄固体画分懸濁液に添加するステップと;
−6〜8のpHで酵素インキュベーションを実施するステップと;
−前記酵素インキュベーションを10〜16%DH(加水分解度)の加水分解度まで実施するステップと;
−前記酵素インキュベーションを30〜80℃の温度で実施するステップと;
−任意選択的に前記液体を前記固体画分から分離するステップと
を含んでなる、米糠タンパク質加水分解物組成物を製造する方法であって、前記酵素または酵素組成物が、バシロリシン(EC3.4.24.28)を含んでなる、方法。 - 前記米糠が、脱脂米糠である、請求項1に記載の方法。
- 前記水を米糠に添加するステップと前記洗浄固体画分を得るステップの間に、前記米糠が、前記水と共にpH4〜8でインキュベートされる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記水を米糠に添加するステップと前記洗浄固体画分を得るステップの間に、前記米糠が、前記水と共に4〜80℃の温度でインキュベートされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水を米糠に添加するステップと前記洗浄固体画分を得るステップの間に、前記米糠が、前記水と共に少なくとも0.5分間インキュベートされる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
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