JP6386761B2 - インボルクリン発現抑制剤 - Google Patents
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しかしながら、これらのラブダン型ジテルペン類にインボルクリン発現抑制作用やくせ毛改善作用があることは知られていない。
1)下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
2)下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするくせ毛改善剤。
X及びYは、Xが基−CH 2 OHでYがメチル基を示すか、XとYが一緒になって基−CH2−O−CO−を示す。〕
2)この抽出物を用い、水および酢酸エチルを用いて分配した。分層後、水層をダイヤイオンHP20を充填したカラムに通液し、吸着した成分を10,30,50,99.5%EtOHで順次溶出する。このうち99.5%EtOH溶出画分と先の酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮する。
3)これを80%MeOHおよびヘキサン各500mLを用いて分配する。分層後、80%EtOH層に水を加え、60%MeOH溶液に濃度調整した後、クロロホルムを加えて再び分配する。
4)分層後、クロロホルム層を減圧濃縮し、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、活性画分1を得る。当該画分を、ODSカラムを備えた分取HPLCにて7つの画分(1a〜1g)に分け(図1参照)、このうち一つの活性画分(1e)を用い、分取HPLCで9つの画分(1e−1〜1e−9)に分け、活性成分(1e−2<化合物1>,1e−7<化合物2>)を単離することができる。
5)また、別の活性画分(1f)について、同様に7つの画分(1f−1〜1f−7)に分け、活性成分(1f−5<化合物3;アンドログラパニン>)を得ることができる。
上記製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物を製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物の他、夫々化粧品、医薬部外品、医薬品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
また、上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、インボルクリンの発現抑制、くせ毛改善を目的とするヒトが好ましい。
<1>下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
<2>下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするくせ毛改善剤。
<3>下記式(2)で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
<5>くせ毛改善剤を製造するための、下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物の使用。
<6>インボルクリン発現抑制に使用するための、下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
<7>くせ毛改善に使用するための、下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
<8>下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物を用いるインボルクリン発現抑制方法。
<9>下記式(1)で表されるラブダン型ジテルペン化合物を用いるくせ毛改善方法。
<10>非治療的である<8>又は<9>の方法。
<11>使用が非治療的な使用である<5>又は<6>の化合物。
X及びYは、Xが基−CH 2 OHでYがメチル基を示すか、XとYが一緒になって基−CH2−O−CO−を示す。〕
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
オヒルムシロ(北海道十勝産)全草の乾燥物を細断し、50vol%EtOHで室温1週間抽出した。ろ過後、残渣に50vol%EtOHを加え、再び抽出した。ろ過後、先の抽出液と合わせて濃縮し、オヒルムシロ50%EtOH抽出物とした。
この抽出物7.0gを用い、水および酢酸エチルを用いて分液ロートで振り混ぜ、分配した。分層後、水層をダイヤイオンHP20を充填したカラムに通液し、吸着した成分を10,30,50,99.5%EtOHで順次溶出した。このうち99.5%EtOH溶出画分と先の酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮し、溶媒を留去して固形物0.74gを得た。これを80%MeOHおよびヘキサン各500mLを用いて分液ロートで振り混ぜ、分配した。分層後、80%EtOH層に水を加え、60%MeOH溶液に濃度調整した後、クロロホルムを加えて再び分液ロートで振り混ぜ、分配した。
分層後、クロロホルム層を減圧濃縮して溶媒を留去し、固形物0.64gを得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、活性画分1(135mg)を得た。うち90mgを用い、ODSカラムを備えた分取HPLCにて7つの画分(1a〜1g)に分けたところ、画分1d〜1fに活性を認めた(図1参照)。
うち1e画分(14.3mg)を用い、分取HPLCで9つの画分(1e−1〜1e−9)に分けた結果、1e−2(2.3mg),1e−7(1.7mg)を活性成分として単離した。また、1f画分(14.0mg)も同様に7つの画分(1f−1〜1f−7)に分けたところ、単一成分として1f−5(3.2mg)を得た。1e−2で単離された化合物、1e−7で単離された化合物、及び1f−5で単離された化合物を、夫々化合物1、化合物2及び化合物3とし、各化合物の13C NMR スペクトルデータを表1に示す。尚、化合物3(1f−5)は、アンドログラパニンと同定された。
(1)細胞培養
ヒト表皮角化細胞株HaCaTはドイツ癌研究所(DKFZ)より入手し、DMEM(Invitrogen)に非働化した10%ウシ胎児血清(Invitrogen)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen)を添加した培地で37℃、5%CO2条件下で培養した。
6穴プレートに2×105個/wellとなるようにHaCaT細胞を播種し、24時間後に製造例1で調製された化合物1、化合物2及び化合物3を所定の濃度で添加した。更に24時間後に培地を吸引、PBSで2回洗浄後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いてメーカーの使用説明書に従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度を測定し、1μgを用いてQuantitect RT(QIAGEN)による逆転写反応を実施し、cDNAを得た。このcDNAを4ng/μLに希釈し、評価サンプルとした。調製したcDNA 8ngにTaqman Universal Master mix(Applied Biosystems)を10μL、Taqmanプローブ(Applied Biosystems)を1μL、滅菌水を7μL添加し、7500 リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を用いてPCR反応を実施した。内部標準にはRPLP0遺伝子を用いた。TaqmanプローブはIVL:Hs00846307_s1、RPLP0:Hs9999902_m1を使用した。結果を、表2に示す。
6穴プレートに1×105個/ウェルとなるようにHaCaT細胞を播種し、24時間後に化合物4(「アンドログラフォリド」<シグマ・アルドリッチ社製>;10μM)を添加した。48時間後に培地を吸引、PBSで2回洗浄後、Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail(Thermo Scientific)を含むRIPA Buffer(Sigma)150μLにて細胞を溶解した。その後、セルスクレーパーにより、細胞を剥離・回収し、遠心して回収した上清を細胞抽出液としてとして評価に用いた。
細胞抽出液の総タンパク質濃度はBCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)を用いて定量した。細胞抽出液の蛋白質量として5μgを0.35M DTT(sigma)を含むLaemmli Sample Buffer(Bio-Rad)と1:1で混合し、95℃で5分間インキュベートした。SDS−PAGEは7.5% TGXゲル(Bio-Rad)を用いて定法に従い実施した。ゲルを転写するメンブレンにはメタノールにより親水化したPVDFメンブレン(Bio-Rad)、ブロッティングバッファーにはTris/Glycine/メタノール転写バッファー(Bio-Rad)を用いた。
4℃で一晩転写後、メンブレンを5%スキムミルク溶液/PBS−Tで室温、2時間ブロッキングした後、抗IVL抗体(BTI、BT-651)、抗Actin抗体(SantaCruz)を0.3%スキムミルク/PBS−Tで1000倍希釈して室温、2時間反応させた。メンブレンをPBS−Tで洗浄した後、抗IVL抗体に対して、抗ウサギ−HRP抗体(NA934VS、GE)、抗Actin抗体に対して、抗ヤギ−HRP抗体(岩井化学)を0.3%スキムミルク/PBS−T で2000倍希釈して室温、1時間反応させた。反応終了後、PBS−Tで洗浄し、ECL Prime Western Blotting Detection System(GE)を用いて発光を検出した。各バンドの積算値の算出はMulti Gauge V3.2(FUJIFILM)ソフトウェアを用いた。結果を表3に示す。
表2、3から明らかなように、化合物1、化合物2及び化合物3には、遺伝子レベルで優れたインボリクリン発現抑制作用が認められ、化合物4にはタンパク質レベルで優れたインボリクリン発現抑制作用が認められた。
Claims (3)
- 下記式(1):
X及びYは、Xが基−CH2OHでYがメチル基を示すか、XとYが一緒になって基−CH2−O−CO−を示す。〕
で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。 - 下記式(1’):
X及びYは、Xが基−CH2OHでYがメチル基を示すか、XとYが一緒になって基−CH2−O−CO−を示す。〕
で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするくせ毛改善剤。 - 下記式(2):
で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
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