KR20180016984A - 구성형 1,4-디옥산 분해균 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Abstract
본 발명은 1,4-디옥산 최대 비분해속도가 우수한 구성형 1,4-디옥산 분해균을 제공하는 것을 과제로 한다. 해결수단으로서 수탁번호 NITE BP-02032로서 기탁된 N23주인 구성형 1,4-디옥산 분해균을 제공한다.
Description
본 발명은 구성형 1,4-디옥산 분해균에 관한 것이다.
1,4-디옥산은 하기 화학식 1로 표시되는 환상 에테르이다. 1,4-디옥산은 물이나 유기용매와의 상용성이 우수하여, 주로 유기합성의 반응용제로서 사용되고 있다.
2010년도 일본에서의 1,4-디옥산의 제조·수입량은 약 4,500 t/년이며, 약 300 t/년이 환경 중에 방출된 것으로 추측된다. 1,4-디옥산은 수용성이기 때문에 수환경 중에 방출되면 광역으로 확산되어 버린다. 또한 휘발성, 고체에 대한 흡착성, 광분해성, 가수분해성, 생분해성이 모두 낮기 때문에 수중으로부터의 제거가 곤란하다. 1,4-디옥산은 급성 독성 및 만성 독성을 가질뿐더러 발암성도 지적되고 있는 것으로부터, 1,4-디옥산에 의한 수환경의 오염은 사람이나 동식물에 악영향을 미칠 것이 우려되고 있다. 그렇기 때문에 일본에서는 수도수질기준(0.05 ㎎/L 이하), 환경기준(0.05 ㎎/L 이하) 및 폐수기준(0.5 ㎎/L 이하)에 의해 1,4-디옥산의 규제가 이루어지고 있다.
또한 비특허문헌 1에는 1,4-디옥산을 포함하는 산업폐수에는 1,4-디옥산 외에 1,3-디옥솔란 및 2-메틸-1,3-디옥솔란 등의 환상 에테르가 포함되어 있는 것이 보고되어 있다. 특히 1,3-디옥솔란은 급성 독성 등의 독성이 확인되고 있어, 1,3-디옥솔란을 포함하는 오염수 등은 적절히 처리하지 않으면 안된다.
종래의 활성오니법이나 활성탄흡착법 등의 처리방법의 경우는, 수중으로부터 1,4-디옥산 등의 환상 에테르를 충분히 제거하는 것이 불가능하다. 예를 들면 1,4-디옥산은 과산화수소를 첨가한 오존처리(O3/H2O2), 자외선 조사 하에서의 오존처리(O3/UV), 방사선이나 초음파 조사 하에서의 오존처리 등, 복수의 물리화학적인 산화방법을 병용하는 촉진산화법에 있어서만 처리의 유효성이 확인되고 있다. 그러나, 촉진산화법은 초기 투자비 및 운전비가 높기 때문에 보급에 이르지 못하였다. 또한 비특허문헌 2에는 1,4-디옥산 이외의 유기물이 존재하면 촉진산화법에 의한 1,4-디옥산의 처리효율이 저하되는 것이 보고되어 있다.
저비용이면서도 안정적으로 1,4-디옥산 등의 환상 에테르를 포함하는 물을 처리하는 방법이 요구되고 있어 특허문헌 1, 비특허문헌 3에서는 1,4-디옥산 분해균에 의한 1,4-디옥산 처리가 제안되어 있다. 1,4-디옥산 분해균은 1,4-디옥산을 단일 탄소원으로 하여 분해하는 균(자화균)과, 테트라히드로푸란 등의 특정 기질의 존재 하에서 1,4-디옥산을 분해할 수 있는 균(공대사균)의 2종으로 크게 구별된다. 그렇기 때문에 지하수나 폐수 등에 포함되는 1,4-디옥산을 1,4-디옥산 분해균으로 처리하는 경우, 특정 기질을 첨가할 필요가 없는 자화균을 활용하는 쪽이 효율적이다.
자화균은 추가로 1,4-디옥산 분해효소의 유도 유무에 따라 유도형과 구성형으로 나누어진다. 비특허문헌 4에 기재되어 있는 바와 같이, 유도형 1,4-디옥산 분해균은 1,4-디옥산 등의 유도물질이 존재함으로써 분해효소가 생산·분비되기 때문에 1,4-디옥산 처리에 사용하기 전에 사전에 순양(馴養)할 필요가 있다. 한편, 구성형 1,4-디옥산 분해균은 상시 분해효소를 생산하고 있기 때문에 순양하지 않고 바로 1,4-디옥산 처리에 사용하는 것이 가능하다.
그러나 비특허문헌 3에 기재되어 있는 바와 같이, 구성형 1,4-디옥산 분해균의 1,4-디옥산 최대 비분해속도는 유도형 1,4-디옥산 분해균과 비교하여 낮다는 문제가 있다. 또한 특허문헌 1, 비특허문헌 3, 4에 개시되어 있는 1,4-디옥산 분해균이 1,4-디옥산의 존재하에 있어서 그 밖의 환상 에테르를 분해할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다.
본 출원 발명자들에 의한 특허문헌 2에는 디에틸렌글리콜을 포함하는 배지를 사용하여 1,4-디옥산 분해균을 늘리는 1,4-디옥산 분해균의 배양방법이 제안되어 있다. 1,4-디옥산 분해균은 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하기 때문에, 디에틸렌글리콜을 함유하는 배지를 사용함으로써 멸균처리를 행하지 않고 다른 미생물이 생식하고 있는 조건 하에서도 우선적으로 증식 가능하다.
CD. Adams, PA. Scaclan and ND. Secrist: Oxidation and biodegradability enhancement of 1,4-dioxane using hydrogen peroxide and ozone, Environ. Sci. Technol., 28(11), pp. 1812-1818, 1994.
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K. Sei, K. Miyagaki, T. Kakinoki, K. Fukasako, D. Inoue and M. Ike: Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source, Biodegradation, 24, 5, pp. 665-674, 2012.
1,4-디옥산 최대 비분해속도가 우수한 구성형 1,4-디옥산 분해균을 제공한다.
1. 수탁번호 NITE BP-02032로서 기탁된 N23주인 구성형 1,4-디옥산 분해균.
2. 1.에 기재된 구성형 1,4-디옥산 분해균을 포함하는 현탁액.
3. 1.에 기재된 구성형 1,4-디옥산 분해균 또는 2.에 기재된 현탁액을 사용하는 것을 특징으로 하는 수중의 환상 에테르 처리방법.
4. 1.에 기재된 구성형 1,4-디옥산 분해균 또는 2.에 기재된 현탁액을 사용하는 것을 특징으로 하는 토양 중의 환상 에테르 처리방법.
5. 상기 환상 에테르가 1,4-디옥산, 1,3-디옥솔란, 2-메틸-1,3-디옥솔란, 테트라히드로푸란 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 3. 또는 4.에 기재된 환상 에테르 처리방법.
6. 디에틸렌글리콜의 존재 하에서 행하는 것을 특징으로 하는 3. 내지 5. 중 어느 하나에 기재된 환상 에테르 처리방법.
7. 1,4-디옥산, 글리옥실산, 글리콜산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 1-부탄올, 테트라히드로푸란, 글루코오스, 초산 중 1종 이상을 함유하는 배지를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 NITE BP-02032로서 기탁된 N23주인 구성형 1,4-디옥산 분해균의 배양방법.
8. 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올 중 1종 이상을 함유하는 배지를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 NITE BP-02032로서 기탁된 N23주인 구성형 1,4-디옥산 분해균의 배양방법.
N23주는 구성형 1,4-디옥산 분해균으로 상시 분해효소를 생산하고 있다. N23주는 지금까지 보고되어 있는 구성형 분해균 중에서 가장 높은 1,4-디옥산 최대 비분해속도를 가지고 있어 디옥산 분해능력이 우수하다. N23주는 1,4-디옥산을 0.017 ㎎/L 이하의 극저농도까지 분해하는 것이 가능하여 약 5,200 ㎎/L라는 고농도의 1,4-디옥산을 처리하는 것이 가능하다. 또한 1,4-디옥산뿐 아니라 1,3-디옥솔란, 2-메틸-1,3-디옥솔란, 테트라히드로푸란 등의 환상 에테르의 처리능력도 우수하여 복수의 환상 에테르를 동시에 처리하는 것도 가능하다.
N23주를 사용하여 수중 또는 토양 중의 환상 에테르를 처리하는 것이 가능하다. 구성형 1,4-디옥산 분해균인 N23주는 순양하지 않고 바로 높은 환상 에테르 처리능력을 발휘하는 것이 가능하기 때문에, 간이적이고 처리능력이 높은 오염처리 프로세스를 구축하는 것이 가능하다. N23주는 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하기 때문에, 디에틸렌글리콜의 존재 하에서는 다른 미생물이 존재하고 있어도 N23주의 균체량을 높게 유지하는 것이 가능하다. 그렇기 때문에 디에틸렌글리콜의 존재 하에서 환상 에테르 처리를 행하면 환상 에테르 처리능력을 높게 유지하는 것이 가능하다. 또한 디에틸렌글리콜의 존재 하에서는 환상 에테르 농도가 변동해도 환상 에테르 처리능력을 안정적으로 높게 유지하는 것이 가능하다.
탄소원으로서 디에틸렌글리콜을 포함하는 배지를 사용하면 1,4-디옥산 분해능을 갖지 않는 미생물이 존재하고 있어도 N23주가 우선적으로 증식한다. 디에틸렌글리콜을 포함하는 배지를 사용함으로써 N23주를 용이하게 대량으로 배양하는 것이 가능하여, 환상 에테르로 오염된 오염수나 오염토양 등의 처리에 필요로 하는 대량의 균체를 공급하는 것이 가능하다. 또한 멸균을 위한 설비나 약품이 불필요하기 때문에 N23주를 매우 저비용으로 배양하는 것이 가능하다.
N23주는 1,4-디옥산, 글리옥실산, 글리콜산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 1-부탄올, 테트라히드로푸란, 글루코오스, 초산을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하여, 이들을 1종 이상 함유하는 배지를 사용함으로써 N23주의 증식속도를 빠르게 하는 것이 가능하다.
또한 N23주는 1,4-디옥산 분해능을 갖지 않는 미생물과 비교하여 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하기 때문에 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올 중 1종 이상을 주된 탄소원으로서 포함하는 배지를 사용함으로써 다른 미생물을 멸균하지 않고 N23주를 배양하는 것이 가능하다.
도 1은 N23주의 SEM 화상을 나타내는 사진이다.
도 2는 N23주의 16S rDNA의 부분 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 3은 N23주의 16S rDNA 염기서열을 토대로 작성한 계통수를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 2에 있어서 1,4-디옥산 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 3에 있어서 초기 1,4-디옥산 농도와 세포 수율의 관계를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 4에 있어서 N23주(a)와 CB1190주(b)를 사용한 계의 1,4-디옥산 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 5에 있어서 초기 1,4-디옥산 농도에 대한 비분해속도를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 6에 있어서 환상 에테르 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 7에 있어서 탄소원별 배양종료 시의 균체 농도를 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예 8에 있어서 탄소원별 배양종료 시의 균체 농도를 나타내는 도면이다.
도 11은 실시예 8에 있어서 탄소원별 배양종료 시의 잔존 유기탄소 농도를 나타내는 도면이다.
도 2는 N23주의 16S rDNA의 부분 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 3은 N23주의 16S rDNA 염기서열을 토대로 작성한 계통수를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 2에 있어서 1,4-디옥산 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 3에 있어서 초기 1,4-디옥산 농도와 세포 수율의 관계를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 4에 있어서 N23주(a)와 CB1190주(b)를 사용한 계의 1,4-디옥산 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 5에 있어서 초기 1,4-디옥산 농도에 대한 비분해속도를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 6에 있어서 환상 에테르 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 7에 있어서 탄소원별 배양종료 시의 균체 농도를 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예 8에 있어서 탄소원별 배양종료 시의 균체 농도를 나타내는 도면이다.
도 11은 실시예 8에 있어서 탄소원별 배양종료 시의 잔존 유기탄소 농도를 나타내는 도면이다.
아래에 본 발명을 상세하게 설명한다.
1,4-디옥산 분해균은 자연계에 존재하고 있어, 1,4-디옥산으로 오염된 수중이나 토양 중에서 채취한 오니 등을 탄소원으로서 1,4-디옥산만을 포함하는 배지에서 배양함으로써 스크리닝하는 것이 가능하다. 상기한 바와 같이 1,4-디옥산 분해균은 자화균과 공대사균의 2종류로 크게 구별되며, 자화균은 추가로 유도형과 구성형으로 나누어진다.
본 발명의 구성형 1,4-디옥산 분해균(이하, N23주라 한다.)을 1,4-디옥산 오염 지하수로부터 단리하였다. N23주는 수탁번호 NITE BP-02032로서, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NPMD)(일본국 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8(우편번호 292-0818))에 2015년 4월 10일자로 국제기탁되어 있다. N23주의 SEM 화상을 도 1에 나타낸다. N23주는 그람 염색성이 양성, 카탈라아제 반응이 양성이다.
N23주는 구성형 1,4-디옥산 분해균으로 상시 분해효소를 생산하고 있다. 일반적으로 구성형 1,4-디옥산 분해균은 유도형 1,4-디옥산 분해균과 비교하여 낮은 1,4-디옥산 최대 비분해속도를 나타내는데, N23주는 지금까지 보고되어 있는 구성형 1,4-디옥산 분해균 중에서 가장 높은 1,4-디옥산 최대 비분해속도를 가지며, 그 값은 유도형 1,4-디옥산 분해균과 동등 이상이다. 또한 N23주는 1,4-디옥산을 0.017 ㎎/L 이하의 극저농도까지 분해하는 것이 가능하여 약 5,200 ㎎/L라는 고농도의 1,4-디옥산을 처리하는 것이 가능하다. N23주는 1,4-디옥산 등을 사용하여 순양할 필요가 없고, 높은 1,4-디옥산 최대 비분해속도를 가지며, 1,4-디옥산을 극저농도까지 분해하는 것이 가능하여 고농도의 1,4-디옥산을 처리하는 것이 가능하기 때문에 1,4-디옥산의 생물처리에 적합하게 이용하는 것이 가능하다.
N23주는 1,4-디옥산뿐 아니라 1,3-디옥솔란, 2-메틸-1,3-디옥솔란, 테트라히드로푸란 등의 환상 에테르를 효율적으로 분해하는 것이 가능하다. 또한 복수의 환상 에테르를 동시에 처리하는 것도 가능하다. 그렇기 때문에 N23주는 1,4-디옥산, 1,3-디옥솔란, 2-메틸-1,3-디옥솔란, 테트라히드로푸란 등의 환상 에테르의 생물처리에 적합하게 이용하는 것이 가능하다.
N23주의 16S rDNA를 8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 U1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 프라이머로 한 PCR 증폭을 행하여 얻어진 생성 증폭산물의 시퀀스 해석을 행하였다. N23주의 16S rDNA의 부분 염기서열을 도 2 및 서열표의 서열번호 1에 나타낸다.
N23주의 16S rDNA의 부분 염기서열에 대해 DDBJ(DNA Data Bank of Japan)의 BLAST 검색을 행하여 상동성 검색을 행한 바, N23주는 슈도노카디아 테트라히드로푸란옥시단스 K1주(Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans strain K1)(이하, K1주라 한다.)와 99%로 높은 상동성을 나타내었다. 여기서 K1주는 1,4-디옥산을 공대사로 분해하는 공대사균이다(S. Mahendra and L. Alvarez-Cohen: Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria, Environ. Sci. Technol., 40 (17), pp.5435-5442, 2006.). 그것에 비해 N23주는 1,4-디옥산을 단일 탄소원으로 하여 분해하는 자화균이다. 따라서 N23주는 K1주와 99%로 높은 상동성을 나타내나, K1주와는 명백하게 다른 종류의 균이다. 16S rDNA 염기서열을 토대로 작성한 계통수를 도 3에 나타낸다.
N23주를 배양하는 배지로서는 액체배지 또는 고체배지를 들 수 있다. 배지로서는 N23주를 배양할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, MGY 배지나 CGY 배지 등의 공지의 배지를 사용하는 것이 가능하다. N23주를 대량으로 배양하기 위해서는 액체배지를 사용하는 것이 바람직하고, 액체배지를 공급하면서 액체배지의 공급량과 동량의 N23주를 포함하는 배양액을 추출하는 연속 배양을 행하는 것이 더욱 바람직하다.
N23주를 배양할 때에는 필요한 무기물질이나 유기물질을 첨가하는 것이 가능하다. 미생물의 활동량은 필요한 영양소 등의 인자 중에서 가장 적은 인자에 의해 제한되기 때문에, 부족한 영양소를 첨가함으로써 증식을 촉진시키는 것이 가능하다. 첨가하는 무기물질로서는 특별히 제한되지 않고, K2HPO4, (NH4)2SO4, MgSO4·7H2O, FeCl3, CaCl2, NaCl 등을 들 수 있다. 또한 첨가하는 유기물질로서는 특별히 제한되지 않지만 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카사미노산(casamino acid), 효모 추출물, 펩톤 등이 바람직하다.
N23주는 1,4-디옥산, 글리옥실산, 글리콜산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 1-부탄올, 테트라히드로푸란, 글루코오스, 초산을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하다. 1,4-디옥산, 글리옥실산, 글리콜산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 1-부탄올, 테트라히드로푸란, 글루코오스, 초산 중 1종 이상을 함유하는 배지를 사용함으로써 N23주의 증식속도를 빠르게 하는 것이 가능하다. 배지 중의 상기한 화합물의 총 농도는 특별히 한정되지 않지만, 1.0×10-8 wt% 이상 10.0 wt% 이하가 바람직하다. 총 농도의 하한치는 0.1 wt% 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.5 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 1.0 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 총 농도의 상한치는 9.0 wt% 이하인 것이 보다 바람직하고, 8.0 wt% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 7.0 wt% 이하인 것이 가장 바람직하다. 또한 상기한 화합물의 총계가 배지 중의 전체 유기화합물량에 대해 60 wt% 이상인 것이 바람직하고, 80 wt% 이상인 것이 보다 바람직하며, 95 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 99.9 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다.
또한 N23주는 1,4-디옥산 분해능을 갖지 않는 미생물과 비교하여 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하기 때문에 배지가 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올 중 1종 이상을 주된 탄소원으로서 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올의 총계가 배지 중의 전체 유기화합물량에 대해 60 wt% 이상인 것이 바람직하고, 80 wt% 이상인 것이 보다 바람직하며, 95 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 99.9 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다.
1,4-디옥산 분해능을 갖지 않는 미생물은 N23주와 비교하여 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올을 탄소원으로서 이용하는 능력이 떨어지기 때문에, 이들을 포함하는 배지를 사용하여 N23주와 1,4-디옥산 분해능을 갖지 않는 미생물을 배양하면 N23주가 우선적으로 증식한다. 즉 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올 중 1종 이상을 주된 탄소원으로서 포함하는 배지를 사용하여 N23주를 배양하면 사전에 멸균처리를 하지 않고도 N23주를 배양하는 것이 가능하다. 멸균이 필요한 배양방법은 장치의 구석구석까지 멸균하는 것이 곤란하기 때문에 대용량 장치를 사용하여 배양을 행하는 것이 어렵다.
그에 비해 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올 중 1종 이상을 주된 탄소원으로서 포함하는 배지를 사용한 N23주의 배양은 멸균처리가 불필요하기 때문에 대규모 스케일로 배양하는 것이 가능하여, 환상 에테르로 오염된 오염수나 오염토양 등의 처리에 필요한 대량의 균체를 공급하는 것이 가능하다. 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올 중 1종 이상을 주된 탄소원으로서 포함하는 배지를 사용하면 다른 미생물에 의한 오염(contamination)이 일어나지 않기 때문에 N23주를 용이하게 배양하는 것이 가능하다. 또한 멸균을 위한 설비나 약품이 불필요하기 때문에 매우 저비용으로 배양하는 것이 가능하다.
본 발명의 N23주를 사용하여 공장폐수, 일반하수, 지하수 등의 오염수 중, 또는 산업폐기물처리장, 공장, 불법투기사이트 등의 오염토양 중에 포함되는 환상 에테르를 처리하는 것이 가능하다. N23주는 구성형 1,4-디옥산 분해균으로 상시 분해효소를 생산하고 있기 때문에 바로 환상 에테르 처리를 개시하는 것이 가능하다. N23주는 배양액으로부터 여과 분별한 균체, 동결보존한 균체, L-건조보존한 균체, 동결건조한 균체, N23주를 수지 등에 고정화한 고정화 담체 또는 배양액이나 그의 농축액 등의 N23주를 포함하는 현탁액 등의 임의의 형태로 환상 에테르 처리에 사용하는 것이 가능하다. N23주를 환상 에테르로 오염된 피처리물에 접촉시키는 것만으로 환상 에테르를 처리하는 것이 가능하기 때문에, 간이적이고 처리능력이 높은 오염처리 프로세스를 구축하는 것이 가능하다.
N23주에 의해 오염수 중의 환상 에테르를 처리하는 것이 가능하다. N23주를 사용한 오염수 중의 환상 에테르 처리방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 폭기조를 사용하는 표준 활성오니법의 오염수 처리에 있어서 폭기조에 N23주를 고정화 담체나 현탁액 등의 형태로 첨가하는 것만으로 오염수 중의 환상 에테르를 처리하는 것이 가능하다. N23주를 폭기조에 첨가하는 것만으로 환상 에테르의 생물처리를 행하는 것이 가능하기 때문에, 종래의 표준 활성오니법에서 사용되는 설비를 대부분 그대로 활용하는 것이 가능하다. 또한 디에틸렌글리콜을 포함하는 배지를 사용함으로써 N23주를 시판의 장치를 사용하여 용이하게 배양하는 것이 가능하기 때문에, 오염수 처리현장에서 상기한 연속 배양을 행하여 N23주를 포함하는 배양액을 오염수에 연속적으로 주입하는 것이 가능하다.
N23주로 처리되는 오염수에 디에틸렌글리콜을 첨가해도 된다. 이때 오염수 중에 있어서 디에틸렌글리콜 농도가 1.0×10-8 wt% 이상 10.0 wt% 이하가 되도록 주입하는 것이 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 하한치는 0.1 wt% 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.5 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 1.0 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 상한치는 6.0 wt% 이하인 것이 보다 바람직하고, 3.0 wt% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 2.0 wt% 이하인 것이 가장 바람직하다. 생물처리를 행하는 오염수 중에는 다종다양한 미생물이 존재하고 있으나, 오염수 중에 디에틸렌글리콜을 첨가함으로써 오염수 중의 전체 바이오매스에 대한 N23주 균체량의 비율을 높게 유지하는 것이 가능하여, 환상 에테르의 처리능력을 높게 유지하는 것이 가능하다. 또한 환상 에테르 농도가 변동하는 오염수 중에서는 환상 에테르 농도가 낮아지면 N23주의 균체량이 감소하기 때문에, 그 후 환상 에테르 농도가 높아졌을 때에 N23주의 균체량이 부족하여 오염수 중의 환상 에테르를 다 처리할 수 없는 경우가 있다. 오염수에 디에틸렌글리콜을 첨가함으로써 환상 에테르 농도가 변동해도 환상 에테르 처리능력을 안정적으로 높게 유지하는 것이 가능하다. 또한 디에틸렌글리콜에 의한 환경으로의 악영향은 거의 존재하지 않는다.
N23주에 의해 오염토양 중의 환상 에테르를 처리하는 것이 가능하다. 이때 오염토양 중에 있어서 디에틸렌글리콜 농도가 0.1 wt% 이상 10 wt% 이하가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 하한치는 0.5 wt% 이상인 것이 보다 바람직하고, 1 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 2 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 상한치는 8 wt% 이하인 것이 보다 바람직하고, 7 wt% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 5 wt% 이하인 것이 가장 바람직하다. N23주를 사용한 오염토양 중의 환상 에테르 처리방법은 특별히 제한되지 않고, 오염토에 N23주를 첨가하여 혼합교반하거나 오염토양 중에 N23주를 포함하는 현탁액을 주입하는 등의 방법을 들 수 있다. 현장 플랜트의 건설, 토양의 땅파기, 무해화, 되메움 등의 공정이 불필요하기 때문에 토양 중에 N23주를 포함하는 현탁액을 주입하는 것이 바람직하다. 일반적으로 토양 중에는 영양소가 부족하기 때문에 오염토양 중에 탄소원, 무기염류 등을 주입하는 것이 바람직하고, 탄소원으로서 디에틸렌글리콜을 주입하는 것이 더욱 바람직하다. 토양 중에 디에틸렌글리콜을 첨가함으로써 토양 중의 환상 에테르의 처리를 앞당기는 것이 가능하다.
실시예
[실시예 1]
「N23주의 16S rDNA의 부분 염기서열 결정」
N23주를 CGY 액체배지(카시톤 5 g/L, 글리세린 5 g/L, 효모 추출물 1 g/L)를 사용하여 7일간 배양하였다(28℃, 120 rpm). 이 배양액을 10,000×g, 4℃, 3분간 원심분리하여 집균하고 0.9% 생리식염수를 사용하여 2회 세정하였다. 얻어진 세정 균체로부터 「사이고 카오루, 사노 유미코 공역：분자생물학실험 프로토콜 I 세균 게놈 DNA의 조정 basic protocol 세균 게놈 DNA의 소량 조정(미니렙), pp36-37, 마루젠 주식회사, 1997.」의 기재에 준해서 DNA를 추출하여 16S rDNA의 PCR 증폭을 행하였다. 프라이머로서 8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 U1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다. PCR 증폭은 94℃에서 10분간 유지한 후 변성(4℃, 1분), 어닐링(58℃, 1분), 신장(72℃, 2분)을 35사이클 행하고, 마지막에 10분간 72℃에서 유지하였다.
얻어진 증폭산물을 2% 아가로스겔로 전기영동을 행하였다. 그 후 표적의 밴드를 잘라내어 민일루트 겔 익스트랙션 키트(MinElute Gel Extraction Kit)(퀴아젠)를 사용하여 정제를 행하고, 얻어진 생성 증폭산물에 대해 시퀀스 해석을 실시하였다. N23주의 16S rDNA의 부분 염기서열은 도 2에 나타낸 바와 같다.
얻어진 16S rDNA의 부분 염기서열에 대해 DDBJ의 BLAST 검색을 행하여 상동성 검색을 행하였다. 그 결과 N23주는 슈도노카디아 테트라히드로푸란옥시단스 K1주(Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans strain K1)(K1주)와 높은 상동성을 나타내고, 그 값은 99%였다.
[실시예 2]
「N23주의 1,4-디옥산의 분해특성 조사」
300 mL 용량의 배플이 딸린 삼각플라스크에 CGY 배지(카시톤 5 g/L, 글리세린 5 g/L, 효모 추출물 1 g/L)를 100 mL 첨가하여 오토클레이브로 멸균처리(121℃, 15분)를 행하였다. 그 후 500 ㎎/L가 되도록 1,4-디옥산을 첨가하고, N23주를 1백금이량 식균(植菌)하여 회전 진탕배양(28℃, 120 rpm)을 7일간 행하였다(전전 배양).
배양 후 500 ㎎/L의 1,4-디옥산을 포함한 CGY 배지에 계대하여 동일한 조건에서 배양을 행하였다(전배양).
전배양에서 얻어진 배양액을 원심분리에 의해 집균·회수하여 무기염 배지(조성：1 g/L K2HPO4, 1 g/L (NH4)2SO4, 50 ㎎/L NaCl, 200 ㎎/L MgSO4·7H2O, 10 ㎎/L FeCl3, 50 ㎎/L CaCl2, pH：7.3)를 첨가하고, 균체의 세정을 행하였다.
무기염 배지에서 균체를 현탁한 것을 식균액으로 삼았다.
100 mL 무기염 배지에 식균액을 첨가한 후, 1.25 ㎎/L가 되도록 1,4-디옥산을 첨가하여 28℃, 120 rpm으로 회전 진탕배양을 행하였다(n=3). 또한 사전에 식균액에 있어서의 단백질 농도를 PR. Meyers 등의 방법에 준해서 측정하여(PR. Meyers, WR. Bourn, LM. Steyn, PD. van Helden, AD. Beyers, and GD. Brown: Novel method for rapid measurement of growth of mycobacteria in detergent-free media, J Clin Microbiol., 36(9), pp.2752-2754, 1998), 시험개시 시의 단백질 농도를 30 ㎎/L가 되도록 조제하였다. 배양은 12시간 행하고, 2시간마다 용액 중의 1,4-디옥산 농도를 헤드스페이스 가스크로마토그래프 질량분석계(시마즈 제작소：GC/MS-QP2010 PLUS, TURBOMATRIX HS40 이하, 헤드스페이스 GC/MC라 한다.)로 측정하였다. 또한 비교로서 N23주를 첨가하지 않은 실험계도 실시하였다.
도 4에 1,4-디옥산 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. N23주를 첨가한 실험계에서는 시간의 경과와 함께 1,4-디옥산 농도의 저하가 확인되고, 배양 10시간 후에는 0.033 ㎎/L, 12시간 후에는 0.017 ㎎/L가 되었다. 그에 비해 N23주를 첨가하지 않은 실험계에서는 1,4-디옥산 농도는 거의 감소하지 않아 배양 12시간 후의 농도는 1.15 ㎎/L였다. 이 사실로부터 N23주는 1,4-디옥산을 극저농도역까지 분해할 수 있는 1,4-디옥산 분해균인 것이 확인되었다.
[실시예 3]
「1,4-디옥산에 의한 N23주의 증식성 확인」
실시예 2에서 제조한 N23주의 식균액 1 mL를 무기염 배지 19 mL에 첨가한 후, 소정의 농도가 되도록 1,4-디옥산을 첨가하여 28℃, 120 rpm으로 회전 진탕배양을 행하였다(n=3). 배양은 6시간 행하고, 배양 전후에 있어서 1,4-디옥산 농도를 헤드스페이스 GC/MS로 측정하는 동시에 실시예 2에서 나타낸 방법에 준해서 단백질 농도를 측정하였다. 1,4-디옥산의 분해량에 대한 증가한 단백질량의 비율을 세포 수율로서 산출하였다. 도 5에 초기 1,4-디옥산 농도와 세포 수율의 관계를 나타낸다.
모든 실험계에 있어서 단백질량의 증가가 확인되어, N23주가 1,4-디옥산을 탄소원으로 하여 증식하고 있는 것이 확인되었다. 특히 초기 1,4-디옥산 농도가 약 540 ㎎/L인 실험계에 있어서 0.37 ㎎-protein/㎎-1,4-dioxane으로 우수한 증식성을 나타내었다. 또한 초기 1,4-디옥산 농도가 약 5,200 ㎎/L인 실험계에 있어서 세포 수율의 값은 0.025 ㎎-protein/㎎-1,4-dioxane을 나타내, N23주가 고농도의 1,4-디옥산 조건 하에서도 증식하고 있는 것이 확인되었다. 즉 N23주는 1,4-디옥산을 고농도로 포함한 오염수를 처리할 수 있는 것이 명백해졌다.
이상의 결과로부터, N23주는 1,4-디옥산을 단일 탄소원으로 하여 증식시킬 수 있는 자화균인 것이 나타내어졌다. 실시예 1의 결과로부터, N23주는 슈도노카디아 테트라히드로푸란옥시단스 K1주(Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans strain K1)와 유사 균종으로 추정되었으나, N23주는 자화균, K1주는 공대사균이기 때문에 N23주와 K1주는 다른 균이다.
[실시예 4]
「N23주의 1,4-디옥산 분해효소의 유도성 조사」
실시예 2에 기재된 전배양에 있어서 1,4-디옥산을 첨가하는 계(유도계)와 첨가하지 않는 계(비유도계)에서 제조한 식균액을 사용하여 분해시험을 실시하였다. 1,4-디옥산 분해균으로서 N23주와 공지의 유도형 1,4-디옥산 분해균인 슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190(이하, CB1190주라 한다.)을 사용하였다. 또한 CB1190주는 미국 ATCC로부터 구입하였다(ATCC 55486).
실시예 2에서 나타낸 방법에 준하여 시험개시 시의 단백질 농도가 10 ㎎/L가 되도록 식균액을 조제하였다. 19 mL 무기염 배지에 식균액 1 mL를 첨가한 후, 소정의 농도가 되도록 1,4-디옥산을 첨가하였다(n=3). 실험기간 중에는 적절히 샘플링을 행하여 헤드스페이스 GC/MS를 사용해서 1,4-디옥산 농도를 측정하였다. 도 6(a)에 N23주, 도 6(b)에 CB1190주를 사용한 계에서의 1,4-디옥산 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다.
도 6(b)에 나타내는 바와 같이, CB1190주를 1,4-디옥산을 첨가하지 않는 CGY 배지에서 배양한 계(비유도계)에서는 완만한 1,4-디옥산 농도의 저하가 확인되었다. 한편으로, 1,4-디옥산을 첨가하여 배양한 계(유도계)에서는 비유도계와 비교하여 1,4-디옥산 농도는 낮은 값을 나타내 분해속도가 빠른 것이 확인되었다. 이 분해속도의 차이는 전배양에서의 1,4-디옥산에 의한 분해효소의 유도 유무에 의해 생긴 것으로 생각되어, CB1190주의 1,4-디옥산 분해효소는 유도 효소인 것이 확인되었다. CB1190주의 분해효소의 유도성에 대해서는 켈리(Kelley)들에 의해서도 보고되어 있다(SL. Kelley, EW. Aitchison, M. Deshpande, JL. Schnoor, PJ. Alvarez.: Biodegradation of 1,4-dioxane in planted and unplanted soil: effect of bioaugmentation with Amycolatasp. CB1190, Water Res., 35(16), pp.3791-800, 2001.).
한편, 도 6(a)에 나타내는 바와 같이, N23주는 비유도계 및 유도계에서 1,4-디옥산 농도의 추이에 현저한 차이는 확인할 수 없었다. 같은 결과에 대해서는 상기 비특허문헌 4에서 보고되어 있고, 이러한 거동을 나타내는 균은 구성형으로 분류된다. 그렇기 때문에 N23주는 구성형 1,4-디옥산 분해균인 것이 확인되었다. 또한 N23주는 유도계의 CB1190주와 비교하여 1,4-디옥산 분해능이 우수하였다.
[실시예 5]
「N23주의 1,4-디옥산 최대 비분해속도 측정」
실시예 2의 순서로 제조한 식균액을 사용하여 분해시험을 행하였다. 19 mL 무기염 배지에 식균액 1 mL를 첨가한 후, 소정 농도가 되도록 1,4-디옥산을 첨가하여 28℃, 120 rpm으로 회전 진탕배양을 8시간 행하였다. 실험은 초기 1,4-디옥산 농도를 11, 107, 258, 564 및 1,136 ㎎/L로 하고, 각 계에 있어서 n=2로 실시하였다. 실험기간 중에는 1시간 또는 2시간마다 샘플링을 행하여 1,4-디옥산 농도를 헤드스페이스 GC/MS로 측정하였다. 그들의 평균치로부터 1,4-디옥산 농도의 시간 경과에 따른 변화를 그래프화하여 각각의 기울기(시간당 1,4-디옥산 분해량)에 대해 실험개시 시의 단백질량으로 나눔으로써 비분해속도를 구하였다. 또한 비분해속도는 N23주를 첨가하지 않은 실험계를 실시하여 휘발에 의한 1,4-디옥산의 감소량을 빼서 산출하였다. 실시예 2에서 나타낸 방법에 준하여 초기 단백질 농도는 128~206 ㎎/L로 하였다. 또한 CB1190주에 대해서도 동일하게 측정하였다.
도 7에 초기 1,4-디옥산 농도에 대한 비분해속도를 나타낸다.
기질이 저농도일 때에는 농도에 비례적으로 증가하지만, 기질 농도가 어느 정도까지 높아지면 한계점에 도달하여 최대 비분해속도에 점차 근접해가는 전형적인 모노드(Monod)식에 따르는 것이 명백해졌다. 이 해석결과로부터 각 균주에서의 최대 비분해속도를 구한 바, CB1190주에서의 최대 비분해속도는 0.051 ㎎-1,4-dioxane/㎎-protein·h를 나타내었다. 한편으로 N23주의 최대 비분해속도는 0.216 ㎎-1,4-dioxane/㎎-protein·h를 나타내, CB1190주의 대략 4.2배의 값이었다. 또한 상기 비특허문헌 3에 있어서 세이 등은 1,4-디옥산 분해균의 최대 비분해속도 조사를 실시하고 있다. 표 1에 실시예 5의 결과, 및 상기 비특허문헌 3에 기재되어 있는 각 균주와 그의 타입 및 최대 비분해속도를 나타낸다. N23주는 지금까지 보고되어 있는 구성형 1,4-디옥산 분해균보다도 2.3~4.2배 높은 최대 비분해속도를 가지고 있었다. 또한 그 값은 유도형 1,4-디옥산 분해균과 동등 이상이었다. N23주는 지금까지 보고되어 있는 구성형 1,4-디옥산 분해균과 비교하여 높은 최대 비분해속도를 갖는 균주인 것이 확인되었다.
[실시예 6]
「N23주에 의한 1,3-디옥솔란 및 2-메틸-1,3-디옥솔란의 분해 조사」
구성형 1,4-디옥산 분해균인 N23주가 1,3-디옥솔란과 2-메틸-1,3-디옥솔란을 분해 가능한지 확인하는 실험을 행하였다. 분해시험에서는 19 mL 무기염 배지에 식균액 1 mL를 첨가한 후, 소정의 농도가 되도록 1,4-디옥산, 1,3-디옥솔란 및 2-메틸-1,3-디옥솔란의 3종의 환상 에테르를 첨가하였다(n=3). 실험기간 중에는 적절히 샘플링을 행하여 헤드스페이스 GC/MS를 사용해서 1,4-디옥산, 1,3-디옥솔란, 2-메틸-1,3-디옥솔란의 농도를 측정하였다. 또한 실시예 2에서 나타낸 방법에 준해서 시험개시 시의 단백질 농도가 대략 90 ㎎/L가 되도록 사전에 식균액을 조제하였다.
도 8에 각 환상 에테르 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. 실험개시 직후부터 모든 환상 에테르 농도가 저하하는 것이 확인되었다. 즉, N23주는 1,4-디옥산, 1,3-디옥솔란, 2-메틸-1,3-디옥솔란을 동시에 분해하는 것이 가능하여 복수 종의 환상 에테르의 처리에 이용 가능한 것이 확인되었다.
[실시예 7]
「탄소원의 차이에 따른 N23주의 증식성 확인」
N23주를 CGY 액체배지(카시톤 5 g/L, 글리세린 5 g/L, 효모 추출물 1 g/L)를 사용하여 7일간 배양하였다(28℃, 120 rpm). 이 배양액을 10,000×g, 4℃, 3분간 원심분리하여 집균하고 0.9% 생리식염수를 사용하여 2회 세정하였다. 그 후 0.9% 생리식염수를 사용하여 소정 농도가 되도록 균체를 현탁하고 식균액을 제조하였다.
300 mL 용량의 배플이 딸린 삼각플라스크에 무기염 배지(조성：1 g/L K2HPO4, 1 g/L (NH4)2SO4, 50 ㎎/L NaCl, 200 ㎎/L MgSO4 ·7H2O, 10 ㎎/L FeCl3, 50 ㎎/L CaCl2, pH：7.3)를 100 mL 첨가하여 121℃, 15분간 오토클레이브를 행하였다. 그 후 1 g/L가 되도록 탄소원을 첨가한 후에 N23주의 식균액을 첨가하여(초기 균체 농도：244 ㎎-dry/L) 28℃, 120 rpm으로 회전 진탕배양을 행하였다(n=2). 또한 탄소원으로서는 1,4-디옥산, 디에틸렌글리콜, 글루코오스, 락트산을 각각 사용하였다. 시험개시로부터 4일째에 배양을 종료하고, 흡인 여과로 용액 중의 균체를 여과물로서 회수해 105℃에서 하룻밤 건조시킨 후, 균체 중량을 측정함으로써 배양종료 시의 균체 농도(㎎/L)를 구하였다. 도 9에 탄소원별 배양종료 시의 균체 농도를 나타낸다.
모든 탄소원에 있어서 N23주의 증식이 확인되고, 특히 글루코오스로 배양한 계에 있어서 배양 4일 후의 균체 농도가 가장 높아졌다. 그러나 글루코오스는 다른 미생물도 증식 기질로서 이용 가능한 것으로부터, 다른 미생물이 존재하는 환경 하에서 글루코오스를 탄소원으로 하여 N23주를 우선적으로 증식시키는 것은 곤란하다. 한편 디에틸렌글리콜은 상기 특허문헌 2에 보고되어 있는 바와 같이 1,4-디옥산 분해균을 특이적으로 증식시키는 것이 가능하다. N23주는 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용 가능하기 때문에, 디에틸렌글리콜을 사용하여 N23주를 다른 미생물보다도 우선적으로 증식시키는 것이 가능하다.
[실시예 8]
「탄소원의 차이에 따른 N23주의 증식성 확인 2」
N23주를 MGY 배지(맥아 추출물：10 g/L, 글루코오스：4 g/L, 효모 추출물：4 g/L, pH 7.3)를 사용하여 2주간 배양하였다. 이 배양액을 10,000×g, 4℃, 3분간 원심분리하여 집균하고 무기염 배지(조성：1 g/L K2HPO4, 1 g/L (NH4)2SO4, 50 ㎎/L NaCl, 200 ㎎/L MgSO4·7H2O, 10 ㎎/L FeCl3, 50 ㎎/L CaCl2, pH：7.3)를 사용하여 2회 세정하였다.
50 ㎖ 용량의 바이알병에 탄소원을 100 ㎎-C/L 포함하는 무기염 배지를 20 mL 첨가한 후, N23주를 50 ㎎-cell/L가 되도록 첨가하여 28℃, 120 rpm으로 회전 진탕배양을 행하였다(n=3). 탄소원으로서는 1,4-디옥산, 글리옥실산, 글리콜산, 글리옥살, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 1-부탄올, 페놀, 테트라히드로푸란, 글루코오스 및 초산을 사용하였다.
7일간 배양 후 유리섬유 여과지(GF/B, Whatman, 직경 47 ㎜)를 사용하여 배양액 중의 고형분을 회수하고 105℃에서 건조시켜 균체 농도를 측정하였다. 또한 여과에 의해 회수한 용액에 잔존하는 전체 유기탄소 농도를 TOC계로 측정하였다. 또한 비교를 위해 탄소원을 첨가하지 않는 블랭크계도 동일하게 시험을 행하였다. 균체 농도를 도 10에, 잔존 유기탄소 농도를 도 11에 나타낸다.
배양 7일 후의 균체 농도는 글리옥살, 트리에틸렌글리콜 및 페놀을 사용한 실험 이외에는 크게 상승하였다. 특히 1,4-디옥산, 1,4-부탄디올, 1-부탄올 및 글루코오스에 있어서는 높은 균체 농도를 나타내었다. 또한 잔존 유기탄소 농도는 명확한 균체 증식이 확인된 실험계에서는 낮은 값을 나타내었다. 이상의 결과로부터 N23주는 1,4-디옥산, 글리옥실산, 글리콜산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 1-부탄올, 테트라히드로푸란, 글루코오스 및 초산을 탄소원으로서 사용하여 증식 가능한 것이 나타내어졌다. 그렇기 때문에 이들 탄소원을 사용함으로써 N23주를 효율적으로 배양할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> TAISEI CORPORATION
<120> 1,4-dioxane-decomposing bacterium producing constitutive enzyme
<130> NATC160511FU
<150> JP2015-096577
<151> 2015-05-11
<150> JP2015-205643
<151> 2015-10-19
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> Pseudonocardia sp.N23
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc ggtaaggcct ttcggggtac 60
acgagcggcg aacgggtgag taacacgtgg gtgacctgcc ctcagctctg ggataagcct 120
gggaaactgg gtctaatacc ggatatgacc tctcatcgca tggtgggtgg tggaaagttt 180
ttcggctggg gatgggcccg cggcctatca gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg 240
cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcgcaatg ggcggaagcc tgacgcagcg 360
acgccgcgtg ggggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcgccagg gacgaagcgc 420
aagtgacggt acctggataa gaagcaccgg ccaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480
gtagggtgcg agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggtctgtcgc 540
gtcggtcgtg aaaacctgca gcttaactgt gggcttgcgg tcgatacggg catgactgga 600
gttcggcagg ggagactgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga 660
acaccggtgg cgaaggcggg tctctgggcc gatactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg 720
gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggtg ctaggtgtgg 780
gggccattcc acggtctctg tgccgcagct aacgcattaa gcaccccgcc tggggagtac 840
ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg 900
gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctgggtttg acatgcacca gacatcccta 960
gagatagggc ttcccttgtg gttggtgtgc aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct cgttccatgt tgccagcgcg 1080
ttatggcggg gactcatggg agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggatgacgt 1140
caagtcatca tgccccttat gtccagggct tcacacatgc tacaatggca agtacagagg 1200
gctgcgagac cgcgaggtgg agcgaatccc ttaaagcttg tctcagttcg gatcggggtc 1260
tgcaactcga ccccgtgaag ttggagtcgc tagtaatcgc agatcagcaa cgctgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagttgg taacacccga 1380
agccgacggc ctaacccgtg agggagggag ttgtcgaagg tgggactggc gattgggacg 1440
Claims (8)
- 수탁번호 NITE BP-02032로서 기탁된 N23주인 구성형 1,4-디옥산 분해균.
- 제1항에 기재된 구성형 1,4-디옥산 분해균을 포함하는 현탁액.
- 제1항에 기재된 구성형 1,4-디옥산 분해균 또는 제2항에 기재된 현탁액을 사용하는 것을 특징으로 하는 수중의 환상 에테르 처리방법.
- 제1항에 기재된 구성형 1,4-디옥산 분해균 또는 제2항에 기재된 현탁액을 사용하는 것을 특징으로 하는 토양 중의 환상 에테르 처리방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 환상 에테르가 1,4-디옥산, 1,3-디옥솔란, 2-메틸-1,3-디옥솔란, 테트라히드로푸란 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 환상 에테르 처리방법. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
디에틸렌글리콜의 존재 하에서 행하는 것을 특징으로 하는 환상 에테르 처리방법. - 1,4-디옥산, 글리옥실산, 글리콜산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 1-부탄올, 테트라히드로푸란, 글루코오스, 초산 중 1종 이상을 함유하는 배지를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 NITE BP-02032로서 기탁된 N23주인 구성형 1,4-디옥산 분해균의 배양방법.
- 1,4-디옥산, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올 중 1종 이상을 함유하는 배지를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 NITE BP-02032로서 기탁된 N23주인 구성형 1,4-디옥산 분해균의 배양방법.
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