JP6393685B2 - 顕微鏡、及び顕微鏡による試料検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料のための照明光を生成するための１又は複数のレーザと、試料からの検出信号のための検出装置を有する顕微鏡、とりわけ共焦点顕微鏡、に関する。更に、本発明は、顕微鏡、とりわけ共焦点顕微鏡、によって試料を検査するための方法に関する。

冒頭に掲げたタイプの顕微鏡及びそのような顕微鏡による試料の検査方法は実用上知られており、種々多様な実施の態様が存在する。例えば、共焦点レーザ顕微鏡法の場合、通常、生物学的試料は着色物質（色素）でマークされる（標識される）。その際、しばしば、異なるオルガネラ（複数）が異なる着色物質（複数）でマークされる。これらの着色物質は、１つのレーザ又は複数のレーザによって生成される照明光によって励起されて光を放出する。試料内に複数（の種類）の着色物質が存在する場合、これらは、大抵、検出装置内における波長分離によって異なる画像チャンネル（複数）に描出（ないし表示）される（dargestellt）。その際、相応の検出信号（複数）が、検出のために予め設定可能な異なる波長領域（複数）が調整可能であるか又は構成されている検出チャンネル（複数）を通り抜ける。

着色物質の放出スペクトルは互いに重なりあうことが多い。更に、大抵、反射された励起光は、着色物質の放出スペクトルの中に入り込む。例えば自家蛍光、第２高調波発生又は共鳴エネルギ移動のような現象も、単なる波長分離によっては、「正常な」蛍光フォトンから区別することはできない。これらの現象は試料に関する付加的情報を提供するか或いは純粋な蛍光画像に妨害的に重畳するため、検出において、これらの現象を本来的な蛍光信号から分離可能にすることが望まれる。

例えば共焦点レーザ顕微鏡の場合、蛍光光は検出の前にしばしば色的に分割（分解）される。これは、カスケード状に配置された複数の光学的ビームスプリッタによって、１つのプリズムによって、又は１つの格子を含む装置によって達成される。スペクトル分割後、光は、異なる検出チャンネル（複数）を形成するための異なる検出器（複数）に入射する。従って、各検出器ないし各検出器チャンネルには、１つの特定の波長領域が割り当てられる。

更に、蛍光寿命の測定のために、２つの方法が知られている。第１の方法は、個別フォトンカウント（Einzelphotonenzaehlung）であり、この方法では、各フォトンについて、励起と検出信号の間の時間が測定される。その際、極めて多数の個別測定について統計的処理が行われる。この場合、減衰曲線、従って、着色物質分子の寿命を求めることが、その目的である。必要なデータ量が多いため、評価は、大抵、オフラインで実行される。尤も、寿命の概算であれば、測定された個別値の平均をとることによりオンラインで行うことも可能である。

蛍光寿命を測定するための第２の既知の方法は、いわゆるゲーティング（Gating）法であり、この方法では、フォトン（複数）が、測定前に規定される時間ウィンドウ（複数）に分類して入れられる。この場合、測定後に着色物質の寿命を計算可能にするために、個別フォトン測定の場合のように、統計的処理が行われる。既知のゲーティング法では、ゲーティング・ウィンドウ毎に夫々１つの測定が実行される。

ＥＰ ２ ２５３ ９８３ Ａ２ ＷＯ ２００４／１１３９８７ Ａ１ ＥＰ １ ３０８ ７１５ Ａ１

既知の顕微鏡及び試料を検査するための既知の方法の場合、試料に関する情報を運搬する多数の現象が検出の際に認識（識別）できないことが問題である。これらの現象の検出信号は、しばしば、使用されずに抑圧ないし除去（unterdrueckt）されたり、少なくとも低減されるため、他の現象の測定の際に最早障害を引き起こさない可能性がある。しかしながら、この場合、場合によって利用可能な検出信号までも無駄になる（利用不能になる）。

それゆえ、本発明の課題は、冒頭に掲げたタイプの顕微鏡及び冒頭に掲げたタイプの顕微鏡により試料を検査するための方法であって、検査の際の複数の現象のとりわけ良好な分離により、異なる現象（複数）を考慮したとりわけ多面的な使用を可能にする顕微鏡及び試料検査方法を提供することである。

本発明により、上記の課題は、請求項１に記載の顕微鏡によって、及び、請求項８に記載の顕微鏡による試料検査方法によって解決される。
具体的には、上記の課題を解決するために、本発明の第１の視点により、試料のための照明光を生成するための１又は複数のレーザと、試料からの検出信号のための検出装置を有する顕微鏡、とりわけ共焦点顕微鏡が提供される。該顕微鏡においては、該検出装置が予め設定可能な異なる波長領域を検出するために調整可能な複数のスペクトル検出チャンネルを有するよう構成され、
前記複数のスペクトル検出チャンネルに夫々複数の時間的検出ウィンドウが割り当て可能に構成され、前記複数のスペクトル検出チャンネルに夫々割り当て可能に構成された前記複数の時間的検出ウィンドウは、測定中に調整可能である（形態１・第１基本構成）。
（形態２）上記の顕微鏡において、前記スペクトル検出チャンネルの波長領域及び／又は前記時間的検出ウィンドウは、測定中、調整可能及び／又は描出ないし表示可能であることが好ましい。
（形態３）上記の顕微鏡において、前記波長領域及び／又は前記時間的検出ウィンドウは夫々異なる値を有することが好ましい。
（形態４）上記の顕微鏡において、各スペクトル検出チャンネルに対し、１つの独立の評価電子装置又は独立の評価チャンネルが割り当てられるか又は複数の独立の評価チャンネルが割り当てられ、有利には各評価チャンネルに対し、１つの時間的検出ウィンドウ又は複数の時間的検出ウィンドウが割り当てられることが好ましい。
（形態５）上記の顕微鏡において、前記評価電子装置における前記１つの評価チャンネルにおける又は前記複数の評価チャンネルにおける評価は、前記時間的検出ウィンドウに時間的に関連する制御信号によって活性化可能又は不活性化可能であることが好ましい。
（形態６）上記の顕微鏡において、２又は３以上の時間的検出ウィンドウが、データ取り込み中又はデータ取り込み後に互いに関連付け可能であり、有利には、該関連付けの結果は描出ないし表示可能であることが好ましい。
（形態７）上記の顕微鏡において、異なる時間的検出ウィンドウに対し異なるレーザが割り当て可能であることが好ましい。
更に、上記の課題を解決するために、顕微鏡、とりわけ共焦点顕微鏡、とりわけ上記形態１〜７の何れかの顕微鏡、によって試料を検査するための方法が提供される。該方法においては、該顕微鏡が、試料のための照明光を生成するための１又は複数のレーザと、該試料からの検出信号のための検出装置を有し、該検出装置が、予め設定可能な異なる波長領域の検出のために調整可能な複数のスペクトル検出チャンネルを有し、
前記複数のスペクトル検出チャンネルに夫々複数の時間的検出ウィンドウが割り当て可能であり、かくして、検出信号が前記複数の時間的検出ウィンドウに取り込まれ、前記複数のスペクトル検出チャンネルに夫々割り当て可能に構成された前記複数の時間的検出ウィンドウは、測定中に調整可能である（形態８・第２基本構成）。
（形態９）上記の方法において、取り込まれるべき検出信号の評価は並行的又は順次的に実行されることが好ましい。
（形態１０）上記の方法において、各スペクトル検出チャンネルに対し、１つの独立の評価電子装置又は独立の評価チャンネルが割り当てられるか又は複数の独立の評価チャンネルが割り当てられ、有利には各評価チャンネルに対し、１つの時間的検出ウィンドウ又は複数の時間的検出ウィンドウが割り当てられることが好ましい。
（形態１１）上記の方法において、前記評価電子装置における前記１つの評価チャンネルにおける又は前記複数の評価チャンネルにおける評価は、前記時間的検出ウィンドウに時間的に関連する制御信号によって活性化又は不活性化されることが好ましい。
（形態１２）上記の方法において、順次的評価の場合、時間的検出ウィンドウの終端において前記制御信号を不活性化する毎に、アドレスカウンタがインクリメントされることが好ましい。
（形態１３）上記の方法において、時間的検出ウィンドウの評価された画像情報を含む各記憶セルは、個別に予め設定可能なマークが配されることが好ましい。
（形態１４）上記の方法において、取り込まれるべき検出信号の評価は、トラック・アンド・ホールド回路によって実行され、ゲーティングパルスの各スタートによって、データ蓄積が開始されることが好ましい。
（形態１５）上記の方法において、２又は３以上の時間的検出ウィンドウは、データ取り込み中又はデータ取り込み後に互いに関連付けられ、有利には、該関連付けの結果が描出ないし表示されることが好ましい。
（形態１６）上記の方法において、異なる時間的検出ウィンドウに対し異なるレーザが割り当てられることが好ましい。

試料検査中に異なる現象（複数）を互いに分離し評価することが、測定方法を巧妙に構成及び実行することによって可能であることが、本発明において初めて認識された。このため、具体的態様においては、スペクトル検出チャンネル（複数）において夫々複数の時間的検出ウィンドウが調整可能に構成され、かくして、検出信号（複数）が調整可能な時間的検出ウィンドウに取り込まれることができる。従って、この場合、検出信号の時間依存性、例えば極めて迅速に出現する反射光及び通常はより遅れて出現する蛍光光、が考慮される。これに関して実行される時間的検出ウィンドウによる時間的分離によって、反射信号及び蛍光信号の相互の妨害（ないし干渉）は大幅に回避される。従って、これら２つ現象は、互いに独立に検査及び評価されることができる。従って、本発明の顕微鏡及び本発明の方法によって、波長選択と検出される時間ウィンドウの選択の間のダイナミックな協働、従って例えば画像コントラストの最適化が可能になる。更に、両者の選択方法即ち波長と時間的検出ウィンドウの選択方法を組み合わせることによって、例えば共焦点画像生成における付加的情報を生成することが可能になる。とりわけ、利用者は、画像生成に関し、直ちにヴィジュアル的なフィードバックを取得することができ、場合によっては、測定中においても、検出チャンネル及び検出ウィンドウの調整を適正化することができる。

従って、本発明の顕微鏡及び本発明の試料検査方法によって、検査中の複数の現象のとりわけ良好な分離により、異なる現象（複数）を考慮したとりわけ多面的な使用が可能にされる。

具体的には、スペクトル検出チャンネル（複数）の波長領域（複数）は、測定中に調整可能及び／又は描出（表示）可能にされることができる（であろう）。これによって、その都度の使用例に対する測定の調整の適正化が可能になる。この場合、画像生成によるヴィジュアル的フィードバックは有益であり得る（であろう）。これに対し代替的に又は追加的に、時間的検出ウィンドウは測定中に調整可能及び／又は描出（表示）可能にされることができる（であろう）。これによっても、例えば画像コントラストの適正化のために既存の測定状況への適合化が可能にされる。画像による描出ないし表示（Darstellung）は測定を容易化し、より快適に（便宜的に）する。

更なる有利な一形態では、波長領域（複数）は異なる大きさを有することができる（であろう）。これによっても、その都度の使用例を考慮した測定条件の適正化が可能になる。使用例次第では、波長領域（複数）は同じ大きさにすることもできるであろう。これに対し代替的に又は付加的に、時間的検出ウィンドウ（複数）はその都度異なる大きさを有することができる（であろう）。これによって、検出信号（複数）の個別の時間的推移に対する適合化が可能になる。

検出信号のとりわけ快適（便宜的）かつ多面的な評価を考慮し、各スペクトル検出チャンネルに対し１つの独立の評価電子装置又は１つの独立の評価チャンネルを割り当てることができる（であろう）。これに対し代替的に（その代わりに）、個別の検査状況に対しとりわけフレキシブルに評価を適合可能にするために、各スペクトル検出チャンネルに対し複数の独立の評価チャンネルを割り当てることもできる（であろう）。更にフレキシブルな態様では、その際、各評価チャンネルに対し１つの時間的検出ウィンドウ又は複数の時間的検出ウィンドウを割り当てることができる（であろう）。

取り込まれるべき検出信号（複数）の評価は、この場合、使用例に応じて、並行（並列）的（parallel）又は順次（直列）的（seriell）に実行することもできる（であろう）。１つのスペクトル検出チャンネルに複数の独立の（別々の）評価チャンネルが割り当てられる場合、並行的評価が可能であり、その際、更に、各評価チャンネルに対し、予め設定可能な数の検出ウィンドウを割り当てることができる（であろう）。単独の評価チャンネルの場合（評価チャンネルが１つの場合）、取り込まれるべき検出信号（複数）の順次的評価を実行することができる（であろう）が、この場合、その都度１つの検出ウィンドウが順次的に評価されるべきであろう。

更なる有利な一形態では、評価電子装置における、１つの評価チャンネルにおける又は複数の評価チャンネルにおける評価は、時間的検出ウィンドウ（複数）に時間的に対応する（関連する：korrelieren）制御信号（複数）によって活性化（作動）又は不活性化（停止）されることができる（であろう）。制御信号（複数）により評価を活性化する場合、評価は、（１つの）制御信号を受領してから実行される。不活性化の場合は、制御信号の受領後、評価は最早実行されない。使用例によっては、活性化モードに応じた又は不活性化モードに応じた、適切な制御プロセスを選択することもできる。

更なる有利な一形態では、２又は３以上の時間的検出ウィンドウが、データ取り込み中又はデータ取り込み後に、互いに関連付けられることができる（であろう）。有利には、この関連付け（Verrechnung）の結果は、例えばディスプレイに出力することによって、描出（表示）可能（darstellbar）にすることができる（であろう）。

更なる有利な形態では、異なる時間的検出ウィンドウ（複数）に対し、異なるレーザ（複数）を割り当て可能にすることができる（であろう）。その限りにおいて、例えば、各時間的検出ウィンドウに対して又は複数の時間的検出ウィンドウのグループ（複数）に対しても、夫々、異なるレーザ（複数）を割り当て可能に構成することができる（であろう）。更には、単独の（１つの）時間的検出ウィンドウ又は複数の時間的検出ウィンドウの１つのグループに対して、夫々、複数のレーザを割り当て可能に構成することもできる（であろう）。これについては、その都度の使用例が考慮されるべきである。

相応の一形態では、好適な態様で構成された顕微鏡による試料検査方法において、有利な態様で、２又は３以上の時間的検出ウィンドウが、データ取り込み中又はデータ取り込み後に、互いに関連付けられ、そして、有利には、その関連付けの結果が描出されることができる（であろう）。同様に、好適な方法において、異なる時間的検出ウィンドウ（複数）に対し、異なるレーザ（複数）が割り当てられることができる（であろう）。

順次的評価の場合、時間的検出ウィンドウの終端における制御信号の不活性化の都度、アドレスカウンタをインクリメントすることができる（であろう）。これにより、画像撮像（記録）中における個々の時間セグメント（複数）の分離された描出ないし表示（Darstellung）が可能になる。各時間セグメントないし各時間的検出ウィンドウに対し評価された画像情報は、アドレスカウンタのインクリメントによって、独自の（専属の）記憶セルに存在することができる（であろう）。順次的評価において、複数の時間セグメントないし複数の検出ウィンドウが統合される（まとめられる）べき場合には、並行的評価の場合には簡単に達成可能であるように、これは、割り当てられた記憶セルの内容の後続の（その後に行われる）関連付けによって、順次的評価の場合にも容易に達成されることができる（であろう）。

このような順次的評価の場合においても、画像信号の特定の時間セグメントの目標を定めた抑圧ないし除去（Unterdrueckung）を可能にする評価の反転（Invertierung）を達成することができる（であろう）。このため、（１つの）時間的検出ウィンドウの評価された画像情報を含む各記憶セルに、個別に予め設定可能なマーク（ないし標識）が配されることができる（であろう）。このマークは、後続の評価において、この時間セグメントないし検出ウィンドウの内容を全体画像から差し引くことを可能にする。

評価の更に有利な態様では、取り込まれるべき検出信号の評価はトラック・アンド・ホールド回路によって実行することができる（であろう）。この場合、ゲーティングパルスの開始によって、その都度、データ蓄積が開始されることができる（であろう）。

提示した方法によって有益な情報を与えるデータを取得するために、一方ではデータを高い繰返し率で取り込むこと、他方では高い時間的解像度を達成することは、有用である。この場合、８０ＭＨｚの繰返し率は有利である。上述の２つの要求ないし要件は、設計上の実装によってＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）又はＡＳＩＣ（Application-Specific Integrated Circuit）においてとりわけ有利な態様で適合されることができるが、この場合、ＦＰＧＡ／ＡＳＩＣとスキャン（ないしサンプリング）ないしデータ取り込みのための可及的に少ない超高速モジュールの組み合わせは、とりわけ好都合である。

まとめると、共焦点レーザ顕微鏡法の画像生成は、従来、検出信号の時間的依存を考慮していなかったことは、ここで確認しておくべきことである。従って、試料に関する情報を運搬する多くの現象は検出の際に認識（識別）されることはできない。更に、蛍光顕微鏡法における時間的現象を測定するための既存の方法は、専ら、着色物質分子の寿命を可及的に正確に量的に求めることを目標として有する。更に、この場合、測定中におけるパラメータの適合化は行われない。とりわけ、波長選択と検出される時間ウィンドウの選択の間のダイナミックな協働は、既知の方法では不可能である。

本発明の教示を有利な態様で構成及び発展させる種々の可能性が存在する。このために、一方では、添付の請求の範囲が、他方では、図面を参照した本発明の好ましい実施例の以下の説明が参照されるべきである。図面を参照した本発明の好ましい実施例の説明と関連して、本発明の教示の一般的に好ましい実施形態及び発展形態も説明される。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は専ら発明の理解を助けるためのものであり、本発明を図示の態様に限定することを意図したものではない。

複数の検出チャンネル及び夫々に割り当てられた複数の時間的検出ウィンドウについての本発明の構成の一例の模式図。 図１の構成例を有する異なる検出ウィンドウ（複数）及び異なる検出チャンネル（複数）によって取り込まれた複数の画像データの一例の模式図。 並行的評価のための３つの評価チャンネルの一構成例のダイアグラム。 並行的評価の一例の模式図。 順次的評価の場合の複数の検出ウィンドウの時間的順序の一例のダイアグラム。 順次的評価の一例の模式図。 トラック・アンド・ホールド回路の一例の模式図。 複数の異なる検出器の検出ウィンドウ（複数）と１つのレーザとの関連付けの一例の模式図。 複数の異なる検出器の検出ウィンドウ（複数）と複数の異なるレーザとの関連付けの一例の模式図。 １つの検出器の複数の検出ウィンドウと複数の異なるレーザとの関連づけの一例の模式図。 １つのピクセル上での順次的画像取り込みによるクロス信号（Kreuzsignal）の除去の一例の模式図。 データ評価のための、１つのピクセル上での順次的画像取り込みの際の、クロス信号の使用の一例の模式図。

本発明の一実施例では、検出されるフォトンの付加的特性として、着色物質（色素）の励起後、生成されたフォトンが検出器に衝突（到達）するまでの時間（期間）ないし時間ウィンドウが使用される。例えば、反射、自家蛍光及び蛍光はその特性において互いに相違するため、これらを検出の際に互いに分離することが可能になる。

この実施例では、時間的検出ウィンドウは、共焦点レーザ顕微鏡法の画像生成において、検出波長領域と並んで、複数の検出信号の分離のための第２の基準として導入される。図１は、このために、ユーザインタフェースにおける２つの独立チャンネルＣｈ．１及びＣｈ．２のための調整可能性の一例を模式的に示す。この場合、波長領域１及び２の数、及び、時間的検出ウィンドウＣｈ．１．１、Ｃｈ．１．２及びＣｈ．１．３ないしＣｈ．２．１、Ｃｈ．２．２及びＣｈ．２．３の数については、夫々、視認性の観点から、図１においては、２つの波長領域、及び、波長領域ないし検出チャンネル当たり３つの時間的検出ウィンドウに限定されている。しかしながら、一層より多くの波長領域及び一層より多くの時間的検出ウィンドウを使用することも可能である。

図１に示した実施例における画像生成は、図２に基づいて以下のように説明できるであろう：Ｃｈ．１は緑色光−輪郭が破線で示されたもの−のみを受け取り、Ｃｈ．２は赤色光−輪郭が実線で示されたもの−のみを検出する。検出ウィンドウ内のシンボルの一重の輪郭は、この実施例では、Ｃｈ．１．３及びＣｈ．２．３に示されているように、極めて早期に生成される反射光を表す。他方、二重の輪郭を有するシンボルは蛍光信号を表す。例えば、この場合、ハート（のシンボル）は長寿命の蛍光であり、これに対し、顔（のシンボル）は短寿命の蛍光であることが示されている。

蛍光顕微鏡法では、例えば、以下の実用的使用が可能であるが、これらに限定されないことに留意すべきである。

蛍光光と反射光の分離を実行することができる（であろう）。この場合、２又は３以上の検出チャンネルにおいて互いに重なりあう波長領域（複数）を有する複数の検出チャンネルの同時表示を達成することができる。一方では、反射光は、蛍光光の画像生成に対し妨害的に作用し得る。他方、純粋な反射画像は、例えば光学的境界面の位置及び状態に関する更なる情報を提供することができる。反射信号の単純な（純粋な）抑圧（消滅）は、この情報を喪失させるであろう。

更なる使用領域は、第２高調波発生（Second Harmonic Generation、ＳＨＧ）とＭＰ蛍光の分離を描出（表示）できる（であろう）。この場合、ＳＨＧ信号は、まさに反射のように、極めて高速な信号であり、従って、蛍光から時間的に容易に分離されることができる。これに対し、純粋なスペクトル分離は困難であるか不可能であり、特に、とりわけ蛍光の放出波長がＳＨＧの波長と重なる場合には困難ないし不可能である。とりわけ試料が容易に退色するものである場合又は試料が高速に運動するものである場合、利用者はＳＨＧと蛍光信号を同時に検出することができ、２つの測定プロセスを要しないため有利である。

更に、自家蛍光と蛍光の分離は一使用例を構成する。自家蛍光は植物標本にしばしば現れる。この場合、自家蛍光の寿命及び波長は極めて多様である。付加的基準として、時間的検出ウィンドウは、蛍光と自家蛍光の分離をより容易にすることができる。

原理的には、２又は３以上の時間的検出ウィンドウ又は検出チャンネルはデータ取り込み中（オンライン）に又はデータ取り込み後（オフライン）に互いに関連付けられることができ、有利には、該関連付けの結果が描出されることができるように構成することも可能である。一例として、ＦＲＥＴ描出（表示）が可能であろう。ＦＲＥＴの場合、しばしば、専らドナー蛍光の弱い減少（退色）と同時に寿命の短縮が現れ、他方、アクセプタでは、強度の小さい増大と同時により平坦な増大勾配（Anstiegsflanke）が現れる。ドナーの長寿命の蛍光の強度がアクセプタの短寿命の強度によって分割される場合、これは、純粋な強度測定又は純粋な寿命測定によるよりもより感度が高い測定方法を提供する。時間的検出ウィンドウ又は検出チャンネルが減算、加算、乗算及び／又は任意的に相互に関連付けされる（miteinander verrechnet）ことができる他の種々の応用例も可能である。

複数のパルスレーザがシステムに存在する場合、これらは、同時に又は利用者によって選択可能な順序で交互にパルスを生成する、即ち励起光を放出することができる。利用者によって調整可能な複数の検出器の時間的検出ウィンドウ（複数）はすべて１つのレーザに関連付けられること（図８ａ参照）ができる。また、複数の検出器の時間的検出ウィンドウ（複数）が複数のレーザに関連付けられること（図８ｂ参照）又は１又は複数の検出器の時間的検出ウィンドウ（複数）が交互に複数のレーザに関連付けられること（図８ｃ参照）も可能である。レーザパルス及び時間的検出ウィンドウの時間的関係のこのフレキシブルな割り当てにより、とりわけ、ピクセルレベルでの順次的データ取り込みが可能になる（図８ｄ参照）。かくして、スペクトル的に相互に近接する蛍光色素におけるクロス励起（Kreuzanregung）とクロス放出（Kreuzemission）は、ハードウェアレベルで互いに分離されることができる。ライン毎又は画像毎の順次的スキャンと比べると、ピクセル毎の順次的データ取り込みでは、高速に運動する試料の場合、個別の検出チャンネル間でのピクセルシフト（ずれ）は起こらない。更に、クロス励起チャンネルとクロス放出チャンネルも一緒に取り込まれる場合、オンライン・データ評価は、「正常な（normal）」クロス放出とＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）放出の区別を可能にする（図８ｅ参照）。なお、図８ａ〜図８ｅのすべてにおいて、時間軸は図示左側から右側に進行する即ち水平軸ないしｘ軸が時間軸を形成する。

更に、異方性（Anisotropie）現象の描出も１つの使用例を構成する。異方性は、着色物質の過剰に長いないし過剰に短い崩壊時間をもたらし得る。既述の方法は、寿命の定量化には使用されないが、長寿命の強度による短寿命の強度の単純な分割によって、寿命変化は良好に可視化されることができる。

更に、ゲーティッド（Gated）ＦＣＳ（Fluorescence Correlation Spectroscopy）も１つの使用例を構成する。極めて微弱なＦＣＳ試料の場合、水による散乱光が測定結果に影響を及ぼし得る。この散乱光は、時間的選択によって、ＦＣＳ測定の際に容易に同定されることができ、検出チャンネルのために不可視化されることができる。更に、妨害的な自家蛍光の影響は、ＦＣＳ検出時間ウィンドウを適切に選択することにより最小化することができる。

フォトン（複数）の時間的（一次的）衝突（到達）後の検出の分離は、検出器に後置される（下流に配設される）電子装置において実行される。原理的には、電子装置の並行（並列）的構成及び順次（直列）的構成の何れも可能である。

順次的構成の場合、光源から放出されるパルス（列）と検出ユニットから到着するパルス（列）は、シリアル／パラレル的に動作する高速スキャン（サンプリング）ユニットによってスキャン（サンプリング）される。この場合、パルス（列）は、極めて高速なＡＤＣ（Analog to Digital Converter）モジュールによってスキャンされることができ、パルス（列）の到着の時点は相応の処理アルゴリズムによって求めることができる。次いで、光源からの（１つの）パルスと検出ユニットからの（１つの）パルス又はパルス列との間の１つないし複数の時間的間隔（期間）が求められる。持続時間（期間）に関するこの情報は、適切な方法によって、相応の時間セグメントないし部分（複数）又は検出ウィンドウ（複数）に割り当てることができる。

並行的構成は、図３に応じて達成することができる（であろう）。この場合、試料放出の検出されるべき時間セグメントは、電気的信号で表す（描出する）ことができる。各電気的評価チャンネルに対し、１又は複数の時間ウィンドウ又は検出ウィンドウが割り当てられる。これらの評価チャンネルを用いることによって、画像情報の評価を実行する更なる電気回路要素を制御することができる。図３は、３つの評価チャンネルに配分された全体で５つの時間セグメントないし検出ウィンドウを有する３つの評価チャンネルの一例を示す。尤も、評価チャンネル及び時間セグメントの数は図示の数に限定されるものではなく、この数は単なる例示のために選択されたに過ぎない。

図示の評価チャンネルの各々は、専属の評価電子装置を制御する。各時間セグメントは、共焦点顕微鏡法の際に、検出信号又は共焦点信号の評価を開始及び停止する。これに関し、図４は、制御信号によってその都度活性化（実行）される並行的評価の一例を示す。図示の構成例の場合、予め規定される（１つの）スペクトルチャンネルは任意の数の時間セグメントに分割されることができ、これらの時間セグメントは互いに分離されて（別々に）評価されることができる。この場合、スペクトル検出チャンネルの各々に対し、制御論理（回路）及び評価（装置）からなる図示の構成が達成される。

或いは、制御信号を用いることによって評価を停止し、かくして、所定の信号成分を目標を定めて絞る（消去する：ausblenden）ことを可能にする逆方向の使用を実行することも可能である。

順次的評価の一例では、図５に応じた評価を実行することができる。この場合、１つの評価チャンネルのために１つの制御信号のみが存在する。この制御信号内において、検出されるべきすべての時間セグメントが調整される。

この種の制御信号が、評価電子装置を制御するために利用される。画像撮像（記録）中において個々の時間セグメントの分離された（別々の）描出（ないし表示）を達成するために、（夫々の）時間セグメントの終端（終了時）において制御信号を不活性化する都度、アドレスカウンタがインクリメントされる。この構成の原理的構造は図６に示されている。この図において、順次的評価及びアドレスカウンタのインクリメントをとりわけ良好に見出すことができる。

各時間セグメントについて評価された画像情報は、アドレスカウンタのインクリメントによって固有の（専属の）記憶セルに存在する。並行的評価の場合に可能であるように、複数の時間セグメントが統合される（まとめられる）べき場合、これは、割り当てられた記憶セルの内容の後続の（その後に行われる）関連付け（Verrechnung）によって達成されることができる。

画像信号の所定の時間セグメントの目標を定めた抑圧ないし消去（Unterdrueckung）を可能にする評価の反転は、順次的評価によって同様に達成することができる。このため、後続の評価においてこの時間セグメントの内容を全体画像から差し引くことを可能にするマークが記憶セルに配される。

他の態様の評価の一例は、図７に応じ、トラック・アンド・ホールド回路によって達成することができる。この場合、ゲーティング信号（Gating-Signal）が、順次的信号として、トラック・アンド・ホールド段Ｔ／Ｈのクロック入力部に供給される。

ゲーティングパルスの開始によって、その都度、トラック・アンド・ホールド段において画像データの蓄積が開始される。時間ウィンドウの終端において、トラック・アンド・ホールド段のメモリに含まれる電荷がアナログ・デジタル変換器によってスキャン（サンプリング）され、更に処理される。この種の信号処理の結果は、ゲーティング期間に亘って積算（積分）される、検出されるフォトン数に比例する値である。

本発明の教示の更なる有利な実施形態については、反復を回避するために、明細書の概説部分及び添付の請求の範囲の参照を指摘する。

最後に、上述の実施例は保護を要求する教示を説明するためのものに過ぎず、この教示はこれらの実施例に限定されるものではないことを明確に指摘する。

１ 波長領域
２ 波長領域
Ｃｈ．１ 検出チャンネル
Ｃｈ．２ 検出チャンネル
Ｃｈ．１．１ 検出ウィンドウ
Ｃｈ．１．２ 検出ウィンドウ
Ｃｈ．１．３ 検出ウィンドウ
Ｃｈ．２．１ 検出ウィンドウ
Ｃｈ．２．２ 検出ウィンドウ
Ｃｈ．２．３ 検出ウィンドウ

Claims (16)

1. 試料のための照明光を生成するための１又は複数のレーザと、試料からの検出信号のための検出装置を有する顕微鏡又は共焦点顕微鏡であって、
   該検出装置が予め設定可能な異なる波長領域（１、２）を検出するために調整可能な複数のスペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）を有するよう構成され、
   前記複数のスペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）に夫々複数の時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）が割り当て可能に構成され、
   前記複数のスペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）に夫々割り当て可能に構成された前記複数の時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）は、測定中に調整可能である、
   顕微鏡。
2. 前記スペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）の波長領域（１、２）及び／又は前記時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）は、測定中、調整可能及び／又は描出ないし表示可能である、
   請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記波長領域（１、２）及び／又は前記時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）は夫々異なる値を有する、
   請求項１又は２に記載の顕微鏡。
4. 各スペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）に対し、１つの独立の評価電子装置又は独立の評価チャンネルが割り当てられるか又は複数の独立の評価チャンネルが割り当てられる、
   請求項１〜３の何れかに記載の顕微鏡。
5. 前記評価電子装置における前記１つの評価チャンネルにおける又は前記複数の評価チャンネルにおける評価は、前記時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）に時間的に関連する制御信号によって活性化可能又は不活性化可能である、
   請求項４に記載の顕微鏡。
6. ２又は３以上の時間的検出ウィンドウが、データ取り込み中又はデータ取り込み後に互いに関連付け可能である、
   請求項１〜５の何れかに記載の顕微鏡。
7. 異なる時間的検出ウィンドウに対し異なるレーザが割り当て可能である、
   請求項１〜６の何れかに記載の顕微鏡。
8. 顕微鏡又は共焦点顕微鏡又は請求項１〜７の何れかに記載の顕微鏡によって試料を検査するための方法であって、
   該顕微鏡が、試料のための照明光を生成するための１又は複数のレーザと、該試料からの検出信号のための検出装置を有し、該検出装置が、予め設定可能な異なる波長領域（１、２）の検出のために調整可能な複数のスペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）を有し、
   前記複数のスペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）に夫々複数の時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）が割り当て可能であり、かくして、検出信号が前記複数の時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）に取り込まれ、
   前記複数のスペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）に夫々割り当て可能に構成された前記複数の時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）は、測定中に調整可能である、
   方法。
9. 取り込まれるべき検出信号の評価は並行的又は順次的に実行される、
   請求項８に記載の方法。
10. 各スペクトル検出チャンネル（Ｃｈ．１、Ｃｈ．２）に対し、１つの独立の評価電子装置又は独立の評価チャンネルが割り当てられるか又は複数の独立の評価チャンネルが割り当てられる、
    請求項８又は９に記載の方法。
11. 前記評価電子装置における前記１つの評価チャンネルにおける又は前記複数の評価チャンネルにおける評価は、前記時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）に時間的に関連する制御信号によって活性化又は不活性化される、
    請求項１０に記載の方法。
12. 順次的評価の場合、時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）の終端において前記制御信号を不活性化する毎に、アドレスカウンタがインクリメントされる、
    請求項９〜１１の何れかに記載の方法。
13. 時間的検出ウィンドウ（Ｃｈ．１．１、Ｃｈ．１．２、Ｃｈ．１．３、Ｃｈ．２．１、Ｃｈ．２．２、Ｃｈ．２．３）の評価された画像情報を含む各記憶セルは、個別に予め設定可能なマークが配される、
    請求項８〜１２の何れかに記載の方法。
14. 取り込まれるべき検出信号の評価は、トラック・アンド・ホールド回路によって実行され、ゲーティングパルスの各スタートによって、データ蓄積が開始される、
    請求項８に記載の方法。
15. ２又は３以上の時間的検出ウィンドウは、データ取り込み中又はデータ取り込み後に互いに関連付けられ、有利には、該関連付けの結果が描出ないし表示される、
    請求項８〜１４の何れかに記載の方法。
16. 異なる時間的検出ウィンドウに対し異なるレーザが割り当てられる、
    請求項８〜１５の何れかに記載の方法。

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