JP6417113B2 - インボルクリン発現抑制剤 - Google Patents
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Description
また最近、本出願人は、毛髪形状と毛髪毛根部における各種遺伝子の遺伝子発現との関係を探索したところ、非くせ毛者の毛根部に比して、くせ毛者の毛根部において、インボルクリン(IVL)遺伝子の発現量が有意に増加しており、インボルクリンの発現を制御することにより、くせ毛を抑制したり、促進できることを報告している(特許文献1)。
しかしながら、斯かるオヒルムシロにインボルクリン発現抑制作用があること、或いはくせ毛や軟毛化に対して効果があることは知られていない。
1)オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
2)オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とするくせ毛改善剤。
3)オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とする軟毛化剤。
本発明において、オヒルムシロは、全草、葉、茎、芽、花、蕾、根、根茎、種子、若しくは果実等、又はこれらを組み合わせて使用することが可能であるが、全草を用いるのが好ましい。斯かるオヒルムシロは、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
後記実施例に示すように、オヒルムシロのアルコール抽出物を活性炭処理した抽出物は、より優れたインボルクリン発現抑制作用を有する。
インボルクリンは、メデュラ、内毛根鞘の角質細胞で発現することが示されており、これら組織にて、トリコヒアリン等の角化関連蛋白質とイソペプチド結合で架橋され、機械的、化学的な刺激に耐えうる組織の強度形成に関与すると考えられている(Lorenzo A., Ann. Anatomy (2011) doi:10.1016/j.aanat.2011.10.012)。つまり、表皮と同様に、毛髪においてもメデュラ、内毛根鞘においてコーニファイドエンベロープ形成に関与し、組織の強度、すなわち毛髪のハリ・コシといった髪質に深く関わっているものと考えられる。したがって、インボルクリンの発現を抑制することは、毛髪の軟毛化に繋がると云える。
また、上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、インボルクリンの発現抑制、くせ毛改善或いは軟毛化を目的とするヒトが好ましい。
<1>オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
<2>オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とするくせ毛改善剤。
<3>オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とする軟毛化剤。
<5>くせ毛改善剤を製造するための、オヒルムシロ又はその抽出物の使用。
<6>軟毛化剤を製造するための、オヒルムシロ又はその抽出物の使用。
<7>インボルクリン発現抑制に使用するための、オヒルムシロ又はその抽出物。
<8>くせ毛改善に使用するための、オヒルムシロ又はその抽出物。
<9>軟毛化に使用するための、オヒルムシロ又はその抽出物。
<10>オヒルムシロ又はその抽出物を用いるインボルクリン発現抑制方法。
<11>オヒルムシロ又はその抽出物を用いるくせ毛改善方法。
<12>オヒルムシロ又はその抽出物を用いる軟毛化方法。
<13><7>〜<9>において、使用は非治療的使用である。
<14><10>〜<12>において、方法は非治療的方法である。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
ヒルムシロ科ヒルムシロ属のオヒルムシロ(Potamogeton narans;北海道十勝産)の全草細断物20gに95vol% EtOHを1000mL加え、室温で1週間抽出し、ろ過した。残渣に95vol% EtOH 1000mLを加え、再び室温下で1週間抽出し、ろ過した。2回分のろ液を合わせて濃縮、固形物6.4gを得た。抽出された固形物を1w/v%となるように95vol% EtOHに溶解し、95%エタノール抽出物(オヒルムシロ抽出物1)とした。
ヒルムシロ科ヒルムシロ属のオヒルムシロPotamogeton narans(北海道十勝産)の全草細断物20gに95vol% EtOHを1000mL加え、室温で1週間抽出し、ろ過した。残渣に95vol% EtOH 1000mLを加え、再び室温下で1週間抽出し、ろ過した。2回分のろ液を合わせて濃縮、固形物6.4gを得た。抽出された固形物のうち3.2gをとり、95vol% EtOHを320mL加えて溶解した。その際、若干の澱が析出したため、ろ過してこれを除去した。得られた溶液のうち100mLをとり、活性炭(白鷺P)1.0gを加えて室温で1週間撹拌処理を行い、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた固形物を濃度1w/v%の95vol%EtOH溶液(38mL)とし、活性炭処理95%エタノール抽出物(オヒルムシロ抽出物2)とした。
(1)細胞培養
ヒト表皮角化細胞株HaCaTはドイツ癌研究所(DKFZ)より入手し、DMEM(Invitrogen)に非働化した10%ウシ胎児血清(Invitrogen)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen)を添加した培地で37℃、5%CO2条件下で培養した。
6穴プレートに2×105個/wellとなるようにHaCaT細胞を播種し、24時間後に製造例1及び2で調製したオヒルムシロ抽出物1〜2(0.5%v/v)を添加した。更に24時間後に培地を吸引、PBSで2回洗浄後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いてメーカーの使用説明書に従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度を測定し、1μgを用いてQuantitect RT(QIAGEN)による逆転写反応を実施し、cDNAを得た。このcDNAを4ng/μLに希釈し、評価サンプルとした。調製したcDNA 8ngにTaqman Universal Master mix(Applied Biosystems)を10μL、Taqmanプローブ(Applied Biosystems)を1μL、滅菌水を7μL添加し、7500 リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を用いてPCR反応を実施した。内部標準にはRPLP0遺伝子を用いた。TaqmanプローブはIVL:Hs00846307_s1、RPLP0:Hs9999902_m1を使用した。結果を表1に示す。
6穴プレートに1×105個/ウェルとなるようにHaCaT細胞を播種し、24時間後に製造例1で調製したオヒルムシロ抽出物1(0.5%v/v)を添加した。48時間後に培地を吸引、PBSで2回洗浄後、Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail(Thermo Scientific)を含むRIPA Buffer(Sigma)150μLにて細胞を溶解した。その後、セルスクレーパーにより、細胞を剥離・回収し、遠心して回収した上清を細胞抽出液としてとして評価に用いた。
細胞抽出液の総タンパク質濃度はBCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)を用いて定量した。細胞抽出液の蛋白質量として5μgを0.35M DTT(sigma)を含むLaemmli Sample Buffer(Bio-Rad)と1:1で混合し、95℃で5分間インキュベートした。SDS−PAGEは7.5% TGXゲル(Bio-Rad)を用いて定法に従い実施した。ゲルを転写するメンブレンにはメタノールにより親水化したPVDFメンブレン(Bio-Rad)、ブロッティングバッファーにはTris/Glycine/メタノール転写バッファー(Bio-Rad)を用いた。
4℃で一晩転写後、メンブレンを5%スキムミルク溶液/PBS−Tで室温、2時間ブロッキングした後、抗IVL抗体(BTI、BT-651)、抗Actin抗体(SantaCruz)を0.3%スキムミルク/PBS−Tで1000倍希釈して室温、2時間反応させた。メンブレンをPBS−Tで洗浄した後、抗IVL抗体に対して、抗ウサギ−HRP抗体(NA934VS、GE)、抗Actin抗体に対して、抗ヤギ−HRP抗体(岩井化学)を0.3%スキムミルク/PBS−T で2000倍希釈して室温、1時間反応させた。反応終了後、PBS−Tで洗浄し、ECL Prime Western Blotting Detection System(GE)を用いて発光を検出した。各バンドの積算値の算出はMulti Gauge V3.2(FUJIFILM)ソフトウェアを用いた。結果を表2に示す。
得られた遺伝子及び蛋白質発現量は、平均値±標準偏差で表記し、unpaired t-testにより有意差検定を行った。
Claims (3)
- オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤(但し、皮膚の弾力、ハリもしくはタルミ改善剤又は皮膚の老化予防もしくは改善剤としての使用を除く)。
- オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とするくせ毛改善剤。
- オヒルムシロ又はその抽出物を有効成分とする軟毛化剤。
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