JP2016183197A - ベロ毒素不活性化剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】エピガロカテキンガレート及び/又はガロカテキンガレートを有効成分とするStx1不活性化剤。
【選択図】なし
Description
ワクチンや抗菌剤は、菌の感染及び生育を防止するために最も一般的使用されている手段である。臨床的には、ホスホマイシン等の抗生物質が経験的に使用されている。また非特許文献1には、エピガロカテキンガレート(EGCg)にO−157に対する殺菌作用があることが報告されている。しかし、これらはEHEC全般に対しては常に有効とはいえない。なぜなら、ワクチンは、O157には効いても他のタイプのEHECには効かないなど、効果が菌のタイプにより制限されるという問題があり、また抗菌剤を使用する場合、菌が死滅する際に菌体内に蓄えられたベロ毒素が腸管内に一度に放出されることにより、症状が重篤化するおそれがあるからである。
(1)エピガロカテキンガレート及び/又はガロカテキンガレートを有効成分とするStx1不活性化剤。
(2)エピガロカテキンガレート及び/又はガロカテキンガレートを有効成分とする、腸管出血性大腸菌により腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び/又は改善剤。
(3)抗生物質と併用されるものである(2)記載の予防及び/又は改善剤。
あるいは、本発明によれば、EGCg及び/又はGCgを有効成分とするStx1不活性化剤が提供される。また本発明によれば、EGCg及び/又はGCgを有効成分とする、EHECにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び/又は改善剤が提供される。
あるいは、本発明によれば、EGCg及び/又はGCgは、Stx1不活性化剤、又はEHECにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び/若しくは改善剤を製造するために使用することができる。
あるいは、本発明によれば、対象にEGCg及び/又はGCgを投与するか又は摂取させることを含む、Stx1不活性化方法、又はEHECにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状の予防及び/若しくは改善方法が提供される。
本発明において、EGCg及び/又はGCgは、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類や、ウサギ等の動物、それらに由来する腸管上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞、腎細胞、中枢神経細胞等の細胞、それらの細胞を含む組織、器官等に適用され得る。
本発明において、EHECにより腸管内に分泌されたベロ毒素による中毒症状としては、例えば食中毒、下痢、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、腎障害、中枢神経障害、急性脳症等の症状が挙げられるが、これらに限定されない。
上記飲食品又は飼料は、EGCg及び/又はGCgを単独で含有していてもよく、又は他の食材や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等の添加剤を組み合わせて含有していてもよい。
投与又は摂取の対象としては、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、ウサギ等の動物が挙げられ、より好ましくはヒトである。あるいは、投与の対象は、Stx1不活性化が所望される上記ヒト又は動物由来の組織、器官、細胞、又はそれらの分画物であり得る。当該細胞としては、腸管上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞、腎細胞、中枢神経細胞等が好ましく、当該組織及び器官としては上記に挙げた細胞を含む組織及び器官が好ましく、当該分画物としては、上記に挙げた細胞の分画物が好ましい。また当該組織、器官、細胞、又はそれらの分画物は、好ましくは、天然由来又は生物学的若しくは生物工学的に改変された組織、器官、細胞、又はそれらの分画物である。
(1)試験物質
GCg(ガロカテキンガレート) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
EGCg(エピガロカテキンガレート) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
C(カテキン) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
EC(エピカテキン) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
GC(ガロカテキン) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
EGC(エピガロカテキン) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
Cg(カテキンガレート) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
ECg(エピカテキンガレート) 三井農林株式会社 (純度98%以上)
テアフラビン ナカライテスク(株)(純度90%以上)
ベロ毒素を産生する腸管出血性大腸菌(EHEC)としては、Stx1産生株としてEscherichia coli O157:H7 No.33株(stx1+)を、Stx2産生株としてE.coli O157 No.148株(stx2+)を、ベロ毒素を産生しない株としてE.coli O157:H20 No.37株(stx1−、stx2−、Stx1−、Stx2−)を、それぞれ使用した。
上記No.33株及びNo.148株をLB培地(Becton&Dickinson)5ml中、37℃で一晩振とう培養した。培養液を1000倍希釈して10μlを新しいLB培地5ml(40本)に接種してさらに37℃で一晩振とう培養した。各菌株の培養液5mlを15ml遠沈管に入れ、polymixin Bを5000U/1mlとなるように培養液に加え、37℃で1時間インキュベートし、培養液を集めた。集めた培養液を25mlずつ50ml遠沈管に入れて、遠心分離(3000×g、15分間)して、上清をいったんビーカーに集めた後、ろ過(0.2μm)滅菌して毒素溶液とした。
毒素溶液中のベロ毒素の力価は、VTEC−RPLA「生研」(デンカ生研)を用い、附属のプロトコールに従ってStx1(VT1)及びStx2(VT2)の産生性を調べて算出した。測定の結果、No.33株から得られた毒素溶液(Stx1)は力価512、No.148株から得られた毒素溶液(Stx2)は力価2048であった。以下のベロ毒素不活化試験では、Stx1は力価16、Stx2は力価64になるようにPBSで希釈した毒素溶液を用いた。
96穴プレートにベロ細胞を播種(2×104細胞/ウェル、各100μl)し、24時間培養した。(2)で調製した毒素溶液220μlと、PBSで濃度調製し、ろ過滅菌した試験物質220μlとを滅菌チューブ中で混合し(混合液中の試験物質の最終濃度:0.1v/v%、0.01v/v%又は0.001v/v%)、37℃で1時間インキュベートした後、ベロ細胞培養液に添加した(200μl/ウェル)。コントロールとして、同濃度の毒素溶液(Stx1又はStx2)のみを添加した細胞を培養した。
48時間培養後、培地を除去してPBS(約200μl/ウェル)で3回洗浄し、2%ホルマリン含有PBS(200μl/ウェル)を添加して室温で1分間静置した後、純水(200μl/ウェル)で2回洗浄し、水を除去した後、0.1%クリスタルバイオレット5%エタノール溶液(200μl/ウェル)を添加して細胞を10分間染色した。純水で洗浄(約400μl/ウェル、2回)後、水分を除去、風乾させた。乾燥後の96穴プレートの写真を撮影した後、各ウェルにエタノール200μlを加え、10分間静置して染色色素を抽出し、プレートリーダーで595nmの吸光度を測定することで、ベロ細胞の生残を調べた。ベロ毒素により細胞が死滅するとプレートから剥離し染色されないので、吸光度が高いほど細胞が生残している、すなわちベロ毒素による毒性が阻害されたと判定した。各試験物質添加群での細胞生存率を、コントロール群に対する相対値として求めた。
結果を下記表1に示す。EGCg又はGCgと混合されたStx1毒素溶液を添加された細胞は、他のカテキン類及びテアフラビンの場合と比べて細胞の生存率が向上しており、EGCg及びGCgに高いStx1毒性低減作用があることが示された。Stx2毒素溶液に対しては何れの試験物質にも毒性低減作用は見られなかった。
Stx1とStx2とは、細胞のGb3レセプターから始まる共通の経路を介して細胞に毒性の影響を及ぼすことが知られているが(細菌毒素ハンドブック 編集員;櫻井純、本田武司、小熊恵二 発行元;株式会社サイエンスフォーラム 発行年;2002年)、本試験においてEGCg及びGCgによる毒性低減効果はStx1にのみ観察され、Stx2では観察されなかった。従って、EGCg及びGCgが、細胞ではなくStx1そのものに対して作用し、その毒性活性を不活化していることが示された。
(1)試験物質
GCg 三井農林株式会社 (純度98%以上)
EGCg 三井農林株式会社 (純度98%以上)
実施例1と同様の手順でStx1産生株No.33及びStx2産生株No.148から毒素溶液を調製した。毒素溶液中のベロ毒素の力価は、VTEC−RPLA「生研」(デンカ生研)を用い、附属のプロトコールに従ってStx1(VT1)及びStx2(VT2)の産生性を調べて算出した。測定の結果、No.33株から得られた毒素溶液(Stx1)は力価512、No.148株から得られた毒素溶液(Stx2)は力価2048であった。以下のベロ毒素不活化試験では、Stx1およびStx2をPBSで段階的に2倍希釈し、最終希釈倍率2〜2048倍に調製した毒素溶液を用いた。
96穴プレートにベロ細胞を播種(2×104細胞/ウェル、各100μl)し、24時間培養した。(2)で調製した毒素溶液100μlと、PBSで濃度調製し、ろ過滅菌した最終濃度0.0015%の試験物質100μlとを混合し、37℃で1時間インキュベートした後、ベロ細胞培養液に添加した(200μl/ウェル)。コントロールとして、同濃度の毒素溶液(Stx1又はStx2)のみを添加した細胞を培養した。
48時間培養後、培地を除去してPBS(約200μl/ウェル)で3回洗浄し、2%ホルマリン含有PBS(200μl/ウェル)を添加して室温で1分間静置した後、純水(200μl/ウェル)で2回洗浄し、水を除去した後、0.1%クリスタルバイオレット5%エタノール溶液(200μl/ウェル)を添加して細胞を10分間染色した。純水で洗浄(約400μl/ウェル、2回)後、水分を除去、風乾させた。乾燥後の96穴プレートの写真を撮影した後、各ウェルにエタノール200μlを加え、10分間静置して染色色素を抽出し、プレートリーダーで595nmの吸光度を測定することで、ベロ細胞の生残を調べた。ベロ毒素により細胞が死滅するとプレートから剥離し染色されないので、吸光度が高いほど細胞が生残している、すなわちベロ毒素による毒性が阻害されたと判定した。各試験物質添加群での細胞生存率を、コントロール群に対する相対値として求めた。試験はいずれの組み合わせでもn=6で行った。求めた生残率について、コントロール群に対する有意差検定(t検定)を行った。
結果を図1〜図4に示す。EGCgと混合された16〜128倍希釈されたStx1毒素溶液又はGCgと混合された16〜256倍希釈されたStx1毒素溶液を添加された細胞は、EGCg又はGCg未処理の同希釈倍率のStx1毒素溶液を添加された細胞と比較して生存率が向上した(図1及び3)。この結果から、毒素1ngを不活性化するのに必要なEGCg及びGCgは0.018ngであることが明らかとなった。Stx2毒素溶液に対してはEGCg又はGCgの何れの試験物質にも毒性低減作用は見られなかった(図2及び4)。
Claims (7)
- エピガロカテキンガレート及び/又はガロカテキンガレートを有効成分とする、Stx1そのものに対して作用するStx1不活性化剤。
- エピガロカテキンガレート及び/又はガロカテキンガレートを有効成分とする、Stx1そのものに対して作用して腸管出血性大腸菌により腸管内に分泌されたStx1による中毒症状を予防及び/又は改善するための剤。
- 抗生物質と併用されるものである請求項2記載の予防及び/又は改善剤。
- エピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートを合計で0.001〜0.1質量%含有する、請求項1記載のStx1不活性化剤。
- 成人1人当たりの1日投与量がエピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートの合計量として1.87〜10,000mgである、請求項1又は4記載のStx1不活性化剤。
- エピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートを合計で0.001〜0.1質量%含有する、請求項2又は3記載の予防及び/又は改善剤。
- 成人1人当たりの1日投与量がエピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレートの合計量として1.87〜10,000mgである、請求項2、3、又は6記載の予防及び/又は改善剤。
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