JP6218096B1 - Nannochloropsis and its production method. - Google Patents
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Abstract
【課題】給餌コストの低減に寄与するナンノクロロプシスを提供すること。【解決手段】塩素濃度が３．０ｐｐｍであると共に塩分濃度が２．０％の培養水中で増殖するナンノクロロプシスである。ナンノクロロプシスの培養水の塩素濃度を高濃度にする高濃度塩素処理工程と、第１処理工程後に塩素成分を中和する中和処理工程と、中和処理工程後の周年培養工程と、周年培養工程後の高濃度塩素培養水中における培養工程とを有することを特徴とする新株のナンノクロロプシスの作出方法である。【選択図】なし[PROBLEMS] To provide Nannochloropsis which contributes to a reduction in feeding cost. SOLUTION: Nannochloropsis grows in culture water having a chlorine concentration of 3.0 ppm and a salinity of 2.0%. High concentration chlorination process to increase the chlorine concentration of Nannochloropsis culture water, neutralization process to neutralize chlorine components after the first treatment process, anniversary culture process after the neutralization process, and anniversary It is a method for producing a new strain of Nannochloropsis, characterized by having a culture step in a high-concentration chlorine culture water after the culture step. [Selection figure] None
Description
本発明は、いわゆるナンノクロロプシスに関し、特に魚類養殖の際に用いる飼料として好適なものに関するものである。 The present invention relates to so-called Nannochloropsis, and particularly relates to a suitable feed for use in fish farming.
水産庁の水産白書によれば、サケ・マス類、ブリ類及びタイ類の日本国内における流通量は、天然魚よりも養殖魚の方が多いという現状である（参照：平成２５年度の水産白書の第１章「特集 養殖業の持続的発展」の第１節「これまでの養殖業の展開」の「（１）養殖業の意義」）。
魚の養殖業界では、近年、養殖用生餌や配合飼料等の餌料の価格の上昇等に伴い養殖経費が上昇している。そして、餌料価格の上昇は、養殖魚類の販売価格の上昇の原因の一つになっている。
稚魚や幼魚の餌料としては、例えば、ワムシなどの動物性プランクトンを挙げることができ、動物性プランクトンの餌料としてクロレラを挙げることができる（特許文献１参照）。
したがって、これらの餌料のコストを低減させることができれば、養殖魚類の販売価格を抑えることができることになる。
According to the Fisheries White Paper of the Fisheries Agency, the distribution of salmon, trout, yellowtail, and Thai in Japan is larger in the case of cultured fish than natural fish (see: “(1) Significance of aquaculture” in Chapter 1 “Development of aquaculture so far” in Chapter 1 “Special Feature: Sustainable Development of Aquaculture”.
In the fish culture industry, in recent years, the cost of aquaculture has risen with an increase in the price of feed for aquaculture feeds and mixed feeds. An increase in feed prices is one of the causes of an increase in the sales price of cultured fish.
Examples of feed for fry and juveniles include zooplankton such as rotifers, and examples of feed for zooplankton include chlorella (see Patent Document 1).
Therefore, if the cost of these feeds can be reduced, the selling price of cultured fish can be reduced.
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、給餌コストの低減に寄与するナンノクロロプシスを提供することを課題とする。 This invention is made | formed in view of such a subject, and makes it a subject to provide the nannochloropsis which contributes to reduction of feeding cost.
本発明の発明者は、魚の養殖で用いられることがあるナンノクロロプシス（ナンノクロロピス）に着目した。
ナンノクロロプシスは、「真核生物/ストラメノパイラ/不等毛植物門/真正眼点藻綱/ユウスティグマトス目/ナンノクロロプシス属」である。不等毛植物としては例外的に緑色を呈する単細胞性の藻類である。不等毛植物は淡水から土壌に生育するものが多いが、ナンノクロロプシス属は例外的に海洋に生育している。
ナンノクロロプシスは、いわゆる「海産クロレラ」と称されることもあるが、クロレラは「真核生物/植物界/緑色植物亜界/緑藻植物門/トレボウキシア藻綱/クロレラ目/クロレラ科/クロレラ属」であり、ナンノクロロプシスとクロレラは全く別のものである。
The inventor of the present invention focused on Nannochloropsis (Nanochloropis), which is sometimes used in fish farming.
Nannochloropsis is "Eukaryote / Stramenopyra / Irregular phytophyta / Spiritidae algae / Ustigmataceae / Nannochloropsis genus". As an unequal hairy plant, it is a unicellular algae with an exceptional green color. Many irregular hairy plants grow from fresh water into the soil, but the genus Nannochloropsis grows exceptionally in the ocean.
Nannochloropsis is sometimes referred to as the so-called "marine chlorella", but chlorella is "eukaryote / plant kingdom / green plant subfamily / green algae phytophyte / trevoxia algae / chlorella / Chlorella family / Chlorella Nannochloropsis and chlorella are completely different.
ナンノクロロプシスに着目した発明者は、自ら培養したナンノクロロプシスを用いて仔魚の養殖（種苗生産）を行い、魚の養殖用餌料として好適なナンノクロロプシスに関する研究を継続的に行った。
また、養殖した仔魚を養殖業者において成魚に成長させる過程について確認する作業を行った。その結果、成魚への成長と養殖業者における給餌量との関係について、養殖業者に供給した稚魚の個体差というよりもロット差と考えるのが妥当と判断できる成長事例があることが分かった。
そこで、この点に関する研究の一環として、餌料として用いているナンノクロロプシス（ナンノクロロピス）について、種々の検討・分析を行った。
その結果、本発明に係るナンノクロロプシスを見出した。つまり、培養（生産）が容易なナンノクロロプシス株の提供や、給餌効率が高いナンノクロロプシス株の提供をするに至った。さらに、このようなナンノクロロプシスを用いることで、魚養殖時の餌料コストを低減できることを見出した。
The inventor who paid attention to Nannochloropsis cultivated larvae (seedling production) using Nannochloropsis cultured by himself, and continuously conducted research on Nannochloropsis suitable as food for fish culture.
In addition, the farmer confirmed the process of growing the cultured larvae into adult fish. As a result, it has been found that there are growth cases where it can be judged that it is more appropriate to consider the difference between the growth of adult fish and the amount of food fed by the farmer as a lot difference rather than an individual difference of the fry supplied to the farmer.
Therefore, as part of the research on this point, various studies and analyzes were conducted on Nannochloropsis (Nannochloropis) used as a feed.
As a result, Nannochloropsis according to the present invention was found. That is, the present inventors have provided a Nannochloropsis strain that can be easily cultured (produced) and a Nannochloropsis strain with high feeding efficiency. Furthermore, it discovered that the feed cost at the time of fish culture could be reduced by using such Nannochloropsis.
本出願に係る発明は、塩素濃度が３．０ｐｐｍの培養水中で増殖するナンノクロロプシスである。
そして、塩素濃度が１５．０ｐｐｍの培養水中で増殖する。
また、塩分濃度が２．０％の培養水中で増殖する。
また、塩分濃度が１．５％の培養水中で増殖する。
また、水温が２８℃の培養水中で増殖する。
また、水温が３０℃の培養水中で増殖する。
The invention according to the present application is Nannochloropsis that grows in culture water having a chlorine concentration of 3.0 ppm.
And it grows in the culture water whose chlorine concentration is 15.0 ppm.
It also grows in culture water with a salinity of 2.0%.
It also grows in culture water with a salinity of 1.5%.
Moreover, it grows in culture water having a water temperature of 28 ° C.
Moreover, it grows in culture water having a water temperature of 30 ° C.
本出願に係る別の発明は、このような新株のナンノクロロプシスを含有する液体を濃縮して得られるナンノクロロプシス濃縮液である。
また、このような新株のナンノクロロプシスを粉末にしたナンノクロロプシス粉末である。
また、このような新株のナンノクロロプシス、ナンノクロロプシス濃縮液又は粉末のうちの少なくともいずれか１つが配合された魚餌料用配合飼料である。
また、このような新株のナンノクロロプシス、ナンノクロロプシス濃縮液、粉末又は配合飼料のうちの少なくともいずれか１つを餌料として投与することを特徴とする魚の養殖方法である。
また、このような新株のナンノクロロプシス、ナンノクロロプシス濃縮液、粉末のうちの少なくともいずれか１つを餌料として投与することを特徴とするワムシの培養方法である。
Another invention according to the present application is a nannochloropsis concentrate obtained by concentrating a liquid containing such a new strain of nannochloropsis.
Further, it is a Nannochloropsis powder obtained by powdering such a new strain of Nannochloropsis.
Moreover, it is a mixed feed for fish feed in which at least any one of such a new strain of Nannochloropsis, Nannochloropsis concentrate or powder is blended.
Moreover, it is a fish culture method characterized by administering at least any one of such a new strain of Nannochloropsis, Nannochloropsis concentrate, powder or mixed feed as a feed.
Also, the present invention is a method for cultivating a rotifer characterized by administering at least one of such a new strain of Nannochloropsis, Nannochloropsis concentrate, and powder as a feed.
本出願に係るさらに別の発明は、ナンノクロロプシスの培養水の塩素濃度を高濃度にする高濃度塩素処理工程と、前記第１処理工程後に塩素成分を中和する中和処理工程と、前記中和処理工程後の周年培養工程と、当該周年培養工程後の高濃度塩素培養水中における培養工程とを有することを特徴とする新株のナンノクロロプシスの作出方法である。
そして、高濃度塩素培養水中における培養工程におけるナンノクロロプシスの細胞数の密度は、１．０×１０7〜３．５×１０7 cell/mLである。
Still another invention according to the present application includes a high concentration chlorination step for increasing the chlorine concentration of culture water of Nannochloropsis, a neutralization step for neutralizing a chlorine component after the first treatment step, A method for producing a new strain of Nannochloropsis, characterized by comprising an anniversary culture step after the neutralization treatment step and a culture step in high-concentration chlorine culture water after the anniversary culture step.
The density of the number of cells Nannochloropsis in the culturing step at high concentration chlorine culture water is 1.0 × 10 7 ~3.5 × 10 7 cell / mL.
本出願に係る新株のナンノクロロプシスは、塩素濃度が高濃度の培養水中で増殖するものであるなど、多様な環境下において培養が容易であり、安定供給が容易であるので、魚養殖で用いる餌料として好適である。 The new strain Nannochloropsis according to the present application is easy to culture in various environments, such as those that grow in culture water with a high chlorine concentration, and is used for fish farming because it is easy to stably supply. Suitable as a feed.
次に、本発明の実施形態に係るナンノクロロプシスについて説明する。
本実施形態のナンノクロロプシス（以下、単に新株と称することがある）は、次のような親株のナンノクロロプシス（以下、単に親株と称することがある）から得られたものである。
親株は、自然界の海水中からの採取や自然界から採取されたナンノクロロプシスを培養する研究機関等から入手可能なものである。
Next, Nannochloropsis according to an embodiment of the present invention will be described.
The Nannochloropsis of this embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as a new strain) is obtained from the following parent strain of Nannochloropsis (hereinafter also simply referred to as a parent strain).
The parent strain can be obtained from a research institute that cultivates natural nocturnal seawater and cultures of natural nonochloropsis.
発明者は、１９９６年ごろから仔魚の育成（種苗生産）の餌料に関して大分県水産試験場に相談していたところ、同試験場で培養されていた親株のナンノクロロプシスを仔魚養殖の試験・研究の目的で譲り受けた。その後、この親株を培養して仔魚養殖の餌料の試験・研究を行った。 The inventor had been consulting with the Oita Prefectural Fisheries Experiment Station regarding the feeding of larvae (seedling production) since around 1996. I took over. Thereafter, this parent strain was cultured to test and study the feed for larva farming.
（親株の培養・増殖）
上述の親株を、屋外設置された６つの培養水槽（以下、単に水槽）を用い、いわゆる独立栄養増殖法によって培養・増殖（以下、周年培養と称することがある）を継続した。各水槽（第１水槽〜第６水槽）は、２０トン（ton）の培養水（海水）を貯水可能なものである。
周年培養では、１か月〜２か月に一度程度の間隔で栄養分の施肥を行った。
栄養分の施肥量（培養水１トン当たり）は、培養中の親株（ナンノクロロプシス）の成育状況を観察しつつ適宜決定した。施肥一回当たりの各水槽への施肥量は、具体的には、硫酸アンモニウム５０ｇ〜１００ｇ／トン、尿素２０ｇ〜５０ｇ／トン、過リン酸石灰１０ｇ〜３０ｇ／トンであった。
また、一週間に一度程度の間隔で、各水槽に対して定期的に「減虫処理・雑菌処理」を行った。この処理では、水槽における塩素濃度が１．５ｐｐｍ（mg/L）になるように塩素を添加した（表１参照）。
また、１０日〜２週間に一度程度の間隔で、各水槽中の培養水の半分の量をポンプで吸い出した後、水槽内の培養水の量が２０トンになるように海水（培養水）を追加した。
なお、独立栄養増殖法は、周知の方法であるので、ここでは詳細な説明を省略することがある。なお、ここで説明する周年培養においては、概ね、培養水の塩分濃度については２．５重量％以上であることを目安に、また、培養水の温度については２６℃以下であることを目安に管理を行った。また、周年培養では、各水槽の全体観察、各水槽中の培養水及びナンノクロロプシスについて、原則、一日に１回以上、観察及び管理を行った。
(Culture and growth of parent strain)
The above-mentioned parent strain was continuously cultured and grown (hereinafter sometimes referred to as anniversary culture) by so-called autotrophic growth using six culture tanks (hereinafter simply referred to as aquarium) installed outdoors. Each water tank (the 1st water tank-the 6th water tank) can store 20 tons (ton) of culture water (seawater).
In the anniversary culture, nutrients were fertilized at intervals of about once every one to two months.
The amount of fertilizer applied per nutrient (per ton of culture water) was appropriately determined while observing the growth of the parent strain (Nannochloropsis) during culture. Specifically, the fertilizer application amount to each water tank per fertilization was 50 g to 100 g / ton of ammonium sulfate, 20 g to 50 g / ton of urea, and 10 g to 30 g / ton of superphosphate lime.
In addition, “depletion treatment / bacteria treatment” was periodically performed on each water tank at an interval of once a week. In this treatment, chlorine was added so that the chlorine concentration in the water tank was 1.5 ppm (mg / L) (see Table 1).
Also, once about half of the culture water in each tank is pumped out at intervals of about once every 10 days to 2 weeks, seawater (culture water) so that the volume of culture water in the tank is 20 tons Added.
Note that the autotrophic growth method is a well-known method, and therefore detailed description may be omitted here. In the anniversary culture described here, the salinity concentration of the culture water is generally 2.5% by weight or more, and the temperature of the culture water is 26 ° C. or less. Managed. In the anniversary culture, the entire observation of each water tank, the culture water in each water tank, and Nannochloropsis were observed and managed as a rule at least once a day.
安定した周年培養状態（培養・増殖状態）において、吸い出し前の各水槽中の培養水に含まれる親株のナンノクロロプシスの細胞数を計測したところ、各水槽の培養水中のナンノクロロプシスの細胞数（個体数）は３．０×１０7〜３．５×１０7cell/mLの範囲であった。また、細胞の大きさ（平均）は、２．０〜３．０μｍであった。 In a stable year-round culture state (culture / growth state), the number of cells of Nannochloropsis of the parent strain contained in the culture water in each aquarium before sucking was measured. The number of Nannochloropsis cells in the culture water of each aquarium The (number of individuals) was in the range of 3.0 × 10 7 to 3.5 × 10 7 cells / mL. The cell size (average) was 2.0 to 3.0 μm.
周年培養において吸出しによって定期的に得られる、ナンノクロロプシスを含む培養水（以下、餌料液と称することがある）は、そのまま、仔魚やワムシの餌料又は餌料添加物として使用可能である（後述の実施例及び比較例参照）。
また、周年培養で定期的に得られる培養水中から濾過等によって分離されたナンノクロロプシスも餌料又は餌料添加物として使用可能であり、分離されたナンノクロロプシスを乾燥させた乾燥ナンノクロロプシスも餌料又は餌料添加物として使用可能であり、分離されたナンノクロロプシスの粉末や濃縮液も餌料及び餌料への添加物として使用可能である。
Culture water containing Nannochloropsis (hereinafter sometimes referred to as “feeding liquid”) that is periodically obtained by sucking in the anniversary culture can be used as it is as a feed or feed additive for larvae and rotifers (described later). See Examples and Comparative Examples).
In addition, Nannochloropsis separated from the culture water regularly obtained in the anniversary culture by filtration or the like can also be used as a feed or feed additive, and dried Nannochloropsis obtained by drying the separated Nannochloropsis can also be used as a feed. Alternatively, it can be used as a feed additive, and a separated Nannochloropsis powder or concentrate can also be used as a feed and an additive to the feed.
ナンノクロロプシスの濃縮液の製造方法としては、周知の種々の方法を用いることができる。例えば、培養水を濃縮してナンノクロロプシス濃縮液を得る濃縮工程を実施して製造することができる。
濃縮工程としては、濾過器や遠心分離機等を用いて適量の水分を分離し、適量の水分と混合された濃縮液を得る方法を用いることができる。なお、最初の濃縮工程の後、得られたナンノクロロプシスを洗浄する洗浄工程および濃縮工程のセットを１回以上行って濃縮液を得る濃縮工程であっても良い。また、濃縮工程の前及び／又は後など、適宜の時期に殺菌等の目的で加熱処理工程（殺菌処理工程）を実施することが好ましい。
Various known methods can be used as a method for producing a concentrated solution of Nannochloropsis. For example, it can be produced by carrying out a concentration step of concentrating culture water to obtain a Nannochloropsis concentrate.
As the concentration step, a method of separating an appropriate amount of water using a filter, a centrifuge, or the like and obtaining a concentrated liquid mixed with an appropriate amount of water can be used. In addition, after the first concentration step, a concentration step may be performed in which a set of washing step and concentration step for washing the obtained Nannochloropsis is performed one or more times to obtain a concentrated solution. Moreover, it is preferable to implement a heat treatment process (sterilization treatment process) for the purpose of sterilization at an appropriate time, such as before and / or after the concentration process.
粉末の製造方法としては、周知の種々の方法を用いることができるが、ここでは、培養水を濾過して得られるナンノクロロプシスをパウダー状にする工程（粉末工程）を実施する製造する方法を用いた。
パウダー状にする方法としては、霧状に噴霧するスプレードライヤ法を用いた。スプレードライヤ法とは、濾過後の液状（泥状）のナンノクロロプシスを噴霧して熱風（約１２０℃）で瞬間的に乾燥させる方法である。
なお、粉末工程の前に、濾過後のナンノクロロプシスを遠心分離機等を用いて脱水しても良い。そして、脱水・洗浄・脱水のように脱水工程（及び洗浄工程）を繰り返し行ってもよい。
粉末工程としては、スプレードライヤ法のほかに、例えば、濾過後のナンノクロロプシスをフリーズドライしたものを粉砕機で粉砕する方法など、周知の種々の用いることができる。
また、粉末工程の前に殺菌目的で加熱処理工程を実施した。殺菌等の目的で行う加熱処理工程（殺菌処理工程）については適宜の時期に実施することが好ましい。さらに、スプレードライヤ法の場合は、スプレー後、さらに粉砕工程を行っても良い。
Various known methods can be used as a method for producing the powder. Here, a method for producing a powder (a powder process) in which the nanonochloropsis obtained by filtering the culture water is powdered is used. Using.
As a powder method, a spray dryer method of spraying in a mist form was used. The spray dryer method is a method in which liquid (mud) Nannochloropsis after filtration is sprayed and dried instantaneously with hot air (about 120 ° C.).
In addition, you may spin-dry | dehydrate Nannochloropsis after filtration using a centrifuge etc. before a powder process. Then, the dehydration step (and the washing step) may be repeated as in the case of dehydration / washing / dehydration.
As the powder process, in addition to the spray dryer method, for example, various well-known methods such as a method of pulverizing a freeze-dried Nannochloropsis with a pulverizer can be used.
Moreover, the heat processing process was implemented for the disinfection purpose before the powder process. The heat treatment step (sterilization treatment step) performed for the purpose of sterilization or the like is preferably performed at an appropriate time. Further, in the case of the spray dryer method, a pulverization step may be further performed after spraying.
また、ナンノクロロプシス、ナンノクロロプシス濃縮液又はナンノクロロプシス粉末のうちの少なくともいずれか１つを餌料として投与してワムシを養殖し、得られたワムシを養殖用の餌料として用いた。なお、ワムシの培養方法は、ワムシの培養水槽に、これらの餌料を適宜の量投与するという、周知の方法である。 Moreover, at least one of Nannochloropsis, Nannochloropsis concentrate or Nannochloropsis powder was administered as a feed to cultivate rotifers, and the obtained rotifer was used as a culture feed. The rotifer culture method is a well-known method in which appropriate amounts of these feeds are administered to a rotifer culture tank.
なお、濃縮液の製造方法、粉末の製造方法及びワムシの培養方法は、いずれも周知の方法であるので、ここでは詳細な説明を省略した。 In addition, since the manufacturing method of a concentrate, the manufacturing method of a powder, and the rotifer culture | cultivation method are all well-known methods, detailed description was abbreviate | omitted here.
そして、周年培養で得られたナンノクロロプシス（餌料液、濃縮液、粉末等）を仔魚養殖の餌料又は添加物（仔魚の餌料であるワムシの餌料としての使用を含む）として使用し、養殖した仔魚が養殖業者において成魚に成長する過程を観察することを継続的に行い、仔魚から成魚への成長と養殖業者における給餌量との関係について、継続的に検討を行った。
その結果、仔魚の個体差に起因すると考えられる成長差のみならず、養殖業者に供給・提供した仔魚の供給時期（つまりは供給ロット）に起因する成長差について検討する必要があると考えられることを見出した。
そこで、この点に関する研究の一環として、餌料であるナンノクロロプシスについて、種々の検討・分析を行い、本発明に係るナンノクロロプシスを見出した。
Then, Nannochloropsis (food solution, concentrate, powder, etc.) obtained by the anniversary culture was used as a food or additive for larva culture (including use as a food for rotifer, a food for larvae) and cultured. We continued to observe the process of larvae growing into adult fish in the farmer, and continuously examined the relationship between the growth from larvae to adult fish and the amount of feed in the farmer.
As a result, it is considered necessary to examine not only the growth difference that is attributed to individual differences in larvae, but also the difference in growth that is attributed to the supply period (ie, supply lot) of larvae supplied / provided to aquaculture farmers. I found.
Therefore, as part of the research on this point, various studies and analyzes were performed on Nannochloropsis as a feed, and the Nannochloropsis according to the present invention was found.
実施例１〜実施例５（第１処理：第２水槽〜第６水槽）
親株の周年培養中の第１水槽〜第６水槽のうち、第２水槽〜第６水槽中に塩素を添加して、各水槽の塩素濃度を３０〜５０ｐｐｍ（本実施形態では５０ｐｐｍ。表１参照）という高濃度の状態にした（高濃度塩素処理）。
高濃度塩素処理から２４時間経過後、中和処理を行った。中和処理では、チオ硫酸ナトリウムを添加した。チオ硫酸ナトリウムの添加量は培養水１０トンに対して１００ｇの割合という目安であった。
中和処理後、培養水中のナンノクロロプシスを観察したところ、細胞数は２．０×１０7〜３．０×１０7cell/mLであった。
なお、高濃度塩素処理及び中和処理は、種々の条件で処理可能であるが、高濃度塩素処理における塩素濃度が３０〜５０ｐｐｍで、高濃度塩素処理継続時間（高濃度処理後、中和処理を行うまでの時間）が１２時間以上４８時間以下が好ましい。
塩素濃度が５０ｐｐｍを超え、しかも高濃度処理継続時間が４８時間を超える場合、ナンノクロロプシスが全て死滅してしまうおそれがあるからである。他方、３０ｐｐｍより低く、高濃度処理継続時間が１２時間より短時間の場合、十分な高濃度塩素処理が行われず、一部の珪藻類が生存したりするおそれがあるからである。
Example 1 to Example 5 (first treatment: second tank to sixth tank)
Among the first tank to the sixth tank during the anniversary culture of the parent strain, chlorine is added to the second tank to the sixth tank, and the chlorine concentration of each tank is 30 to 50 ppm (in this embodiment, 50 ppm. See Table 1). ) (High concentration chlorine treatment).
After 24 hours from the high concentration chlorine treatment, neutralization treatment was performed. In the neutralization treatment, sodium thiosulfate was added. The amount of sodium thiosulfate added was a standard of 100 g per 10 tons of culture water.
After the neutralization treatment, the number of cells was 2.0 × 10 7 to 3.0 × 10 7 cells / mL when nannochloropsis in the culture water was observed.
The high concentration chlorination treatment and neutralization treatment can be performed under various conditions, but the chlorine concentration in the high concentration chlorination is 30 to 50 ppm, and the high concentration chlorination treatment time (after the high concentration treatment, neutralization treatment). Is preferably 12 hours to 48 hours.
This is because if the chlorine concentration exceeds 50 ppm and the high-concentration treatment duration exceeds 48 hours, all the nonnochloropsis may be killed. On the other hand, if the concentration is lower than 30 ppm and the duration of the high concentration treatment is shorter than 12 hours, sufficient high concentration chlorine treatment is not performed, and some diatoms may survive.
第２水槽〜第６水槽において、中和処理後に生存していたナンノクロロプシスを、３か月間、上述の周年培養と同じ条件で培養・増殖を行った（高濃度塩素処理後の第１増殖工程）。
第１水槽については、この第１増殖工程の期間中、従来の周年培養を継続した（比較例１）。
したがって、この期間中の「減虫処理・雑菌処理」における塩素濃度は、全ての水槽において１．５ｐｐｍであった（表１参照）。
中和処理から３か月経過後のナンノクロロプシスの細胞数は３．０×１０7〜３．５×１０7 cell/mLであった。
In the second tank to the sixth tank, Nannochloropsis surviving after the neutralization treatment was cultured and grown for 3 months under the same conditions as the above-mentioned anniversary culture (the first growth after the high-concentration chlorine treatment). Process).
About the 1st water tank, the conventional anniversary culture was continued during the period of this 1st multiplication process (comparative example 1).
Therefore, the chlorine concentration in “insect reduction treatment / miscellaneous bacteria treatment” during this period was 1.5 ppm in all the water tanks (see Table 1).
The number of Nannochloropsis cells after 3 months from the neutralization treatment was 3.0 × 10 7 to 3.5 × 10 7 cells / mL.
（第２処理：第１水槽〜第６水槽）
第１増殖工程後、各水槽で行う「減虫処理・雑菌処理」における塩素の添加量を変更した（表１参照）。
第１水槽については、「減虫処理・雑菌処理」における塩素濃度を２．０ppmとした。また、第２水槽については３．０ｐｐｍ、第３水槽については４．０ｐｐｍ、第４水槽については５．０ｐｐｍ、第５水槽については１０．０ｐｐｍ、第６水槽については１５．０ｐｐｍとした（高濃度塩素処理後の第２増殖工程）。
これ以外の条件は、上述の第１増殖工程と同じであった。
塩素濃度を変更してから３日後、第２水槽〜第６水槽中のナンノクロロプシスの細胞数を計測したところ１．０×１０5〜３．０×１０5cell/mLであった。
なお、この第２増殖工程を各水水槽について６か月間行った。
(Second treatment: 1st tank to 6th tank)
After the first growth step, the amount of chlorine added in “insect reduction treatment / miscellaneous bacteria treatment” performed in each water tank was changed (see Table 1).
About the 1st water tank, the chlorine concentration in "insect reduction treatment / bacteria treatment" was 2.0 ppm. The second water tank was 3.0 ppm, the third water tank was 4.0 ppm, the fourth water tank was 5.0 ppm, the fifth water tank was 10.0 ppm, and the sixth water tank was 15.0 ppm (high Second growth step after concentration chlorine treatment).
The other conditions were the same as those in the first growth step described above.
Three days after the chlorine concentration was changed, the number of cells of Nannochloropsis in the second tank to the sixth tank was measured and found to be 1.0 × 10 5 to 3.0 × 10 5 cells / mL.
In addition, this 2nd multiplication process was performed for each water tank for 6 months.
（第１水槽）
６か月間の第２増殖工程後、第１水槽中のナンノクロロプシスを顕微鏡観察したところ、細胞数の密度、大きさ、細胞の色などの状態について特段の変化は見られなかった。その後、第１水槽での「減虫処理・雑菌処理」における塩素濃度を１．５ｐｐｍに変更し（元に戻し）て、周年培養を継続した（表１参照）。
(First tank)
After 6 months of the second growth step, the nannochloropsis in the first tank was observed under a microscope, and no particular change was observed in the state of cell density, size, cell color, and the like. Thereafter, the chlorine concentration in the “insecticide treatment / miscellaneous bacteria treatment” in the first tank was changed to 1.5 ppm (returned to the original), and the year-round culture was continued (see Table 1).
（第２水槽〜第６水槽）
６か月間の第２増殖工程後、第２水槽〜第６水槽中のナンノクロロプシスを顕微鏡観察したところ、細胞の色などの状態について、特段の変化は見られなかったが、細胞数は減少していた。第２水槽〜第６水槽中のナンノクロロプシスの細胞数は、８．０×１０6〜１．５×１０7 cell/mLであった（表２参照）。
(2nd-6th tank)
Microscopic observation of Nannochloropsis in the 2nd to 6th tanks after the second growth process for 6 months showed no particular change in the state of cell color, but the number of cells decreased. Was. The number of cells of Nannochloropsis in the second tank to the sixth tank was 8.0 × 10 6 to 1.5 × 10 7 cells / mL (see Table 2).
（第２処理の継続：第２水槽〜第６水槽）
第２水槽〜第６水槽について、上述した６か月間の第２増殖工程（前期第２増殖工程）を、さらに６か月間（後期第２増殖工程）、継続した。
このような第２増殖工程を合計１２か月間行い、第２〜第６水槽中のナンノクロロプシスについて顕微鏡観察したところ、細胞の色などの状態について特段の変化は見られなかったが、細胞数の密度は１．５×１０7〜２．５×１０7 cell/mLであった（表２参照）。また、大きさ（平均）は、３〜５μｍ程度であった（表２参照）。
(Continuation of the second treatment: second tank to sixth tank)
About the 2nd water tank-the 6th water tank, the 2nd growth process (early 2nd growth process) for 6 months mentioned above was continued for another 6 months (late 2nd growth process).
Such a second growth step was performed for a total of 12 months, and when nannochloropsis in the second to sixth aquariums was observed with a microscope, no particular change was observed in the state of cell color or the like. The density was 1.5 × 10 7 to 2.5 × 10 7 cells / mL (see Table 2). The size (average) was about 3 to 5 μm (see Table 2).
（第３処理：第２水槽）
１２か月間の第２増殖工程後、第２水槽からの吸い出しによって半分の量分取した培養水（約１０トン）に海水を追加し、第２水槽と同じ条件の水槽（以下、試験用第２水槽）を用意し、水槽中のナンノクロロプシス増殖・培養を行った。
(Third treatment: second tank)
After the second growth step for 12 months, seawater was added to the culture water (about 10 tons) separated by half by suction from the second tank, and the same condition as the second tank (hereinafter referred to as the test tank) 2 tanks) were prepared, and Nannochloropsis proliferation and culture in the tank were performed.
この試験用第２水槽については、「減虫処理・雑菌処理」における塩素の添加量を、それまでの濃度から変更した。
具体的には、試験用第２水槽において一週間に一回程度の間隔で行っている「減虫・雑菌処理」における塩素濃度を、「減虫・雑菌処理」を行うごとに１ｐｐｍずつ高め、最終的には１５ｐｐｍまで高めた（表１参照）。これ以外の培養・増殖中の条件は、上述の周年培養と同じであった。
「減虫・雑菌処理」の塩素濃度が１５ｐｐｍになると、その後は１５ｐｐｍを１週間維持した。１週間後、試験用第２水槽中のナンノクロロプシスについて顕微鏡観察を行ったところ、細胞数の密度、大きさ、細胞の色などの状態について、第３処理前と比較して特段の変化は見られなかった（表２参照）。
For the second water tank for testing, the amount of chlorine added in the “insect-repellent treatment / miscellaneous bacteria treatment” was changed from the previous concentration.
Specifically, the chlorine concentration in the “detoxification / bacteria treatment” performed at intervals of about once a week in the second water tank for testing is increased by 1 ppm each time “insect reduction / bacteria treatment” is performed, Finally, it was increased to 15 ppm (see Table 1). The other conditions during culture / growth were the same as the above-mentioned anniversary culture.
When the chlorine concentration in the “insect / miscellaneous bacteria treatment” reached 15 ppm, 15 ppm was maintained for one week thereafter. One week later, when the nannochloropsis in the second water tank for examination was observed with a microscope, the density, size, cell color, etc. of the number of cells were not significantly different from those before the third treatment. It was not seen (see Table 2).
（第３処理：第１水槽）
第２水槽と同様、第１水槽から半分の量分取した培養水（約１０トン）に海水を追加し、第１水槽と同じ条件の水槽（以下、試験用第１水槽）を用意し、水槽中のナンノクロロプシス増殖・培養を行った。
そして、「減虫処理・雑菌処理」における塩素の添加量を変更する実験を行った。
具体的には、一週間に一回程度の間隔で行っている「減虫・雑菌処理」における塩素濃度を、１．５ｐｐｍから３．０ｐｐｍに高め、その後は、試験用第２水槽と同様に１ｐｐｍずつ高め、最終的には１５ｐｐｍまで高めた（表１参照）。これ以外の培養・増殖中の条件は、上述の周年培養と同じであった。
その結果、１．５ｐｐｍから３．０ｐｐｍに高めた最初の「減虫処理・雑菌処理」後から細胞数の減少及び枯れが発生し、濃度を高めるに連れて細胞数の減少及び枯れが進んだ（表２参照）。
(Third treatment: first tank)
As with the second tank, seawater is added to the culture water (about 10 tons) collected in half from the first tank, and a tank with the same conditions as the first tank (hereinafter, the first tank for testing) is prepared. Nannochloropsis was grown and cultured in a water tank.
And the experiment which changes the addition amount of chlorine in "the insecticidal treatment / bacteria treatment" was conducted.
Specifically, the chlorine concentration in the “decreased / miscellaneous bacteria treatment” performed at intervals of about once a week is increased from 1.5 ppm to 3.0 ppm, and thereafter, as in the second water tank for testing. The level was increased by 1 ppm and finally increased to 15 ppm (see Table 1). The other conditions during culture / growth were the same as the above-mentioned anniversary culture.
As a result, the cell number decreased and withered after the first “anti-insect treatment / miscellaneous treatment” increased from 1.5 ppm to 3.0 ppm, and the cell number decreased and withered as the concentration increased. (See Table 2).
（第３処理：第３水槽〜第６水槽）
１２か月間の第２増殖工程を行った第３水槽〜第５水槽についても、第２水槽と同様、試験用水槽を用意して第３処理を行った。
つまり、用意した試験用第３水槽〜試験用第５水槽での「減虫処理・雑菌処理」における塩素の添加量を変更した（表１参照）。
具体的に説明すると、試験用第３水槽については、４．０ｐｐｍであった濃度を１．０ｐｐｍずつ上げていき、試験用第４水槽については５．０ｐｐｍであった濃度を１．０ｐｐｍに上げていき、試験用第５水槽については１０ｐｐｍであった濃度を１．０ｐｐｍに上げていき、いずれの試験用水槽についても最終的には１５ｐｐｍｍまで濃度を高めた。
いずれの試験用水槽においても、「減虫・雑菌処理」の塩素濃度が１５ｐｐｍになると、その後は１５ｐｐｍを１週間維持し、１週間後、各試験用水槽中のナンノクロロプシスについて顕微鏡観察を行った。なお、第６水槽については、試験用水槽を用意しなかったので、第６水槽中のナンノクロロプシスについて行った顕微鏡観察結果である。
試験用第３水槽〜試験用第５水槽及び第６水槽のいずれの水槽中のナンノクロロプシスとも、細胞の色などの状態について特段の変化は見られなかった（表２参照）。
(Third treatment: third tank to sixth tank)
About the 3rd tank-the 5th tank which performed the 2nd breeding process for 12 months, the water tank for a test was prepared like the 2nd tank, and the 3rd processing was performed.
That is, the added amount of chlorine in the “insect reduction treatment / bacteria treatment” in the prepared third water tank for test to fifth water tank for test was changed (see Table 1).
Specifically, for the third water tank for testing, the concentration that was 4.0 ppm was increased by 1.0 ppm, and for the fourth water tank for testing, the concentration that was 5.0 ppm was increased to 1.0 ppm. Then, the concentration which was 10 ppm for the fifth water tank for testing was increased to 1.0 ppm, and for all the water tanks for testing, the concentration was finally increased to 15 ppmm.
In any test water tank, when the chlorine concentration of the “insecticide / miscellaneous bacteria treatment” reaches 15 ppm, then 15 ppm is maintained for 1 week, and after 1 week, the nannochloropsis in each test water tank is observed with a microscope. It was. In addition, about the 6th water tank, since the test water tank was not prepared, it is the microscope observation result performed about Nannochloropsis in a 6th water tank.
No particular change was observed in the state of cell color and the like in any of the Nannochloropsis in any of the third water tank for testing to the fifth water tank for testing and the sixth water tank (see Table 2).
この結果、第２〜第６水槽中のナンノクロロプシス（新株）は、耐塩素性に優れており、しかも１５ｐｐｍという高塩素濃度中の培養水中で培養・増殖することが解った（表２参照）。
また、第３水槽中には一部の珪藻類の繁茂が認められたが、第４水槽〜第６水槽においては、そのような繁茂が認められなかった。ナンノクロロプシスの培養水槽中に繁茂した一部の珪藻類（例えば、キートセロス）は、ナンノクロロプシスの培養・増殖に対して悪影響をおよぼすおそれがあるが、このような珪藻類の繁茂がなければ、悪影響が生じるおそれがなく好ましい。したがって、塩素濃度が５．０ｐｐｍ以上で増殖可能な新株のナンノクロロプシスがより好ましい。
そして、一部の珪藻類の生育をより確実に防止することができるという観点からすれば、塩素濃度が１０ｐｐｍ以上で増殖可能な新株のナンノクロロプシスがより好ましく、一部の珪藻類の生育をさらに確実に防止することができるという観点からすれば、塩素濃度が１５ｐｐｍ以上で増殖可能な新株のナンノクロロプシスがさらに好ましい。
上述したように、第１処理の後には、高濃度処理後の第１増殖工程（３か月）を行うことが好ましい。また、第１増殖工程後、第２処理（第２増殖工程、６か月）を行うことが好ましい。
As a result, it was found that Nannochloropsis (new strain) in the second to sixth aquariums was excellent in chlorine resistance and was cultured and proliferated in culture water having a high chlorine concentration of 15 ppm (see Table 2). ).
Moreover, although the overgrowth of some diatoms was recognized in the 3rd water tank, such overgrowth was not recognized in the 4th water tank-the 6th water tank. Some diatoms (e.g., Keatoceros) that have grown in Nannochloropsis culture tanks may adversely affect the culture and growth of Nannochloropsis. , Which is preferable since there is no risk of adverse effects. Therefore, a new strain, Nannochloropsis, which can grow at a chlorine concentration of 5.0 ppm or more is more preferable.
From the viewpoint of more reliably preventing the growth of some diatoms, a new strain of Nannochloropsis that can grow at a chlorine concentration of 10 ppm or more is more preferable, and the growth of some diatoms is more preferable. From the viewpoint that it can be surely prevented, a new strain of Nannochloropsis capable of growing at a chlorine concentration of 15 ppm or more is more preferable.
As described above, it is preferable to perform the first growth step (three months) after the high concentration treatment after the first treatment. Moreover, it is preferable to perform a 2nd process (2nd proliferation process, 6 months) after a 1st proliferation process.
従来のナンノクロロプシスの培養・増殖においては、「減虫処理・雑菌処理」における塩素濃度の管理を誤ってしまうと、ナンノクロロプシスが激減し、あるいは死滅してしまうおそれがある。
ポンプ等による定期的な吸い出し等で取得した培養水は、通常、ナンノクロロプシスを豊富に含むことから、仔魚やワムシの餌料として使用可能であると共に餌料の原料として出荷可能であるところ、ナンノクロロプシスが激減し、あるいは死滅していれば、餌料として使用できず、餌料原料として出荷できない。
この点、本実施形態の新株のナンノクロロプシスであれば、高塩素濃度中での培養・増殖が可能であるので、「減虫処理・雑菌処理」における塩素濃度管理が極めて容易であり、当該処理を容易且つ確実に行うことができ、ナンノクロロプシスの安定培養を容易且つ確実に行うことができる。つまり、新株のナンノクロロプシスは、安定培養に好適であり、培養容易性に優れている。
In conventional culture and growth of Nannochloropsis, if the management of the chlorine concentration in the “insect-repellent treatment / miscellaneous treatment” is mistaken, Nannochloropsis may be drastically reduced or killed.
Culture water obtained by regular pumping out, etc. usually contains abundant Nannochloropsis, so it can be used as feed for larvae and rotifers and can also be shipped as feed material. If Psis is drastically reduced or dead, it cannot be used as feed and cannot be shipped as feed material.
In this respect, the new strain Nannochloropsis of this embodiment can be cultured and proliferated in a high chlorine concentration, so that the chlorine concentration control in the “anti-insecticide treatment / miscellaneous bacteria treatment” is extremely easy. The treatment can be carried out easily and reliably, and stable culture of Nannochloropsis can be carried out easily and reliably. That is, the new strain Nannochloropsis is suitable for stable culture and is excellent in culture ease.
（新株のナンノクロロプシスの性質試験）
１２か月間の第２増殖工程を行った第２水槽〜第６水槽について、第２増殖工程と同様の条件でさらに約２年間、培養・増殖（周年培養）を行った（第２増殖工程の継続）。また、第１水槽についても、条件を変更することなく、継続して周年培養を行った。
そして、第１水槽〜第６水槽におけるこの期間の周年培養中に、各水槽中のナンノクロロプシスについて、次のような塩分濃度試験及び培養水温度試験を行った。
(Property test of new strain Nannochloropsis)
About the 2nd tank-the 6th tank which performed the 2nd breeding process for 12 months, culture and proliferation (annual culture) were performed for about 2 years on the same conditions as the 2nd breeding process (in the 2nd breeding process) Continue). In addition, the first water tank was continuously cultured for the anniversary without changing the conditions.
And during the anniversary culture of this period in the first to sixth tanks, the following salinity concentration test and culture water temperature test were performed on Nannochloropsis in each tank.
実施例６〜実施例１０（塩分濃度試験・表３参照）
屋外設置された各水槽は風雨に晒されており、降水があると各水槽中の培養水の塩分濃度は低下する。特に６月の梅雨の時期には培養水の塩分濃度が低下しやすい。試験期間中、各水槽の塩分濃度を一日一回以上確認していたところ、塩分濃度が１．５重量％以下になることがあった。
本試験では、塩分濃度の低下が確認された場合であっても、急激に塩分濃度を上昇させる対応は採らなかった。
つまり、本試験期間中の周年培養では、１０日〜２週間に一度程度の間隔で、各水槽中の培養水の半分の量をポンプで吸い出し、その後、水槽内の培養水の量が２０トンになるように海水（培養水）を追加することによる塩分濃度の上昇だけで、徐々に塩分濃度を高める対応とした。
Examples 6 to 10 (salt concentration test, see Table 3)
Each tank installed outdoors is exposed to wind and rain, and if there is rain, the salinity of the culture water in each tank decreases. Particularly during the rainy season in June, the salinity of the culture water tends to decrease. During the test period, the salinity of each water tank was confirmed at least once a day, and the salinity might be 1.5% by weight or less.
In this test, even if a decrease in salinity was confirmed, no measures were taken to increase the salinity abruptly.
That is, in the anniversary culture during this test period, half of the culture water in each tank is pumped out at intervals of about once every 10 days to 2 weeks, and then the volume of culture water in the tank is 20 tons. In order to gradually increase the salinity concentration, only the increase in the salinity concentration by adding seawater (culture water).
（塩分濃度試験結果：第２水槽〜第６水槽）
ポンプによる吸出し作業前の各水槽中のナンノクロロプシスについて顕微鏡観察を行ったところ、第２水槽〜第６水槽のいずれの水槽についても、細胞数の密度、大きさ、細胞の色などの状態について、降水前から降水による塩分濃度の低下を経て元の塩分濃度に戻るまで、特段の変化は見られなかった。
（塩分濃試験結果：第１水槽、比較例２）
塩分濃度の低下に伴い、一時的に細胞数の減少が見られたが、塩分濃度が上昇して２．５重量％以上に戻る過程で、元の細胞数に戻った。
(Salt concentration test result: second to sixth tanks)
Microscopic observation of Nannochloropsis in each water tank before the pumping work was carried out, and the state of cell number density, size, cell color, etc. in any of the 2nd to 6th water tanks There was no particular change from before the precipitation until it returned to the original salinity after decreasing the salinity due to precipitation.
(Salt concentration test result: first water tank, comparative example 2)
As the salt concentration decreased, the number of cells temporarily decreased. However, in the process of increasing the salt concentration and returning to 2.5% by weight or more, the cell number returned to the original number.
この結果、第１水槽で培養・増殖している親株のナンノクロロプシスについては、塩分濃度が低下した梅雨の時期に一時的にナンノクロロプシスの細胞数が減少し、餌料として適さない状態（餌料原料としての出荷に適さない状態）になった。
他方、第２水槽〜第６水槽で培養・増殖している新株のナンノクロロプシスについては、細胞数の減少は見られず、常に餌料として適した状態であった。
つまり、新株のナンノクロロプシスは、塩分濃度の低下といった環境の変化が生じても、細胞数が減少することがなく安定培養可能であり、培養・増殖が容易であることが解った。
餌料の安定供給は、魚の養殖において極めて重要であるところ、安定培養が可能な本実施形態の新株のナンノクロロプシスは、魚の餌料として好適であるということができる。
As a result, for the parent strain Nannochloropsis cultured and proliferated in the 1st tank, the number of Nannochloropsis cells temporarily decreased during the rainy season when the salinity level decreased, and it was not suitable as food (food) It was not suitable for shipment as a raw material).
On the other hand, the new strain Nannochloropsis cultured and proliferating in the second tank to the sixth tank did not show a decrease in the number of cells, and was always suitable as a feed.
In other words, it was found that the new strain, Nannochloropsis, can be stably cultured without a decrease in the number of cells even when environmental changes such as a decrease in salinity occur, and culture and proliferation are easy.
Since stable feed supply is extremely important in fish culture, it can be said that the new strain Nannochloropsis of this embodiment capable of stable culture is suitable as fish feed.
（培養水温度試験・表４参照）
屋外に設置された各水槽中の培養水温度は、外気の影響を受けて変化する。特に夏季は、培養水温度が高温になりやすい。試験期間中、各水槽の培養水温度を一日一回以上確認していたところ、８月中旬から９月上旬にかけて、約２週間程度連続して最低水温が３０度以上の状態であったことがあった。つまり、この試験期間中は、培養水温度の上昇が確認された場合であっても、急激に冷却するような対応は採らなかった。
(Culture water temperature test, see Table 4)
The culture water temperature in each tank installed outdoors changes under the influence of outside air. Especially in the summer, the culture water temperature tends to be high. During the test period, the temperature of the culture water in each tank was confirmed at least once a day, and the minimum water temperature was 30 degrees or more continuously for about 2 weeks from mid-August to early September. was there. In other words, during this test period, even if an increase in the temperature of the culture water was confirmed, no measures were taken for rapid cooling.
実施例１１〜実施例１５（培養水温度試験結果：第２水槽〜第６水槽）
各水槽中のナンノクロロプシスについて、日々の顕微鏡観察を行ったところ、いずれの水槽についても、細胞数の密度、大きさ、細胞の色などの状態について、高温になる前（例えば２５℃）から高温の状態を経て元の温度に戻るまで、特段の変化は見られなかった。
（培養水温度試験結果：第１水槽、比較例３）
７月中旬以降になって、水温が２６℃を超えると、水槽全体の目視観察で緑色から茶色への変色が観察された。そして、水温が２８℃を越えると、細胞数が１．０×１０7cell/mL以下になったので施肥を中断した。９月下旬〜１０月上旬にかけて水温が下がり２６℃以下になった頃、施肥を再開したところ、細胞数が徐々に増えて元に戻った。
Example 11-Example 15 (culture water temperature test result: 2nd water tank-6th water tank)
When nannochloropsis in each water tank was observed with a microscope every day, the state of cell number density, size, cell color, etc. of any water tank was not changed from a high temperature (for example, 25 ° C.). No particular change was observed until the temperature returned to the original temperature through a high temperature state.
(Culture water temperature test result: first water tank, comparative example 3)
After mid-July, when the water temperature exceeded 26 ° C., a color change from green to brown was observed by visual observation of the entire aquarium. And when water temperature exceeded 28 degreeC, since the cell number fell below 1.0 * 10 < 7 > cell / mL, fertilization was interrupted. When the water temperature decreased to 26 ° C. or less from late September to early October, when fertilization was resumed, the number of cells gradually increased and returned to the original.
この結果、第１水槽で培養・増殖している親株のナンノクロロプシスについては、水温が３０℃を超える夏季、茶色に変色して枯れた状態になり、餌料として適さない状態（餌料原料としての出荷に適さない状態）になった。
他方、第２水槽〜第６水槽で培養・増殖している新株のナンノクロロプシスについては、水温が３０℃を超えても、細胞数の減少は見られず、常に餌料として適した状態であった。
つまり、新株のナンノクロロプシスは、培養水の温度上昇といった環境の変化が生じても、細胞数が減少することがなく安定的に培養可能であり、培養容易であることが解った。餌料の安定供給は、魚の養殖において極めて重要であるところ、安定培養が可能な本実施形態の新株のナンノクロロプシスは、魚の餌料として好適であるということができる。
As a result, the parent strain Nannochloropsis cultured and proliferated in the first aquarium turns brown and withered in the summer when the water temperature exceeds 30 ° C, and is not suitable as a feed (as a feed ingredient) It was not suitable for shipment.
On the other hand, the new strain Nannochloropsis cultured and grown in the 2nd to 6th tanks did not show a decrease in the number of cells even when the water temperature exceeded 30 ° C, and was always in a suitable state as a food. It was.
That is, it was found that the new strain Nannochloropsis can be cultured stably without any decrease in the number of cells even when environmental changes such as an increase in the temperature of the culture water occur, and is easy to culture. Since stable feed supply is extremely important in fish culture, it can be said that the new strain Nannochloropsis of this embodiment capable of stable culture is suitable as fish feed.
（金魚の養殖試験）
屋内に設置された養殖水槽を２つ用意し、新株のナンノクロロプシスを餌料として用いて、金魚の稚魚の養殖試験を行った。
一方の水槽で後述の実施例１６を行い、他方の水槽では後述の比較例４を行った。
各水槽は、いずれも、３０Ｌの養殖水（淡水）を貯水可能なものであった。
隣接設置された２つの水槽を用いるなどすることで、養殖試験中の両水槽中の養殖水の水温等の環境条件を一致させた。例えば、養殖試験中の両水槽中の養殖水の温度は、いずれも、１６℃〜２２℃の範囲であった。
なお、養殖方法については周知の方法を用いたので、ここでは、給餌条件についてのみ説明し、その他の条件についての詳細な説明を省略した。
(Goldfish culture test)
Two aquaculture tanks installed indoors were prepared, and a new fish, Nannochloropsis, was used as a feed, and a goldfish fry culture test was conducted.
Example 16 to be described later was performed in one water tank, and Comparative Example 4 to be described later was performed in the other water tank.
Each tank was capable of storing 30 L of aquaculture water (fresh water).
By using two water tanks installed adjacent to each other, environmental conditions such as the temperature of the aquaculture water in both tanks during the aquaculture test were matched. For example, the temperature of the aquaculture water in both water tanks during the aquaculture test was in the range of 16 ° C to 22 ° C.
In addition, since the well-known method was used about the aquaculture method, only the feeding conditions were demonstrated here and the detailed description about the other conditions was abbreviate | omitted.
（実施例１６：金魚の稚魚の養殖・表５参照)
同程度の体格の金魚を５匹用意した。養殖試験開始時の５匹の金魚の総体重は、１０３．７ｇであった。この５匹の金魚を１５日間養殖した。
（給餌条件）
各水槽に対して一日１回、午前８時頃に１．２ｇの餌料を投与して養殖した。投与した餌料は、市販の餌料（ミニペット（キョーリン社製））であった。
給餌量は、日間給餌量の最低水準量の給餌率である体重比の約１％の分量を目安として定めた量である。なお、給餌量の定め方は、以下同様である。
(Example 16: Goldfish fry culture-see Table 5)
Five goldfish of the same physique were prepared. The total body weight of the five goldfishes at the start of the aquaculture test was 103.7 g. The five goldfish were cultured for 15 days.
(Feeding conditions)
Each aquarium was cultured once a day by administering 1.2 g of food at around 8 am. The administered food was a commercially available food (Minipet (manufactured by Kyorin)).
The amount of feeding is an amount determined by using an amount of about 1% of the weight ratio, which is the feeding rate of the lowest level of daily feeding, as a guide. The method for determining the amount of feeding is the same below.
（比較例４：金魚の養殖）
同程度の体格の金魚を５匹用意した。養殖試験開始時の５匹の金魚の総体重は、１０６．０ｇであった。この５匹の金魚を１５日間養殖した。
（給餌条件）
実施例１６と同じ餌を用い、その他の条件についても実施例１６と同じとした。
(Comparative Example 4: Goldfish farming)
Five goldfish of the same physique were prepared. The total body weight of the five goldfishes at the start of the aquaculture test was 106.0 g. The five goldfish were cultured for 15 days.
(Feeding conditions)
The same bait as in Example 16 was used, and other conditions were the same as in Example 16.
（酸素消費量の測定）
実施例１６及び比較例４では、１５日の養殖期間のうち最後の６日間について、毎日、金魚の酸素消費量（mg/L/7h）を測定した。その後、６日間の酸素消費量の平均値を算出した（表５参照）。
酸素消費量の測定方法は、次のような方法であった。午前８時に給餌した後、まず、飼育水槽中内の酸素濃度を測定して暗幕で被って通気を止める。その後、午後３時に再び飼育水槽中内の酸素濃度を測定する。そして、これらの数値の差を算出することで酸素消費量を得た。例えば、最初の酸素濃度の測定値が8.90mg/Lで、２回目の測定値が3.40mg/Lであれば、酸素消費量は8.90-3.40=5.50mg/L/7hである。酸素濃度の測定では、ハンディDOメーター（飯島電子工業社製）を用いた。
なお、後述の酸素消費量の測定でも同じ方法を用いた。
表５に示されるように、実施例１６の金魚と比較例４の金魚の酸素消費量を比較すると、実施例１６の金魚の消費量は比較例４の金魚よりも０．５mg/L/7h）多かった。また、実施例１６の金魚の消費量は比較例４の金魚の１．１倍であった。実施例１６及び比較例４のデータから、実施例１７及び比較例５で用いられる金魚の個体差に関する情報が得られた。
(Measurement of oxygen consumption)
In Example 16 and Comparative Example 4, the goldfish oxygen consumption (mg / L / 7h) was measured daily for the last 6 days of the 15-day culture period. Thereafter, the average value of oxygen consumption for 6 days was calculated (see Table 5).
The method for measuring the oxygen consumption was as follows. After feeding at 8 am, first measure the oxygen concentration in the breeding aquarium and cover it with a black curtain to stop ventilation. Thereafter, the oxygen concentration in the breeding aquarium is measured again at 3 pm. And the oxygen consumption was obtained by calculating the difference between these numerical values. For example, if the measured value of the first oxygen concentration is 8.90 mg / L and the second measured value is 3.40 mg / L, the oxygen consumption is 8.90-3.40 = 5.50 mg / L / 7h. In measuring the oxygen concentration, a handy DO meter (manufactured by Iijima Electronics Co., Ltd.) was used.
The same method was used for the measurement of oxygen consumption described later.
As shown in Table 5, when the oxygen consumption of the goldfish of Example 16 and the goldfish of Comparative Example 4 are compared, the consumption of the goldfish of Example 16 is 0.5 mg / L / 7h than the goldfish of Comparative Example 4. A lot. Moreover, the consumption of the goldfish of Example 16 was 1.1 times that of the goldfish of Comparative Example 4. Information on individual differences of goldfish used in Example 17 and Comparative Example 5 was obtained from the data of Example 16 and Comparative Example 4.
（実施例１７：金魚の養殖・表６参照)
実施例１６で得られた５匹の金魚を継続して養殖した。実施例１６にて１５日間養殖した後、本実施例で１５日間養殖し、合計の養殖期間は３０日間であった。
本実施例では、投与する餌料を変更した。それ以外の条件は実施例１６と同じであった。
本実施例で投与した餌料は、実施例１６で用いた市販の餌料と、第３水槽で培養された新株のナンノクロロプシスの粉末とを混合した餌料であった。新株のナンノクロロプシスの混合率は１０重量％であった。なお、これ以後の実施例や比較例でも、同様にナンノクロロプシス粉末を用いた。
(Example 17: Goldfish farming, see Table 6)
The five goldfish obtained in Example 16 were continuously cultured. After being cultured for 15 days in Example 16, it was cultured for 15 days in this example, and the total culture period was 30 days.
In this example, the feed to be administered was changed. The other conditions were the same as in Example 16.
The feed administered in this example was a mix of the commercially available feed used in Example 16 and a new strain of Nannochloropsis powder cultured in the third water tank. The mixing ratio of the new strain Nannochloropsis was 10% by weight. In the following examples and comparative examples, Nannochloropsis powder was similarly used.
（比較例５：金魚の養殖）
比較例４で得られた５匹の金魚を継続して養殖した。比較例４にて１５日間養殖した後、本比較例で１５日間養殖し、合計の養殖期間は３０日間であった。
養殖条件は比較例４と同じであった。つまり、投与した餌料は比較例４と同じであった。
(Comparative Example 5: Goldfish farming)
Five goldfish obtained in Comparative Example 4 were continuously cultured. After being cultured for 15 days in Comparative Example 4, it was cultured for 15 days in this Comparative Example, and the total culture period was 30 days.
The culture conditions were the same as in Comparative Example 4. That is, the administered food was the same as in Comparative Example 4.
（酸素消費量の測定）
実施例１７及び比較例５では、１５日の養殖期間のうち最後の６日間について、毎日、金魚の酸素消費量（mg/L/7h）を測定した。その後、６日間の平均値を算出した（表６参照）。
表６に示されるように、実施例１７の金魚と比較例５の金魚の酸素消費量を比較すると、実施例１７の金魚の消費量は、比較例５の金魚よりも１．１５mg/L/7h多いということができる。従って、実施例１６及び比較例４の結果では、０．５mg/L/7hの差であったので、実施例１７の金魚は、比較例５の金魚よりも酸素消費量が増大したと判断できることが解った。また実施例１７の金魚は、比較例５の金魚と比較して酸素消費量が約１．２６倍であった。実施例１６及び比較例４の結果では、１．１倍であったので、実施例１７の金魚は、比較例５の金魚よりも酸素消費量が増大したということができることが解った。
この結果、本実施形態の新株のナンノクロロプシスを餌料として用いて養殖すると、酸素消費量が増加することが解った。つまり、代謝活性化に優れた餌料であることが解った。
(Measurement of oxygen consumption)
In Example 17 and Comparative Example 5, the oxygen consumption (mg / L / 7h) of goldfish was measured every day for the last 6 days of the 15-day culture period. Thereafter, an average value for 6 days was calculated (see Table 6).
As shown in Table 6, when the oxygen consumption of the goldfish of Example 17 and the goldfish of Comparative Example 5 were compared, the consumption of the goldfish of Example 17 was 1.15 mg / L / well than the goldfish of Comparative Example 5. It can be said that there are many 7h. Therefore, since the difference between Example 16 and Comparative Example 4 was 0.5 mg / L / 7h, it can be determined that the oxygen consumption of the goldfish of Example 17 was higher than that of the goldfish of Comparative Example 5. I understand. The goldfish of Example 17 had an oxygen consumption of about 1.26 times that of the goldfish of Comparative Example 5. Since the results of Example 16 and Comparative Example 4 were 1.1 times, it was found that the goldfish of Example 17 can be said to have increased oxygen consumption compared to the goldfish of Comparative Example 5.
As a result, it was found that when the new strain Nannochloropsis of the present embodiment was used as a feed, the oxygen consumption increased. That is, it turned out that it is a feed excellent in metabolic activation.
（実施例１８：金魚の養殖・表７参照)
実施例１７で得られた５匹の金魚をさらに継続して養殖した。実施例１６の養殖開始からの養殖期間は、合計で２か月であった。
本実施例では、実施例１７で用いた餌料と同じ餌料を用いた。
(Example 18: Goldfish farming, see Table 7)
The five goldfish obtained in Example 17 were further cultured. The total cultivation period from the start of cultivation in Example 16 was 2 months.
In this example, the same feed as that used in Example 17 was used.
（比較例６：金魚の養殖）
比較例５で得られた５匹の金魚をさらに継続して養殖した。比較例４の養殖開始からの養殖期間は、合計で２か月であった。
養殖条件は比較例４及び比較例５と同じであった。つまり、投与した餌料は比較例４及び比較例５と同じであった。
(Comparative Example 6: Goldfish farming)
The five goldfishes obtained in Comparative Example 5 were further cultured continuously. The total cultivation period from the start of cultivation in Comparative Example 4 was 2 months.
The culture conditions were the same as those in Comparative Example 4 and Comparative Example 5. That is, the administered feed was the same as in Comparative Example 4 and Comparative Example 5.
表７に示されるように、実施例１８の金魚は、比較例６の金魚よりも体重増加量が大きく、また体重増加率も高かった。
従って、実施例１６で養殖された金魚は、比較例４で養殖された金魚と比較して成長が早いことが解った。
As shown in Table 7, the goldfish of Example 18 had a larger weight gain and a higher weight gain than the goldfish of Comparative Example 6.
Therefore, it was found that the goldfish cultured in Example 16 grew faster than the goldfish cultured in Comparative Example 4.
（実施例１９：金魚の養殖・表８参照)
実施例１８で得られた５匹の金魚をさらに継続して養殖した。
本実施例では、各実施例で用いた市販の配合飼料のみを投与した。ナンノクロロプシスについては配合しなかった。１回の給餌で与える餌料は、２．５ｇであった。 給餌条件以外の条件は、実施例１６と同じであった。なお、実施例１８の終了からの養殖期間は４か月で最後の２０日間で行った。
(Example 19: Goldfish culture-see Table 8)
The five goldfish obtained in Example 18 were further cultured continuously.
In this example, only the commercially available blended feed used in each example was administered. Nannochloropsis was not blended. The feed given by one feeding was 2.5g. Conditions other than the feeding conditions were the same as in Example 16. In addition, the culture period from the end of Example 18 was 4 months and the last 20 days.
（比較例７：金魚の養殖）
比較例６で得られた５匹の金魚をさらに継続して養殖した。
本比較例では、比較例６と同じ餌料を投与した。また、１回の給餌で与える餌料は、４．０ｇであった。それ以外の条件は、比較例４〜６と同じであった。
(Comparative Example 7: Goldfish farming)
The five goldfishes obtained in Comparative Example 6 were further cultured continuously.
In this comparative example, the same feed as in comparative example 6 was administered. Moreover, the feed given with one feeding was 4.0g. The other conditions were the same as those in Comparative Examples 4-6.
表８に示されるように、実施例１９の給餌量は、比較例７と比べて少ないが、体重増加量は同じであり、体重増加率は比較例７よりも高かった。
この結果、実施例１６で養殖された稚魚は、成魚に養殖する際、比較例４で養殖された稚魚と比較して少ない給餌量で、比較例の稚魚と同等又はそれ以上の成長速度で養殖可能であることが解った。
As shown in Table 8, the feeding amount of Example 19 was smaller than that of Comparative Example 7, but the weight gain was the same, and the weight gain rate was higher than that of Comparative Example 7.
As a result, the fry cultivated in Example 16 is cultivated at a growth rate equal to or higher than that of the fry of the comparative example with a smaller amount of feeding compared to the fry cultivated in the comparative example 4 when cultivating the adult fish. It turns out that it is possible.
なお、上述した金魚の養殖試験の目的は、養殖で得られる効果を説明するためであると共に、新株の加工による熱処理後の効果の確認をするためである。
摂餌直後の酸素濃度を測定し、食物の消化率（酸化分解量）を比較することで、体重の測定をして消化物の増肉への転換量を調べた。
The purpose of the goldfish culture test described above is to explain the effect obtained by the culture and to confirm the effect after heat treatment by processing the new strain.
By measuring the oxygen concentration immediately after feeding and comparing the digestibility (oxidative degradation amount) of food, the body weight was measured to examine the amount of digestion converted to thickening.
表５は、全ての条件を等しくして両区（実施例１６と比較例４）で用いた金魚が元々有する個体間の差の有無を確認し、数値化して示したものである。
また、表６は、実施例１７のみに新株含有飼料を与えて得られた結果を示したものである。そして、得られた結果と、表５（実施例１６及び比較例４）との比較によって、本発明に係る新株のナンノクロロプシスの効果を示すことができる。
比較の結果、酸素消費量は、実施例１７において「＋」（増加）しており、食べた餌の燃焼分解（消化）のために酸素が多く使われていることが解った。なお、「−」（減少）であれば、その逆で、消化の進転が遅くなり酸素の利用が減ったことになる。
Table 5 shows all the conditions equal to confirm the presence or absence of differences between individuals originally possessed by the goldfish used in both sections (Example 16 and Comparative Example 4), and quantify them.
Table 6 shows the results obtained by giving new strain-containing feed only to Example 17. And the effect of Nannochloropsis of the new strain according to the present invention can be shown by comparing the obtained results with Table 5 (Example 16 and Comparative Example 4).
As a result of the comparison, it was found that the oxygen consumption amount was “+” (increase) in Example 17, and oxygen was frequently used for the combustion decomposition (digestion) of the eaten food. If it is "-" (decrease), conversely, the progress of digestion is slowed down and the use of oxygen is reduced.
ところで、上述の試験の結果、新株を飼料に添加することで「＋」の値となることが解ったが、真に食物の酸化分解量（消化率）が上がった場合の他、同じ消化率でも酸素をより多く必要とした（消化が悪い状態になっていた）場合も考えらえる。
この点を確認するために、体重を測定して魚体中の増重量を調べた。
By the way, as a result of the above test, it was found that adding a new strain to the feed resulted in a “+” value, but the same digestibility was obtained except when the amount of oxidative degradation (digestibility) of the food was truly increased. However, there may be cases where more oxygen is needed (digestion was poor).
In order to confirm this point, the body weight was measured and the weight increase in the fish body was investigated.
表７は、上記実験（実施例１６・比較例４及び実施例１７・比較例５）の結果を踏まえ、食べた食物の消化率の増減を調べる目的で、一定期間体重を測定した値を示すものである。
表に示されるように、実施例１８の金魚の方が「＋」（体重増加率がより高い）という結果であった。この結果、表６に示される酸素消費量の増量分は食べた食物の消化率（酸化分解量）の増大に寄与したものであり、消化の増量分は増肉量（同化合成）につながり、体重が増えたことが解った。
つまり、表６や表７に示される結果から、本発明に係る新株ナンノクロロプシス含有飼料を食べることで食物の消化率が増え、それによって消化物の吸収量や増肉量も増えることが解った。
Table 7 shows the values measured for a certain period of time for the purpose of examining the increase or decrease in the digestibility of the eaten food, based on the results of the above experiments (Example 16, Comparative Example 4 and Example 17, Comparative Example 5). Is.
As shown in the table, the result of the goldfish of Example 18 was “+” (the weight gain rate was higher). As a result, the increased amount of oxygen consumption shown in Table 6 contributed to the increase in the digestibility (oxidative degradation amount) of the eaten food, and the increased amount of digestion led to the increased amount of meat (anabolic synthesis), I understood that I gained weight.
In other words, from the results shown in Tables 6 and 7, it can be seen that eating the feed containing the new strain Nannochloropsis according to the present invention increases the digestibility of the food, thereby increasing the amount of digested material absorbed and the increased amount of meat. It was.
さらに、表８は、実施例１９の給餌量を減らして体重を測定することで、消化率と増肉率の割合を調べた結果を示すものである。
その結果、実施例１９の給餌量（給餌率）を４割減らしても、実施例１９の金魚の体重増加量は、比較例７の金魚の体重増加量と同等であった。したがって、本発明に係る新株ナンノクロロプシスを含んだ飼料を食べることで、飼料の増肉への転換率（増重率）が高くなることがわかった。
つまり、新株ナンノクロロプシスを用いると、体重増加量は下がらず、日間飽食量の極限値の数値は下がり、転換率が高くなることがわかった。
Further, Table 8 shows the results of examining the ratio of digestibility and thickness increase rate by measuring the body weight while reducing the amount of feeding in Example 19.
As a result, even if the feeding amount (feeding rate) of Example 19 was reduced by 40%, the weight gain of the goldfish of Example 19 was equivalent to the weight gain of the goldfish of Comparative Example 7. Therefore, it turned out that the conversion rate (weight increase rate) of feed to the meat increase becomes high by eating the feed containing the new strain Nannochloropsis according to the present invention.
In other words, it was found that when the new strain Nannochloropsis was used, the weight gain did not decrease, the limit value of daily satiety decreased, and the conversion rate increased.
（トラフグの養殖試験・表９参照）
培養・増殖した新株のナンノクロロプシスを餌料として用いたトラフグの養殖試験を行った。
用いた水槽は、屋内設置されたほぼ正八角形（６ｍ×６ｍ）で深さが１ｍのものであった。これに約３０トンの養殖水（海水）を貯水して養殖を行った。水槽には随時注水を行い、いわゆるかけ流しによる養殖水の入れ替えを行った。なお、注水量は、養殖開始当初は１トン／時の割合とし、成長に応じて順次増量させ、最終的には４トン／時の割合の量であった。
また、水槽に注水する養殖水に対しては、適宜、砂ろ過及び砂ろ過後のＵＶ殺菌処理（サニトロン・ＪＳ３０）を行った。
また、ふ化仔魚から３ｃｍまでの間、サーモスタッドを用いた自動調整によって、水槽内の水温を１８℃〜１９℃に保った。
なお、養殖方法については、周知であるので詳細な説明については省略していることがある。
(Traffog farming test, see Table 9)
A culture experiment was conducted on trough pufferfish using the newly cultured Nannochloropsis as feed.
The aquarium used was a regular octagon (6 m × 6 m) installed indoors and a depth of 1 m. About 30 tons of aquaculture water (seawater) was stored in this for aquaculture. Water was poured into the tank at any time, and the aquaculture water was replaced by so-called pouring. The amount of water injection was set at a rate of 1 ton / hour at the beginning of aquaculture, gradually increased according to the growth, and finally at a rate of 4 ton / hour.
Moreover, with respect to the aquaculture water poured into the water tank, sand filtration and UV sterilization treatment after sand filtration (Sanitron / JS30) were appropriately performed.
Moreover, the water temperature in a water tank was kept at 18 degreeC-19 degreeC by the automatic adjustment using a thermostud from the hatched larva to 3 cm.
Since the aquaculture method is well known, detailed description may be omitted.
（実施例２０：孵化仔魚の養殖）
上述の条件の水槽にて、孵化仔魚１５００００匹を１２０日間養殖した。
（給餌条件）
投与する餌料は、ワムシ、プランクトン、仔魚用配合飼料であった。そして、同時にナンノクロロプシスを添加した。このナンノクロロプシスは、主に、餌料として投与されたワムシの餌料目的である。
各餌料の給餌条件及びナンノクロロプシスの添加条件は、次の条件であった。
ワムシは、上述の第３水槽で周年培養している新株のナンノクロロプシスを餌料に用いて培養・増殖させたものであった。ワムシの養殖開始当初の給餌量は、１つの水槽に対して１億個体／日であった。その後、孵化仔魚の成長に従い、徐々に増量し、最終的には５億個体／日であった。
新株のナンノクロロプシスの添加量（供給量）は、１つの水槽に対して２００リットル／日の培養水であった。この培養水は、上述の第３水槽（及び／又は同じ条件で周年培養している水槽）から取得したものである。
プランクトンについては、トラフグの日齢２０日目から給餌を開始した。プランクトンは、具体的には、市販のブラインシュリンプ（日清マリンテック社）であった。給餌開始当初の投与量は、１つの水槽につき、１０００万個体／日であった。その後、成長するに従って徐々に増量した。最終的には１億個体／日であった。
これらについて、一日の餌料の量を管理しつつ、一日に１回又は２回に分けて餌料を投与した。
仔魚用配合飼料については、トラフグの日齢２５日目から給餌を開始した。他方、ワムシ及びプランクトンの給餌は日齢５０日までとし、その後は、配合飼料だけを給餌した。
仔魚用配合飼料は、市販の配合飼料を混合したものであった。具体的には、（株）ヒガシマルの仔魚用配合飼料と、日清丸紅飼料（株）の仔魚用配合飼料と、中部飼料（株）の仔魚用配合飼料を「１：１：１」の比率で混合したものであった。給餌開始当初の投与量及び投与方法は、１つの水槽につき５０ｇ／日を１回投与するというものであった。その後、成長するに従って徐々に増量し、最終的には２０００ｇ／日を６回に分けて投与するというものであった。
また、体長が５ｃｍになった頃（日齢８０日頃）から、配合飼料と同時にオキアミのミンチ（エトウ釣具）の給餌を開始した。ミンチの給餌開始後、配合飼料及びミンチの投与量の比率（重量比）は「３：１」であった。
なお、孵化仔魚の養殖では、日齢３０日の時点で約１０００００匹になっていた仔魚を２つに分けて養殖する（間引いて養殖する）いわゆる分養を行った。
その後、適宜の時期に分養を行い、最終的には４つの水槽で養殖する状態になり、各水槽において約１０ｃｍの仔魚を約２００００匹（合計約８００００匹）養殖する状態になった。
(Example 20: Culture of hatching larvae)
150,000 hatched larvae were cultivated in a water tank under the above conditions for 120 days.
(Feeding conditions)
The feeds to be administered were rotifers, plankton and mixed feed for larvae. At the same time, Nannochloropsis was added. This Nannochloropsis is mainly for the purpose of feeding rotifers administered as food.
The feeding conditions for each feed and the addition conditions for Nannochloropsis were as follows.
The rotifer was obtained by culturing and growing a new strain, Nannochloropsis, which was cultivated in the third water tank as described above, as a feed. The initial feeding amount of rotifer was 100 million individuals / day for one aquarium. Thereafter, the amount was gradually increased according to the growth of hatched larvae, and finally it was 500 million individuals / day.
The addition amount (supply amount) of the new strain Nannochloropsis was 200 liters / day of culture water for one water tank. This culture water is obtained from the above-described third water tank (and / or a water tank that has been cultured for the year under the same conditions).
About plankton, feeding was started from the 20th day of age. Plankton was specifically a commercially available brine shrimp (Nisshin Marine Tech Co., Ltd.). The dosage at the beginning of feeding was 10 million individuals / day per tank. After that, it gradually increased as it grew. Ultimately it was 100 million individuals / day.
For these, the food was administered once or twice a day while controlling the amount of the daily food.
As for the mixed feed for larvae, feeding was started from the 25th day of age. On the other hand, rotifer and plankton were fed up to 50 days of age, and thereafter, only the mixed feed was fed.
The mixed feed for larvae was a mixture of commercially available mixed feed. Specifically, the ratio of “1: 1: 1” of the mixed feed for larvae of Higashimaru Co., Ltd., the mixed feed for larvae of Nisshin Marubeni Feed Co., Ltd., and the mixed feed for larvae of Chubu Feed Co., Ltd. Were mixed. The dosage and administration method at the beginning of feeding were to administer 50 g / day once per aquarium. Thereafter, the dose was gradually increased as it grew, and finally 2000 g / day was divided into 6 doses.
In addition, from the time when the body length became 5 cm (around 80 days of age), feeding of krill mince (fish fishing tackle) was started simultaneously with the mixed feed. After the start of feeding mince, the ratio of the mixed feed and mince dose (weight ratio) was “3: 1”.
In addition, in the culture of hatching larvae, so-called rearing was performed by dividing the larvae that had become approximately 100,000 at the age of 30 days into two parts (cultured by thinning).
After that, it was cultivated at an appropriate time, and finally it was put into a state where it was cultivated in four aquariums, and about 20,000 larvae of about 10 cm (about 80000 total) were cultivated in each aquarium.
（成魚の養殖試験）
実施例２０で１０ｃｍ程度に成長した稚魚（のうちの約１００００匹）について、さらに、成魚にするための養殖を１年間行った。ここでの養殖では、容量が２０トンの直径５ｍの円形の水槽を用いた。
なお、養殖方法については、周知であるので詳細な説明については省略していることがある。
(Adult fish culture test)
The fry (about 10000 of them) grown to about 10 cm in Example 20 was further cultured for 1 year for adult fish. In the aquaculture here, a circular water tank with a capacity of 20 tons and a diameter of 5 m was used.
Since the aquaculture method is well known, detailed description may be omitted.
（給餌条件）
給餌した餌料は、市販のトラフグ養殖用の配合飼料およびミンチであった。
配合飼料は、マルハニチロ（株）のトラフグ養殖用配合飼料と、（株）ヒガシマルのトラフグ用養殖配合飼料とを「１：１」で混合したものであった。この餌料を一日に１回投与した。
なお、給餌方法は、養殖魚の食欲を観察しながら必要十分な給餌量を見極めつつ投与するという周知の方法であった。
(Feeding conditions)
The feed that was fed was a commercially available mixed feed for minnowfish and mince.
The mixed feed was a mixture of Maruha Nichiro's trough puffer culture mixed feed and Higashimaru's cultured pufferfish mixed feed for "1: 1". This feed was administered once a day.
In addition, the feeding method was a well-known method of administering while determining the necessary and sufficient amount of feeding while observing the appetite of the cultured fish.
表９に示されるように、トラフグの体重１グラム当たりの給餌量（体重比）は、トラフグの体重を基準として、１％以下であった。
ところで、通常の日間給餌量（体重比）は、一般的には、稚魚期の場合で３〜７％、中間魚から成魚の期間の場合で１〜３％であると言われている（例えば、山口県水産振興課が平成２４年３月発行の「トラフグ」に関する栽培漁業のてびき（改訂版）参照）。
因みに、参照資料に挙げた「トラフグ」に関する栽培漁業のてびき（改訂版）には、トラフグの種苗に対する給餌率は、通常３〜５％であると記載されているところ（てびき６頁参照）、本実施例２０における中間魚から成魚へのトラフグの養殖（４か月以降）では、１％以下の給餌量で食欲を満たすことができ、少ない給餌量で養殖可能であることが解った。
As shown in Table 9, the amount of feeding (weight ratio) per gram of body weight of trough puffer was 1% or less based on the body weight of trough puffer.
By the way, it is generally said that the normal daily feeding amount (weight ratio) is 3 to 7% in the case of fry, and 1 to 3% in the period from the intermediate fish to the adult fish (for example, Yamabi Prefecture Fisheries Promotion Division (see revised version) of the cultivated fishery related to “Trafugu” issued in March 2012).
By the way, in the cultivated fishery rebirth (revised version) related to "Trafugu" listed in the reference material, it is stated that the feeding rate for seedlings of trough puffer is usually 3-5% (see page 6 ) In the farming of trough puffer fish from the intermediate fish to the adult fish in this Example 20 (after 4 months), it was found that the appetite can be satisfied with a feeding amount of 1% or less, and it can be cultured with a small feeding amount. .
上述の実施例は、トラフグの養殖であるが、本実施例の新株のナンノクロロプシスは、種々の魚の養殖で用ることで、同様の効果が得られる。例えば、トラフグと同様に白身魚であるヒラメ、真鯛などにおいても同様の効果がある。 Although the above-mentioned embodiment is a culture of trough puffer, the same effect can be obtained by using the new strain Nannochloropsis of this embodiment in the cultivation of various fish. For example, the same effect can be obtained for flounder, red snapper, etc., which are white fish as well as trough puffer fish.
なお、１９９０年頃からの養殖魚の生産・販売の実績を基に説明すると、従来の親株のナンノクロロプシス又は市販のクロレラ製品（淡水産・海水産）等を使用して実施例２０と同様の方法でトラフグ・ヒラメ・マダイの稚魚を生産した後、生産された稚魚を成魚に養殖する際、成魚に対する給餌率（魚体重に対する割合）は、いずれの魚種であっても通常の一般的な量である１％〜３％の範囲であった（表１０参照）。
これに対して、実施例１６及び比較例４と、実施例１７及び比較例５の金魚の養殖における比較試験（表８参照）や、実施例２０のトラフグ養殖試験の結果（表９参照）から解るように、本実施例に係る新株のナンノクロロプシスを使用すれば、日間給餌率が０．４％〜０．８％の範囲の日間給餌率で、従来通りの成魚の養殖を行うことができる。
In addition, when it demonstrates based on the production and sale results of cultured fish from around 1990, the same method as in Example 20 using the conventional parent strain Nannochloropsis or commercially available chlorella products (freshwater and seafood), etc. After producing larvae of tiger pufferfish, flounder and red sea bream in Japan, when the produced larvae are cultivated into adult fish, the feeding rate (ratio to the fish weight) for the adult fish is the usual general amount. The range was 1% to 3% (see Table 10).
On the other hand, from the comparison test (refer to Table 8) in the culture of goldfish of Example 16 and Comparative Example 4, Example 17 and Comparative Example 5 (see Table 8), and from the results of the trough puffer culture test of Example 20 (see Table 9). As can be seen, if the new strain Nannochloropsis according to the present example is used, the conventional adult fish can be cultured at a daily feeding rate in the range of 0.4% to 0.8%. it can.
また、本発明に係る新株のナンノクロロプシスを用いたヒラメの中間養殖（８ｃｍ〜１５ｃｍ程度）における日間給餌率（魚体重に対する一日の給餌量の割合）は、平均すると０．４３％であった。例えば、体重が約１００ｇ（体長約１５ｃｍ）のヒラメに対する給餌量は、約０．４ｇ（給餌率約０．４％）ということである。
そして、本発明に係る新株のナンノクロロプシスを用いたマダイの中間養殖における日間給餌率（魚体重に対する一日の給餌量の率）は、約０．６％であった。例えば体重が約３０ｇ（体長約１２ｃｍ）のマダイに対する給餌量は約０．１８ｇ（給餌率約０．５８％ということである。
つまり、ヒラメの成魚への養殖においても、本実施例に係る新株のナンノクロロプシスを使用すれば、日間給餌率が０．４％〜０．６％の範囲の日間給餌率で、従来通りの成魚の養殖を行うことができた。
Moreover, the average daily feeding rate (ratio of the daily feeding amount to the fish body weight) in the middle culture of flounder (about 8 cm to 15 cm) using the new strain Nannochloropsis according to the present invention was 0.43%. It was. For example, the amount of feeding for Japanese flounder having a body weight of about 100 g (body length: about 15 cm) is about 0.4 g (feeding rate: about 0.4%).
And the daily feeding rate (rate of the daily feeding amount with respect to the fish weight) in the intermediate culture of red sea bream using the new strain Nannochloropsis according to the present invention was about 0.6%. For example, the feeding amount for red sea bream having a body weight of about 30 g (body length of about 12 cm) is about 0.18 g (feeding rate of about 0.58%).
In other words, in the cultivation of flounder adults, if the new strain Nannochloropsis according to this example is used, the daily feeding rate is in the range of 0.4% to 0.6%. Adult fish farming was possible.
ところで、養殖における給餌量に関して、魚の一日の活動で必要なエネルギに対応する給餌量（基礎代謝に対応する給餌量）が検討されている。
「養魚学総論（株式会社厚生閣、昭和５３年６月３０日発行、５９７頁）」によれば、魚が体重１ｇを一日維持するのに必要な餌飼料の量（給餌量率）は、水温の違いの差はあるが、マアジ・マフグ・カワハギ・ニジマスについて、水温１０℃〜２０℃付近で、配合飼料のみで約０．４％、生餌のみで約１．７％（水分を多く含む分、多くの餌が必要）である。そして、投餌回数（投与回数）を増やした場合の、餌料の増重量（体重増量）への転換率は、それに比例して増加しておらず、日間増重量には一定の極限値（飽食状態）がある。
つまり、投餌回数を増やすと、増重量はその極限値に次第に近づくように増加することになる。したがって、やたらに投餌回数（投餌量）を増やしても、魚体重の増加速度には限界があり、餌が無駄になるだけである。
そして、飽食量について、魚の体長や水温別の違いはあるが、その給餌率の日間標準量は、体重に対して稚魚期で約５％、成魚で約３％と説明されている（表１０参照。稚魚は成魚よりも基礎代謝が大きいため、飽食給餌率は大きな値になる）。
By the way, regarding the amount of feeding in aquaculture, the amount of feeding (feeding amount corresponding to basal metabolism) corresponding to the energy required for the daily activities of fish has been studied.
According to “General Study of Fish Culture (Koseikaku Co., Ltd., published on June 30, 1978, 597 pages)”, the amount of feed (feed rate) necessary for a fish to maintain a weight of 1 g a day is There is a difference in water temperature, but for maji, mahugu, kawahagi and rainbow trout, the water temperature is around 10 ° C to 20 ° C, about 0.4% for mixed feed only, and about 1.7% for raw food only (water content) It contains a lot of food and needs a lot of food). And when the number of times of feeding (number of times of administration) is increased, the conversion rate to weight gain (weight gain) of the feed does not increase proportionally, and there is a certain limit value (satisfaction for daily weight gain) State).
That is, when the number of feedings is increased, the weight increase gradually increases so as to approach the limit value. Therefore, even if the number of times of feeding (feeding amount) is increased, there is a limit to the rate of increase in fish weight, and the food is only wasted.
Regarding the amount of satiety, although there are differences in fish length and water temperature, the daily standard amount of feeding rate is explained to be about 5% for juveniles and about 3% for adults relative to body weight (Table 10). (Refer to juveniles because they have a higher basal metabolism than adults, so the satiation rate is higher.)
実際、本発明に係る新株のナンノクロロプシスを用いていない従前の養殖経験では、一日の給餌量が１％以下の範囲では、給餌量が減れば減るほど魚の成長は遅くなった。その一方で、標準量よりも食べる割には太らない、ということもよくあることであった。そして、飽食量（給餌率約３％の給餌量）を超えた量の餌を食べる状態が３日以上続くと、過食症によって健康状態を害して病気の発生率が高くなり、養殖の歩留まりが悪くなった。つまり、これまでの養殖経験に基づけば、魚は、成長のためには少なくとも約１％以上の餌を摂取する必要があり、成魚に関する標準給餌量（給餌率）は、成長、健康、経済面等の観点から、１％〜３％が適正な値であった。
この点、上述したように、本発明に係る新株のナンノクロロプシスを使用して生産された稚魚（仔魚）を成魚に育成する過程における給餌量について軽減効果が認められた。つまり、これまでよりも少ない給餌量（給餌率）で、従来通りの成魚の養殖を行うことができることが解った。
In fact, according to the previous aquaculture experience not using the new strain Nannochloropsis according to the present invention, the growth of fish slowed down as the feeding amount decreased within the daily feeding amount of 1% or less. On the other hand, it is often the case that you don't get fat compared to the standard amount. And if you continue to eat more than 3 days of food that exceeds the amount of satiation (feeding rate of about 3%), bulimia will damage your health and increase the incidence of the disease, It got worse. In other words, based on past aquaculture experience, fish need to eat at least about 1% of food for growth, and the standard feed rate (feeding rate) for adult fish is growth, health and economics. From the viewpoint of the above, 1% to 3% was an appropriate value.
In this respect, as described above, an effect of reducing the feeding amount in the process of growing young fry (larvae) produced using the new strain Nannochloropsis according to the present invention into adult fish was recognized. That is, it was found that adult fish can be cultured as usual with a smaller amount of feeding (feeding rate) than before.
Claims (6)
前記第１処理工程後に塩素成分を中和する中和処理工程と、
前記中和処理工程後の周年培養工程と、
当該周年培養工程後に行われる塩素濃度が３ｐｐｍ以上１５ｐｐｍ以下の培養水中における培養工程とを有することを特徴とする新株のナンノクロロプシスの作出方法。 A high-concentration chlorination process in which the chlorine concentration of the culture water of Nannochloropsis is 30 ppm or more and 50 ppm or less ;
A neutralization treatment step of neutralizing the chlorine component after the first treatment step;
Anniversary culture step after the neutralization treatment step;
A method for producing a new strain of Nannochloropsis, characterized by having a culture step in culture water having a chlorine concentration of 3 ppm or more and 15 ppm or less performed after the anniversary culture step.
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