JP6232177B2

JP6232177B2 - ベロ毒素不活性化剤

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Publication number: JP6232177B2
Application number: JP2012037228A
Authority: JP
Inventors: 尚文重宗; 中山　素一; 素一中山; 孝司継国; 宮本　敬久; 敬久宮本
Original assignee: Kao Corp; Kyushu University NUC
Current assignee: Kao Corp; Kyushu University NUC
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2017-11-15
Anticipated expiration: 2032-02-23
Also published as: JP2016183197A; JP6239057B2; JP2013136553A

Description

本発明は、ベロ毒素Ｓｔｘ１の不活性化剤に関する。

Ｏ−２６、Ｏ−５５、Ｏ−９１、Ｏ−１０３、Ｏ−１０４、Ｏ−１１１、Ｏ−１２１、Ｏ−１４５、Ｏ−１５７、Ｏ−１６５等の腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；ＥＨＥＣ）は、食中毒、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群等の疾患の原因菌である。ＥＨＥＣは、強い病原性を有し、しばしば集団感染を引き起こし、また感染者の死亡例も少なくない。

ベロ毒素（Ｖｅｒｏｔｏｘｉｎ；ＶＴ）は、ＥＨＥＣに産生され、上記疾患を引き起こす原因と考えられている毒素である。ベロ毒素は、志賀毒素と同一のＳｈｉｇａｔｏｘｉｎｆａｍｉｌｙに分類される毒素であり、志賀毒素とアミノ酸配列が同一のＳｔｘ１と、アミノ酸配列が５５％同一のＳｔｘ２とが知られている。Ｓｔｘ１とＳｔｘ２は、生物学的性質は類似するものの、その物理化学的及び免疫学的性質は異なることが知られている。

ＥＨＥＣによる感染症を防止する手段としては、菌の生育抑制、菌によるベロ毒素の産生又は分泌抑制、及び産生されたベロ毒素の無毒化、が挙げられる。
ワクチンや抗菌剤は、菌の感染及び生育を防止するために最も一般的使用されている手段である。臨床的には、ホスホマイシン等の抗生物質が経験的に使用されている。また非特許文献１には、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）にＯ−１５７に対する殺菌作用があることが報告されている。しかし、これらはＥＨＥＣ全般に対しては常に有効とはいえない。なぜなら、ワクチンは、Ｏ１５７には効いても他のタイプのＥＨＥＣには効かないなど、効果が菌のタイプにより制限されるという問題があり、また抗菌剤を使用する場合、菌が死滅する際に菌体内に蓄えられたベロ毒素が腸管内に一度に放出されることにより、症状が重篤化するおそれがあるからである。

ＥＨＥＣによるベロ毒素の産生又は分泌を抑制する物質が知られている。非特許文献２には、ザクロ果皮抽出物によりＥＨＥＣによるベロ毒素の産生が抑制されたことが、非特許文献３には、ＥＧＣｇにより菌体外へのベロ毒素の分泌が抑制されたことが、それぞれ報告されている。特許文献１には、ホップ苞葉タンニンから得られた特定の構造を有するポリカテキンに、Ｓｔｘ１の細胞質ゾルへの移行を阻害して、その病原性を抑える作用があることが記載されている。また、より報告数は少ないが、ベロ毒素を不活性化する物質も知られている。非特許文献４及び上述の非特許文献１には、Ｓｔｘ２に対する抗毒素作用を有する物質として、リンゴジュース及びカテキン製剤がそれぞれ報告されている。

ＥＧＣｇ及びガロカテキンガレート（ＧＣｇ）は、茶カテキンの主要成分として知られている。上記非特許文献１及び３に報告されているように、ＥＧＣｇのＥＨＥＣに対する殺菌作用、ベロ毒素分泌抑制作用や、Ｓｔｘ２に対するカテキン類の抗毒素作用が知られている。しかしながら、ベロ毒素そのもの、とりわけＳｔｘ１の不活性化に関するＥＧＣｇ及びＧＣｇの作用については、これまで知られていなかった。

特表２００６−５０８９２４号公報

大久保ら、感染症学雑誌、第72巻第3号:211-217、平成10年3月20日 Supayang et al J. Health Science, 51(5):590-596, 2005 Konishi et al, Biochim Biophys Acta, 1472:42-50, 1999 Reuven et al, J. Food Science, 75(5):296-301, 2010

本発明は、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の産生するベロ毒素Ｓｔｘ１の毒性を不活性化し、当該菌の感染による症状を予防、治療又は改善するために有用なＳｔｘ１不活性化剤を提供することに関する。

本発明者らは、ベロ毒素を無毒化する物質を探索した結果、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）及びガロカテキンガレート（ＧＣｇ）が、Ｓｔｘ１を不活性化する作用を有することを見出した。

すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）エピガロカテキンガレート及び／又はガロカテキンガレートを有効成分とするＳｔｘ１不活性化剤。
（２）エピガロカテキンガレート及び／又はガロカテキンガレートを有効成分とする、腸管出血性大腸菌により腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／又は改善剤。
（３）抗生物質と併用されるものである（２）記載の予防及び／又は改善剤。

本発明によれば、ベロ毒素Ｓｔｘ１を不活性化することのできる素材が提供される。これらの素材は、ＥＨＥＣが腸管内に分泌したベロ毒素による影響を抑え、食中毒、下痢、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、中枢神経障害、急性脳症等のベロ毒素による中毒症状の予防、治療又は改善のために有用である。

ＥＧＣｇによるＳｔｘ１不活性化作用。エラーバー＝標準偏差。ＥＧＣｇによるＳｔｘ２不活性化作用。エラーバー＝標準偏差。ＧＣｇによるＳｔｘ１不活性化作用。エラーバー＝標準偏差。ＧＣｇによるＳｔｘ２不活性化作用。エラーバー＝標準偏差。

本明細書において、「Ｓｔｘ１」及び「Ｓｔｘ２」は、それぞれ、ＶＴ₁及びＶＴ₂、又はＳＬＴ（Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅｔｏｘｉｎ）−１及びＳＬＴ−２とも称されるベロ毒素を意味する。これらはいずれも、志賀毒素（Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎ；Ｓｔｘ）と同じくＳｈｉｇａｔｏｘｉｎ（Ｓｔｘ）ｆａｍｉｌｙに分類される毒素であり、他のＳｔｘｆａｍｉｌｙに属する毒素と同様にＡサブユニットとＢサブユニットからなる構造を有している。Ｓｔｘ１のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋＭ１６６２５として登録されており、Ｓｔｘのアミノ酸配列と同一又はほぼ同一である。一方、Ｓｔｘ２には多くの変異型が知られており、そのＳｔｘアミノ酸配列に対する同一性は５５％程度である。Ｓｔｘ１とＳｔｘ２は、いずれも細胞のＧｂ３レセプターと結合することから始まる一連の経路で細胞に致死的影響を与えるが、一方、Ｓｔｘ１とＳｔｘ２との間のアミノ酸配列の同一性はＡサブユニットで５８．２％、Ｂサブユニットで６０．７％に過ぎない。従って、Ｓｔｘ１とＳｔｘ２は、その生物学的性質（生体に対する毒性）は共通するものの、物理学的及び免疫学的性質においては異なる。例えば、Ｓｔｘ１は、Ｓｔｘと抗原性が共通しており抗志賀毒素抗体で中和されるが、Ｓｔｘ２はＳｔｘ１又はＳｔｘとの間に共通する抗原性を有さない（細菌毒素ハンドブック編集員；櫻井純、本田武司、小熊恵二発行元；株式会社サイエンスフォーラム発行年；２００２年）。

Ｓｔｘ１を産生するＥＨＥＣとしては、例えば、Ｓｔｘ１のみを産生するＥＨＥＣとしては、２００５年に島根県で発生したＯ２６：Ｈ１１、２００５年に札幌市で発生したＯ２６：ＨＮＴ等が挙げられる（寺嶋淳，日本食品微生物学会雑誌，２４（２）：７４−７９，２００７）。その他に、Ｏ−５５、Ｏ−９１、Ｏ−１１１、Ｏ−１２１、Ｏ−１５７、Ｏ−１６５等もＳｔｘ１を産生するＥＨＥＣとして知られている（ＬｉＲ．ｅｔ．ａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ４９：２４６−２５１，２０１０）。

本明細書において、「Ｓｔｘ１不活性化」とは、Ｓｔｘ１が有する細胞毒性活性を低減又は消失させることである。Ｓｔｘ１不活性化によって、細胞がＳｔｘ１から受ける毒性又は悪影響を低減又は消失させることができる。

Ｓｔｘ１がその毒性を及ぼし得る「細胞」としては、アフリカミドリザル由来ベロ細胞、ならびに生体においてベロ毒素により直接又は間接的に影響を受け得る腸管細胞、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、又はウサギに由来する腸管上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞、腎細胞、中枢神経細胞等が挙げられる。

本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。

本明細書において、「改善」とは、疾患又は症状の好転、疾患又は症状の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。

エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）及びガロカテキンガレート（ＧＣｇ）は、茶カテキンの主要成分として知られている。ＥＧＣｇ及びＧＣｇは市販されており、市販品としては、テアビゴ（ＤＳＭニュートリションジャパン）、サンフェノンＥＧＣｇ（太陽化学株式会社）等が挙げられる。あるいは、ＥＧＣｇ及びＧＣｇは化学合成するか、又は茶葉由来の原料から調製してもよい。

化学合成の方法としては、Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，３５（９）：１００６−１００７，２００６に記載の方法等が挙げられる。

茶葉由来の原料から調製する場合、例えば、茶葉抽出物又はそれらの濃縮物から精製すればよい。当該茶抽出は、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、例えばＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ａｓｓａｍｉｃａ、又はそれらの雑種から得られる茶葉から製茶された茶葉に、水若しくは熱水、又は必要に応じてこれらにさらに抽出助剤を添加し、攪拌抽出等をすることにより行うことができる。また、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する方法を併用してもよい。抽出助剤としては、アスコルビン酸ナトリウム等の有機酸又はその塩等が挙げられる。当該製茶された茶葉には、煎茶、番茶、玉露、てん茶、釜煎り茶等の緑茶類；総称して烏龍茶と呼ばれる鉄観音、色種、黄金桂、武夷岩茶等の半発酵茶；紅茶と呼ばれるダージリン、ウバ、キーマン等の発酵茶が含まれる。

当該茶抽出物の濃縮は、上記抽出物を濃縮することにより行うことができ、当該茶抽出物の精製は、溶剤やカラムを用いることにより行うことができる。茶抽出物の濃縮物や精製物の形態としては、固体、水溶液、スラリー状等種々のものが挙げられる。例えば、当該茶抽出物は、特開昭５９−２１９３８４号、特開平４−２０５８９号、特開平５−２６０９０７号、特開平５−３０６２７９号等に詳細に例示されている方法で調製することができる。また、市販品を用いることもでき、斯かる市販の茶抽出物としては、（株）伊藤園「テアフラン」、三井農林（株）「ポリフェノン」、太陽化学（株）「サンフェノン」、サントリー（株）「サンウーロン」等が挙げられる。

これらの茶抽出物又はその濃縮物を、例えば特開２００１−９７９６８号公報に記載されるように、マクロポーラス極性樹脂で処理することにより、ＥＧＣｇ又はＧＣｇを精製することができる。

下記実施例に示すように、細胞をベロ毒素Ｓｔｘ１の存在下で培養した場合、Ｓｔｘ１の毒性の影響を受けて細胞はほとんど生存できないが、ＥＧＣｇ又はＧＣｇを共存させたＳｔｘ１を添加した場合、生存率が大幅に向上する。従って、ＥＧＣｇ及びＧＣｇは、細胞に対するＳｔｘ１の毒性活性を低減する作用を有する。ＥＧＣｇ及びＧＣｇによるこの効果は、他のカテキン類やテアフラビンと比較して、顕著に高い。

また下記実施例に示すように、ＥＧＣｇ又はＧＣｇによる毒性低減効果はＳｔｘ２に対しては観察されない。このことは、ＥＧＣｇ及びＧＣｇによるＳｔｘ１毒性低減作用が、細胞ではなくＳｔｘ１そのものに対して作用してその毒性活性を不活化した結果によるものであることを示す。従って、本発明によれば、ＥＨＥＣによるベロ毒素の産生又は分泌を抑えるのではなく、既に分泌されてしまったベロ毒素自体を不活性化させることによって、ＥＨＥＣによる中毒症状の予防又は改善に導くことができる。よって本発明は、抗生物質による菌体破壊によって起こるベロ毒素の大量放出に起因する症状の重篤化にも適用できるので、従来の治療剤と比較して有利である。

従って、本発明によれば、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、Ｓｔｘ１の不活性化のために使用することができる。また本発明によれば、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、ＥＨＥＣにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／又は改善のために使用することができる。
あるいは、本発明によれば、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを有効成分とするＳｔｘ１不活性化剤が提供される。また本発明によれば、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを有効成分とする、ＥＨＥＣにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／又は改善剤が提供される。
あるいは、本発明によれば、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、Ｓｔｘ１不活性化剤、又はＥＨＥＣにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／若しくは改善剤を製造するために使用することができる。
あるいは、本発明によれば、対象にＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを投与するか又は摂取させることを含む、Ｓｔｘ１不活性化方法、又はＥＨＥＣにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／若しくは改善方法が提供される。

本発明において、ＥＧＣｇ及びＧＣｇは、各々単独で使用されてもよく、又は組み合わせて使用されてもよい。
本発明において、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類や、ウサギ等の動物、それらに由来する腸管上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞、腎細胞、中枢神経細胞等の細胞、それらの細胞を含む組織、器官等に適用され得る。
本発明において、ＥＨＥＣにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状としては、例えば食中毒、下痢、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、腎障害、中枢神経障害、急性脳症等の症状が挙げられるが、これらに限定されない。

上述したとおり、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、既に分泌されてしまったベロ毒素を不活性化させることができるため、抗生物質による菌体破壊によって起こるベロ毒素の大量放出に起因する症状の重篤化にも適用できる。従って、本発明においてＥＨＥＣにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状を予防及び／又は改善する場合、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇとともに、任意の抗生物質を併用してもよい。抗生物質としては、ホスホマイシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、カナマイシン、ニューキノロン等が挙げられるが、これらに限定されることなく、当業者が対象の種、年齢、状態等にあわせて任意に選択することができる。

本発明において、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇはまた、Ｓｔｘ１不活性化のため、又は腸管出血性大腸菌により腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／若しくは改善のための組成物、医薬、医薬部外品、飲食品、飼料等の有効成分として使用することができ、あるいはそれらの製造のために使用することができる。当該組成物、医薬、医薬部外品、飲食品、飼料等は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。あるいは、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、Ｓｔｘ１不活性化のため、又は腸管出血性大腸菌により腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／若しくは改善のための組成物、医薬、医薬部外品、飲食品、飼料等に素材として配合され得る。

上記医薬又は医薬部外品は、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。例えば、経口投与形態としては、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシル、シロップ、懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与形態としては、経鼻、経腸、坐剤等が挙げられる。

上記医薬や医薬部外品は、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを単独で含有していてもよく、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、希釈剤、分散剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該医薬や医薬部外品は、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇのＳｔｘ１不活性化作用が失われない限り、他の有効成分や薬理成分をさらに含有していてもよい。

上記医薬又は医薬部外品は、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇから、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や薬理成分を組みあわせて、常法により製造することができる。当該医薬又は医薬部外品におけるＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇの含有量は、ＥＧＣｇとＧＣｇの合計量として、０．００１〜０．１質量％であればよく、０．００１〜０．０１質量％が好ましく、０．００１〜０．００５質量％がより好ましい。

上記飲食品は、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを有効成分として含有し、Ｓｔｘ１不活性化機能、又は腸管出血性大腸菌により腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／若しくは改善機能を企図し、必要に応じて当該機能を表示した、病者用飲食品、特定保健用飲食品等の機能性飲食品であり得る。上記飲食品の種類は特に限定されない。飲料としては、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等、あらゆる飲料が挙げられる。食品の形態は、固形、半固形、液状等の任意の形態であってもよく、また錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。例えば、食品としては、パン類、麺類、パスタ、ゼリー状食品、各種スナック類、ケーキ類、菓子類、アイスクリーム類、スープ類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、その他加工食品、調味料、サプリメント等が挙げられる。
上記飲食品又は飼料は、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを単独で含有していてもよく、又は他の食材や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等の添加剤を組み合わせて含有していてもよい。

ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを有効成分して含有する飼料としては、例えば非ヒト霊長類、ラット、マウス等のげっ歯類、ウサギ等に用いる飼料が挙げられる。当該飼料は、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇを単独で、又はこの他に、魚肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて配合し、常法により製造することがきできる。

上記飲食品又は飼料中におけるＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇの含有量は、ＥＧＣｇとＧＣｇの合計量として、通常、飲料の形態では、０．００１〜０．１質量％であればよく、０．００１〜０．０１質量％が好ましく、０．００１〜０．００５質量％がより好ましい。また、食品又は飼料の形態では、０．００１〜０．１質量％であればよく、０．００１〜０．０１質量％が好ましく、０．００１〜０．００５質量％がより好ましい。

本発明によるＳｔｘ１不活性化方法においては、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、Ｓｔｘ１不活性化を必要とする対象に有効量で投与されるか、あるいはそれらを必要とする対象に有効量で摂取される。
投与又は摂取の対象としては、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ウサギ等の動物が挙げられ、より好ましくはヒトである。あるいは、投与の対象は、Ｓｔｘ１不活性化が所望される上記ヒト又は動物由来の組織、器官、細胞、又はそれらの分画物であり得る。当該細胞としては、腸管上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞、腎細胞、中枢神経細胞等が好ましく、当該組織及び器官としては上記に挙げた細胞を含む組織及び器官が好ましく、当該分画物としては、上記に挙げた細胞の分画物が好ましい。また当該組織、器官、細胞、又はそれらの分画物は、好ましくは、天然由来又は生物学的若しくは生物工学的に改変された組織、器官、細胞、又はそれらの分画物である。

本発明によるＥＨＥＣにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び／又は改善方法においては、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、当該中毒症状の予防及び／又は改善を必要とする対象に有効量で投与されるか、あるいはそれらを必要とする対象に有効量で摂取される。投与又は摂取する対象としては、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ウサギ等の動物が挙げられ、より好ましくはヒトである。当該方法においては、ＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇとともに、上述した任意の抗生物質が併用されてもよい。

上記本発明の方法におけるＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇの投与又は摂取の有効量は、投与又は摂取する対象において所望のＳｔｘ１不活性化効果又は毒性低減効果を得られる量であれば、特に限定されない。有効量は、対象の種、状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、ＥＧＣｇとＧＣｇの合計量として、１．８７〜１００，０００ｍｇが好ましく、３．７４〜２５，０００ｍｇがより好ましく、４６．８〜１０，０００ｍｇがさらに好ましく、２２５〜２，２５０ｍｇがなお好ましい。またＥＧＣｇ及び／又はＧＣｇは、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

実施例１カテキン類によるベロ毒素不活化試験
（１）試験物質
ＧＣｇ（ガロカテキンガレート）三井農林株式会社（純度９８％以上）
ＥＧＣｇ（エピガロカテキンガレート）三井農林株式会社（純度９８％以上）
Ｃ（カテキン）三井農林株式会社（純度９８％以上）
ＥＣ（エピカテキン）三井農林株式会社（純度９８％以上）
ＧＣ（ガロカテキン）三井農林株式会社（純度９８％以上）
ＥＧＣ（エピガロカテキン）三井農林株式会社（純度９８％以上）
Ｃｇ（カテキンガレート）三井農林株式会社（純度９８％以上）
ＥＣｇ（エピカテキンガレート）三井農林株式会社（純度９８％以上）
テアフラビンナカライテスク（株）（純度９０％以上）

（２）毒素溶液の調製と力価の測定
ベロ毒素を産生する腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）としては、Ｓｔｘ１産生株としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７Ｎｏ．３３株（ｓｔｘ１＋）を、Ｓｔｘ２産生株としてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７Ｎｏ．１４８株（ｓｔｘ２＋）を、ベロ毒素を産生しない株としてＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ２０Ｎｏ．３７株（ｓｔｘ１−、ｓｔｘ２−、Ｓｔｘ１−、Ｓｔｘ２−）を、それぞれ使用した。
上記Ｎｏ．３３株及びＮｏ．１４８株をＬＢ培地（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）５ｍｌ中、３７℃で一晩振とう培養した。培養液を１０００倍希釈して１０μｌを新しいＬＢ培地５ｍｌ（４０本）に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養した。各菌株の培養液５ｍｌを１５ｍｌ遠沈管に入れ、ｐｏｌｙｍｉｘｉｎＢを５０００Ｕ／１ｍｌとなるように培養液に加え、３７℃で１時間インキュベートし、培養液を集めた。集めた培養液を２５ｍｌずつ５０ｍｌ遠沈管に入れて、遠心分離（３０００×ｇ、１５分間）して、上清をいったんビーカーに集めた後、ろ過（０．２μｍ）滅菌して毒素溶液とした。
毒素溶液中のベロ毒素の力価は、ＶＴＥＣ−ＲＰＬＡ「生研」（デンカ生研）を用い、附属のプロトコールに従ってＳｔｘ１（ＶＴ₁）及びＳｔｘ２（ＶＴ₂）の産生性を調べて算出した。測定の結果、Ｎｏ．３３株から得られた毒素溶液（Ｓｔｘ１）は力価５１２、Ｎｏ．１４８株から得られた毒素溶液（Ｓｔｘ２）は力価２０４８であった。以下のベロ毒素不活化試験では、Ｓｔｘ１は力価１６、Ｓｔｘ２は力価６４になるようにＰＢＳで希釈した毒素溶液を用いた。

（３）ベロ毒素不活化試験
９６穴プレートにベロ細胞を播種（２×１０⁴細胞／ウェル、各１００μｌ）し、２４時間培養した。（２）で調製した毒素溶液２２０μｌと、ＰＢＳで濃度調製し、ろ過滅菌した試験物質２２０μｌとを滅菌チューブ中で混合し（混合液中の試験物質の最終濃度：０．１ｖ／ｖ％、０．０１ｖ／ｖ％又は０．００１ｖ／ｖ％）、３７℃で１時間インキュベートした後、ベロ細胞培養液に添加した（２００μｌ／ウェル）。コントロールとして、同濃度の毒素溶液（Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２）のみを添加した細胞を培養した。
４８時間培養後、培地を除去してＰＢＳ（約２００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、２％ホルマリン含有ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）を添加して室温で１分間静置した後、純水（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄し、水を除去した後、０．１％クリスタルバイオレット５％エタノール溶液（２００μｌ／ウェル）を添加して細胞を１０分間染色した。純水で洗浄（約４００μｌ／ウェル、２回）後、水分を除去、風乾させた。乾燥後の９６穴プレートの写真を撮影した後、各ウェルにエタノール２００μｌを加え、１０分間静置して染色色素を抽出し、プレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定することで、ベロ細胞の生残を調べた。ベロ毒素により細胞が死滅するとプレートから剥離し染色されないので、吸光度が高いほど細胞が生残している、すなわちベロ毒素による毒性が阻害されたと判定した。各試験物質添加群での細胞生存率を、コントロール群に対する相対値として求めた。

（４）結果
結果を下記表１に示す。ＥＧＣｇ又はＧＣｇと混合されたＳｔｘ１毒素溶液を添加された細胞は、他のカテキン類及びテアフラビンの場合と比べて細胞の生存率が向上しており、ＥＧＣｇ及びＧＣｇに高いＳｔｘ１毒性低減作用があることが示された。Ｓｔｘ２毒素溶液に対しては何れの試験物質にも毒性低減作用は見られなかった。
Ｓｔｘ１とＳｔｘ２とは、細胞のＧｂ３レセプターから始まる共通の経路を介して細胞に毒性の影響を及ぼすことが知られているが（細菌毒素ハンドブック編集員；櫻井純、本田武司、小熊恵二発行元；株式会社サイエンスフォーラム発行年；２００２年）、本試験においてＥＧＣｇ及びＧＣｇによる毒性低減効果はＳｔｘ１にのみ観察され、Ｓｔｘ２では観察されなかった。従って、ＥＧＣｇ及びＧＣｇが、細胞ではなくＳｔｘ１そのものに対して作用し、その毒性活性を不活化していることが示された。

実施例２ＥＧＣｇおよびＧＣｇによるベロ毒素不活化試験
（１）試験物質
ＧＣｇ三井農林株式会社（純度９８％以上）
ＥＧＣｇ三井農林株式会社（純度９８％以上）

（２）毒素溶液の調製と力価の測定
実施例１と同様の手順でＳｔｘ１産生株Ｎｏ．３３及びＳｔｘ２産生株Ｎｏ．１４８から毒素溶液を調製した。毒素溶液中のベロ毒素の力価は、ＶＴＥＣ−ＲＰＬＡ「生研」（デンカ生研）を用い、附属のプロトコールに従ってＳｔｘ１（ＶＴ₁）及びＳｔｘ２（ＶＴ₂）の産生性を調べて算出した。測定の結果、Ｎｏ．３３株から得られた毒素溶液（Ｓｔｘ１）は力価５１２、Ｎｏ．１４８株から得られた毒素溶液（Ｓｔｘ２）は力価２０４８であった。以下のベロ毒素不活化試験では、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２をＰＢＳで段階的に２倍希釈し、最終希釈倍率２〜２０４８倍に調製した毒素溶液を用いた。

（３）ベロ毒素不活化試験
９６穴プレートにベロ細胞を播種（２×１０⁴細胞／ウェル、各１００μｌ）し、２４時間培養した。（２）で調製した毒素溶液１００μｌと、ＰＢＳで濃度調製し、ろ過滅菌した最終濃度０．００１５％の試験物質１００μｌとを混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、ベロ細胞培養液に添加した（２００μｌ／ウェル）。コントロールとして、同濃度の毒素溶液（Ｓｔｘ１又はＳｔｘ２）のみを添加した細胞を培養した。
４８時間培養後、培地を除去してＰＢＳ（約２００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、２％ホルマリン含有ＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）を添加して室温で１分間静置した後、純水（２００μｌ／ウェル）で２回洗浄し、水を除去した後、０．１％クリスタルバイオレット５％エタノール溶液（２００μｌ／ウェル）を添加して細胞を１０分間染色した。純水で洗浄（約４００μｌ／ウェル、２回）後、水分を除去、風乾させた。乾燥後の９６穴プレートの写真を撮影した後、各ウェルにエタノール２００μｌを加え、１０分間静置して染色色素を抽出し、プレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度を測定することで、ベロ細胞の生残を調べた。ベロ毒素により細胞が死滅するとプレートから剥離し染色されないので、吸光度が高いほど細胞が生残している、すなわちベロ毒素による毒性が阻害されたと判定した。各試験物質添加群での細胞生存率を、コントロール群に対する相対値として求めた。試験はいずれの組み合わせでもｎ＝６で行った。求めた生残率について、コントロール群に対する有意差検定（ｔ検定）を行った。

（４）結果
結果を図１〜図４に示す。ＥＧＣｇと混合された１６〜１２８倍希釈されたＳｔｘ１毒素溶液又はＧＣｇと混合された１６〜２５６倍希釈されたＳｔｘ１毒素溶液を添加された細胞は、ＥＧＣｇ又はＧＣｇ未処理の同希釈倍率のＳｔｘ１毒素溶液を添加された細胞と比較して生存率が向上した（図１及び３）。この結果から、毒素１ｎｇを不活性化するのに必要なＥＧＣｇ及びＧＣｇは０．０１８ｎｇであることが明らかとなった。Ｓｔｘ２毒素溶液に対してはＥＧＣｇ又はＧＣｇの何れの試験物質にも毒性低減作用は見られなかった（図２及び４）。

Claims

エピガロカテキンガレート及び／又はガロカテキンガレートを有効成分とする、Ｓｔｘ１そのものに対して作用するＳｔｘ１不活性化剤。
エピガロカテキンガレート及び／又はガロカテキンガレートを有効成分とする、Ｓｔｘ１そのものに対して作用して腸管出血性大腸菌により腸管内に分泌されたＳｔｘ１による中毒症状を予防及び／又は改善するための剤（ただし腸管や腎の上皮細胞のＳｔｘ誘導アポトーシスを抑制するものを除く）。
抗生物質と併用されるものである請求項２記載の予防及び／又は改善剤。
エピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートを合計で０．００１〜０．１質量％含有する、請求項１記載のＳｔｘ１不活性化剤。
成人１人当たりの１日投与量がエピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートの合計量として１．８７〜１０，０００ｍｇである、請求項１又は４記載のＳｔｘ１不活性化剤。
エピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートを合計で０．００１〜０．１質量％含有する、請求項２又は３記載の予防及び／又は改善剤。
成人１人当たりの１日投与量がエピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートの合計量として１．８７〜１０，０００ｍｇである、請求項２、３、又は６記載の予防及び／又は改善剤。