FR3067604A1

FR3067604A1 - Extrait d'helichrysum italicum obtenu au moyen de solvants eutectiques profonds

Info

Publication number: FR3067604A1
Application number: FR1855360A
Authority: FR
Inventors: Valerie Cenizo; Geraldine Lemaire; Pascal Portes; Charline Combes; Virginie Rouquet
Original assignee: Laboratoires M&L SA
Current assignee: Laboratoires M&L SA
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2038-06-19
Also published as: FR3057166B1; FR3067604B1; FR3057166A1

Abstract

La présente invention concerne un extrait particulier d'Helichrysum italicum, qui peut être obtenu par extraction des parties aériennes de la plante au moyen de solvants eutectiques profonds. Cet extrait se caractérise par la présence d'hétérosides de flavonols dont le cycle B est dihydroxylé. L'invention concerne également une composition cosmétique contenant cet extrait et ses utilisations, notamment dans le traitement des signes cutanés du vieillissement.

Description

La présente invention concerne un extrait particulier & Helichrysum italicum, ainsi qu'une composition cosmétique le contenant et ses utilisations, notamment dans le traitement des signes cutanés du vieillissement.

ARRIERE-PLAN DE L’INVENTION

Les plantes du genre Helichrysum rassemblent différentes espèces d'immortelle, dont l'immortelle d'Italie ou Helichrysum italicum (également désignée par Helichrysum angustifolium D.C.). Plusieurs extraits d'immortelle ont déjà été décrits comme présentant des propriétés anti-âge. En particulier, il a été démontré dans la demande WO 03/018730 qu'une huile essentielle d'immortelle renfermant de l'acétate de néryle présentait notamment un effet anti-radicalaire. Un effet anti-oxydant et/ou anti-inflammatoire a par ailleurs été mis en évidence pour d'autres extraits & Helichrysum contenant des flavonoïdes, obtenus notamment par chromatographie liquide à haute performance (Maffei et al., Journal of Chromatography, 537 (1991) 449-452) ou par extraction à l'aide d'huile de jojoba (WO 2013/050902). Il est en outre connu que des extraits aqueux ^Helichrysum italicum, riches en acide caféique, permettent de restructurer l'épiderme et de lisser la surface de la peau (FR 2 975 006).

Les flavonoïdes constituent une classe de polyphénols renfermant le squelette ci-dessous :

r

s «

Ils peuvent eux-mêmes être subdivisés en différentes catégories en fonction du carbone du cycle C sur lequel est fixé le cycle B, de la présence ou non d'une ou plusieurs insaturations sur le cycle C et/ou d'un groupement oxo en position 4 et/ou d'un groupement hydroxyle en position 3 du cycle C.

Une catégorie particulière de flavonoïdes est constituée des flavonols ayant la structure suivante :

Parmi ceux-ci, on compte notamment les flavonols non substitués sur le cycle B, tels que la baicaléine, les flavonols mono-hydroxylés sur le cycle B, tels que le kaempférol, et les flavonols di-hydroxylés sur le cycle B, tels que la quercétine et la quercétagétine. A la connaissance de la Demanderesse, ces flavonoïdes et leurs dérivés glycosylés ne sont pas présents en quantité détectable dans les huiles essentielles üHelichrysum. En outre, les extraits AHelichrysiim contenant des flavonoïdes, tels que mentionnés précédemment, renferment uniquement des flavonols des deux premiers types précités ou leurs glycosides.

La Demanderesse a mis en évidence qu'un nouvel extrait AHelichrysum, renfermant de manière caractéristique des hétérosides de flavonols dihydroxylés sur le cycle B, présentait non seulement des propriétés anti-oxydantes et anti-inflammatoires, mais également d'autres propriétés biologiques avantageuses lui permettant d'exercer une activité anti-âge complète.

Cet extrait peut être obtenu par extraction des parties aériennes, comprenant notamment les sommités fleuries, AHelichrysiim italicum à l'aide d'un mélange de solvants eutectiques profonds (ou NaDES pour Natural Deep Eutectic Solvent).

Les solvants de type NaDES sont des mélanges de composés d'origine naturelle présentant la propriété d'avoir une température de fusion unique et définie pour une composition déterminée ; le mélange eutectique présente alors certaines propriétés physiques qui sont celles des corps purs, et notamment la propriété d'avoir la même composition en phase liquide et en phase solide. La température de fusion de l'eutectique est inférieure à la température de fusion du mélange des mêmes corps dans d'autres proportions. Les constituants des solvants eutectiques profonds sont capables de former ensemble des liaisons hydrogène fortes. On pense que les solvants de type NaDES sont présents dans les cellules végétales où ils permettent de synthétiser et stocker une diversité de métabolites non hydrosolubles tels que les flavonoïdes (Y. Dal et al., Analytica Chimica Acta (2013) 766:61-68). Il a déjà été suggéré de les utiliser comme solvants d'extraction de matières végétales (Y. H. Choi et al., Plant Physiology (2011) 156:1701-1705 ; WO 2011/155829) ou pour protéger des aliments contre l'oxydation ou la dégradation acide (WO 2015/165738). Toutefois, à la connaissance de la Demanderesse, il n'a encore jamais été suggéré d'utiliser ces solvants pour extraire des flavonoïdes üHelichrysum italicum.

RESUME DE L’INVENTION

L’invention a ainsi pour objet un extrait üHelichrysum italicum, caractérisé en ce qu'il renferme des hétérosides de flavonols dont le cycle B est dihydroxylé.

Elle a également pour objet une composition cosmétique comprenant cet extrait dans un milieu physiologiquement acceptable.

Elle a encore pour objet l'utilisation cosmétique de cet extrait, par application topique sur la peau, pour prévenir ou traiter les signes du vieillissement cutané et/ou comme agent apaisant.

FIGURES

La Figure 1 représente la variation d'induction d’IL-8 par un extrait selon l'invention, testé à deux concentrations.

DESCRIPTION DETAILLEE

Comme indiqué précédemment, la présente invention porte sur un nouvel extrait üHelichrysum italicum, qui se caractérise en ce qu'il renferme des hétérosides de flavonols dont le cycle B est dihydroxylé. Ces hétérosides de flavonols comprennent en particulier au moins un hétéroside, en particulier un O-hexoside, de quercétagétine et/ou de quercétine, plus particulièrement un O-hexoside de quercétagétine et un O-hexoside-O-rhamnoside de quercétine. L'extrait selon l'invention peut renfermer au moins 50 ppm d'hétérosides de flavonols, tel que mesuré par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse.

Un tel extrait est notamment susceptible d'être obtenu par extraction des parties aériennes üHelichrysum italicum à l'aide d'un mélange de solvants eutectiques profonds (ci-après désigné par solvant NaDES).

Dans une forme d'exécution préférée de l'invention, ce mélange de solvants est constitué de : (a) au moins deux solvants respectivement choisis dans au moins deux groupes distincts constitués (i) des acides carboxyliques, (ii) du glucose, (iii) du fructose, (iv) du sucrose, (v) du lactose, (vi) du tréhalose, (vii) des polyols et (viii) des composés azotés constitués de la choline, de ses sels inorganiques et des acides aminés et (b) éventuellement de l'eau.

Parmi les solvants précités, l'acide carboxylique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par les oxo-acides, tels que l'acide pyruvique ; les mono- ou polyhydroxyacides, tels que les acides malique, citrique, lactique, tartrique, ascorbique, glucuronique et neuraminique ; et les acides dicarboxyliques, tels que les acides oxalique, adipique, maléique, fumarique, succinique, aconitique, malonique et oxalique.

De son côté, le polyol est de préférence choisi dans le groupe constitué par les alcools de sucre tels que le mannitol, le sorbitol, l'inositol, le ribitol, le galactitol, l'érythritol et le xylitol ; la glycérine ; le 1,3-propanediol ; et le propylène glycol.

En outre, des exemples d'acides aminés peuvent être choisis dans le groupe constitué par la proline et l'alanine.

Dans une forme d'exécution particulièrement préférée de l'invention, le mélange de solvants formant le solvant NaDES est constitué de fructose, de glycérine et d'eau, de préférence dans un rapport massique de 50:25:25.

Avant sa mise en œuvre dans la préparation de l'extrait selon l'invention, le solvant NaDES peut être lui-même préparé par chauffage du mélange des solvants jusqu'à faire fondre ses constituants solides, par exemple pendant une durée de 0,5 à 3h à une température de 50 à 80°C, généralement sous agitation, pour obtenir un liquide fondu, puis éventuellement refroidissement à température ambiante. En outre, les parties aériennes CHelichrysiim italicum peuvent être préalablement broyées et/ou séchées. L'extraction peut être effectuée par mise en contact de la plante éventuellement séchée et/ou broyée avec le solvant NaDES à une température de 25°C à 95°C, par exemple de 60 à 80°C, pendant une durée allant de 0,5 à 24h, par exemple de 2 à 4 h. Le rapport massique de la plante éventuellement séchée et/ou broyée au solvant NaDES peut aller de 1:99 à 50:50, par exemple de 1:99 à 10:90. A l'issue de cette étape d'extraction, le liquide et le résidu solide obtenus peuvent être séparés par toute technique connue de l'homme de l'art et notamment par centrifugation, décantation ou pressage, de préférence par essorage centrifuge. L'extrait brut ainsi obtenu peut ensuite être clarifié par filtration et éventuellement stérilisé.

La présente invention porte également sur une composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait üHelichrysum italicum tel que défini précédemment.

L'extrait selon l'invention peut avantageusement représenter de 0,001 à 5% en poids et préférentiellement de 0,01 à 2% en poids, par rapport au poids total de la composition.

Cette composition renferme généralement un milieu physiologiquement acceptable, en particulier cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne génère pas de picotements ou de rougeurs incompatibles avec une utilisation cosmétique. Ce milieu renferme de préférence une phase aqueuse et éventuellement une phase grasse. On préfère que la composition se présente sous forme d'émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile.

La phase aqueuse peut notamment contenir, outre de l'eau, au moins un constituant choisi parmi les gélifiants aqueux et les actifs hydrophiles tels que les humectants.

Par gélifiant aqueux, on désigne un composé polymérique capable d'immobiliser des molécules d'eau en s'hydratant et d'augmenter ainsi la viscosité de la phase aqueuse. Un tel gélifiant peut être choisi parmi : les polysaccharides, tels que : la cellulose et ses dérivés, les amidons modifiés, le carraghénane, l'agar agar, la gomme de xanthane et les gommes végétales telles que la gomme de guar ou de caroube ; les polymères synthétiques et notamment les homopolymères d'acrylate de sodium avantageusement réticulés, ainsi que les copolymères acryliques, en particulier les copolymères d'acrylate de sodium et/ou de (méth)acrylate d’alkyle et/ou de (méth)acrylate d'hydroxyalkyle et/ou de (méth)acrylate de (polyéthoxy)alkyle, avec au moins un autre monomère, avantageusement l'acide 2-acrylamido-2-méthylpropane sulfonique (AMPS), ces copolymères étant de préférence réticulés; et leurs mélanges.

De son côté, la phase grasse peut comprendre une ou plusieurs huiles volatiles et/ou non volatiles. Des exemples d'huiles volatiles sont les alcanes ramifiés, tels que l'isododécane, et les alcanes linéaires en C10-C13. Comme huiles non volatiles, on peut citer notamment :

- les esters d'acides et de mono-alcool choisis parmi : les mono- et polyesters d'acides linéaires saturés en C2-C10 (de préférence en C6-C10) et de mono-alcools linéaires saturés en C10-08 (de préférence C10-04), les mono- et polyesters d'acides linéaires saturés en C10-C20 et de mono-alcools ramifiés ou insaturés en C3-C20 (de préférence C3-C10) ; les mono- et polyesters d'acides ramifiés ou insaturés en C5-C20 et de mono-alcools ramifiés ou insaturés en C5-C20 ; les mono- et polyesters d'acides ramifiés ou insaturés en C5-C20 et de mono-alcools linéaires en C2-C4 ;

- les triglycérides d'acides gras en C6-C12, tels que les triglycérides d'acides caprylique et caprique et la triheptanoïne ;

- les acides gras ramifiés et/ou insaturés en C10-C20 (tels que les acides linoléique, laurique et myristique) ;

- les alcools gras ramifiés et/ou insaturés en C10-C20 (tels que l'octyldodécanol et l'alcool oléylique) ;

- les hydrocarbures tels que le squalane (C30), notamment le squalane végétal extrait de l'huile d'olive, et l'hémisqualane (Cl5) ;

- les carbonates de dialkyle, tels que le dicaprylyl carbonate et le diéthylhexyl carbonate ;

- les dialkyléthers tels que le dicaprylyl éther ; et

- leurs mélanges.

On peut également citer les huiles végétales qui contiennent un ou plusieurs des constituants précités.

Comme esters d'acides et de monoalcools, on peut notamment citer les monoesters tels que le mélange de caprate et caprylate de coco, le macadamiate d'éthyle, l'ester éthylique de beurre de karité, l'isostéarate d’isostéaryle, l'isononanoate d'isononyle, l'isononanoate d'éthylhexyle, le néopentanoate d’hexyle, le néopentanoate d'éthylhexyle, le néopentanoate d’isostéaryle, le néopentanoate d'isodécyle, le myristate d’isopropyle, le myristate d’octyl dodécyl e, le palmitate d’isopropyle, le palmitate d'éthylhexyle, le laurate d’hexyle, le laurate d'isoamyle, le nonanoate de cétostéaryle, le capylate de propylheptyle et leurs mélanges. D'autres esters utilisables sont les diesters d'acides et de monoalcools tels que l’adipate de disopropyle, l’adipate de diéthylhexyle, le sébaçate de diisopropyle et le sébaçate de diisoamyle.

Des exemples d'huiles végétales sont notamment les huiles de germe de blé, de tournesol, d'argan, d'hibiscus, de coriandre, de pépins de raisin, de sésame, de maïs, d'abricot, de ricin, de karité, d'avocat, d'olive, de soja, l'huile d'amande douce, de palme, de colza, de coton, de noisette, de macadamia, de jojoba, de luzerne, de pavot, de potimarron, de sésame, de courge, de cassis, d'onagre, de lavande, de bourrache, de millet, d'orge, de quinoa, de seigle, de carthame, de bancoulier, de passiflore, de rosier muscat, d'Echium, de cameline ou de camélia.

La phase grasse peut en outre comprendre au moins un structurant de phase grasse.

Par structurant de phase grasse, on entend un composé capable d'épaissir les huiles contenues dans la composition, choisi notamment parmi les cires, les gélifiants de phase grasse et les corps gras pâteux, ainsi que leurs mélanges.

Le terme cire désigne, dans le contexte de cette description, un corps gras solide à 25°C, à changement d'état solide / liquide réversible, ayant un point de fusion généralement compris entre 30 et 160°C, de préférence entre 50 et 90°C, tel que mesuré par Calorimétrie à Balayage Différentiel (DSC). Des exemples de cires sont en particulier les cires d'origine animale ou végétale, telles que les cires d'abeille, de candelilla, de carnauba ou d'acacia ; les huiles végétales hydrogénées et éventuellement modifiées par l'acide isostéarique, notamment les huiles de colza, de soja, de tournesol, de jojoba, de coprah et de ricin hydrogénées ; les esters d'acides gras linéaires saturés en C14-C30 et d'alcools gras linéaires saturés en C16-C36 ; les acides linéaires et saturés en C10-C30 ; les alcools linéaires et saturés en C8-C30 ; et leurs mélanges. Ces cires peuvent se trouver sous forme micronisée, c'est-à-dire sous la forme d'une poudre dont les particules présentent une taille moyenne en nombre inférieure ou égale à 50 pm, et notamment allant de 0,5 à 50 pm, de préférence allant de 1 à 30 pm, voire allant de 3 à 20 pm, où la « taille moyenne en nombre » correspond à la dimension donnée par la distribution granulométrique statistique à la moitié de la population, dite D50.

Par gélifiants de phase grasse, il est fait référence aux composés modifiant la rhéologie de la phase grasse par formation d'un réseau tridimensionnel. Comme composés de ce type, on peut notamment citer les argiles (en particulier les bentonites et les hectorites) modifiées hydrophobes, notamment par du chlorure de di-stéaryl di-méthyl ammonium ; les silices pyrogénées modifiées hydrophobes ; le palmitate et le myristate de dextrine ; les polyamides, les copolymères oléfine(s) / styrène, les poly(acrylates d'alkyle) ; les glycérides d'acides gras (de préférence linéaires et saturés) en C16-C26 tels que le composé Nomcort® HKG ; les dérivés de cellulose et les mélanges en contenant ; et leurs mélanges. Certaines huiles végétales hydrogénées peuvent également être considérées comme des gélifiants de phase grasse.

Enfin, les corps gras pâteux utilisables comme structurants de phase grasse sont définis comme des corps gras à changement d'état liquide / solide réversible, présentant à l'état solide une organisation cristalline anisotrope et comportant à une température de 23°C une fraction liquide et une fraction solide. On préfère utiliser les beurres végétaux. Les beurres de karité, de cacao et de mangue constituent des exemples de tels corps gras pâteux.

La composition utilisée selon l'invention peut par ailleurs comprendre un ou plusieurs émulsionnants, parfums, conservateurs, séquestrants, anti-oxydants, ajusteurs de pH, filtres UV, charges pulvérulentes, pigments, colorants et leurs mélanges.

Selon une forme d'exécution préférée, cette composition renferme en outre au moins un actif anti-âge, en particulier un actif adapté à prévenir et/ou traiter les rides, le relâchement cutané et/ou la formation de taches pigmentaires, qui peut notamment être choisi parmi les agents antiradicalaires, les agents stimulant la différenciation et/ou la prolifération des kératinocytes et/ou des fibroblastes ; les agents stimulant la synthèse de glycosaminoglycanes et/ou de collagène et/ou de fibrilles d'ancrage dermo-épidermique ; les agents prévenant la dégradation du collagène et/ou des glycosaminoglycanes et/ou des fibrilles d'ancrage dermo-épidermique ; les agents anti-glycation ; les agents dépigmentants et/ou inhibant la mélanogénèse ; et leurs mélanges. En variante et/ou en plus, la composition selon l'invention peut comprendre au moins un actif à effet neuronal.

Des exemples de tels actifs anti-âge et/ou à effet neuronal sont notamment : l'acide ascorbique, ses sels, ses éthers et ses esters, notamment le glucoside d'ascorbyle ; l'adénosine ; le ribose ; les extraits de miel ; les protéines et glycoprotéines, extraites notamment d'amande douce ; les protéines végétales hydrolysées, notamment issues du riz, des graines d'hibiscus ou du lupin ; les polypeptides et les pseudodipeptides, tels que le chlorhydrate de carcinine, le palmitoyl pentapeptide-4 (Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser) et le palmitoyl tripeptide-38 commercialisés notamment par SEDERMA sous les dénominations commerciale Matrixyl® 3000 et Matrixyl® Synthe'6, respectivement, le palmitoyl tripeptide-8 commercialisé par la société LUCAS MEYER sous la référence commerciale Nutrazen®, le pentapeptide-18 commercialisé par la société LIPOTEC sous la dénomination commerciale Leuphasyl® Solution, le sh-decapeptide9 commercialisé par la société SANDREAM sous la dénomination commerciale Neoendorphin® et le palmitoyl hexapeptide-52 commercialisé par la société INFINITEC sous la référence commerciale X50 Myocept® Powder ; les silanes tels que le mannuronate de méthylsilanol ; les arabinoxylanes, extraits en particulier de farine de seigle et les galactoarabinanes, issus notamment du mélèze ; l'acide hyaluronique et ses sels ; les polyphénols, extraits en particulier de mimosa ; les alpha-hydroxyacides, dont ceux extraits de citron; les extraits aqueux de plantes telles que le trèfle d'eau, la pensée sauvage, la prêle des champs, le chardon aux ânes (Onopordum acanthium), le millefeuille (Achillea millefolium, contenu notamment dans le produit Neurobiox® de la société BASF), l'embelia (Embelia continua, telle que commercialisée par la société SEPPIC), le figuier de Barbarie (Opuntia ficus indica, commercialisé notamment par MIBELLE AG BIOCHEMISTRY sous la dénomination commerciale AquaCacteen®), la sauge (Salvia officinalis, vendue notamment par PROVITAL GROUP), Vitex negundo (commercialisé notamment par les LABORATOIRES EXPANSCIENCE sous la référence commerciale Neurovity®), la châtaigne, la papaye, l'arganier, l'avoine, le tournesol, la pâquerette, la pivoine ou l'aneth ; les extraits aqueux d'algues et notamment de coralline, de janie rouge, d'Ungaria pinnatifada, d'Alaria esculenta ou de Nannochlorosis oculata \ les huiles essentielles, notamment d'immortelle ou de myrte ; les gluconates de zinc et/ou de cuivre ; et leurs mélanges.

En variante ou en plus, la composition utilisée selon l'invention peut comprendre au moins un polymère tenseur, c'est-à-dire capable de tendre la peau par action mécanique et de réduire ainsi l'apparence des rides et des ridules. Il peut s'agir d'un polymère synthétique ou naturel, en particulier d'un polysaccharide, notamment d'un extrait d'algue ou de plancton marin ou d'une gomme végétale.

Cette composition peut se présenter sous toute forme adaptée à une application topique sur la peau et notamment sous forme de lait, de crème, de lotion, de gel ou de masque. Il s'agit généralement d'une composition non rincée.

Elle peut être utilisée, par application topique sur la peau, pour prévenir ou traiter les signes du vieillissement cutané et/ou comme agent apaisant. Il est ainsi possible de prévenir et/ou réduire la formation de rides et ridules, le relâchement cutané et/ou la perte d'éclat du teint, notamment en renforçant la barrière cutanée, en augmentant la différenciation des kératinocytes, en protégeant la peau contre le stress oxydant et en prévenant la glycation des protéines cutanées. Pour ce faire, la composition selon l'invention peut être appliquée sur la peau du visage et/ou du corps, plus particulièrement sur le visage et/ou le décolleté, à raison d'une à deux fois par jour, de préférence matin et/ou soir.

EXEMPLES

L’invention sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants, qui sont donnés à titre purement illustratif et n’ont pas pour but de limiter la portée de l’invention, définie par les revendications annexées.

Exemple 1 : Préparation d'un extrait selon l'invention

On a préparé un extrait selon l'invention suivant le procédé décrit ci-dessous.

Les parties aériennes fleuries sèches üHelichrysum italicum ont été broyées à l'aide d'un broyeur à couteaux équipé d'une grille de maille 12 mm. Le solvant d'extraction a séparément été préparé par mélange pendant 1 à 2h à 70°C de fructose, de glycérine et d'eau dans un rapport massique de 50:25:25, conduisant à un liquide limpide et incolore. Le solvant a été introduit dans un réacteur auquel la plante broyée a été ajoutée dans un rapport massique plante sèche broyée / solvant de 5/95. L'extraction a été effectuée pendant 3h à 70°C sous agitation continue. On a ensuite procédé à une séparation liquide / solide au moyen d'une essoreuse centrifuge, puis l'extrait brut a été clarifié par filtration frontale sur différents grades de plaques de filtration en profondeur. L'extrait clarifié a alors été filtré sur une cartouche contenant une membrane ayant un seuil de coupure de 0,22 pm. On a ainsi obtenu un extrait sous forme de liquide ambré.

Exemple 2 : Caractérisation de l'extrait

On a comparé la composition en polyphénols de l'extrait de l'Exemple 1 avec celle d'extraits huileux et aqueux CHelichrysiim italicum. L'extrait huileux a été obtenu comme suit. On a mélangé 9% en poids de poudre de plante séchée et broyée avec 91% d'une huile de tournesol désodorisée à l'aide d'ultrasons, dans un récipient refroidi à 10°C. L'extraction a été réalisée pendant 30 min, sous ultrasons, avec une agitation de 500 tours/min. L'extraction a été poursuivie au micro-ondes sous un flux d'azote de 0,4 L/min. Les phases solide et liquide huileuse obtenues ont été séparées par décantation, puis la phase huileuse a été filtrée et stockée sous atmosphère inerte, à l'abri de la lumière.

Matériel

- Chromatographie liquide ultra haute performance (Agilent Technologies, USA)

- Injecteur automatique 1290 sériés

- Détecteur à barrette de diodes (DAD) 1260 sériés

- Spectromètre de Masse : Esquire 6000 (Bruker Daltonics, Bremen) équipé d'une source d'ionisation Electrospray (ESI).

Préparation des échantillons

L’extrait aqueux a été dilué au io^eme dans un mélange MeOH/HzO (50/50).

L'extrait selon l'invention été dilué au 5^eme dans un mélange MeOH/HzO (50/50).

- L'extrait huileux a été préparé par dissolution de 2g de d’extrait huileux dans lmL d’hexane. Cette solution huileuse a été extraite 3 fois par 2mL d’un mélange MeOH/HzO (60/40). Les phases MeOH/HzO ont ensuite été regroupées.

Méthode d’analyse

Les solutions obtenues après dilution/extraction ont été filtrées sur filtre PTFE (0,45 pm) puis injectées (lpL) sur une colonne Agilent 08 (2,1 mm x 100 mm ; 1,8 pm) à une température maintenue à 25°C et à un débit de 0,4 mL/min. On a utilisé comme solvants : A = H2O/HCOOH (0,1%) et B = ACN/HCOOH (0,1%). Le gradient d'élution des polyphénols était le suivant :

Temps (min.)	% Solvant B
0	5
2	18,3
6	29
6,5	31,7
9,5	38,3
11,5	71
15	95
16	100
17	100
17,2	5
20,2	5

Tableau 1 : gradient d’élution des polyphénols

A la sortie du détecteur à barrette de diode, l’éluant a été injecté dans le spectromètre de masse. Les analyses ont été réalisées en mode négatif ou positif.

Les spectres de LC-MS ont été acquis sur l'ensemble de la gamme des masses (m/z) allant de 100 à 1400. L'ensemble des données a ensuite été collecté et traité par le logiciel Hystar version 3.0.

Résultats

Composé	Extrait huileux	Invention	Extrait aqueux
Isomère d'acide chlorogénique	n.d	22,8 ± 0,7	17,7 ±0,5
Acide chlorogénique	n.d	68,9 ± 1,5	9,6 ±0,3
Isomère d'acide chlorogénique	n.d	17,2 ±0,9	10,3 ±0,5
Acide dicaféoyl glucarique	n.d	31,0 ±0,8	2,4 ±0,1
Acide caféique	n.d	18,8 ±0,9	38,1 ±0,3
Acide dicaféoyl glucarique	n.d	n.d	n.d
Quercetagétine-O-hexoside	n.d	49,4 ± 1,9	n.d
Flavonoïde-O-hexoside	n.d	28,4 ± 1,3	n.d
Acide dicaféoyl quinique	n.d	75,0 ± 2,6	n.d
Acide dicaféoyl quinique	n.d	32,4 ± 1,3	<LQ
Acide dicaféoyl quinique	n.d	417,2 ± 12,8	<LQ

Acide dicaféoyl quinique	n.d	163,0 ±4,9	n.d
Acide dicaféoyl quinique	n.d	<LQ	n.d
Quercétine-O-hexoside-O- rhamnoside	n.d	8,3 ± 0,3	n.d
Arzanol	43.1 ±0.8	56,3 ± 1,7	n.d
Méthylarzanol	4.6 ±0.4	5,6 ±0,9	n.d
Diméthylarzanol	<LQ	<LQ	n.d
Hydroxytrémétone	Présence	Présence	Présence
Dérivés d’hydroxytrémétone	Présence

n.d : non détecté ; <LQ : détecté mais inférieur à la limite de quantification

Tableau 2 : composition majoritaire de la fraction polyphénolique des extraits d’immortelle

Comme il ressort de ce tableau, l'extrait selon l'invention se caractérise par une teneur élevée 5 en hétérosides de flavonoïdes, en particulier en O-hexosides de flavonols dihydroxylés sur le cycle B. Ils sont également plus riches en acide chlorogénique et en acide dicaféoyl quinique que les extraits aqueux. Il a par ailleurs été confirmé par chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse que le flavonoïde O-hexoside ne correspondait à aucun autre des composés cités ci-dessus.

Exemple 3 : Test in vitro sur expiant de peau humaine

3.1 Matériels & Méthodes

Traitement des expiants expiants de peau provenant de plastie abdominale d’un donneur féminin ont été incubés indépendamment en présence de l’extrait préparé dans l'Exemple 1, pendant 72h dans un milieu de culture de peau (Biopredic) à 37°C et à 5% de CO2 à l’interface air-liquide. L’extrait selon l'invention a été directement dilué dans le milieu de culture à la concentration de 0,5%.

3 expiants de peau non traités ont été incubés dans les mêmes conditions.

Extraction des protéines

Le pool de 3 expiants non traités ou traités avec l'extrait selon l'invention à 0,5% a été broyé à l'aide d'un mixeur à immersion (Kinematica, Polytron PT1200E) équipé d'un axe de 5 mm dans un tampon contenant du DTT, de l’EDTA et un cocktail d’antiprotéases. Les protéines des homogénats ont été extraites par chauffage puis sonication sur glace en présence de 2% de SDS. Les lysats ont été centrifugés (15000 g, 10 minutes). Les protéines ont été dosées à l'aide du kit Pierce 660nm Protein Assay (Thermo, Cat N°22660).

Préparation des peptides

Les extraits peptidiques ont été préparés selon la méthode FASP (Filter Aided Sample Préparation). 250 pg de protéines de chaque extrait ont été chargés sur un ultrafiltre (Amicon Ultra 0.5, lOkDa MWCO). Les protéines ont été réduites (Dithiothréitol), alkylées (Iodoacétamide) et digérées (Trypsine). Les peptides issus de cette digestion ont été dessalés par SPE (SepPak Cl8), séchés et solubilisés dans 100 pl d’une solution contenant 5% d’acétonitrile et 0.1% d’acide formique.

Les peptides ont été dosés par la méthode BCA.

Analyse par spectrométrie de masse / chromatographie en phase liquide en tandem (LCMS/MS)

Pour chaque échantillon, 2,5 μΐ d’extrait peptidique ajusté à 100 ng/μΐ ont été injectés en triplicat. La chromatographie a été réalisée avec Ultimate 3000 (Dionex). La colonne chromatographique utilisée était une colonne 08 (75 pm x 50 cm, 3 pm). Après une période de 2 minutes de piégeage sur pré-colonne, un gradient de 5 à 35% d’acétonitrile a été appliqué pendant 60 minutes avec un débit de 300 nl/minute.

Les données ont été acquises avec un Q-Exactive HF (Thermo). Le scan MS a été réalisé à 60000 de résolution avec un délai transitoire de 100 ms. Le scan MS/MS a été réalisé à 17500 de résolution sur les 20 ions les plus intenses avec un temps d’accumulation de 60 ms. 2800 cycles ont été réalisés soit 23 cycles (mesures) par pic chromatographique.

Les paramètres expérimentaux suivants ont été appliqués à cette analyse :

Voltage source	Gaz de balayage	Température tube de transfert	Energie de collision
1300V	0 psi	250°C	variable*

* L’énergie de collision est déterminée automatiquement en fonction de la masse et de la charge du composé analysé.

Analyse des données

Identification des protéines : L’identification a été effectuée à l’aide de l’algorithme MASCOT (version 2.4) contre une base de données Uniprot KB regroupant le protéome de référence humain et la protéase utilisée pour la digestion (trypsine de porc).

Quantification des protéines : l’analyse a été réalisée grâce aux logiciels Skyline 3.5.1 et Marker View 1.2.1.

Une bibliothèque de peptides identifiés par leur masse exacte et leur temps de rétention a été générée à partir des interrogations MASCOT. Les XIC (Extract Ion Chromatograms) ont été générés par le logiciel Skyline 3.5.0 avec pour paramètre une précision en masse de +/-10 ppm et une précision en temps de rétention de +/- 2,5 minutes. L’analyse statistique des résultats a été effectuée à l’aide du logiciel Marker View 1.2.1. Pour pallier aux variations expérimentales, les aires de chaque protéine ou peptide ont été normalisées par la somme des aires de toutes les protéines ou tous les peptides. Deux tests statistiques ont été effectués : une analyse en composante principale (ACP Pareto) pour évaluer graphiquement l’homogénéité des résultats pour un même échantillon et les différences entre échantillons et un test de Student pour déterminer si les différences observées entre échantillons sont statistiquement significatives (seuil : p <0,05).

Résultats

619 protéines ont été identifiées dans les échantillons traités et non traités parmi lesquelles 240 protéines sont significativement régulées (p<0,05) par traitement avec l’extrait selon l'invention à 0,5%. Sur ces 240 protéines, 106 protéines sont régulées avec un facteur de variation (fold change en anglais) supérieur ou égal à 1,3 ou inférieur ou égal à 0,77 comparativement au contrôle non traité (p<0,05).

Les voies de signalisation qui ont été mises en évidence à l’aide de l’analyse CORAVALID comme enrichies par traitement avec l’extrait selon l'invention à 0,5% sont :

Mécanisme de réparation de l’ADN Mécanisme de protection contre le stress oxydant Prévention de la glycation

Différenciation épidermique : fonction barrière Adhésion cellulaire

Synthèse protéique : Prolifération cellulaire Régénération tissulaire

Mécanisme de réparation de ΓΑΡΝ:

Désignation	Nom anglais de la protéine		Variation	P
XRCC5 HUMAN	X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5	P13010	1,44	0,0401
CTNB1HUMAN	Catenin beta-1 (Beta-catenin)	P35222	1,33	0,0012
HMGB1HUMAN	High mobility group protein B1	P09429	2,38	0,0180

Mécanisme de protection contre le stress oxydant :

Désignation	Nom anglais de la protéine		Variation	P
CATAHUMAN	Catalase	P04040	1,44	0,0040
PARK7HUMAN	Protein deglycase DJ-1	Q99497	1,39	0,0451
HEMOHUMAN	Hemopexin	P02790	1,61	0,00002

Prévention de la glycation

Désignation	Nom anglais de la protéine		Variation	P
PARK7HUMAN	Protein deglycase DJ-1	Q99497	1,39	0,0451

Différenciation épidermique: Fonction barrière

Désignation	Nom anglais de la protéine		Variation	P
DCD HUMAN	Dermcidin	P81605	1,87	0,0143
FABP4HUMAN	Fatty acid-binding protein 4	P15090	1,87	0,0012
CNFN_HUMAN	Cornifelin	Q9BYD5	1,32	0,0156
FILA2HUMAN	Filaggrin-2	Q5D862	1,58	0,0000
CTNB1HUMAN	Catenin beta-1 (Beta-catenin)	P35222	1,33	0,0012
XP32HUMAN	Skin-specific protein 32	Q5T750	2,90	0,0002
BBC3HUMAN	Bcl-2-binding component 3	Q9BXH1	4,31	0,0294
CYC HUMAN	Cytochrome c	P99999	1,34	0,0017
DMKN HUMAN	Dermokine	Q6E0U4	1,54	0,0069
FHL1HUMAN	Four and a half LIM domains protein 1	Q13642	1,50	0,0020
K2C6BHUMAN	Keratin, type II cytoskeletal 6B	P04259	0,47	0,0002

Adhésion cellulaire:

Désignation	Nom anglais de la protéine		Variation	P
ACTN2HUMAN	Alpha-actinin-2	P35609	1,33	0,0027
TLN1HUMAN	Talin-1	Q9Y490	1,32	0,0018
VINC HUMAN	Vinculin	P18206	1,34	0,0138

Synthèse protéique (transcription/traduction/modifîcation des protéines): Prolifération cellulaire

Désignation	Nom anglais de la protéine		Variation	P
RA1L2HUMAN	Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Al-like 2	Q32P51	1,63	0,0007
RSMB HUMAN	Small nuclear ribonucleoprotein- associated proteins B and B'	P14678	1,99	0,0331
RS11HUMAN	40S ribosomal protein SI 1	P62280	2,52	0,0461
RS28HUMAN	40S ribosomal protein S28	P62857	1,73	0,0001
RS18HUMAN	40S ribosomal protein S18	P62269	1,70	0,0278
RS30HUMAN	40S ribosomal protein S30	P62861	1,57	0,0041
RS7HUMAN	40S ribosomal protein S7	P62081	1,45	0,0046
RS3AHUMAN	40S ribosomal protein S3a	P61247	1,35	0,0029
RS26LHUMAN	Putative 40S ribosomal protein S26- like 1	Q5JNZ5	1,34	0,0242
RL19HUMAN	60S ribosomal protein L19	P84098	1,77	0,0104
RL4HUMAN	60S ribosomal protein L4	P36578	1,46	0,0054
RL31HUMAN	60S ribosomal protein L31	P62899	1,44	0,0449
RL3HUMAN	60S ribosomal protein L3	P39023	1,41	0,0037
RL35AHUMAN	60S ribosomal protein L35a	P18077	1,38	0,0204
RL27HUMAN	60S ribosomal protein L27	P61353	1,32	0,0041
PIAS4HUMAN	E3 SUMO-protein ligase PIAS4	Q8N2W9	0,20	0,0005
K1C15HUMAN	Keratin, type I cytoskeletal 15	P19012	1,36	0,0005

Réponse régénérât!ve (cicatrisation tissulaire):

Désignation	Nom anglais de la protéine		Variation	P
A1AG1HUMAN	Alpha-1-acid glycoprotein 1	P02763	2,30	0,0197
A1ATHUMAN	Alpha-1 -antitrypsin	PO1009	1,42	0,0000
CATB HUM AN	Cathepsin B	P07858	1,59	0,0083
FIBGHUMAN	Fibrinogen gamma chain	P02679	1,88	0,0000
FIBBHUMAN	Fibrinogen beta chain	P02675	1,66	0,0002
FIBAHUMAN	Fibrinogen alpha chain	P02671	1,58	0,0016
TPM1HUMAN	Tropomyosin alpha-1 chain	P09493	1,33	0,0093
AACTHUMAN	Alpha-1 -anti chymotrypsin	P01011	1,56	0,0043
TRFEHUMAN	Serotransferrin	P02787	1,38	0,0000
APOH HUMAN	Beta-2-glycoprotein 1	P02749	1,72	0,0195

Conclusion

L’extrait d’immortelle selon l'invention permet d'augmenter la différenciation des cellules 5 épidermiques, de renforcer la fonction barrière de la peau et de maintenir une meilleure hydratation. Il permet également une meilleure adhésion cellulaire associée à des capacités accrues de régénération tissulaire et à une augmentation de la synthèse protéique. Par ailleurs, l’extrait d’immortelle selon l'invention stimule les défenses de la peau contre le stress oxydant et accroît les capacités de réparation de l’ADN, ainsi que la prévention de la glycation. Il peut donc avantageusement être utilisé dans une composition cosmétique pour prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement.

Exemple 4 : Test in vitro sur culture de kératinocytes humains

Matériels & Méthode

Culture cellulaire

Des kératinocytes, provenant d’une biopsie mammaire réalisée sur un donneur féminin de 60 ans, ont été ensemencés dans des plaques 96 puits (Nunc) à raison de 8000 cellules par puits dans un milieu de croissance de kératinocytes (KGM Gold, Lonza) supplémenté d’extrait pituitaire bovin, d’EGF, d’insuline, d’épinephrine et de calcium. Les cellules ont été maintenues 3 jours en culture à 37°C et sous 5% de CO2. A la fin de ce temps de culture de 3 jours, le milieu de culture a été remplacé par du milieu KGM Gold (Lonza) sans hydrocortisone qui est un anti-inflammatoire pouvant interférer avec le test.

Evaluation de la production d’IL-8 induite par un stress inflammatoire

Après 24h de privation en hydrocortisone, les cellules ont été stressées à l’aide de 200 ng/ml de flagelline (Invivogen) et traitées en même temps avec l’extrait d’immortelle selon l'Exemple 1 à différentes concentrations ou avec des molécules anti-inflammatoires de référence : le gallate d'épigallocatéchine (EGCG; Enzo LifeSciences) à 10 μΜ ou l’hydrocortisone (HC, SigmaAldrich) à 500 ng/ml. Un contrôle « non traité » sans addition de flagelline ni traitement a été réalisé. Il représente le niveau basal d’IL-8 en conditions non inflammatoires.

La culture a été maintenue pendant 2 jours sans changement de milieu.

Après 2 jours de culture, les milieux de culture ont été prélevés pour doser la production de la cytokine IL-8 induite par la flagelline à 200 ng/ml.

Le dosage de l’IL-8 dans les milieux de culture a été réalisé à l’aide du kit « IL8 single analyte ELISArray kit» (Qiagen). Le protocole de dosage d'IL-8 utilisé était celui du fournisseur. Brièvement, le tampon de dilution contenant 1% de BSA (concentration finale) a été préparé pour diluer les échantillons au 1/5 et la gamme d’étalonnage effectuée en dilution sérielle de moitié de 200 pg/ml à 31,3 pg/ml. Le tampon d'essai contenant 0,2% de BSA a également été préparé. Ensuite, sur la plaque revêtue de l’anticorps IL-8 (fournie dans le kit), 50 μΐ de tampon d'essai ont été ajoutés puis 50 μΐ d’échantillons dilués au 1/5 ou la gamme ont été ajoutés dans chaque puits et incubés à température ambiante pendant 2h. Après ces 2h d’incubation, la solution d'anticorps de détection a été ajoutée, suivie de 3 lavages de la plaque avec une solution de tampon de lavage. Une solution de conjugué « Avidin-HRP » a été ajoutée dans chaque puits et incubée pendant 30 minutes à l’obscurité, suivie de 4 lavages avec la solution de tampon de lavage. Une solution de développement a été ajoutée à chaque puits et incubée pendant 15 min. Puis une solution d'arrêt a été ajoutée pour arrêter la réaction. L’absorbance a été lue à 450 nm puis corrigée par celle lue à 470 nm. La valeur obtenue à 470 nm a été soustraite de la valeur obtenue à 450 nm.

En parallèle, la viabilité cellulaire a été évaluée de la manière suivante.

Après avoir prélevé les milieux de culture pour le dosage d'IL-8, les cellules ont été incubées avec une solution de XTT à 0,3 mg/ml (Roche Diagnostics) pendant 2h à 37°C et sous 5% de CO2.

A la fin de la période d’incubation, l’absorbance a été mesurée à 450 nm.

La viabilité cellulaire a été calculée de la manière suivante :

% viabilité = (moyenne des DO mesurées dans les puits traités - blanc)/ (moyenne des DO mesurées dans les puits non traités - blanc) X 100 Le seuil de toxicité était fixé à 80% de viabilité cellulaire.

Etudes statistiques

Les études statistiques ont été faites par le test One Way ANOVA.

Résultats

Cytotoxicité de l’extrait selon l'invention

L’extrait d’immortelle selon l'invention n’était pas toxique pour les kératinocytes humains aux concentrations évaluées.

Production d’IL-8 induite par un stress inflammatoire

Le traitement avec la flagelline à 200 ng/ml pendant 48h a induit une augmentation de production d’IL-8 par les kératinocytes. Cette augmentation était de 789,2 ± 344,9% (p<0,001) par rapport au contrôle non traité (100 ± 4,1%). Ce résultat a permis de valider le stress inflammatoire induit par la flagelline à 200 ng/ml.

En présence d’HC à 500 ng/ml ou d’EGCG à 10 μΜ (témoins positifs), la production d’IL-8 par les kératinocytes était respectivement diminuée de 58,4% (p<0,05) et de 89,2% (p<0,005) par rapport à la production induite par la flagelline à 200 ng/ml. Ce résultat a permis de valider l’expérience.

L'extrait d’immortelle selon l'invention aux concentrations de 0,1% et 0,05% diminuait également significativement la production d’IL-8 de 68,4% (p<0,01) et de 86,4% (p<0,005).

Conclusion

Cet exemple démontre que l’extrait d’immortelle selon l'invention diminue la production d’IL8 induite par un stress inflammatoire dans des kératinocytes humain en culture. Il est ainsi possible d'envisager son utilisation comme agent apaisant dans des compositions cosmétiques, notamment dans le traitement des peaux sensibles.

Exemple 4 : Composition cosmétique

La composition suivante a été préparée de manière classique pour l'homme de l'art, en 5 mélangeant les ingrédients ci-dessous dans les proportions pondérales indiquées.

Emulsionnants non ioniques 6,00 %

Beurre de karité 2,00 %

Epaississants de phase grasse 6,50 %

Huiles 8,25 %

Adénosine 0,04 %

Glycérine 6,00 %

Epaississants de phase aqueuse 2,50 %

Extrait selon l'invention 1,00%

Hydroxyde de sodium 1,00%

Conservateurs qs

Parfum qs

Eau qsp 100,00%

Claims

1. Composition cosmétique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, un extrait üHelichrysum italicum renfermant des hétérosides de flavonols dont le cycle B est

5 dihydroxylé et une huile essentielle d'immortelle.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les hétérosides de flavonols comprennent au moins un hétéroside, notamment un O-hexoside, de quercétagétine et/ou un hétéroside de quercétine.

3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'extrait CHelichrysiim italicum renferme au moins 50 ppm d'hétérosides de flavonols.

4. Utilisation cosmétique de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, 15 par application topique sur la peau, pour prévenir ou traiter les signes du vieillissement cutané et/ou comme agent apaisant.