JP6234720B2 - アスファルト分解能力を有する新規微生物 - Google Patents

Description

本発明は、アスファルト分解能力を有する新規微生物に関するものである。

近年、工場やガソリンスタンドなどの跡地を再利用する際に、跡地の土壌が鉱物油やその他の化学物質に汚染されている場合があり、これら汚染土壌への対策が必要になっている。
そして、このような汚染土壌の浄化方法の１つに、微生物が有する汚染物質の分解能を利用したバイオレメディエーション法がある。またこのようなバイオレメディエーション法に用いる新規な微生物が各種単離されている（特許文献１〜３参照）。
具体的には、アントラセンやフルオランテンなどの多環芳香族化合物（特許文献１）やＡ重油（特許文献２）を分解したり、六価クロム（特許文献３）などを還元することができる微生物が開示されている。

特許第４２２７８６１号公報 特許第４８３６５５２号公報 特許第４３９５８７０号公報

しかしながら、汚染物質は上記以外にも色々な物質があり、その中でもアスファルトは様々な種類の高分子化合物、炭化水素、油状物質から構成されており、微生物による分解が困難な物質であることが知られている。また、アスファルトを構成する成分の中でも、主成分であるアスファルテン（芳香族炭化水素が架橋した高分子化合物）については、現在のところ微生物による分解が極めて困難なものであることから、アスファルトで汚染された土壌などはバイオレメディエーション法による浄化ができないものであった。
具体的には、アスファルト（特にアスファルテン）を分解する能力を有する微生物は極めて少なく、さらにその中でも十分なアスファルト分解能（特にアスファルテン分解能）を有している微生物は今まで単離されていないのが現状である。

今回、本願発明者らは、鋭意検討を行った結果、アスファルテンを含むアスファルトを分解する能力を有する新規微生物を単離することに成功したのである。
すなわち、上記した問題点に鑑みてなされたものであって、従前の微生物では分解が困難であった、アスファルトを分解する能力を有する新規微生物の提供を目的とするものであり、さらにアスファルトを構成する成分の中でも特に分解が極めて困難であったアスファルテンについても分解する能力を有する新規微生物の提供を目的とするものである。

上記目的を達成するために、本発明の請求項１は、アスファルト分解能力を有する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９７で寄託された微生物である。

本発明の請求項２は、請求項１に記載の微生物を汚染された土壌または水に供給することを特徴とする汚染土壌または汚染水の浄化方法である。

本発明によれば、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９７で特定される新規微生物を用いることで、従前の微生物では分解が困難であったアスファルテンを含むアスファルトを分解することができることから、アスファルトで汚染された土壌においてもバイオレメディエーション法による浄化を行うことができる。また、好気雰囲気とすることができれば水中においても分解能が発現することからアスファルトで汚染された水についても浄化を行うことができる。

１７−６株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９７）の分子系統解析結果である。 １７−６株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９７）のコロニー観察像である。 １７−６株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９７）の形態観察像である。

本発明に係る微生物は、Penicillium属に属するものであり、さらに詳しくはペニシリウム・スピーシーズ（Penicillium sp.）に帰属すると推定されるものであり、株名は１７−６株である。また、本発明に係る微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に平成２５年６月１７日に受託されており、その受託番号はＮＩＴＥ Ｐ−１５９７である。
なお、本発明に係る微生物については、炭化水素化合物または油分を分解する能力を有しつつ、紫外線照射や放射線照射などの公知の手法にて変異をさせた変異株や、自然界において変異した変異株も含まれるものである。

本発明に係る微生物の単離方法は以下の通りである。

（１）１次スクリーニング
まず、ＰＤＡ培地に環境サンプル（土壌や木片など）を塗布し、３０℃、４８時間静置培養した。次に、生育してきた菌糸を別のＰＤＡ培地に植え継ぎ、３０℃、４８時間静置培養した。そして、この操作を繰り返し、単離できた糸状菌を１次スクリーニング通過菌株とした。ＰＤＡ培地の組成を表１に示す。

（２）２次スクリーニング
次に、アスファルトを分離基質として使用することが困難であったため、市販の芳香族化合物を分離基質としてスクリーニングを行うこととした。
タンニン酸を４．５ｇ／Ｌ加えたＰＤＡ培地と、レマゾールブリリアントブルーＲソルト（ＲＢＢＲ）を０．３ｇ／Ｌ加えたＰＤＡ培地をそれぞれ作製した。これらの培地に１次スクリーニング通過糸状菌を一白金耳植菌し、３０℃、１２０時間静置培養した。培養後、それぞれの培地を観察し、タンニン酸含有ＰＤＡ培地では褐色の変化が、ＲＢＢＲ含有ＰＤＡ培地では脱色が確認できた糸状菌を２次スクリーニング通過菌株とした。

（３）３次スクリーニング
最後に、リグニンを０．１％（ｗ／ｖ）含有したリグニン含有Ｋｉｒｋ培地９５ｍＬに２次スクリーニング通過菌株を植菌し、３０℃、１００ｒｐｍで7日間振盪培養した。そして、培養液上清の吸光スペクトルを測定し、芳香族成分の分解能を確認できたものをスクリーニング取得菌株、すなわち本発明に係る微生物１７−６株とした。Ｋｉｒｋ培地の組成を表２に、Ｋｉｒｋ培地の原料である基本培地と微量元素溶液の配合をそれぞれ表３、４に示す。

次に、本発明に係る微生物１７−６株の分類学的性質及び形態的性質を説明する。

（分類学的性質）
まず、本発明に係る微生物１７−６株の塩基配列は、配列番号１に示すＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列である。
次に、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行ったところ表５に示す結果となり、子嚢菌門の一種であるPenicillium属のPenicillium rolfsiiの複数の塩基配列と相同率９８．６〜９８．８％の相同性を示した。
また、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（株式会社テクノスルガ）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行ったところ表６に示す結果となり、子嚢菌門の一種であるPenicillium属のPenicillium rolfsii ＮＲＲＬ１０７８株と相同率９８．７％の相同性を示した。

次に、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩塩基配列に基づく分子系統解析を行ったところ図１に示す結果となり、Penicillium属のPenicillium rolfsii ＮＲＲＬ１０７８株とクラスターを形成した。しかしながら、このクラスターはブーツストラップ確率が６４％と低いことから、既知の帰属分類群における決定は難しいものとなる。
従って、本発明に係る微生物１７−６株は、Penicillium属のPenicillium rolfsiiに近縁なPenicillium sp.と推定されるものではあるが、新種の蓋然性が高い微生物であると考えられる。

（形態的性質）
次に、本発明に係る微生物１７−６株の形態観察を、ＰＤＡ培地上で、２５℃下、培養１週間において行った。その結果、表面が灰緑色〜白色、裏面が黄土色のビロード状で、培地中に黄褐色系の可溶性色素を産生するコロニーを形成した。また、栄養菌糸から直立した柄の先端からラミ、メトレ、およびフィアライドが形成される三輪生のペニシルスの形成が認められた。コロニー観察像を図２に、形態観察像を図３に示す。
色調 ：灰緑色〜白色（表面：図２（ａ））、黄土色（裏面：図２（ｂ））
形 ：ビロード状
その他：培地中に黄褐色系の可溶性色素を産生し、栄養菌糸から直立した柄の先端からラミ、メトレ、およびフィアライドが形成される三輪生のペニシルスを形成

（培養条件、保管条件）
最後に、本発明に係る微生物１７−６株の培養条件、保管条件を以下に示す。なお、以下に記載の培養条件、保管条件は一例に過ぎず、本発明に係る微生物１７−６株が増殖できるものであれば特に限定されるものではない。
［培養条件］
培地名：ポテトデキストロース培地（ポテトエキス４ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ）
培地の殺菌条件：オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）
培養温度：２５℃
培養期間：１〜３週間
酸素要求性：好気
培養方法：好気培養
光要求性：不要
［保管条件］
凍結乾燥法による保管：可能（保管温度：５℃付近、保護剤の組成：１０％スキムミルク、１％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ無調整、加圧滅菌（１１５℃、１５分））
凍結法による保管（−８０℃付近）：可能（保護剤：２０％グリセロール）
継代培養による保管：固体培養、液体培養どちらでも可（植え継ぎ間隔：１ヶ月、保管温度：５℃）

以上の分類学的性質（塩基配列解析）および形態的性質（形状的特徴）の結果から、本発明に係る微生物１７−６株は、Penicillium属のPenicillium rolfsiiに近縁なPenicillium sp.と推定されるものではあるが、新種の蓋然性が高い微生物であることが認められた。
また、本発明に係る微生物１７−６株は、後記するようにアスファルテンを含むアスファルトを分解する能力を有する微生物であるが、Penicillium属（特に、Penicillium sp.）に属する微生物においてこのような能力を有する微生物はこれまで単離されていない。
従って、これらの結果から本発明に係る微生物１７−６株は新規微生物であることが確認できた。

なお、本発明に係る微生物１７−６株は、水中においても使用することができる。従って、本発明に係る微生物１７−６株は、アスファルトで汚染された土壌の浄化だけでなく、アスファルトで汚染された水の浄化にも使用することができる。

さらに、本発明に係る微生物１７−６株を使用する際には、必要に応じて適宜、窒素やリンなどの栄養素や各種の栄養塩を添加することもできる。

次に、本発明に係る微生物１７−６株のアスファルト分解能を実施例に基づいて説明する。

（実施例１）
まず、表２のＫｉｒｋ培地に寒天末を２０ｇ／Ｌ加え、Ｋｉｒｋ寒天培地を作製した。これに、アスファルトを１プレート当たり０．０５ｇ塗布することによって試験用培地を作製した。

次に、本発明に係る微生物１７−６株を上記の試験用培地に一白金耳添加し、３０℃で７日静置培養した。

最後に、培養後の試験用培地の残存油分濃度を有機溶媒で抽出し、イアトロスキャンを用いたＴＬＣ−ＦＩＤ法にて分析することで、本発明に係る微生物１７−６株のアスファルト分解能を評価した。結果を表７に示す。

その結果、本発明に係る微生物１７−６株はアスファルトを構成する全ての成分に対して高い分解率を示した。特に、アスファルトを構成する成分の中でも分解が極めて困難であるアスファルテンについても、他のアスファルト成分と同等の分解能を示した。

（実施例２）
次に、本発明に係る微生物１７−６株の水中におけるアスファルテンの分解能を評価した。
まず。表２のｋｉｒｋ培地にアスファルテンを０．１％（ｗ／ｖ）添加することによってＫｉｒｋ培地を作製した。

次に、本発明に係る微生物１７−６株を上記の試験用培地に一白金耳添加し、３０℃で７日静置培養した。

最後に、培養後の試験用培地の残存油分濃度を有機溶媒で抽出し、イアトロスキャン（ＴＬＣ−ＦＩＤ）にて分析することで、本発明に係る微生物１７−６株のアスファルテン分解能を評価した。

その結果、本発明に係る微生物１７−６株を添加した実施例は、７日後のアスファルテンの濃度が３．３４±１．６９％低下し、水中においてもアスファルテンに対して分解率を示すことがわかった。

以上の結果から、本発明に係る微生物１７−６株は、従前の微生物にはない、アスファルトを分解する能力を有する微生物であり、その分解能が極めて高い微生物であることがわかった。さらに、水中においても分解能を有する微生物であることがわかった。

本発明に係る微生物は、バイオレメディエーション法による汚染土壌または汚染水の浄化に用いることができる。

ＮＩＴＥ Ｐ−１５９７

Claims (2)

1. アスファルト分解能力を有する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９７で寄託された微生物。
2. 請求項１に記載の微生物を汚染された土壌または水に供給することを特徴とする汚染土壌または汚染水の浄化方法。