JP6400882B2

JP6400882B2 - 特定カカオポリフェノールを有効成分とする血糖値コントロール剤、および、特定カカオポリフェノールの製造方法

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Publication number: JP6400882B2
Application number: JP2012273125A
Authority: JP
Inventors: みどり夏目; 正明岡部; 均芦田; 山下　陽子; 陽子山下
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2018-10-03
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: JP2014118369A

Description

本発明は、４量体以上のカカオポリフェノールを有効成分とし、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のカカオポリフェノールを実質的に含有しない血糖値コントロール剤に関する。また、本発明は、特定カカオポリフェールの製造方法にも関する。

過去に「プロシアニジンに血糖値上昇抑制効果がある」ことが報告されている（例えば、特開平９−２９１０３９号公報等）。このため、プロシアニジンは、血糖値コントロール剤等の有効成分として活用されている。そして、プロシアニジンは、例えば、カカオから抽出することができる（例えば、特表２００３−５８５１１１号公報）。なお、プロシアニジンとは、ポリフェノールの一形態である。

特開平９−２９１０３９号公報特表２００３−５８５１１１号公報

ところで、近年、従前の血糖値コントロール剤等よりも効率よく血糖値をコントロールすることができる血糖値コントロール剤等が求められている。

そこで、本発明の課題は、従前のプロシアニジンを有効成分とする血糖値コントロール剤等よりも効率よく血糖値をコントロールすることができる、特定ポリフェノールを有効成分とする血糖値コントロール剤等を提供することにある。

本発明に係る血糖値コントロール剤は、４量体以上のカカオポリフェノール混合物を有効成分とし、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のカカオポリフェノールを含有しない。ただし、これは、血糖値コントロール剤がカテキン、エピカテキンおよび３量体以下のプロシアニジンを「実質的に」含有しないことを意味する。つまり、この血糖値コントロール剤は、「カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のポリフェノールの総質量」に対する「４量体以上のポリフェノール混合物の総質量」の比が９以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１１以上、さらに好ましくは１２以上であるポリフェノール混合物と言い換えることもできる。なお、この比の上限は無限大（∞）であり、この比が高ければ高い程に好ましいが、例えば、この比の上限は１００である。そして、本発明に係る血糖値コントロール剤は、体内インクレチン産生促進剤でもある。なお、ここにいう「カカオポリフェノール」はカカオ由来のポリフェノールである。また、ここにいう「ポリフェノール」は、プロシアニジンであることが好ましい。さらに、この４量体以上のカカオポリフェノール混合物は、乾燥物基準で１日あたり１ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以上で経口投与することが好ましい。そして、この血糖値コントロール剤は、飲食品やサプリメントに添加することができる。

本発明に係る血糖値コントロール剤は、３量体以下のカカオポリフェノールの含有率が１０質量％以下である。なお、３量体以下のカカオポリフェノールの含有率は９質量％以下であることが好ましく、８質量％以下であることがより好ましく、７質量％以下であることがさらに好ましく、６質量％以下であることが特に好ましく、５質量％以下であることが最も好ましい。

また、上述の有効成分は、「シリカ基材にグリセロプロピル基を化学結合させた粒子状ゲルを充填剤とする内径が８．０ｍｍ、長さが１００ｍｍのカラム」に、アセトニトリルおよびメタノール水溶液（９７質量％）を、メタノール水溶液（９７質量％）の質量割合が０質量％（０分）、２０質量％（４〜９分）、４０質量％（１３〜１８分）、０質量％（２０〜３０分）となるグラジエント条件下にて、２．４ｍＬ／分の流速で送液する高速液体クロマトグラフィー装置において、カカオエキスの原料液（４５ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬで注入した後の１６分から３０分までの間、より好ましくは１７分から２５分までの間に流出する画分を分取することにより得られることを例示することができる。なお、この画分から溶媒を除去して、画分中の成分を濃縮および／または乾燥させてもよい。

また、上述の有効成分は、「シリカ基材にグリセロプロピル基を化学結合させた粒子状ゲルを充填剤とする内径が５．０ｍｍ、長さが１００ｍｍのガードカラム」および「シリカ基材にグリセロプロピル基を化学結合させた粒子状ゲルを充填剤とする内径が５．０ｍｍ、長さが３００ｍｍの本カラム」に、アセトニトリルおよびメタノール水溶液（９７質量％）を、メタノール水溶液（９７質量％）の質量割合が０質量％（０分）、２０質量％（２４〜５４分）、４０質量％（７８〜１０８分）、０質量％（１２０〜１８０分）となるグラジエント条件下にて、２０．８ｍＬ／分の流速で送液する高速液体クロマトグラフィー装置において、カカオエキスの原料液（４５ｍｇ／ｍＬ）を１９６０μＬで注入した後の８５分から１５０分までの間、より好ましくは９０分から１３５分までの間に流出する画分を分取することによっても得られることを例示することができる。なお、この画分から溶媒を除去して、画分中の成分を濃縮および／または乾燥させてもよい。

本願発明者らの鋭意検討の結果、本発明に係る血糖値コントロール剤は、従前のものよりも効率よく血糖値をコントロールすることができることが明らかとなった。つまり、本発明に係る４量体以上のポリフェノール混合物を血糖値コントロール剤の有効成分として使用することができる。ただし、この血糖値コントロール剤には、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のカカオポリフェノールが実質的に含まれない。

実施例１に係るゲル濾過分画の結果を示すチャートである。実施例１に係るゲル濾過分画後の各画分に含まれる高重合度プロシアニジンの含有率の解析結果を示すチャートである（ａ）カカオエキス（ＣＬＰｒ），ｂ）低重合画分（ＣＬＰｒ−Ｌ），ｃ）高重合画分（ＣＬＰｒ−Ｈ））。実施例１に係るカカオエキス、高重合プロシアニジンおよび低重合プロシアニジンをそれぞれマウスに投与した場合における各マウスの血中インスリン濃度を比較して表す棒グラフ図である。なお、図中、「Ｗａｔｅｒ」は水を示し、「Ｈｉｇｈ−ＤＰ」はＣＬＰｒ−Ｈを示し、「Ｌｏｗ−ＤＰ」はＣＬＰｒ−Ｌを示す。プロシアニジンＢ２、プロシアニジンＣ１およびシンナムタンニンＡ２をそれぞれマウスに投与した場合における各マウスの血中インスリン濃度を比較して表す棒グラフ図である。なお、図中、「Ｗａｔｅｒ」は水を示し、「ＥＣ」はエピカテキンを示し、「ＰｃＢ２」はプロシアニジンＢ２を示し、「ＰｃＣ１」はプロシアニジンＣ１を示し、ＣＴＡ２はシンナムタンニンＡ２を示す。実施例２に係るゲル濾過分画の結果を示すチャートである。

本発明の実施の形態に係る４量体以上のカカオプロシアニジン（以下「高重合プロシアニジン」ともいう）は、カカオエキスをゲル濾過分画することによって得ることができる。なお、このゲル濾過分画では、溶離液として「酸を含まない溶離液」が使用される。なお、カカオエキスは、市販品等を購入してもよいし、公知の方法によって、カカオ豆・カカオ粉末から抽出してもよい。本発明の実施の形態に用いることができる「カカオ豆」は、産地や生育状況、焙焼の有無等により制限されることはない。

ゲル濾過分画には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）等の公知の手段を用いることができる。なお、実験室規模では操作の容易さや再現性の観点から、ＨＰＬＣを用いることが好ましく、実験室規模と同等の分画効率を得られる範囲において、パイロットプラント規模や実機規模へのスケールアップも可能である。かかる場合、ゲル濾過材の一態様として、順相分離用の「グリセロプロピル基を化学結合させたシリカ粒子」を用いて、極性の低い分子から溶出される（本発明では、重合度が低いポリフェノールから順に溶出される）原理を利用し、ＨＰＬＣ、ＧＦＣ等を実行することが好ましい。

ここにいう「酸を含まない溶離液」とは、溶離液に一般的に添加される酢酸、リン酸、ギ酸、トルフルオロ酢酸等を実質的に含まない溶離液を意味する。なお、本発明の実施の形態では、このような溶離液としては、例えば、アセトニトリル・メタノール等の極性有機溶媒、水、これらの混合溶液が好適に用いられる。なお、「酸を含まない」とは、３量体以下のカカオポリフェノールと４量体以上のカカオポリフェノール（カカオプロシアニジン）とのゲル濾過分画に実質的に影響を及ぼさないことを基準として判断することができる。

本願発明者らの分析の結果、本発明に係る高重合プロシアニジンが、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のプロシアニジンに比べて、インクレチン産生を特異的に促進することが明らかとなった。インクレチンは、血糖値をコントロールする一要因であるインスリンの産生に影響する物質として知られている。このため、本発明に係る高重合プロシアニジンは、血糖値コントロール剤および体内インクレチン産生促進剤の有効成分として使用することができる。なお、かかる場合、本発明に係る血糖値コントロール剤では、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のプロシアニジンを含有しないことが好ましい。ただし、これは、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のプロシアニジンを「実質的に」含有しないことを意味する。つまり、本発明に係る血糖値コントロール剤は、「カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のポリフェノールの総質量」に対する「４量体以上のポリフェノールの総質量」の比が９以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１１以上、さらに好ましくは１２以上であるポリフェノール混合物であると言い換えることもできる。なお、この比の上限は無限大（∞）であり、この比が高ければ高い程に好ましいが、例えば、この比の上限は１００である。

なお、本発明の実施の形態に係る血糖値コントロール剤について、血糖値コントロール効果を有効に発現させるためには、高重合プロシアニジン（乾燥物）を１日あたり１ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以上、好ましくは１日あたり２ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以上、より好ましくは１日あたり５ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以上、さらに好ましくは１日あたり１０ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以上で生体に経口投与することが好ましい。なお、この値の上限は無限大（∞）であり、この値が高ければ高い程に好ましいが、例えば、この値の上限は１日あたり１０００ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以下である。そして、例えば、高重合プロシアニジン（乾燥物）を１包装形態あたり１ｇ以上で含有することが好ましい。

以下に、実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されることはない。また、以下において、「低重合」との用語は、重合度が１以上３以下、すなわち単量体〜３量体であることを意味し、「高重合」との用語は、重合度が４以上、すなわち４量体以上であることを意味する。

＜実施例１＞
（１）原料液の調製
エクアドル原産のカカオエキス（以下「ＣＬＰｒ」ともいう）の濃度が３０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＣＬＰｒをメタノール水溶液（５０質量％）に溶解させた後に、このＣＬＰｒ溶液を、孔径が０．４５μｍの再生セルロース膜で濾過して原料液を調製した。

（２）ゲル濾過分画
高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」ともいう）システムの環境条件を、以下に示すように設定した。そして、上述の原料液を１９６０μＬでＨＰＬＣシステムに注入し、原料液の注入後の４５分から８５分の溶離画分を低重合画分（以下「ＣＬＰｒ−Ｌ」ともいう）とし、原料液の注入後の９０分から１３５分の溶離画分を高重合画分（以下「ＣＬＰｒ−Ｈ」ともいう）として、それぞれ分画採取した（図１参照）。図１に示される通り、本実施例では、３量体と４量体のピークが完全に離れている。このため、ＣＬＰｒ−Ｌには、主にカテキン、エピカテキンならびにそれらの２量体および３量体が含まれ、ＣＬＰｒ−Ｈには、主に４量体以上のプロシアニジンが含まれている。なお、この分画点としては、ＣＬＰｒ-Ｈに可能な限り、カテキン、エピカテキンならびにそれらの２量体および３量体のプロシアニジンが含まれない時点を設定した。

（ＨＰＬＣシステムの環境条件）
・装置：大量分取用液体クロマトグラフィーシステム（島津社製、システム構成：ＬＣ−８Ａ，２台、ＦＣＶ−１３０ＡＬ、ＳＩＬ−１０ＡＰ、ＳＰＤ−２０ＡＶ、ＦＲＣ−１０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア）
・ガードカラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ１００Ｄｉｏｌ−１０５０×１００ｍｍ
・本カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ１００Ｄｉｏｌ−１０５０×３００ｍｍ
・流速：２０．８ｍｌ／分
・検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ
・溶離液：アセトニトリルおよびメタノール水溶液（９７質量％）
・グラジエント：（メタノール水溶液（９７質量％）の質量％）０（０分）、２０（２４〜５４分）、４０（７８〜１０８分）、０（１２０〜１８０分）

（３）各画分に含まれる高重合プロシアニジンの含有率の解析
上述のＣＬＰｒ−ＬおよびＣＬＰｒ−Ｈの各溶離画分をそれぞれ２〜４ｍＬで採取し、遠心エバポレーターにて、それぞれを乾固した。次いで、その乾固した各溶離画分を、１００μＬのメタノール水溶液（５０質量％）で、それぞれ再溶解させて、サンプルとした。

上記の各サンプルを、Ｋｅｌｍらの方法に準拠したプロシアニジン類順相ＨＰＬＣ測定法（Kelm, M.A. et al. J. Agric Food Chem 2006, 54(5); p.1571-1576 参照）を用いて、エピカテキン等量で分析したところ、図２に示される分析チャートおよび表１に示される結果が得られた。

ＣＬＰｒ−Ｈには、４量体以上のプロシアニジンが９０質量％以上で含まれていた。一方、ＣＬＰｒ−Ｌでは、４量体以上のプロシアニジンが検出されなかった。なお、これらのプロシアニジンは、逆相ＨＰＬＣ分析の手法に準じて、エピカテキンで検量線を作成し、各重合度のプロシアニジン濃度をエピカテキン当量として算出することにより定量した。

（４）各画分の収率
上述のＣＬＰｒ−ＬおよびＣＬＰｒ−Ｈの各溶離画分を、エバポレーターで減圧し、有機溶媒を除去して濃縮した。そして、この濃縮された溶離画分を超純水で洗浄しながら金属容器に移し、−８０℃で凍結乾燥させた。そして、各溶離画分の重量を秤量して、ＣＬＰｒ−ＬおよびＣＬＰｒ−Ｈの各収率を求めたところ、ＣＬＰｒ−Ｌの収率は３３％であり、ＣＬＰｒ−Ｈの収率は４０％であった。

＜各溶離画分の血糖値コントロール作用の確認＞
（１）生体に対する各画分の血中インスリン濃度の測定
４週齢雄性ＩＣＲ−マウスを一晩（１８時間）絶食させた後に、そのマウスを検体Ａ、検体Ｂおよび検体Ｃに区分した。そして、検体Ａに上述のＣＬＰｒを、検体ＢにＣＬＰｒ−Ｌを、検体ＣにＣＬＰｒ−Ｈを、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗずつで経口投与した。次いで、投与から６０分後に、各検体を屠殺してから、各検体の心臓から血液を採取した。そして、各検体の血液を凝固させて血漿を採取した。

次に、インスリン測定キット（株式会社シバヤギ製，レビス（登録商標）インスリンマウスキット）を用いて、各検体から得られた血漿中のインスリン濃度を測定した。その測定結果を図３に示す。なお、マウスの飼育では、通常飼料を与え、水分を制限しなかった。

図３から明らかなように、ＣＬＰｒ−Ｈを投与した検体Ｃの血中インスリン濃度は、検体Ａおよび検体Ｂの血中インスリン濃度よりも高くなった。すなわち、ＣＬＰｒ−Ｈは、ＣＬＰｒおよびＣＬＰｒ−Ｌよりも、生体の血中インスリン濃度を高める機能に優れていることが明らかとなった。

（２）参考例
４週齢雄性ＩＣＲ−マウスを一晩（１８時間）絶食させた後に、そのマウスを検体Ｄ、検体Ｅおよび検体Ｆに区分した。そして、検体ＤにプロシアニジンＢ２（２量体のプロシアニジン）を、検体ＥにプロシアニジンＣ１（３量体のプロシアニジン）を、検体ＦにシンナムタンニンＡ２（４量体のプロシアニジン）を、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗずつで経口投与した。次いで、その投与から６０分後に、各検体を屠殺してから、各検体の心臓から血液を採取した。そして、各検体の血液を凝固させて、血漿を採取した。

次に、インスリン測定キット（シバヤギ社製，レビス（登録商標）インスリンマウスキット）を用いて、各検体から得られた血漿中のインスリン濃度を測定した。その測定結果を図４に示す。なお、マウスの飼育では、通常飼料を与え、水分を制限しなかった。

図４から明らかなように、シンナムタンニンＡ２を投与した検体Ｆの血中インスリン濃度は、検体Ｄおよび検体Ｅの血中インスリン濃度よりも有意に高くなった。すなわち、シンナムタンニンＡ２は、プロシアニジンＢ２およびプロシアニジンＣ１よりも、生体の血中インスリン濃度を高める機能に優れていることが明らかとなった。

＜実施例２＞
（１）原料液の調製
実施例１と同様にして、ＣＬＰｒを調製した。
（２）ゲル濾過分画
ＨＰＬＣシステムの環境条件を、以下に示すように変更し、原料液を５０μＬでそのＨＰＬＣシステムに注入した。そして、原料液の注入後の８分から１６分の溶離画分をＣＬＰｒ−Ｌとし、原料液の注入後の１７分から２５分の溶離画分をＣＬＰｒ−Ｈとした以外は、実施例１と同様にして、それぞれを分画採取した（図５参照）。

（ＨＰＬＣシステムの環境条件）
・装置：セミ分取用液体クロマトグラフィーシステム（島津社製、システム構成：ＬＣ−６ＡＤ，２台、ＣＢＭ−２０Ａ、ＣＴＯ−２０Ａ、ＳＩＬ−１０ＡＦ、ＳＰＤ−２０Ａ、ＦＲＣ−１０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア）
・カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ１００Ｄｉｏｌ−５８．０×３００ｍｍ
・流速：２．４ｍｌ／分
・検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ
・溶離液：アセトニトリルおよびメタノール水溶液（９７質量％）
・グラジエント：（メタノール水溶液（９７質量％）の質量％）０（０分）、２０（４〜９分）、４０（１３〜１８分）、０（２０〜３０分）

なお、各画分に含まれる高重合プロシアニジンの含有率、各画分の収率は、実施例１の結果と同様であった。また、各画分の血糖値コントロール作用も、実施例１の結果と同様であった。

本発明に係る４量体以上のポリフェノール（高重合プロシアニジン）は、糖尿病患者等の血糖値のコントロールが必要な患者のための血糖値コントロール剤の有効成分として有効に活用することができる。また、本発明に係る血糖値コントロール剤を、飲食品、サプリメント等に添加することによって、糖尿病の予防や改善等に有効な飲食品、サプリメント等を提供することができる。

Claims

４量体、５量体、６量体、７量体および８量体を含むカカオ由来のプロシアニジンを含有すると共に３量体以下のカカオ由来のプロシアニジンの含有率が１０質量％以下であるカカオ由来のプロシアニジン混合物をその乾燥物基準で１日あたり１ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以上１０００ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以下の範囲の量で経口投与するための、血糖値コントロール剤。
４量体、５量体、６量体、７量体および８量体を含むカカオ由来のプロシアニジンを含有すると共に３量体以下のカカオ由来のプロシアニジンの含有率が１０質量％以下であるカカオ由来のプロシアニジン混合物をその乾燥物基準で１日あたり１ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以上１０００ｍｇ／ｋｇ・Ｂｗ以下の範囲の量で生体に経口投与する血糖値コントロール方法（ただし、人を治療する行為を除く）。