JP6396739B2 - 歯周病菌由来の酵素活性阻害剤 - Google Patents
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Description
成分(B)と成分(A)の質量比((B)/(A))が0.8以上20以下である口腔内細菌由来の酵素活性阻害剤に関する。
また、本発明は、(A)オリザノール、並びに(B)25℃において液状である、トリアシルグリセロール(b1)、トコフェロール(b2)、及び炭化水素油(b3)から選ばれる1種又は2種以上の油剤を有効成分とし、かつ成分(B)と成分(A)との質量比((B)/(A))が0.8以上20以下である口腔内粘膜保護剤に関する。
本発明の口腔内細菌由来の酵素活性阻害剤は、(A)オリザノール、並びに(B)25℃において液状である、トリアシルグリセロール(b1)、トコフェロール(b2)、及び炭化水素油(b3)から選ばれる油剤を有効成分とする。口腔内細菌由来の酵素活性を阻害することによって、例えば、歯周病原因菌由来の酵素活性を阻害することも可能となって歯周病の予防効果を得ることができ、また、非特許文献1〜3に記載のように、歯茎や歯肉等の口腔内粘膜の細胞が破壊されることを防止することができる。したがって、特定の質量比である成分(A)及び成分(B)を有効成分とする、本発明の口腔内細菌由来の酵素活性阻害剤は、口腔内粘膜保護剤としても有効に機能し、または口腔内粘膜を効果的に保護することにより、口腔内の乾燥感の軽減効果や、口腔内のネバつきの抑制効果を高めることができるため、口腔内環境改善剤や口腔内乾燥軽減剤としても使用することができる。また、適宜その他の成分を含有させることにより、口腔内細菌由来の酵素活性阻害効果や口腔内粘膜保護効果等を有する、練り歯磨剤や粉歯磨剤等の歯磨組成物、洗口液や液状歯磨剤等の液体口腔用組成物として用いることもできる。
なお、本発明における口腔内細菌由来の酵素とは、口腔内細菌の代謝物であり、口腔内細菌が存在することによって口腔内で産生されるものである。
成分(A)の含有量は、かかる成分(A)の歯肉上での付着を実現する観点から、本発明の酵素活性阻害剤中に、好ましくは0.01質量%以上であり、より好ましくは0.02質量%以上であり、さらに好ましくは0.05質量%以上である。成分(A)の含有量は、口腔内細菌由来の酵素活性阻害剤の安定性を向上し、効果を向上する観点、及び香味の観点から、本発明の酵素活性阻害剤中に、好ましくは0.5質量%以下であり、より好ましくは0.3質量%以下であり、さらに好ましくは0.2質量%以下である。また、成分(A)の含有量は、本発明の酵素活性阻害剤中に、好ましくは0.01〜0.5質量%であり、より好ましくは0.02〜0.3質量%であり、さらに好ましくは0.05〜0.2質量%である。
なお、本発明の酵素活性阻害剤の25℃における粘度は、製造後少なくとも24時間室温で静置した酵素活性阻害剤を粘度測定用の容器に詰め、25℃の恒温器で24時間保存した後、ヘリパス型粘度計(東機産業株式会社 TVB−10R)を用いて、ロータT−C、回転数2.5rpm、1分間の条件で測定することができる。
なお、本発明の酵素活性阻害剤のpHとは、25℃においてpH電極を用いて測定した値であり、本発明の酵素活性阻害剤が歯磨組成物である場合、蒸留水を加えて酵素活性阻害剤の濃度として10質量%の水溶液に調整した後に測定した値を意味する。
成分(D)等を含む水溶性成分を混合して水相1を得る工程(2)、並びに
油相1と水相1とを15℃〜40℃の温度で混合する工程(3)
を備え、工程(2)以外の工程において、40℃を超え100℃以下の加熱工程を含まない方法を用いるのが好ましい。これにより、各成分の分散性又は溶解性を高めつつ、良好な香味と風味を保持するとともに、成分(A)の口腔粘膜への吸着又は付着を効果的に高めることのできる組成物を得ることができる。
[1](A)オリザノール、並びに(B)25℃において液状である、トリアシルグリセロール(b1)、トコフェロール(b2)、及び炭化水素油(b3)から選ばれる1種又は2種以上の油剤を有効成分とし、かつ
成分(B)と成分(A)の質量比((B)/(A))が0.8以上20以下である口腔内細菌由来の酵素活性阻害剤。
[2]成分(A)の歯肉上での有効量は、歯肉上に適用した本発明の酵素活性阻害剤全量中に、好ましくは0.001質量%以上であり、より好ましくは0.005%質量%以上である上記[1]の酵素活性阻害剤。
[3]成分(A)の含有量は、好ましくは0.01質量%以上であり、より好ましくは0.02質量%以上であり、さらに好ましくは0.05質量%以上であり、好ましくは0.5質量%以下であり、より好ましくは0.3質量%以下であり、さらに好ましくは0.2質量%以下である上記[1]又は[2]の酵素活性阻害剤。
[5]成分(b1)の構成脂肪酸の炭素数は、好ましくは6〜24であり、より好ましくは12〜20である上記[1]〜[4]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[6]成分(b1−1)は、好ましくはオレイン酸、及びリノール酸から選ばれる不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするトリアシルグリセロールであり、かつ成分(b1−1)以外の成分は、ミリスチン酸、パルミチン酸、及びステアリン酸から選ばれる脂肪酸を構成脂肪酸とするトリアシルグリセロールであり、或いは、オレイン酸、及びリノール酸から選ばれる不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするトリアシルグリセロールを、好ましくは95質量%以上含有する上記[1]〜[5]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[7]成分(b1)は、好ましくはシア脂及びオリーブ油から選ばれる1種又は2種である上記[1]〜[6]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[8]成分(b2)は、好ましくはα-トコフェロール、酢酸トコフェロールであり、より好ましくは酢酸dl−α−トコフェロールである上記[1]〜[7]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[9]成分(b3)は、好ましくは流動パラフィン、流動イソパラフィン、スクワラン、スクワレンから選ばれる1種又は2種以上であり、より好ましくは流動パラフィンである上記[1]〜[8]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[10]成分(B)の含有量は、好ましくは0.05質量%以上であり、より好ましくは0.08質量%以上であり、さらに好ましくは0.1質量%以上であり、好ましくは3質量%以下であり、より好ましくは2質量%以下であり、さらに好ましくは1質量%以下である上記[1]〜[9]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[12]さらに25℃において固体又は半固体である成分(A)以外の油剤、融点が40℃以上である成分(A)以外の固体脂の含有量は、好ましくは1質量%以下であり、より好ましくは0.5質量%以下であり、さらに好ましくは0.2質量%以下であり、また成分(B)及び香料成分以外の、25℃において液状である油剤の含有量は、好ましくは1質量%以下であり、より好ましくは0.5質量%以下であり、さらに好ましくは0.2質量%以下である上記[1]〜[11]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[13]さらに香料成分(C)を含有し、かかる成分(C)の含有量が、好ましくは0.1質量%以上であり、より好ましくは0.2質量%以上であり、さらに好ましくは0.3質量%以上であり、好ましくは2質量%以下であり、より好ましくは1.5質量%以下である上記[1]〜[12]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[14]成分(C)と成分(B)の含有量の質量比((C)/(B))は、好ましくは0.3以上であり、より好ましくは0.5以上であり、さらに好ましくは1以上であり、よりさらに好ましくは1.2以上であり、好ましくは5以下であり、より好ましくは4.5以下であり、さらに好ましくは4以下である上記[13]の酵素活性阻害剤。
[16]液体口腔用組成物である場合における水(D)の含有量は、好ましくは60質量%以上であり、より好ましくは70質量%以上であり、さらに好ましくは80質量%以上であり、好ましくは98質量%以下であり、より好ましくは95質量%以下であり、さらに好ましくは92質量%以下である上記[1]〜[14]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[17]好ましくはノニオン性界面活性剤を含有し、より好ましくはノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンモノアルキル(又はアルケニル)エーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びショ糖脂肪酸エステルから選ばれる1種又は2種以上であり、さらに好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである上記[1]〜[16]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[18]ノニオン性界面活性剤の含有量は、好ましくは0.05質量%以上であり、より好ましくは0.1質量%以上であり、さらに好ましくは0.2質量%以上であり、好ましくは1.5質量%以下であり、より好ましくは1.2質量%以下であり、さらに好ましくは1質量%以下である上記[17]の酵素活性阻害剤。
[19]ノニオン性界面活性剤と成分(A)の含有量の質量比(ノニオン性界面活性剤/(A))は、好ましくは0.2以上であり、より好ましくは0.5以上であり、さらに好ましくは0.7以上であり、よりさらに好ましくは1以上であり、好ましくは20以下であり、より好ましくは15以下であり、さらに好ましくは12以下である上記[17]又は[18]の酵素活性阻害剤。
[20]歯磨組成物や液体口腔用組成物である場合の25℃における粘度は、好ましくは1000〜5000dPa・sであり、より好ましくは1500〜4000dPa・sであり、さらに好ましくは2000〜4000dPa・sである上記[1]〜[19]いずれか1の酵素活性阻害剤。
[22]口腔内環境改善剤である上記[21]の口腔内粘膜保護剤。
[23]口腔内細菌由来の酵素活性を阻害するための上記[1]〜[20]いずれか1の酵素活性阻害剤の使用。
[24]口腔内粘膜を保護するための上記[21]の口腔内粘膜保護剤の使用。
[25]口腔内環境を改善するための上記[21]の口腔内粘膜保護剤の使用。
[26]成分(A)、及び(B)を含む油溶性成分を15℃〜40℃の温度で混合して油相1を得る工程(1)、
水溶性成分を混合して水相1を得る工程(2)、並びに
油相1と水相1とを15℃〜40℃の温度で混合する工程(3)
を備え、工程(2)以外の工程において、40℃を超え100℃以下の加熱工程を含まない上記[1]〜[22]いずれか1の口腔内粘膜保護剤の製造方法。
表1に示す処方にしたがって、各酵素活性阻害剤を調製し、必要に応じて得られた酵素活性阻害剤を用い、下記に示す方法にしたがって各測定及び各評価を行った。
(細菌の培養)
Porphyromonas gingivalis ATCC 33277(以後「P.g.」という)の培養には、平板培地としてアネロコロンビアウサギ血液寒天培地(日本BD(株))を用い、液体培地としてブレインハートインフュージョン培地(日本BD(株))に5μg/mLヘミン、1μg/mLメナジオンを添加した培地を用いた。培養は嫌気グローブボックス中(N2:H2:CO2=80:10:10)の37℃インキュベーターで行った。
P.g.を培地で培養後、菌培養上清を抽出し、抽出した菌培養上清に氷冷下にて80%硫酸アンモニウムを加えて攪拌した後、10,000gで30分間遠心分離した。ペレットに少量の氷冷したバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、10mM CaCl2)を加えて溶解した後、氷冷下でバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.05%Tween20、10mM CaCl2)にて一晩透析した。その後、7,000gで10分間遠心分離して、沈殿を除去し、濃縮P.g.培養上清とした。
測定用の緩衝液には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用した。前述のP.g.濃縮培養上清をPBSで50倍に希釈した(P.g.培養上清50倍希釈液)。ジメチルスルホキシド(DMSO)に、表1に記載の各酵素活性阻害剤を溶解した後、PBSで10倍希釈して測定用サンプルとした。96 wellプレートに、酵素として前述のP.g.培養上清50倍希釈液100μLと所定濃度の測定サンプル100μLを加え、37℃で10分間プレインキュベードした。その後、酵素基質となるBoc−Phe−Ser−Arg−MCA(3107−v; (株)ペプチド研究所)を2μL添加し(終濃度100μM)、37℃で10分間インキュベートした。蛍光分光光度計(励起波長380nm、吸収波長460nm)を用いて、反応の進行に伴う蛍光強度の増加を測定し、酵素反応の強さは基質から遊離するAMC(7−amino−4−methylcoumarin)量で評価して、下記式により酵素阻害活性(%)の値を算出した。
酵素阻害活性(%)=100−(測定サンプルの蛍光強度/controlの蛍光強度)×100
なお、コントロールは、評価素材をDMSO100%液としたものであり、各酵素活性阻害剤について、6サンプルずつ酵素活性量を測定して求めた平均値を表1及び図1に示す。酵素阻害活性(%)の値が小さいほど(絶対値が大きいほど)、阻害効果が高いことを意味する。
これに対し、γ-オリザノールに、各々25℃で液状の油剤である、シア脂を併用した実施例2、トコフェロールを併用した実施例3、流動パラフィンを併用した実施例4、オリーブ油を併用した実施例5は、比較例1でも示されるγ-オリザノールによる阻害効果が、各油剤を単独で用いた比較例2〜4で示される効果を相加した場合よりも、高い効果が得られることが認められる。
一方、シリコーン油と混合した比較例6は、オリザノールのプロテアーゼ活性を却って高めてしまっているため、活性阻害効果が減じられる結果となっていることが認められる。
20〜50代男性(N=43)を被験者とし、蒸留水6mLを口に含み、30秒間含嗽した洗口吐出液を採取した後、15,000rpm、4℃で15分間遠心分離した。遠心上清を除去した後、沈渣の質重量を計測し、口腔粘膜剥離量とした。
20〜50代男性(N=46)の10分間の安静時唾液を採取した後、3,000rpm、4℃で15分間遠心分離した。96 well plateに100μL 唾液上清、100μL PBSを添加し、30秒間攪拌した。その後、酵素基質となるBoc−Phe−Ser−Arg−MCA(3107−v; (株)ペプチド研究所)を2μL添加し(終濃度100μM)、37℃で10分間インキュベートした。蛍光分光光度計(励起波長380nm、吸収波長460nm)を用いて、反応の進行に伴う蛍光強度の増加を測定し、酵素反応の強さは基質から遊離するAMC(7−amino−4−methylcoumarin)量で評価し、唾液のプロテアーゼ活性とした。粘膜剥離量とプロテアーゼ活性(平均値に対する相対比)との関係を図2に示す。
被験者46名に記入式質問票を用いて、試験当日の口腔不快症状の有無の評価を記載させた。質問票において口中がネバつくと感じている被験者の唾液プロテアーゼ活性量の平均値と、口中がネバつくと感じていない被験者の唾液プロテアーゼ活性量の平均値をも求めた。同様に、口中が乾くと感じている被験者の唾液プロテアーゼ活性量の平均値と、口中が乾くとは感じられない被験者の唾液プロテアーゼ活性量の平均値を求めた。これら平均値を表2に示し、唾液プロテアーゼ活性と口腔不快症状との関連性を評価した。
以上より、口腔内のプロテアーゼをはじめとする口腔内細菌由来の酵素活性を阻害することにより、粘膜剥離量が低減され、口の中がネバつく、口の中が乾くといった不定愁訴も軽減することができると考えられる。
表3に示す処方にしたがって、各歯磨組成物を調製した。
得られた歯磨組成物を用い、下記に示す方法にしたがって成分(A)の口腔粘膜への吸着性の評価を行った。なお、粘度は、各歯磨組成物を粘度測定用の容器に詰め、25℃の恒温器で24時間保存した後、ヘリパス型粘度計を用いて、ロータT-C、回転数2.5rpm、1分間の条件で測定した。
結果を表3に示す。
歯ブラシ(チェックスタンダード、花王株式会社製)を装着した保持部、及び稼動可能な試験台を備えたブラッシングマシーンを用いた。まず、シリコーン製シート(タイガーズポリマー株式会社 SR板 SR−50、1.5cm×5cm)を両面テープでブラッシングマシーンの試験台に固定した。次いで、各歯磨組成物を1g±0.01g秤量して上記シート上に配置し、イオン交換水250μLを注いだ後、歯ブラシへの荷重を200g、試験台の稼動を60rpmとし、20ストロークずつ3回にわたりブラッシングを行った。なお、シート上からずれた歯磨組成物は、各ブラッシングとブラッシングの間に元のシート上に戻した。
ブラッシング後、一定量の流水でシートを10秒間洗浄し、目視により歯磨組成物が除去されていることを確認した。次いで、シートを軽く乾燥させ、アセトンとともに25mLメスフラスコに投入して1分間程度浸漬して両面テープを剥離した後、シートを再びメスフラスコに戻し、25mLまで水を充填した。
なお、歯磨組成物を用いたブラッシングをしなかったこと以外、同様にして上記測定を行なった結果を用い、両面テープを剥離した後にシート上に残存する粘着剤等の成分によって、得られる結果が左右されないことを確認した。
なお、HPLCの測定は以下の条件により行った。
《γ−オリザノール》
装置:日立高速液体クロマトグラム La chrom Elite
カラム:L−column ODS4.6×150mm(5μm)(化学物質評価研究機構)
カラム温度:40℃
移動相:メタノール/テトラヒドロフラン(88:12)
流量:1.0mL/Min
サンプル注入量:20μL
測定波長:326nm
なお、γ−オリザノールのピークは、保持時間5分の2〜3のピークの総和として測定した。
※2:クロピュアリキッドベジラン、クローダジャパン株式会社製(トリオレイン酸グリセリル44.2質量%、トリリノール酸グリセリル6質量%、トリステアリン酸グリセリル44質量%、トリパルミチン酸グリセリル4質量%)
※3:小堺製薬株式会社製(トリオレイン酸グリセリル82.5質量%、トリリノール酸グリセリル6質量%、トリパルミチン酸グリセリル9質量%、トリステアリン酸グリセリル2.3質量%、トリアラキン酸グリセリル0.2質量%)
※4:l−メントール50質量%、ペパーミントオイル15質量%、アネトール5質量%、スペアミントオイル5質量%、ユーカリオイル1質量%、アニスアルデヒド2.5質量%、プロピレングリコール17質量%、エタノール3質量%、他(1,8-シネオール、ターピネオール等)1.5質量%
※5:レオドールTW-S120V、花王株式会社製
※6:エマール10PT、花王株式会社製
※7:ケルデント、DSP五協フード&ケミカル株式会社製
※8:CMC1150、ダイセルファインケム株式会社製
※9:サンローズF35SH、日本製紙ケミカル製
※10:サイロピュア♯25、富士シリシア化学株式会社製
※11:ソルボシルAC77、PT PQ Silicas Indonesia製
表4に示す処方にしたがって、各口腔内粘膜保護剤を調製し、下記に示す方法にしたがって口腔内の細胞剥離量(%)を測定し、口腔内粘膜の保護効果を評価した。上記比較例1の評価も含め、結果を表4及び図3に示す。
評価素材として、ヒト歯肉上皮前駆細胞(HGEP細胞;CELLnTEC社)を用いた。
まず、ジメチルスルホキシド(DMSO)に、各酵素活性阻害剤を溶解した後、CnT−Prime培地(CELLnTEC社)で100倍希釈して測定用サンプルとした。次に、HGEP細胞をCnT−Prime培地中で増殖させた後、24 well plateに8×104 cells/well播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。培地を1mLの測定用サンプルに置換し、24時間培養後、上記P.g.濃縮培養上清10μLを添加し、2時間インキュベーションした。各wellをPBSで洗浄後、wellに残存している細胞をACTase(細胞剥離用酵素)で回収した後、血球計算版で細胞数を測定し、下記式により細胞剥離量(%)の値を算出した。
細胞剥離量(%)
=100−(測定サンプルの細胞数/controlの細胞数)×100
これに対し、成分(A)のγ-オリザノールと成分(B)の25℃で液状の油剤を併用した実施例9は、比較例1と比較例8とで示される効果を相加した場合よりも、高い細胞剥離抑制効果が得られることが認められる。
Claims (4)
- (A)オリザノール、並びに(B)25℃において液状である、トリアシルグリセロール(b1)、トコフェロール(b2)、及び炭化水素油(b3)から選ばれる1種又は2種以上の油剤を有効成分とし、かつ
成分(B)と成分(A)の質量比((B)/(A))が0.8以上20以下である口腔内細菌であるPorphyromonas gingivalis(ポルフィノモナス ジンジバリス)由来のプロテアーゼ活性阻害剤。 - 成分(b1)が、構成脂肪酸が不飽和脂肪酸であるトリアシルグリセロール(b1―1)を20質量%以上95質量%以下含有する油剤である請求項1に記載の口腔内細菌であるPorphyromonas gingivalis由来のプロテアーゼ活性阻害剤。
- (A)オリザノール、並びに(B)25℃において液状であるトリアシルグリセロール(b1)、トコフェロール(b2)、及び炭化水素油(b3)から選ばれる1種又は2種以上の油剤を有効成分とし、かつ成分(B)と成分(A)との質量比((B)/(A))が0.8以上20以下である口腔内粘膜保護剤。
- 口腔内環境改善剤である請求項3に記載の口腔内粘膜保護剤。
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